CN101392025B - 植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用。本发明蛋白，选自如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆相关的由(a)衍生的蛋白质。实验证明，将本发明基因导入植物细胞中，可提高植物的抗逆性，如抗旱节水、抗盐或耐寒，因此，本发明基因及其应用对培育抗旱节水、抗盐或耐寒新品种具有重要的现实意义。

Description

植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

干旱缺水是全球农业生产面临的严重问题，也是制约我国粮食生产发展的重要因素。主要粮食作物小麦的栽培需要大量的水，我国平均每生产1吨小麦需水量约500-700m³。全世界发展中国家至少有6000万公顷小麦栽培在雨养耕地，但其产量水平只有灌溉条件下的10％-50％。所以，发展抗旱节水小麦品种，以提高作物的水分利用效率，既可增加产量，又可以缓解水资源短缺的矛盾。

改良作物抗旱性对于提高农业生产力具有重大意义，受到世界各国的高度重视，近期我国启动的转基因作物新品种培育重大专项就是最好的实证。研究植物的抗旱机理、克隆抗旱相关基因、通过基因工程改良作物抗旱性是培育抗旱作物新品种的一条有效途径。虽然作物的抗旱性遗传基础复杂，克隆、转化抗旱基因获得抗旱性明显提高的新品种难度较大，但经众多科学家的共同努力，已经取得了一定的进步，涌现了不少成功的例子，如Cheng等(Molecular Breeding，2002，10：71-82)把小麦的LEA蛋白基因导入水稻，转基因植株的抗旱、耐盐性得到了明显提高；WU等(Chinese Science Bulletin，2003，48：2594-2600)将拟南芥的δ-OAT基因转入水稻中过量表达，转基因植株中脯氨酸含量明显增加，抗旱和耐盐性明显增强；Dubouzet等(PlantJ，2003，33：751-763)将水稻转录激活蛋白基因OsDRE1A导入拟南芥后，转基因植株表现了强抗旱、抗盐和耐寒特性。Hu等将OsNAC1基因导入到水稻中，转基因后代的抗旱性得到明显增强，而且不影响后代产量(Hu等2006，Proc Natl Acad Sci USA，10：71-82)。

目前，已克隆的抗旱相关基因主要包两大类，第一类为功能基因，这类基因包括低分子可溶性糖、氨基酸和小分子蛋白质等合成相关基因，以及保护细胞免受损害的酶类，如脯氨酸合成相关酶基因，包括吡咯啉-5-羧酸合成酶基因P5CS及PVAB2，吡咯琳-5-羧酸还原酶基因P5CR等；晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA)，小麦LEA蛋白基因(Ingram等1996，Annual Review of Plant Physiology and PlantMolecular Biology，47：377-403)。

第二类是调节基因，包括各种参与水分胁迫信号传递的基因，主要包括(1)参与ABA、乙烯等信号分子合成的关键酶类(Bray 1997，Trends in Plant Science，2：48-54)；(2)转录因子(Soderman等1996，Plant J，10：375-381)，如DREB(Wang等2008，Plant Mol Biol 67：589-602；Agarwal等2007，Mol GenetGenomics 277：189-198；Chen等2007，Biochem Biophys Res Commun 353：299-305；Maruyama等2004，Plant J38：982-993；Dubouzet等2003，Plant J，33：751-763)，NF-YB1(Yu等2008，Plant Cell，20：1134-1151)，HD-ATART(Nelson等2007，Proc Natl Acad Sci USA，104：16450-16455)，OsNAC1(Hu等2006，ProcNatlAcad Sci USA，10：71-82)等；(3)蛋白磷酸酶，如蛋白质磷酸酶2A和2C等，它们参与ABA信号的传递(Kwak等2002，Plant Cell，14：2849-2861；Leung等1997，Plant Cell，9：759-771；Merlot等2001，Plant J，25：295-303；Sheen1998，Proc Natl Acad Sci USA，95：975-980)。(4)蛋白磷酸激酶，植物蛋白激酶家族非常，主要包括分裂素激活蛋白激酶(MAPK)(Knetsch等1996，PlantCell，8：1061-1067)，钙依赖的蛋白激酶(CDPK)(Li等1996，Plant Cell，8：2359-2368；Sauer等2004，J Exp Bot，55，181-188；Sheen 1996，Science，274：1900-1902)和蔗糖非发酵相关蛋白激酶(SNF1(sucrose non-fermenting)relatedprotein kinase，SnRK)，其中SnRK是近期发现的参与对各种逆境反应的蛋白激酶。

