CN102399760B - 植物耐逆性相关蛋白TaSnRK2.10及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物抗逆相关蛋白TaSnRK2.10及其编码基因与应用。本发明蛋白，为如下(a)或(b)所示的蛋白：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，将本发明基因导入植物中，可提高植物的抗逆性，如耐旱节水、抗盐或耐寒，因此，本发明基因及其应用对培育耐旱节水、抗盐或耐寒新品种具有重要的现实意义。

Description

植物耐逆性相关蛋白TaSnRK2.10及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种植物耐逆性相关蛋白TaSnRK2.10及其编码基因与应用。

背景技术

干旱缺水是全球农业生产面临的严重问题，也是制约我国粮食生产发展的重要因素。主要粮食作物小麦的栽培需要大量的水，我国平均每生产1吨小麦需水量约500-700m³。全世界发展中国家至少有6000万公顷小麦栽培在雨养耕地，但其产量水平只有灌溉条件下的10％-50％。所以，发展耐旱节水小麦品种，以提高作物的水分利用效率，既可增加产量，又可以缓解水资源短缺的矛盾。

改良作物耐旱性对于提高农业生产力具有重大意义，受到世界各国的高度重视，近期我国启动的转基因作物新品种培育重大专项就是最好的实证。研究植物的耐旱机理、克隆耐旱相关基因、通过基因工程改良作物耐旱性是培育耐旱作物新品种的一条有效途径。虽然作物的耐旱性遗传基础复杂，克隆、转化耐旱基因获得耐旱性明显提高的新品种难度较大，但经众多科学家的共同努力，已经取得了一定的进步，涌现了不少成功的例子。

目前，已克隆的耐旱相关基因主要包两大类，第一类为功能基因，这类基因包括低分子可溶性糖、氨基酸和小分子蛋白质等合成相关基因，以及保护细胞免受损害的酶类，如脯氨酸合成相关酶基因，包括吡咯啉-5-羧酸合成酶基因P5CS及PVAB2，吡咯琳-5-羧酸还原酶基因P5CR等；晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA)，小麦LEA蛋白基因。

第二类是调节基因，包括各种参与水分胁迫信号传递的基因，主要包括(1)参与ABA、乙烯等信号分子合成的关键酶类；(2)转录因子，如DREB，NF-YB1等；(3)蛋白磷酸酶，如蛋白质磷酸酶2A和2C等，它们参与ABA信号的传递。(4)蛋白磷酸激酶，植物蛋白激酶家族非常，主要包括分裂素激活蛋白激酶(MAPK)，钙依赖的蛋白激酶(CDPK)和蔗糖非发酵相关蛋白激酶(SNF1(sucrose non-fermenting)related proteinkinase，SnRK)，其中SnRK是近期发现的参与对各种逆境反应的蛋白激酶。

SnRK家族非常庞大，根据其序列相似性和结构域特点，SnRK家族可以分为3个亚家族：SnRK1，SnRK2和SnRK3，其中SnRK1广泛存在于动植物和微生物中。研究表明SnRK1主要参与生物体内对营养缺乏的响应，而SnRK2和SnRK3是植物特有的蛋白激酶。目前，人们对SnRK3亚家族的研究相对比较多，其中对SnRK3成员中的SOS2研究尤为透彻，SOS2编码一种Na⁺/H⁺转运蛋白，该蛋白能够调节植物细胞内外钠、钾离子的平衡，其过量表达能增强转基因植株的耐盐性。此外，人们发现了4个SOS2类似蛋白激酶，分别参与对不同胁迫的反应，如PKS11可能参与对糖的感应，PKS6和PKS18参与ABA信号传递，AtCIPK1/PKS13调节对盐的耐受性。小麦SnRK3成员WPK4受光、细胞分裂素和低温的诱导，而被蔗糖抑制。

