CN104017061B - 转录因子ZmbZIP17及编码基因与其在响应逆境中的应用 - Google Patents

转录因子ZmbZIP17及编码基因与其在响应逆境中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104017061B
CN104017061B CN201310065802.6A CN201310065802A CN104017061B CN 104017061 B CN104017061 B CN 104017061B CN 201310065802 A CN201310065802 A CN 201310065802A CN 104017061 B CN104017061 B CN 104017061B
Authority
CN
China
Prior art keywords
zmbzip17
sequence
plant
dna molecular
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201310065802.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104017061A (zh
Inventor
邓馨
杨艳歌
吕维涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Botany of CAS
Original Assignee
Institute of Botany of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Botany of CAS filed Critical Institute of Botany of CAS
Priority to CN201310065802.6A priority Critical patent/CN104017061B/zh
Publication of CN104017061A publication Critical patent/CN104017061A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104017061B publication Critical patent/CN104017061B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种转录因子ZmbZIP17及编码基因与其在响应逆境中的应用。本发明提供的基因，称为ZmbZIP17，来源于玉米（Zea mays L.），是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，ZmbZIP是与植物耐旱及抗内质网胁迫相关的基因；对于培育耐旱性及内质网胁迫抗性提高的作物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定。

Description

转录因子ZmbZIP17及编码基因与其在响应逆境中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种转录因子ZmbZIP17及编码基因与其在响应逆境中的应用。
背景技术
随着全球水资源的缺乏和极端气候事件频率的不断上升，干旱对作物的产量和品质的负作用日趋显著。植物遭受逆境后会引起内质网中未折叠和错误折叠蛋白的积累，从而导致内质网胁迫（ERstress）。脱落酸（ABA）是一个响应胁迫信号转导的关键调控因子。在胁迫条件下，ABA可调控气孔关闭和基因表达，进而调控植物的耐逆性。玉米是重要的粮食、饲料和能源作物，然而许多玉米产区干旱和盐渍化等问题严重影响其生长和产量。因此，通过分子操作技术提高玉米及其他作物的耐旱性以及内质网胁迫变得日趋重要。
在植物防卫反应和逆境胁迫应答过程中转录因子扮演着非常重要的角色。操纵一个转录因子就可通过它促使多个功能基因发挥作用，从而达到使植株性状获得综合改良的效果，因此导入或改良一个转录因子是提高作物抗逆性的非常有效的途径。
发明内容
本发明的一个目的是提供转录因子ZmbZIP17及编码基因。
本发明提供的蛋白，称为ZmbZIP17，来源于玉米（Zeamays），是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。
上述蛋白中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。
上述DNA分子是如下（1）-（4）中任意一种的DNA分子：
（1）编码区为序列表中序列1自5’末端第120-1811位核苷酸所示的DNA分子；
（2）编码区为序列表中序列3自5’末端第1128-2819位核苷酸所示的DNA分子；
（3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；
（4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有70%以上同源性且编码与植物耐逆性相关蛋白和/或RNA的DNA分子。
上述严格条件下为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。
上述序列表中的序列1由1914个碱基组成，其开放阅读框架（ORF）为自5′末端第120-1811位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的ZmbZIP17。