SnRK家族非常庞大，根据其序列相似性和结构域特点，SnRK家族可以分为3个亚家族：SnRK1，SnRK2和SnRK3，其中SnRK1广泛存在于动植物和微生物中。研究表明SnRK1主要参与生物体内对营养缺乏的响应，而SnRK2和SnRK3是植物特有的蛋白激酶。目前，人们对SnRK3亚家族的研究相对比较多，其中对SnRK3成员中的SOS2研究尤为透彻，SOS2编码一种Na⁺/H⁺转运蛋白，该蛋白能够调节植物细胞内外钠、钾离子的平衡，其过量表达能增强转基因植株的耐盐性(Gong等2002，Plant Physiol，130：256-264；Kelner等2004，Plant Physiol，136：3255-3265)。此外，人们发现了4个SOS2类似蛋白激酶，分别参与对不同胁迫的反应，如PKS11可能参与对糖的感应(Gong等2002，J Biol Chem，277：28340-28350)，PKS6和PKS18参与ABA信号传递(Gong等2002，Plant Physiol，129：225-34)，AtCIPK1/PKS13调节对盐的耐受性(Kim等2007，Plant J，52：473-484)。小麦SnRK3成员WPK4受光、细胞分裂素和低温的诱导，而被蔗糖抑制(Ikeda等1999，Plant Physiol，121，813-820；Sano等1994，Proc Natl Acad Sci USA，91：2582-2586)。

人们对SnRK2家族研究起步较晚，但越来越多的证据表明该家族大多成员受渗透胁迫诱导表达，部分成员还参与ABA信号的传递过程(Boudsocq等2004，JBiolChem，279：41758-41766；Boudsocq等2007，Plant Mol Biol，63：491-503；Kobayashi等2004，Plant Cell，16：1163-1177)。Boudsocq在拟南芥中克隆了10个SnRK2成员，发现其中的9个成员受高渗和盐胁迫的诱导，5个参与对ABA的响应，其中OST1/SRK2.5及其直系同源基因Vicia faba AAPK参与对ABA调节的气孔关闭的控制调节(Li等2000，Science，287：300-303；Mustilli等2002，PlantCell，14：3089-99；Yoshida等2002，Plant Cell Physiol，43：1473-1483)，过量表达SnRK2.8和SnRK2.3能增强转基因植株的抗旱性(Shin等1999，Plant Cell，11：2393-405；Umezawa等2004，Proc Natl Acad Sci USA，101：17306-17311)。Kobayashi等在水稻中分离到10个SnRK2成员，称之为胁迫激活蛋白激酶(StressActivated Protein Kinase，SAPK)，研究表明这10个成员都参与对渗透胁迫的应答，其中3个受ABA诱导(Boudsocq等2004，Plant Cell，16：1163-1677)。过量表达该家族成员SAPK4能明显增强转基因植株的耐盐性(Diedhiou等2008，BMCPlant Biol，8：49)。在大豆中，人们分离到4个SnRK2成员，SPK1、SPK2、SPK3和SPK4，其表达都受渗透胁迫诱导，其中SPK3还受外源ABA的诱导(Monks等2001，Plant Cell，13：1205-1219；Yoon等1997，Mol Gen Genet，255：359-371)。Gomez-Cadenas等在小麦中克隆了1个SnRK2家族成员PKABA1，该基因受ABA和高渗透胁迫的诱导(Proc Natl Acad Sci USA，1999，96：1767-1772)，而除PKABA1外，鲜有小麦SnRK2基因家族的报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种植物抗逆相关蛋白及其编码基因。

本发明所提供的植物抗逆相关蛋白，来源于普通小麦(Triticum aestivum L.)，为如下(a)或(b)所示的蛋白：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆相关的由(a)衍生的蛋白质。

为了使(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagII	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1的自5′端第282至3215位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5＇端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述蛋白的氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基的取代、替换和/或添加，有的是由于自然发生的多态变异引起的，例如由获得蛋白质的生物的物种、个体等的差异导致；有的是由定点诱变、随机诱变等人工诱变处理引起。

本发明所提供的编码基因为如下1)、2)、3)或4)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1的自5′末端第55-1146位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；

2)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述抗逆相关蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列有90％以上同源性且编码所述抗逆相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件是，在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中序列1由1335个脱氧核糖核苷酸组成，包括54bp的5’UTR、1092bp的ORF区、173bp的3’UTR、以及16bp的多聚(A)尾巴；该基因的开放阅读框为1092bp(序列表中序列1的自5′端第55-1146位核苷酸)，编码363个氨基酸(序列表中序列2所示)。