人们对SnRK2家族研究起步较晚，但越来越多的证据表明该家族大多成员受渗透胁迫诱导表达，部分成员还参与ABA信号的传递过程。Boudsocq在拟南芥中克隆了10个SnRK2成员，发现其中的9个成员受高渗和盐胁迫的诱导，5个参与对ABA的响应，其中OST1/SRK2.6及其直系同源基因Vicia faba AAPK参与对ABA调节的气孔关闭的控制调节，过量表达SnRK2.8和SnRK2.3能增强转基因植株的耐旱性。Kobayashi等在水稻中分离到10个SnRK2成员，称之为胁迫激活蛋白激酶(Stress ActivatedProtein Kinase，SAPK)，研究表明这10个成员都参与对渗透胁迫的应答，其中3个受ABA诱导。Huai等在玉米中克隆了9个SnRK2成员，发现不同成员对逆境胁迫的应答不同。过量表达该家族成员SAPK4能明显增强转基因植株的耐盐性。在大豆中，人们分离到4个SnRK2成员，SPK1、SPK2、SPK3和SPK4，其表达都受渗透胁迫诱导，其中SPK3还受外源ABA的诱导。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因。

本发明所提供的蛋白，其来源于普通小麦(Triticum aestivum L.)，命名为TaSnRK2.10，为如下(a)或(b)所示的蛋白：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

为了使(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1的自5′端第84至1169位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述蛋白的氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基的取代、替换和/或添加，有的是由于自然发生的多态变异引起的，例如由获得蛋白质的生物的物种、个体等的差异导致；有的是由定点诱变、随机诱变等人工诱变处理引起。

上述蛋白TaSnRK2.10的编码基因TaSnRK2.10也是本发明保护的范围。

上述编码基因TaSnRK2.10为如下1)-5)中任一一种DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列1的自5′末端第84-1149位核苷酸所示的DNA分子；

3)序列表中序列1的自5′末端第48-1166位核苷酸所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码与耐逆性相关蛋白的DNA分子；

5)与1)或2)或3)限定的DNA序列有90％以上同源性且编码与耐逆性相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件是，在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列表中序列1由1461个脱氧核糖核苷酸组成，包括83bp的5′UTR、1086bp的ORF区、292bp的3′UTR；该基因的开放阅读框为1086bp(序列表中序列1的自5′端第84-1169位核苷酸)，编码361个氨基酸(序列表中序列2所示)。

含有上述任一所述TaSnRK2.10编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有本发明基因的重组表达载体，所述重组表达载体具体为将所述蛋白的编码基因插入pPZP211-GFP的HindIII和Sal I中，得到表达所述蛋白的载体。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

上述提供的方法，为将上述蛋白的编码基因TaSnRK2.10导入目的植物中，得到具有如下1)-3)中的全部、任意一种或任意两种特征的转基因植物：

1)所述转基因植物的主根长度大于所述目的植物；

2)所述转基因植物的侧根数目大于所述目的植物；

3)所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。

上述方法中，耐逆性为耐干旱、耐盐和/或耐低温。

上述方法中，上述蛋白的编码基因是通所述的重组表达载体导入所述目的植物中的。

上述方法中，所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

上述方法中，所述单子叶植物具体可为小麦，所述双子叶植物具体可为拟南芥，本发明的一个实施例为拟南芥。

可以采用常规方法将所述编码基因导入植物中，例如基因枪法，高压电穿孔法，脂质体法，菌转化或转染等。本发明中的具体操作是，先将基因导入载体中，得到重组表达载体，再将重组表达载体导入农杆菌中，得到含有本发明基因的重组农杆菌，再通过农杆菌将基因导入植物中。

本发明的实验证明，将本发明基因导入植物中，可以促进转基因植物根系的生长。提高了植物的抗逆性，如耐旱性和/或抗盐性和/或耐冷性。在干旱条件下，转入本发明基因的植物的存活率为20-40％，而未转入本发明基因的野生型植物的存活率还不到10％；在高盐胁迫条件下，植物的存活率可达30-70％，而未转入本发明基因的野生型植物的存活率还不到15％；在冷冻胁迫条件下，植物的存活率可达85-95％，而未转入本发明基因的野生型植物的存活率仅有70％。同时本发明基因对单子叶、双子叶植物均适用。因此，本发明基因及其应用对培育耐旱节水、抗盐农作物新品种具有重要的意义，适合于推广应用。

附图说明

图1为TaSnRK2.10在受水分胁迫、高盐、低温和ABA处理后的表达情况

图2为转TaSnRK2.10拟南芥主根长度、侧根数量统计

图3为转TaSnRK2.10拟南芥的耐旱性鉴定结果

图4为转TaSnRK2.10拟南芥的耐盐性鉴定结果

图5为转TaSnRK2.10拟南芥的耐冻性鉴定结果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、小麦中抗逆相关蛋白的编码基因TaSnRK2.10的分离