含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。
上述重组载体具体为将编码上述蛋白的DNA分子的表达盒（序列3）插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。
在本发明的实施例中，表达载体具体为pLeela；上述重组载体为将编码上述蛋白的DNA分子表达盒插入pLeela的attR1和attR2重组位点间得到的载体；编码上述蛋白的DNA分子表达盒的核苷酸序列为序列表中的序列3。
用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pBin19、pBI121、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300或其它衍生植物表达载体。
使用ZmbZIP17基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子（pUbi）等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
扩增上述DNA分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。
在本发明的实施例，引物对由如下序列所示的引物组成：5'-CACCAGATCGGCTGAGCCAAGG-3'和5'-CAGACCTAAAGGTGAGGGCTATGG-3'。
上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物耐逆性中的应用也是本发明保护的范围；在上述应用中所述调节植物耐逆性具体为提高植物耐逆性；所述耐逆性具体为耐内质网胁迫或耐旱性；
上述植物具体为双子叶植物或单子叶植物，上述双子叶植物进一步具体为拟南芥。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，为将编码上述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
上述方法中，所述耐逆性为耐内质网胁迫或耐旱性；
上述编码上述蛋白的DNA分子通过上述的重组载体导入目的植物。
上述方法中，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物具体为拟南芥。
上述耐内质网胁迫通过如下1）或2）体现：
1）通过DTT胁迫作用下转基因植物的叶片大于所述目的植物体现；具体为转基因植物的叶片宽度大于所述目的植物。
2）通过DTT胁迫作用下转基因植物的BiP1、BiP2、BiP3、CNX1、ERdj3A、CRT1、GRP94基因至少一个的表达量大于所述目的植物体现。
上述耐旱性通过如下a）或b）体现：
a）通过PEG胁迫作用下转基因植物的存活率高于大于所述目的植物体现；
b）通过ABA胁迫作用下转基因植物的ADH1、Rab18、RD29A基因至少一个的表达量高于所述目的植物体现。
携带有本发明的与植物耐旱、内质网应激相关蛋白编码基因ZmbZIP17的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、大豆、烟草、玉米、油菜、高粱、棉花等农作物，也可以是苜蓿、三叶草、冰草等牧草以及草莓、西红柿等果蔬花卉植物。
本发明的实验证明，本发明从玉米中筛选到一个响应内质网应激以及受ABA诱导表达的ZmbZIP17基因，将该基因导入野生型拟南芥，得到转ZmbZIP17拟南芥，与野生型拟南芥相比，该转ZmbZIP17拟南芥的内质网胁迫应激能力以及耐旱性明显提高，同时可以诱导和提高胁迫相关的Marker基因的表达。说明ZmbZIP17是与耐内质网胁迫和耐旱性相关的蛋白，参与胁迫响应。因此ZmbZIP是与植物耐旱及耐内质网胁迫相关的基因；对于培育耐旱性及耐内质网胁迫的作物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
附图说明
图1为ZmbZIP17基因在玉米中经干旱、ABA、及内质网应激过程中的表达
图2为T2代转ZmbZIP17拟南芥的RT-PCR检测表达量的结果
图3为T2代转ZmbZIP17拟南芥的耐PEG鉴定结果
图4为T2代转ZmbZIP17拟南芥的耐内质网胁迫鉴定结果
图5为T2代转ZmbZIP17拟南芥的ABA胁迫后响应基因的表达
图6为T2代转ZmbZIP17拟南芥的内质网胁迫后响应基因的表达
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、ZmbZIP17基因的获得及在玉米胁迫处理中的表达
1、ZmbZIP17基因的克隆
提取三叶一心期的玉米自交系B73（ZeamaysL.；ZmbZIP60mRNAissplicedinmaizeinresponsetoERstress，BMCResearchNotes（2012）5：144.；公众可从中国科学院植物研究所获得。）叶片的总RNA并以其为模板，RNase抑制剂（购自Takara公司），反转录酶SuperScriptTMIIIReverseTranscriptase（购自Invitrogen公司）。反转录反应体系为：
（1）DNA消化：
10ul体系
条件：37℃30min
（2）反转录：25ul体系
充分解链，加入TotalRNA10ul
OligodT1ul
DEPC-H202.5ul