含有上述任一所述编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有本发明基因的重组表达载体。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗逆植物的方法。

本发明所提供的培育抗逆植物的方法，是将上述任一所述的编码基因导入植物细胞中，培育得到抗逆植物。

可以采用常规方法将所述编码基因导入植物中，例如基因枪法，高压电穿孔法，脂质体法，菌转化或转染等。本发明中的具体操作是，先将基因导入载体中，得到重组表达载体，再将重组表达载体导入农杆菌中，得到含有本发明基因的重组农杆菌，再通过农杆菌将基因导入植物中。

上述抗逆植物是抗干旱和/或抗高盐的植物。

本发明方法对单子叶植物或双子叶植物均可以，单子叶植物具体可为小麦，双子叶植物具体可为拟南芥。

实验证明，将本发明基因导入植物中，提高了植物的抗逆性，如抗旱性和/或抗盐性，在干旱条件下，转入本发明基因的植物的存活率可达94％，而未转入本发明基因的野生型植物的存活率还不到70％。同时本发明基因对单子叶、双子叶植物均适用。因此，本发明基因及其应用对培育抗旱节水、抗盐农作物新品种具有重要的意义，适合于推广应用。

附图说明

图1为TaSnRK2-4与来自不同植物SnRK2成员间的关系。

图2为TaSnRK2-4在受水分胁迫、高盐、低温和ABA处理后的表达情况。

图3为TaSnRK2-4在不同发育时期的小麦幼嫩组织中的表达情况。

图4为转基因拟南芥的抗旱情况。

图5转基因拟南芥耐盐性(盐胁迫后细胞损伤情况)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、小麦中抗逆相关蛋白的编码基因TaSnRK2-4的分离

一、抗逆相关蛋白的编码基因TaSnRK2-4的分离

1、构建小麦的全长cDNA文库，按照文献(毛新国等，2005，用改进的Cap-trapper法构建拟斯卑尔脱山羊草全长cDNA文库.遗传学报，32(8)：811-817)中所述方法进行：

(1)总RNA提取及mRNA纯化，用TRIZOL提取小麦总RNA，用oligo(dT)纤维素分离纯化mRNA。

(2)第一链cDNA的合成：取10ug mRNA与引物I混合，变性后加入第一链cDNA合成的试剂，当温度升到40℃时，加入反转录酶，当反应进行到40分钟时加入引物II(第一链合成引物如下)。为得到更多全长cDNA，在第一链合成时向反应体系中加入海藻糖和山犁糖醇；为限制poly(A)尾巴的长度，以便于大规模测序，用混合引物替代传统的单一引物oligo(dT)₁₈。反应结束后用CTAB-UREA法除去糖类，沉淀cDNA/RNA。

第一链cDNA合成引物

Primer1  dAGATTGTGGTCTCCTCGAGT₁₆R

引物I   Primer2  dAGATTGTGGTCTCCTCGAGT₁₆CR

Primer3  dAGATTGTGGTCTCCTCGAGT₁₆CCR

Primer4  dAGATTGTGGTCTCCTCGAGT₁₆CTR

引物II           dAGATTGTGGTCTCCTCGAGT₁₆CY

(3)高碘酸钠氧化向上步反应管中加入高碘酸钠溶液，氧化RNA，用甘油终止反应。

(4)生物素标记离心收集高碘酸钠氧化的cDNA/RNA，清洗、晾干重新溶解后，加入新鲜配置的Biotin-hydrzide(请将其译成中文，并提供)，23℃温育14～16h，用柠檬酸钠终止反应。

(5)RNase I消化经高碘酸钠氧化后，mRNA 5’和3’端末位碱基核糖上相邻的二醇基团被氧化成为二醛基团，它们都可以和生物素结合。后期利用链霉亲和素包被的磁珠分离全长cDNA时，mRNA 3’端的生物素也可以与磁珠结合。为得到5’端完整的cDNA，必须特异地将3’端标记的生物素除去。真核生物mRNA 3’端poly(A)长度一般在100～250bp，在合成第一链cDNA时，将poly(A)的长度限制在16个碱基，因此cDNA/RNA复合体中mRNA 3’端poly(A)将以单链的形式存在，因此可以用RNase I将其特异除去。