一、抗逆相关蛋白的编码基因TaSnRK2.10的分离

1、构建小麦的全长cDNA文库，按照文献(毛新国等，2005，用改进的Cap-trapper法构建拟斯卑尔脱山羊草全长cDNA文库.遗传学报，32(8)：811-817)中所述方法进行：

(1)总RNA提取及mRNA纯化，用TRIZOL提取小麦总RNA，用oligo(dT)纤维素分离纯化mRNA。

(2)第一链cDNA的合成：取10ug mRNA与引物I混合，变性后加入第一链cDNA合成的试剂，当温度升到40℃时，加入反转录酶，当反应进行到40分钟时加入引物II(第一链合成引物如下)。为得到更多全长cDNA，在第一链合成时向反应体系中加入海藻糖和山犁糖醇；为限制poly(A)尾巴的长度，以便于大规模测序，用混合引物替代传统的单一引物oligo(dT)18。反应结束后用CTAB-UREA法除去糖类，沉淀cDNA/RNA。

第一链cDNA合成引物

(3)高碘酸钠氧化向上步反应管中加入高碘酸钠溶液，氧化RNA，用甘油终止反应。

(4)生物素标记离心收集高碘酸钠氧化的cDNA/RNA，清洗、晾干重新溶解后，加入新鲜配置的Biotin-hydrzide(请将其译成中文，并提供)，23℃温育14～16h，用柠檬酸钠终止反应。

(5)RNase I消化经高碘酸钠氧化后，mRNA 5′和3′端末位碱基核糖上相邻的二醇基团被氧化成为二醛基团，它们都可以和生物素结合。后期利用链霉亲和素包被的磁珠分离全长cDNA时，mRNA 3′端的生物素也可以与磁珠结合。为得到5′端完整的cDNA，必须特异地将3′端标记的生物素除去。真核生物mRNA 3′端poly(A)长度一般在100～250bp，在合成第一链cDNA时，将poly(A)的长度限制在16个碱基，因此cDNA/RNA复合体中mRNA 3′端poly(A)将以单链的形式存在，因此可以用RNaseI将其特异除去。

(6)全长cDNA的捕获及单链cDNA释放先用无DNA污染的tRNA封阻磁珠(Dynalbead M-280)，室温下让cDNA/RNA和磁珠结合20min，用NaOH-EDTA洗脱cDNA/RNA。

(7)末端转移酶加尾收集单链cDNA，变性后加入末端转移反应试剂，37℃反应9分钟，终止反应。

(8)第二链cDNA的合成收集单链cDNA，用LA-Taq合成第二链cDNA。待反应结束后，电泳，回收大于1kb的cDNA。

(9)酶BsaI属于二类限制性内切酶，它的酶切位点正好处于识别位点下游的第一个碱基处，而且酶切没有碱基特异性，但对识别位点的胞嘧啶甲基化敏感。经BsaI酶切的DNA将产生4个碱基突出的黏性末端。根据这些特性，在引物设计时引入了Bsa I、EcoR I和Xho I位点，其中第一链引物中为Bsa I和Xho I位点，第二链引物中为Bsa I和EcoRI位点。通过采取这些措施，仅用Bsa I对cDNA进行单一酶切，就可以实现cDNA的定向克隆。

(10)连接、包装及插入片段检测：收集分级后的目的cDNA片段，重新溶解于ddH₂O中，检测cDNA浓度，确定cDNA的浓度后，取适量的cDNA与载体Un iZAP II连接过夜。包装后，侵染宿主菌XL1-Blue，检测滴度。

(11)质粒提取及序列测定产量，然后重复蛋白酶K消化，酚/氯仿萃取等步文库扩增后，取一定量的扩增文库用于噬粒环骤，最后将cDNA置于乙醇中沉淀过夜。环化，检测噬粒滴度，最后取适量环化后的噬粒侵染SOLR宿主细胞。

(12)将噬粒侵染过的宿主细胞涂布平板，37℃培养过夜。随即挑取阳性克隆于96孔培养板，提取质粒、测序，构建小麦全长cDNA数据库。

搜索小麦全长cDNA数据库，得到候选克隆，测序得到目标克隆的全长序列，其核苷酸序列为序列表中序列1所示，序列全长为1461bp，分析序列1所示基因的结构，表明，其自序列表中序列1的5′末端第1-83位核苷酸为5′UTR(83bp)，第84-1169位核苷酸为开放阅读框(1086bp)，第1170-1461位核苷酸为3′UTR(292bp)。该基因编码的氨基酸序列如序列表中序列2所示，由361个氨基酸残基组成。将序列表中序列1所示的基因命名为TaSnRK2.10，由其编码的蛋白(序列表中序列2所示)命名为TaSnRK2.10。也可以人工合成序列1。