条件：70℃温育5min，冰上放置5min。
条件：42℃温育1h
反转录得到的cDNA稀释10倍作为模板，用引物5’-CACCAGATCGGCTGAGCCAAGG-3'，5'-CAGACCTAAAGGTGAGGGCTATGG-3'，PhusionHigh-FidelityDNAPolymerase（NEB）进行基因全长的扩增，反应条件为：先98℃预变性45sec，然后98℃变性10sec，54℃退火20sec，再72℃延伸1.5min，共40个循环；最后72℃延伸10min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到大小为1690bp左右的PCR产物；回收该PCR产物条带。
将PCR产物与载体pENTR/D-TOPO（购自Invitrogen公司）连接，获得中间载体ZmbZIP17-pENTR。
经过测序，该PCR产物具有序列表中序列1中自5’末端第100-1816位核苷酸，该PCR产物所示的基因命名为ZmbZIP17，该基因的编码区为序列1中自5’末端第120-1811位核苷酸，该基因编码的蛋白命名为ZmbZIP17，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。该中间载体为将序列1中自5’末端第100-1816位核苷酸导入含有拓扑异构酶的线性载体pENTR/D-TOPO得到的载体。
2、ZmbZIP17基因在玉米胁迫处理中的表达
对三叶一心期的玉米苗进行几种处理：
将新鲜玉米苗在含有100μMABA、或2mMDTT、或2μg/mLTM的MS培养基中培养0h、2h、6h、12h；
根据干旱程度将干旱处理分为4种：CK、轻度（FA）、中度（MD）和重度（SD）。新鲜玉米植株自然脱水，通过监测土壤水分含量确定干旱程度。CK表示土壤水分含量在40-50%之间，FA表示土壤水分含量在15-20%之间，MD表示土壤水分含量在7-10%之间、SD表示土壤水分含量在3-5%之间。
以未经任何处理的新鲜植株（CK）为对照。
分别各种处理的玉米的地上部总RNA、反转录获得cDNA。用基因特异性引物Primer1F：5'GAAGCATGTATAGGGAGGAGG3'和Primer1R：5'TCTTGAGTGAAGTTCTGTGACG3'进行qPCR扩增。并以β-tubulin基因为内参，扩增引物为5'GCTATCCTGTGATCTGCCCTGA3’和5'CGCCAAACTTAATAACCCAGTA3'。反应体系为：cDNA1μl，10μL2×SYBRGreenMasterMix，引物各0.5μl，ddH2O8.5μl。程序为：95℃预变性30sec，95℃变性5sec，55℃退火30sec，72℃延伸20min，共40个循环。
结果如图1所示，（a）为DTT处理,（b）为TM处理,（c）为ABA处理，（d）为干旱处理，其中d，轻度（FA）,中度（MD），重度（SD）处理；可以看出该基因明显受ABA、TM、DTT诱导，说明ZmbZIP17可能响应ERstress以及ABA信号。
实施例2、转ZmbZIP17拟南芥的获得及其功能研究
一、转ZmbZIP17拟南芥的获得
1、重组载体pLeela-ZmbZIP17的获得
将实施例1的1构建的中间载体ZmbZIP17-pENTR通过LR反应（LR克隆酶，购自Invitrogen公司）将实施例1的PCR产物导入植物表达载体pLeela（AnovelroleforhistonemethyltransferaseKYP/SUVH4inthecontrolofArabidopsisprimaryseeddormancy，NewPhytologist（2012）193:605-616；公众可从中国科学院植物研究所获得。），同源重组得到重组载体。
经过测序，该重组载体为将序列表中序列3所示的DNA分子插入植物表达载体pLeela的attR1和attR2重组位点间得到的载体，该重组载体受35S启动子驱动，命名为pLeela-ZmbZIP17。
序列表中序列3所示的DNA分子为ZmbZIP17基因表达盒，包括CaMV35Sq启动子、ZmbZIP17基因和pA35S终止子，其中，CaMV35Sq启动子为序列3自5’末端第1-698位核苷酸、ZbZIP17基因为序列3自5’末端第1128-2819位核苷酸（对应序列1自5’末端第120-1811位核苷酸）、pA35S为序列3自5’末端第2824-3042位核苷酸。
2、重组农杆菌的获得
将上述重组载体pLeela-ZmbZIP17转化到农杆菌Gv3101（pMP90RK）（AgrobacteriumtumefaciensstrainGV3101（pMP90RK）；公众可从中国科学院植物研究所获得，记载在如下文献中：BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation,MBevanin，NucleicAcidsResearch（1984）12：8711-8721.）
细胞中，用含有50μg/ml硫酸卡那霉素、50μg/ml庆大霉素、50μg/ml利福平、50μg/mL的羧苄霉素的YEB培养基进行筛选，得到重组菌Gv3101（pMP90RK）/pLeela-ZmbZIP17
提取重组菌的质粒送去测序，结果该质粒为pLeela-ZmbZIP17，说明为阳性重组菌。
3、转ZmbZIP17拟南芥的获得及筛选
1）转ZmbZIP17拟南芥的获得