(6)全长cDNA的捕获及单链cDNA释放先用无DNA污染的tRNA封阻磁珠(Dynal bead M-280)，室温下让cDNA/RNA和磁珠结合20min，用NaOH-EDTA洗脱cDNA/RNA。

(7)末端转移酶加尾收集单链cDNA，变性后加入末端转移反应试剂，37℃反应9分钟，终止反应。(8)第二链cDNA的合成收集单链cDNA，用LA-Taq合成第二链cDNA。待反应结束后，电泳，回收大于1kb的cDNA。

(8)酶Bsa I属于二类限制性内切酶，它的酶切位点正好处于识别位点下游的第一个碱基处，而且酶切没有碱基特异性，但对识别位点的胞嘧啶甲基化敏感。经Bsa I酶切的DNA将产生4个碱基突出的黏性末端。根据这些特性，在引物设计时引入了Bsa I、EcoR I和Xho I位点，其中第一链引物中为Bsa I和Xho I位点，第二链引物中为Bsa I和EcoR I位点。通过采取这些措施，仅用Bsa I对cDNA进行单一酶切，就可以实现cDNA的定向克隆。

(9)连接、包装及插入片段检测：收集分级后的目的cDNA片段，重新溶解于ddH₂O中，检测cDNA浓度，确定cDNA的浓度后，取适量的cDNA与载体Un iZAPII(Stratagene)连接过夜。包装后，侵染宿主菌XL1-Blue，检测滴度。

(10)质粒提取及序列测定产量，然后重复蛋白酶K消化，酚/氯仿萃取等步文库扩增后，取一定量的扩增文库用于噬粒环骤，最后将cDNA置于乙醇中沉淀过夜。环化，检测噬粒滴度，最后取适量环化后的噬粒侵染SOLR宿主细胞。

(11)将噬粒侵染过的宿主细胞涂布平板，37℃培养过夜。随即挑取阳性克隆于96孔培养板，提取质粒、测序，构建小麦全长cDNA数据库。

以水稻SAPK4(BAD18000)为源序列，搜索小麦全长cDNA数据库，得到候选克隆，测序得到目标克隆的全长序列，其序列为序列表中序列1所示，序列全长为1335bp。

分析序列1所示基因的结构，表明，其自5′末端第1-54位核苷酸为5’UTR(54bp)，第55-1146位核苷酸为开放阅读框(1092bp)，第1147-1319位核苷酸为3’UTR(173bp)，第1320-1335位核苷酸为的多聚(A)尾巴(16bp)。

该基因编码的氨基酸序列如序列表中序列2所示，由363个氨基酸残基组成。

将序列表中序列1的自5′末端第55-1146位核苷酸所示的序列与基因水稻SAPK4基因(GenBank No.AB125305)的序列进行比对，其相似性达91.7％。鉴于该基因与SAPK4具有非常高的相似性，其编码产物具有SnRK2基因家族成员的特点，故将本发明的序列表中序列1所示的基因命名为TaSnRK2-4，由其编码的蛋白(序列表中序列2所示)命名为TaSnRK2-4。

以蛋白TaSnRk2-4为源序列，搜索NCBI公共数据库中的蛋白质库，下载与之相似性较高的序列。用BioEdit软件将下载序列及TaSnRk2-4组装为单一的FASTA文件，提交到欧洲生物信息学研究所网站(www.ebi.ac.uk/clustalw)上进行多重比对(multialigment)，下载phylip格式的输出文件，用分子进化分析软件包PHYLIP构建进化树。进化树结果表明，本发明蛋白TaSnRk2-4与单子叶植物水稻和玉米中的同源序列聚在一起，而来自双子叶植物的同源序列聚在一起(图1，At，Arabidosis thaliana(拟南芥)；Bn，Brassica napus(油菜)；Cs，Camellia sinensis(茶)；Fs，Fagus sylvatica(欧洲水青冈)；Gm，Glycine max(大豆)；Mt，Medicago truncatula(苜蓿)；Nt，Nicotiana tabacum(烟草)；0s，Oryza sativa(水稻)；Vv，Vitis vinifera(葡萄)；Zm，Zea mays(玉米))。