二、TaSnRK2.10的表达特征

以耐旱小麦(旱选10号，Triticum aestivum L.，由国家作物种质库保存)为实验材料。

挑选籽粒饱满、大小一致的耐旱小麦种子(旱选10号)，将其置于光照培养箱中，在20℃、12h/d培养，水培至一叶一心，然后进行逆境胁迫处理。水分胁迫：除去培养皿中的水分，加入30mL浓度为16.1％的PEG-6000(渗透势为-0.5MPa)水溶液；高盐胁迫：除去培养皿中的水分，加入30mL 250mM NaCl水溶液；低温胁迫：直接将培养皿移至4℃光照培养箱培养；外源ABA处理：采用50μM ABA溶液进行喷雾直至叶片全部湿润。

分别在不同胁迫处理的0、0.5、1、1.5、2、4、6、12和24h采集叶片，液氮速冻，-70℃保存备用。对照一直采用无离子水培养。

用TRIZOL提取小麦叶片的总RNA，以MMLV反转录试剂盒合成第一链cDNA(Invitrogen)，采用实时定量PCR(Real-time Quantitative PCR，qRT-PCR)的方法检测基因TaSnRK2.10对各种逆境胁迫的响应情况。用组成型表达的Tubulin基因作为内参，设计了qRT-PCR的引物。

按照Livak and Schmittgen提出的公式计算：TaSnRK2.10基因在4种处理下的表达量为对照的N倍，N＝2^-ΔΔCT，ΔΔCT＝(CT_{(Target，Time x)}-CT_{(Tubulin，Time x)})-(CT_{(Target，Time 0)}-CT_{(Tubulin，Time 0)})。

其中，CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。PCR循环在到达CT值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期(对数期)，此时微小误差尚未放大，因此CT值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的CT值是恒定的。

time x代表不同的处理时间点；time 0代表处理的零点；CT_{(Target，Time x)}为经过胁迫处理x时间时，小麦中TaSnRK2.10基因的表达量；CT_{(Tubulin，Time x)}为经过胁迫处理x时间时，小麦中Tubulin基因的表达量；CT_{(Target，Time 0)}为未开始胁迫处理时，小麦中TaSnRK2.10基因的表达量；CT_{(Tubulin，Time 0)}为未开始胁迫处理时，小麦中Tubulin基因的表达量。

实验设3次重复，结果取平均数，结果如图1所示。相对表达量即为N值。结果表明，TaSnRK2.10参与对PEG、NaCl、低温和ABA的应答，但对不同逆境胁迫的应答强度和反应速度不同。

实施例2、基因TaSnRK2.10及其在拟南芥中的应用

一、TaSnRK2.10的获得

设计引物：上游引物F1：5′-CCCAAGCTTGTGGGGGAAGGAAAGGGG-3′(Hind III位点，序列3)，下游引物RI：5′-ACGC GTCGACCATAGCATACACTATCTCCCCGCT-3′(Sal I位点，序列4)，其中下游引物3′端位于基因终止密码子的上游。

提取普通小麦(Triticum aestivum L.旱选10号，由国家作物种质库保存)的mRNA，以5′-GTGGGGGAAGGAAAGGGG-3′和5′-AGTAACATTTGTGGGCGGGC-3′为引物，用RT-PCR的方法获得小麦中基因TaSnRK2.10的全长cDNA；

以基因TaSnRK2.10的全长cDNA序列为模板，以上述引物F1和R1，采用高保真酶Pfu扩增目标基因，得到1119bp的PCR产物，送去测序，结果为该PCR产物具有序列表中序列1自5’末端第48-1166位核苷酸，即为基因TaSnRK2.10，编码区为序列表中序列1自5’末端第84-1169位核苷酸，氨基酸序列如序列表中序列2。