将重组菌Gv3101（pMP90RK）/pLeela-ZmbZIP17采用花序浸泡法转化野生型拟南芥Col-0（ecotypecolumbia，Arabidopsisthaliana；公众可从中国科学院植物研究所获得，记载在如下文献中：Arabidopsis,ausefulweed.MeyerowitzEM，Cell（1989）56：263-270.），得到T0代转ZmbZIP17拟南芥。
2）转ZmbZIP17拟南芥的筛选
取T0代转ZmbZIP17拟南芥种子播种于含有100μg/ml羧苄青霉素钠的MS培养基上，将具有抗性的成活幼苗移至温室培养（培养温度22℃，光周期16/8小时），收集15株T1代转ZmbZIP17拟南芥种子并播种于含100μg/ml羧苄青霉素钠的MS培养基中，选取3株分离比为3：1的T1代转ZmbZIP17拟南芥的成活幼苗（5-10棵）移至温室培养，收集T2代转ZmbZIP17拟南芥种子并播种于含100μg/ml羧苄青霉素钠的MS培养基中，不发生分离转基因拟南芥即纯合体。T2代转ZmbZIP17拟南芥纯合体株系为：2-2（OE-2）、10-6（OE-10）、12-4（OE-12）。
3）检测转基因拟南芥中ZmbZIP17的表达
将3周苗龄的T2代转ZmbZIP17拟南芥提取RNA,反转录得到的cDNA稀释10倍作为模板（方法同实施例1的1），引物同qPCR。以野生型拟南芥（WT）为对照。
反应体系（10ul）：
94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸20sec，共35个循环；最后再72℃延伸10min。
并以Actin1基因为内参，扩增引物见表1。
检测结果如图2所示，OE-2、OE-10和OE-12为T2代转ZmbZIP17拟南芥的3个株系，WT为野生型拟南芥，Actin1为内参；可以看出，未转基因的野生型烟草（WT）中没有扩增出目的条带，T2代转ZmbZIP17拟南芥株系：OE-2、OE-10、OE-12中，皆有192bp的目的条带，说明ZmbZIP17在这3个株系均表达，而野生型没有ZmbZIP17表达。
二、转ZmbZIP17拟南芥耐旱研究
1、耐旱和耐内质网胁迫（ERstress）
将T2代转ZmbZIP17拟南芥株系：OE-2、OE-10、OE-12和野生型拟南芥（WT）种子播于MS培养基上，4℃春化3天后，培养在22℃、50%湿度、光照16h和黑暗8h的条件下，3天后将小苗进行分别转移至含40%PEG的MS培养基和含有2mM二硫苏糖醇（DTT）的MS培养基上，分别模拟干旱胁迫和内质网胁迫，4周后拍照记录结果。每个株系6株，实验共三次重复。
在40%PEG模拟的干旱胁迫条件下，结果如图3所示，野生型拟南芥全部死亡，存活率为0；T2代转ZmbZIP17拟南芥株系：OE-2、OE-10、OE-12存活率分别为16.67%、50.0%、33.3%。
在DTT诱导的内质网胁迫下，结果如图4所示，a为表型，b为叶宽的定量结果；可以看出，野生型拟南芥的叶宽为0.76cm，T2代转ZmbZIP17拟南芥株系：OE-2、OE-10、OE-12的叶宽分别为2.00cm、2.19cm、2.06cm；可以看出，T2代转ZmbZIP17拟南芥叶片比野生型大。
以上结果说明，T2代转ZmbZIP17拟南芥比野生型拟南芥具有明显的耐旱和耐内质网胁迫（ERstress）优势，说明ZmbZIP17过表达可以引起植物耐旱和耐内质网胁迫（ERstress）优势。
2、ABA胁迫和内质网胁迫响应的Marker基因在转ZmbZIP17拟南芥的表达
干旱胁迫：将3周苗龄的T2代转ZmbZIP17拟南芥株系：OE-10、野生型拟南芥（WT）种子播于MS培养基上，4℃春化3天后，培养在22℃、50%湿度、光照16h和黑暗8h的条件下，3天后将小苗进行转移至含100μMABA的MS培养基上培养处理3h，模拟干旱胁迫。每个株系20株，实验共三次重复。以未进行任何胁迫的为对照组（CK）。
内质网胁迫：将3周苗龄的T2代转ZmbZIP17拟南芥株系：OE-2、OE-10和野生型拟南芥（WT）种子播于MS培养基上，4℃春化3天后，培养在22℃、50%湿度、光照16h和黑暗8h的条件下，3天后将小苗进行转移至含有2mM二硫苏糖醇（DTT）的MS培养基上培养3h，模拟内质网胁迫。每个株系20株，实验共三次重复。以未进行任何胁迫的为对照组（CK）。
提取上述各组的植物株系的RNA,反转录得到的cDNA后稀释10倍作为模板（方法同实施例1的1），用表1所示的引物进行PCR扩增，反应体系同本实施例的一的3的3）；用来检测ABA胁迫响应Marker基因ADH1、Rab18、RD29A（3个基因是已知的与ABA及抗旱相关的基因）的相对表达量和内质网胁迫响应Marker基因BiP1、BiP2、BiP3、CNX1、ERdj3A、CRT1、GRP94(7个基因是已知的与内质网胁迫相关的基因）的相对表达量。以拟南芥Actin1基因为内参。
表1为内质网胁迫和ABA胁迫响应mark基因引物
1）ABA胁迫响应Marker基因在T2代转ZmbZIP17拟南芥的表达
结果如图5所示：a为ADH1、b为Rab18、c为RD29A
未进行任何胁迫对照组（CK）中：
将野生型拟南芥的ADH1、Rab18、RD29A基因的相对表达量分别视为本底表达量1；
T2代转ZmbZIP17拟南芥株系OE-10的ADH1、Rab18、RD29A的相对表达量分别是野生型中相应基因表达量的29.45、1.44、30.91倍。
ABA胁迫组中：
野生型拟南芥的ADH1、Rab18、RD29A的相对表达量分别为221.32、2.17、2091.02；