二、植物抗逆相关基因TaSnRK2-4的表达特征

(一)植物抗逆相关基因TaSnRK2-4对不同逆境胁迫的应答情况

以抗旱小麦(旱选10号)为实验材料。

挑选籽粒饱满、大小一致的抗旱小麦种子(旱选10号)，将其置于光照培养箱中，在20℃、12h/d培养，水培至一叶一心，然后进行逆境胁迫处理。水分胁迫：除去培养皿中的水分，加入PEG-6000(渗透势为-0.5MPa)水溶液；高盐胁迫：除去培养皿中的水分，加入250mM NaCl水溶液；低温胁迫：直接将培养皿移至4℃光照培养箱培养；外源ABA处理：采用50μM ABA溶液进行喷雾直至叶片全部湿润。分别在不同胁迫处理的0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h采集叶片，液氮速冻，-70℃保存备用。对照一直采用无离子水培养。

用TRIZOL提取小麦总RNA，以MMLV反转录试剂盒合成第一链cDNA(Invitrogen)，采用实时定量PCR(Real-time Quantitative PCR，qRT-PCR)的方法检测基因TaSnRK2-4对各种逆境胁迫的响应情况。用组成型表达的Tubulin基因作为内参，设计了qRT-PCR的引物。

Tubulin   F 5′-GAGGCCTCGTGTGGTCGCTTTGT-3′

R 5′-GCCCAGTTGTTACCCGCACCAGA-3′

TaSnRK2-4 F 5’-GGTTCATGCAAGCGGAGAGC-3’

R 5’-AACCAAAACCAAACAGAAGCAAAC-3’

按照Livak and Schmittgen提出的公式计算：TaSnRK2-4基因在4种处理下的表达量为对照的N倍，N＝2^-ΔΔCT，ΔΔCT＝(CT_{(Target，Time x)}—CT_{(Tubulin，Time x)})—(CT_{(Taregt，Time O)}—CT_{(Tubulin，Time O)})。

其中，CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。PCR循环在到达CT值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期(对数期)，此时微小误差尚未放大，因此CT值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的CT值是恒定的。

time x代表不同的处理时间点；time 0代表处理的零点；CT_{(Taregt，Time x)}为经过胁迫处理x时间时，小麦中TaSnRK2-4基因的表达量；CT_{(Tubulin，Time x)}为经过胁迫处理x时间时，小麦中Tubulin基因的表达量；CT_{(Target，Time 0)}为未开始胁迫处理时，小麦中TaSnRK2-4基因的表达量；CT_{(Tubulin，Time 0)}为未开始胁迫处理时，小麦中Tubulin基因的表达量。

实验设3次重复，结果取平均数，结果如图2所示(A为ABA处理，B为NaCl处理，C为PEG处理，D为低温处理)。相对表达量即为N值。结果表明，TaSnRK2-4参与对4种胁迫处理的响应，其中对PEG和NaCl胁迫反应比较敏感，对低温处理反应相对比较缓慢，对ABA处理反应比较弱。

(二)植物抗逆相关基因TaSnRK2-4在小麦不同发育时期的表达量

以旱选10号为实验材料。

分别以水培幼苗的根、叶，大田中正常生长小麦拔节期心叶和抽穗期的幼穗为材料，提取总RNA，用MMLV反转录试剂盒合成第一链cDNA，采用qRT-PCR的方法检测TaSnRK2-4基因在不同发育时期不同幼嫩组织中的表达情况，所用的引物序列同前。

实验设3次重复，结果如图3所示(以幼苗期叶中的表达为基准，其它发育时期和其它组织较幼苗叶中的基因的表达水平为相对表达量)。结果表明，TaSnRK2-4在幼苗根中和拔节期的心叶中表达量比较高，在苗期的幼叶和抽穗期的幼穗中表达量比较低。

实施例2、基因TaSnRK2-4在拟南芥中的应用

一、构建转基因TaSnRK2-4拟南芥

以pPZP211为原始载体(GI：506685)(Hajdukiewicz等(1994)，Plant MolBiol，25：989-994)(中国农业科学院作物科学研究所)，在pPZP211的多克隆位点插入CaMV 35S启动子(CaMV 35S启动子序列为Genbank number为AB303068的序列中第1035—1815位核苷酸)，得到中间载体pCHF3，然后在pCHF3的Sal I和Pst I位点间插入GFP(BAG13014)的开放阅读框，最终得到双元载体pCH3-GFP。