也可以人工合成序列1，以上述引物F1和R1为模板，得到PCR产物。

二、构建转基因TaSnRK2.10拟南芥

1、重组载体的构建

以pPZP211为原始载体(GI：506685)(Hajdukiewicz等(1994)，Plant MolBiol，25：989-994)，在pPZP211的多克隆位Sal I和Pst I位点间插入GFP(BAG13014)的开放阅读框，最终得到双元载体pPZP211-GFP(Mao等2010，Journal of experimentalbotany，61：683-696，TaSnRK2.4，an SNF1-type serine-threonine protein kinase ofwheat(Triticum aestivum L.)confers enhanced multi-stress tolerance inArabidopsis，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得)。

将上述的PCR产物用限制性内切酶HindIII和Sal I进行酶切，回收目标基因片段；用限制性内切酶HindIII和Sal I酶切双元载体pPZP211-GFP，回收目的载体片段；将回收的目标基因片段和目的载体片段进行连接，得到连接产物，转入大肠杆菌，得到转化子。提取转化子的质粒，送去测序，该质粒为将序列表中序列1自5’末端第48-1166位核苷酸插入pPZP211-GFP的HindIII和Sal I酶切位点间得到的载体，将该载体命名为pZP211-TaSnRK2.10/GFP。

2、转TaSnRK2.10拟南芥的获得

将载体pZP211-TaSnRK2.10/GFP转入农杆菌(Agrobacteria Gv3101，购自Biovector Science Lab，Inc，货号Biovector-375)，得到重组农杆菌。以农杆菌培养液(2μL)为模板，以寡核苷酸F2：5′-GTGGGGGAAGGAAAGGGG-3′，R2：5′-CATAGCATACACTATCTCCCCGCT-3′为引物进行PCR扩增，得到1119bp的即为筛选出PCR扩增阳性的克隆命名为Gv3101/pZP211-TaSnRK2.10/GFP。

将Gv3101/pZP211-TaSnRK2.10/GFP转入野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana cvColumbia-0，Col-0，以下简称野生型拟南芥，购自拟南芥资源中心ArabidopsisBiological Resource Center，)的花中(注：拟南芥是通过浸花来转化的)，在加有抗生素的MS培养基上筛选转基因植株，共得到45株能在卡那霉素培养基上正常生长的绿色转基因植株。

采用相同的方法将空载体pPZP211-GFP转入野生型拟南芥中，得到T1代转空载体拟南芥，提取RNA，反转录得到cDNA，以上述引物F1和R1为引物进行PCR扩增，未得到目的产物，即为T1代转空载体拟南芥。

3、鉴定

将7日龄，在卡那霉素培养基上表现为绿色的转基因植株放在在荧光显微镜下检测，观察拟南芥幼根中TaSnRK2.10-GFP融合蛋白的表达情况。以野生型拟南芥和T1代转空载体拟南芥为对照。

结果如下：野生型拟南芥没有荧光，而表现为绿色的转基因植株和T1代转空载体拟南芥均有荧光，将有荧光的转基因植株记作荧光鉴定阳性转基因植株。

将荧光鉴定阳性转基因植株提取RNA，反转录得到cDNA，以上述引物F1和R1为引物进行PCR扩增，得到1119bp的PCR产物的为阳性T1代转TaSnRK2.10拟南芥。

根据阳性T1代转TaSnRK2.10拟南芥的荧光的强弱挑选融合蛋白表达量较高的编号为1-4的阳性T1代转TaSnRK2.10拟南芥繁种、加代，待得到编号为L1-4的T3代转TaSnRK2.10拟南芥纯系。

同样将T1代转空载体拟南芥繁种、加代，得到T3代转空载体拟南芥纯系。

四、转TaSnRK2.10拟南芥的功能研究

1、转TaSnRK2.10拟南芥的表型

将转TaSnRK2.10拟南芥(L1-4)的T3代种子播种在MS培养基上(含0.8％的琼脂)，然后将培养皿直立放在22℃、12h光照/d的条件下培养，以野生型拟南芥(WT)和T3代转空载体(GFP)拟南芥为对照。