T2代转ZmbZIP17拟南芥株系：OE-10的ADH1、Rab18、RD29A的相对表达量分别为533.74、5.21、6165.49。
2）DTT胁迫响应mark基因在T2代转ZmbZIP17拟南芥的表达
结果如图6所示：a为BiP1、b为BiP2、c为BiP3、d为CNX1、e为ERdj3A、f为CRT1、g为GRP94；
未进行任何胁迫对照组（CK）中：
将野生型拟南芥的BiP1、BiP2、BiP3、CNX1、ERdj3A、CRT1、GRP94基因的相对表达量分别视为本底表达量1；
T2代转ZmbZIP17拟南芥株系：OE-2的BiP1、BiP2、BiP3、CNX1、ERdj3A、CRT1、C1RP94的相对表达量分别为5.45、2.14、4.06、3.31、1.69、2.44、5.31；
T2代转ZmbZIP17拟南芥株系：OE-10的BiP1、BiP2、BiP3、CNX1、ERdj3A、CRRT1、CRP94的相对表达量分别为3.64、2.95、53.16、4.22、2.75、2.77、6.66。
DTT胁迫组中：
野生型拟南芥的iP1、BiP2、BiP3、CNX1、ERdj3A、CRT1、GRP94的相对表达量分别为4.93、8.95、15.77、4.04、1.54、2.53、2.06；
T2代转ZmbZIP17拟南芥株系：OE-2的BiP1、BiP2、BiP3、CNX1、ERdj3A、CRT1、GEP94的相对表达量分别为62.03、23.84、77.17、28.35、9.38、3.41、28.35；
T2代转ZmbZIP17拟南芥株系：OE-10的ZiP1、BiP2、BiP3、CNX1、ERdj3A、CRT1、GRP94的相对表达量分别为93.20、124.57、2272.20、78.35、16.45、10.89、102.77。
可以看出转ZmbZIP17拟南芥明显受ABA、DTT诱导，可以引起参与ABA途径的胁迫和内质网胁迫相关基因表达量的提高，说明ZmbZIP17参与ABA途径的胁迫和内质网胁迫。
综上所述，ZmbZIP17过表达植株的耐旱性及耐内质网胁迫明显优于未转基因的植株，说明ZmbZIP17是与植物耐旱及耐内质网胁迫相关的蛋白。

Claims (10)

1.一种蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。
3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子是如下(1)或(2)所示：
(1)编码区为序列表中序列1自5’末端第120-1811位核苷酸所示的DNA分子；
(2)编码区为序列表中序列3自5’末端第1128-2819位核苷酸所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：
所述重组载体为将权利要求2或3所述DNA分子插入表达载体中，得到表达权利要求1所述蛋白的重组载体。
6.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物耐逆性中的应用；所述耐逆性为耐内质网胁迫或耐旱性。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
8.一种培育转基因植物的方法，为将编码权利要求1所述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物；所述耐逆性为耐内质网胁迫或耐旱性。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述编码权利要求1所述蛋白的DNA分子通过权利要求4或5所述的重组载体导入目的植物。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。
CN201310065802.6A 2013-03-01 2013-03-01 转录因子ZmbZIP17及编码基因与其在响应逆境中的应用 Expired - Fee Related CN104017061B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310065802.6A CN104017061B (zh) 2013-03-01 2013-03-01 转录因子ZmbZIP17及编码基因与其在响应逆境中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310065802.6A CN104017061B (zh) 2013-03-01 2013-03-01 转录因子ZmbZIP17及编码基因与其在响应逆境中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104017061A CN104017061A (zh) 2014-09-03
CN104017061B true CN104017061B (zh) 2016-08-03

Family

ID=51434104

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310065802.6A Expired - Fee Related CN104017061B (zh) 2013-03-01 2013-03-01 转录因子ZmbZIP17及编码基因与其在响应逆境中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104017061B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106906224A (zh) * 2017-05-04 2017-06-30 安徽农业大学 一种玉米抗逆相关基因ZmDi19‑5及其应用