根据基因TaSnRK2-4全长序列设计引物：上游引物f1：

gaga

GGGATGGAGAAGTACGAGGCG(BamH I位点)，下游引物r1：

gaga

GATATGCGTAGCGAGCTCATGC(Sal I位点)，其中下游引物3′端位于基因终止密码子的上游。

提取普通小麦(Triticum aestivum L.)的mRNA，以CCAACCTACCGACCAACGAAC和AACCAAAACCAAACAGAAGCAAAC为引物，用RT-PCR的方法获得小麦中基因TaSnRK2-4的全长cDNA；以基因TaSnRK2-4的全长cDNA序列为模板，以上述f1和r1为引物，采用高保真酶Pfu扩增目标基因，将扩增产物用限制性内切酶BamH I和Sal I进行酶切，回收目标基因片段；用限制性内切酶BamH I和Sal I酶切双元载体pCH3-GFP，回收目的载体片段；将回收的目标基因片段和目的载体片段进行连接，筛选，得到含有序列表中序列1第55-1146位核苷酸(即基因TaSnRK2-4的开放阅读框)的阳性重组载体pCH3-TaSnRK2-4/GFP。利用农杆菌介导的方法将基因TaSnRK2-4转到拟南芥中。

用加有卡那霉素的MS培养基筛选转基因植株，在荧光显微镜下观测拟南芥幼根中TaSnRK2-4-GFP融合蛋白的表达情况。

根据荧光的强弱挑选融合蛋白表达量较高的转基因株系繁种、加代，待得到转基因纯系后，验证TaSnRK2-4的功能。以未转入任何载体的野生型拟南芥、转入空载体pCH3-GFP的拟南芥为对照。

二、转基因拟南芥的抗旱性检测

称等量的栽培土(蛭石和腐殖土的比例为1:1)于方形塑料钵中，浇水至饱和后，将7日龄的拟南芥幼苗(包括转基因株系、野生型对照、转空载体对照)移栽到塑料钵中，于22℃、12h光照/d、相对湿度70％条件下控水培养，待野生型拟南芥和转空载体的拟南芥严重萎蔫后复水，于复水后第3天照相、统计存活率。

试验设3次重复，结果取平均数。

结果表明转入基因TaSnRK2-4的拟南芥的抗旱性明显好于野生型和转pCHF3/GFP载体拟南芥(图4，A为复水前，B为复水后，WT代表野生型，L1～L6为6个转TaSnRK2-4基因株系，CK为转pCHF3/GFP载体的对照)。

存活率：转基因植株的存活率平均为94％，而野生型拟南芥和转入空载体的对照存活率均不到70％。

三、转基因拟南芥的抗盐性检测

将在MS培养基(无抗生素)上生长7天的拟南芥幼苗(转基因拟南芥幼苗、野生型拟南芥幼苗及转空载体的拟南芥幼苗)转移到不锈钢筛网上，用250mM的NaCl溶液处理拟南芥幼苗(将不锈钢筛子放在塑料盒中，加入NaCl溶液，溶液量以淹没拟南芥根部不淹没拟南芥叶片为宜)，待野生型和转空载体的拟南芥植株出现盐胁迫症状时，迅速将拟南芥幼苗转移到蒸馏水中清洗，然后将其放入盛有蒸馏水的离心管中(20ml)，于摇床上振荡30min，用电导仪测量离心管中水的电导率(EC1)，然后将盛有拟南芥幼苗的离心管放在沸腾的水浴锅中煮沸处理30min，取出离心管，待冷却至室温后，测量离心管中水的电导率(EC2)，然后计算相对电导率。

相对电导率的计算公式如下：相对电导率＝EC1/EC2X100％。

实验设3次重复。结果如图5所示(WT表示未转入任何载体的空对照，CK表示转入空载体的对照，L1-6表示转入TaSnRK2-4基因株系)，转入TaSnRK2-4基因植株经盐胁迫后相对电导率明显小于野生型拟南芥和空载体对照，说明在相同盐胁迫条件下，转基因拟南芥株系比野生型和转空载体对照的损伤较小，表明转TaSnRK2-4基因能提高植物的耐盐性。

序列表

<160>2

<210>1

<211>1335

<212>DNA

<213>小麦属普通小麦(Triticum aestivum L.)

<400>1

<210>2

<211>363

<212>Pro

<213>小麦属普通小麦(Triticum aestivum L.)

<400>2

Claims (10)

1.一种蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1的自5′末端第55-1146位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；

2)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体。

5.含有权利要求2或3所述编码基因的重组菌。

6.含有权利要求2或3所述编码基因的转基因细胞系。

7.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒。

8.一种培育抗逆植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因导入植物细胞中，培育得到抗逆植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过权利要求4所述的重组表达载体导入所述植物中的。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述抗逆植物是抗干旱和/或耐盐的植物。

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