7天后测量转基因株系和对照株系的主根长，每个株系检测20个植株；10天后统计侧根的数量，利用SAS软件进行显著性分析。

实验均重复三次，结果取平均值。

结果如图2所示，A为7天后根系表型鉴定结果，从图中看出转基因株系的主根均长于对照；

B为7天后各株系的主根长，其中，WT、L1、L2、L3、L4、GFP的主根长分别为2.31、2.61、2.64、2.52、2.67、2.07cm；

C为10天后各株系的侧根数目，其中，WT、L1、L2、L3、L4、GFP的侧根数分别为6.0、8.1、9.1、7.2、7.8、5.2；

主根长度统计结果表明，在4个转基因株系中有3个株系达到了极显著水平(P＜0.01)；侧根统计结果表明，所有转基因株系的侧根数均高于对照，其中有2个转基因株系的侧根数显著高于野生型对照(P＜0.01)。

2、转TaSnRK2.10拟南芥的抗逆性检测

将栽培土(蛭石和腐殖土的比例为1∶1)于长方形塑料盘中(盘底有小孔)，浇水至饱和后，将7日龄的T3代转TaSnRK2.10拟南芥(L1-4)、野生型拟南芥(WT)和T3代转空载体拟南芥(GFP)移栽到塑料盘中，于22℃、12h光照/d、相对湿度70％条件下培养。旱胁迫每个株系10株，盐胁迫每个株系15株，实验重复三次结果取平均值。

1)、耐旱性鉴定

控水35天，至野生型拟南芥和GFP严重萎蔫，然后复水，复水后第3天照相，结果如图3所示，可以看出，干旱胁迫(控水前)所有株系均正常生长，复水前株系大部分萎焉，复水后可以看出，L1-4重新正常生长，而野生型拟南芥和GFP无法恢复正常生长。

统计株系的耐旱存活率，结果如下：

转TaSnRK2.10拟南芥(L1-4)的存活率分别为40％、40％、30％、20％，且平均在20-40％，而野生型拟南芥存活率为10％，而GFP全部死亡。

2)、耐盐性鉴定

用300mM的NaCl溶液处理各株系(将塑料盘放在盐溶液中，让盐溶液慢慢浸入土壤中，培养条件同上)，分别在盐处理5天和12天观察各株系的耐逆情况并照相。

结果如图4所示，可以看出，盐胁迫前各株系正常生长，盐胁迫5天(盐处理5天)后，转基因株系叶片的颜色明显比野生型和空载体对照绿，盐胁迫12天后，野生型和空载体对照明显枯死，而仍有30-50％的转基因拟南芥依旧存活。

统计株系的耐盐性存活率，结果如下：

转TaSnRK2.10拟南芥(L1-4)的存活率分别为20％、13.3％、33.3％、33.3％，平均达到25％，而野生型拟南芥和GFP全部死亡。

3)、耐冷性鉴定

称等量的将栽培土于方形塑料盒中，浇水至饱和后，将7日龄的拟南芥幼苗T3代转TaSnRK2.10拟南芥(L1-4)、野生型拟南芥(WT)和T3代空载体拟南芥(GFP)移栽到塑料钵中(每盒4株苗)，于22℃、12h光照/d、相对湿度70％条件下培养，3周后将幼苗放在-10℃的冷冻箱内处理1.5h，然后在15℃复苏24h，然后在正常条件(22℃、12h光照/d、相对湿度70％)下培养2天，在胁迫后第3天观察统计试验结果。

结果如图5所示，可以看出，冷冻处理前，各株系均正常生长，冷冻处理后，野生型和空载体对照的死亡率明显高于转基因对照。

统计株系的耐冷性存活率，结果如下：

转TaSnRK2.10拟南芥(L1-4)的存活率分别为70％、70％、80％、80％，平均存活率达到75％，而野生型拟南芥和GFP的平均存活率分别为57％和50％。

转TaSnRK2.10拟南芥(L1-4)叶片的存活率分别为55％、70％、60％、50％，而野生型拟南芥和GFP的叶片的存活率分别为23％和20％。

Claims (1)

1.一种培育转基因植物的方法，为将序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因导入目的植物中，得到具有如下1）-3）中所述特征的转基因植物：

1）所述转基因植物的主根长度大于所述目的植物；

2）所述转基因植物的侧根数目大于所述目的植物；

3）所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物；所述耐逆性为耐干旱、耐盐和耐低温；

所述目的植物为拟南芥；

所述序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过重组表达载体导入所述目的植物中的； 

所述序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因为如下1）-3）中任意一种DNA分子：

1）序列表中序列1所示的DNA分子；

2）序列表中序列1的自5＇末端第84-1149位核苷酸所示的DNA分子；

3）序列表中序列1的自5＇末端第48-1166位核苷酸所示的DNA分子。

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