CN110684088B (zh) * 2018-07-04 2022-03-01 中国科学院植物研究所 蛋白ZmbZIPa3及其编码基因在调控植物生长发育与耐逆性中的应用
CN113773374B (zh) * 2020-06-04 2024-05-28 中国科学院植物研究所 转录因子ZmbZIPa6及其编码基因与应用
CN113832160B (zh) * 2020-06-08 2023-10-27 中国科学院植物研究所 ZmbZIPf3基因及其编码的蛋白和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1273483C (zh) * 2002-07-30 2006-09-06 中国农业科学院生物技术研究所 一个玉米bZIP类转录因子及其编码基因与应用
CN101591383A (zh) * 2008-05-27 2009-12-02 中国农业科学院作物科学研究所 一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN104017061A (zh) 2014-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Shah et al. Piercing and incubation method of in planta transformation producing stable transgenic plants by overexpressing DREB1A gene in tomato (Solanum lycopersicum Mill.)
Yarra et al. Overexpression of a wheat Na+/H+ antiporter gene (TaNHX2) enhances tolerance to salt stress in transgenic tomato plants (Solanum lycopersicum L.)
US9809827B2 (en) Transgenic maize
CN102191262B (zh) 一种rna干扰载体及其应用
CN101736014A (zh) 水稻生长素运输蛋白基因OsPIN2的基因工程应用
CN110643618A (zh) 小桐子MYB类转录因子JcMYB16基因及其在提高植物抗旱性中的应用
Xiu et al. Improvement and transcriptome analysis of root architecture by overexpression of Fraxinus pennsylvanica DREB2A transcription factor in Robinia pseudoacacia L.‘Idaho’
CN104017061B (zh) 转录因子ZmbZIP17及编码基因与其在响应逆境中的应用
CN104059137B (zh) GsNAC74及其编码基因在培育耐逆性植物中的应用
Yang et al. Genetic transformation and expression of transgenic lines of Populus x euramericana with insect-resistance and salt-tolerance genes
CN103710357B (zh) 紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2及其应用
CN116891862B (zh) 一种沟叶结缕草耐盐基因ZmLA1、蛋白及其应用
CN105647940B (zh) OsGRF6基因提高水稻产量的方法及其应用
CN107325161B (zh) 一种与耐低氮胁迫和高盐胁迫相关的蛋白及其编码基因与应用
CN102464708B (zh) 与植物抗逆性相关的蛋白及其编码基因与应用
CN106397556B (zh) 植物抗旱相关蛋白ZmNAC111及其编码基因与应用
CN105237631B (zh) 一种来源于羊草与抗寒相关的蛋白及其编码基因与应用
CN103602688B (zh) 菊芋Na+/H+逆向转运蛋白基因HtNHX1和HtNHX2及其应用
CN104278053B (zh) 一种提高植物耐旱能力的方法
CN105175519B (zh) 蛋白srl2在培育叶卷曲水稻中的应用
CN103614385B (zh) 一个基因kt525在提高植物耐逆性上的应用
CN103709237B (zh) 植物光合作用相关蛋白OsPSF1及其编码基因和应用
CN104120134B (zh) GsHSFB2b蛋白在培育耐逆性转基因植物中的应用
CN105624172A (zh) 水稻锌指蛋白基因zfp214的基因工程应用
CN107988222B (zh) 厚藤高盐、脱水诱导型启动子IpDHN-PRO及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160803

Termination date: 20180301

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee