CN105624172A - 水稻锌指蛋白基因zfp214的基因工程应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及水稻锌指蛋白基因ZFP214的抗旱性基因工程应用。该基因的cDNA序列如SEQ？ID？NO.1，ZFP214参与水稻耐旱响应，过量表达ZFP214可以提高水稻的耐旱性，并能促进植株生长，提高株高和穗粒数，利于水稻抗逆性遗传改良。

Description

水稻锌指蛋白基因ZFP214的基因工程应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及水稻TFⅢA型锌指蛋白基因ZFP214的抗旱性基因工程应用。
技术背景
TFⅢA型锌指蛋白可以通过结合特异DNA、RNA序列或者与其他蛋白质互作，调控下游基因的表达，广泛存在于真核生物界。已有研究表明，锌指蛋白的主要参与了植株的生长发育和胁迫应答过程(刘强,2000)。
水稻中参与生长发育的TFⅢA型锌指蛋白报道的较少，发现也较晚。Wuetal.(2008)分析了一个不抽穗水稻突变体rid1，通过TAIL-PCR的方法鉴定出该突变基因编码一个C2H2型锌指蛋白，包含3个锌指结构域，命名为RID1(RiceIndeterminate1)，它在拟南芥中没有同源基因。T-DNA敲除突变体rid1生长大于500天时，仍然不抽穗。在突变体中，一些植物调控开花相关基因的表达明显受到抑制，尤其是Ehd1/Hd3a途径和一系列RFT家族同源基因。RID1对开花的调控不依赖昼夜节律，是在分子水平发挥作用，一方面调控发育时期的转换，也就是水稻从营养生长向生殖生长的转换；另一方面Hd3a/RFL1/FTL复合体是诱导开花的关键，其中任何元件的功能缺失都将导致不开花这一表型，一旦RID1激活了发育时期的转变，开花信号、多种调控途径以及FT-like蛋白都将诱导水稻开花。水稻中另外一个参与生长发育的TFⅢA型单锌指蛋白STAMENLESS1(SL1)也是调控花器官发育的因子，和拟南芥JAG亲缘关系最近，受SPW1/OsMADS16表达量的调控。突变体sl1中颖壳和雄蕊发育成心皮，造成无雄蕊、颖壳畸形和心皮数目增多等表型，过量表达SL1使转基因水稻矮化，小花变小，雄蕊增多一个以及类浆片结构增多(Xiaoetal.,2009)。最近研究表明，编码单锌指蛋白的基因OsDST(droughtandsalttolerance)，不仅可以参与了水稻耐旱性和耐盐性(Huangetal.,2009)，还可以在生殖器官的分生组织中直接调控OsCKX2表达，进而影响茎节顶端分生组织(SAM)中细胞分裂素的积累，最终影响生殖器官的数量(Lietal.,2013)。
除了参与植物生长发育和形态建成，还发现很多与植物胁迫响应相关的TFⅢA型锌指蛋白(黄骥,2007)。研究最深入的参与逆境胁迫响应的锌指蛋白之一，STZ(Salttolerancezincfinger)，是利用盐敏感的酵母突变体，采用基因补偿法，从拟南芥cDNA文库筛到的一个包含双锌指结构域的锌指蛋白，可以补偿因钙调磷酸酶缺陷导致的酵母盐敏感性。之后STZ被重新命名为ZAT10，并对其进行了表达分析，表明STZ/ZAT10受盐、低温、干旱以及外源ABA的诱导(Sakamotoetal.,2004)。Mittleretal.(2006)对STZ/ZAT10转基因拟南芥进行了耐逆性分析，结果发现过量表达、RNAi转基因幼苗以及敲除突变体对渗透胁迫和盐胁迫的耐受性都明显提高，同时在胁迫条件下，ROS响应相关的基因表达量明显升高，推测ZAT10可能通过依赖ROS信号途径调控非生物胁迫响应。ZAT12是另外一个拟南芥中参与非生物胁迫响应的TFⅢA型锌指蛋白基因，表达受低温、高温、高盐、干旱、H2O2、机械伤害、光照等多种胁迫的诱导，过量表达转基因拟南芥耐冷、耐旱、耐盐性都显著提高，同时也导致植株矮化；缺失突变体对高盐和干旱胁迫敏感，但对高温的耐受性有所提高，利用基因芯片分析表明ZAT12过量表达转基因植株中，许多LEA家族基因和Cu-Zn-SOD基因明显上调表达，进而导致植株对渗透胁迫和MV、光照的抗性明显提高(Davletovaetal.,2005)。
水稻中也广泛存在在不同类型的锌指蛋白基因，水稻中约有500个基因编码产物具有锌指结构。目前已经报道了10多个非生物胁迫响应相关的锌指蛋白基因，大部分的锌指蛋白基因功能仍然未知。本发明人(2005)从盐诱导水稻cDNA中克隆了第一个锌指蛋白基因OsZFP1，之后又相继研究报道了ZFP245(Huangetal.,2005；Huangetal.,2009)、ZFP252(Xuetal.,2008)、ZFP179(Sunetal.,2010)、ZFP182(Huangetal.,2007；Huangetal.,2012；Zhangetal.,2012)等。这些锌指蛋白基因在植物生长发育和非生物胁迫应答反应中发挥了重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于公开水稻锌指蛋白基因ZFP214的耐旱性基因工程应用。ZFP214参与水稻耐旱响应，过量表达可以提高水稻的耐旱性，并能促进植株生长，提高株高和穗粒数，利于水稻抗逆性遗传改良。
本发明的另一目的在于提供一种针对锌指蛋白基因ZFP214的过量表达载体。
本发明的又一目的在于提供上述针对锌指蛋白基因ZFP214的过量表达载体在作物品种改良中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
cDNA序列如SEQIDNO.1所示的锌指蛋白基因ZFP214的耐旱性基因工程应用，过量表达该基因，能够提高水稻的耐旱性。
上述的应用，其在于将针对锌指蛋白基因ZFP214的过量表达载体导入水稻，提高锌指蛋白基因ZFP214的表达，能够提高水稻的耐旱性。
上述的应用，其在于所述的针对锌指蛋白基因ZFP214的过量表达载体通过以下方法构建：根据SEQIDNO.1所示的锌指蛋白基因ZFP214的基因序列，以重组质粒pMD18T-ZFP214为模板，设计引物ZFP214OEF：CAGGTACCGCATCATACAAAAAT(SEQIDNO.6)和ZFP214OER：CGCTGCAGGATGCTACTATAAAT(SEQIDNO.7)，通过PCR扩增ZFP214基因全长；利用KpnⅠ与PstⅠ将ZFP214全长正向插入植物双元表达载体pCAMBIA1300s的CaMV35S启动子下游，获得针对锌指蛋白基因ZFP214的过量表达载体pCAMBIA1300s-ZFP214。
上述的应用，其在于所述的质粒pMD18T-ZFP214通过以下方法获得：
(1)提取水稻总RNA，以提取的水稻总RNA为模板反转录合成cDNA第一链；
(2)以F1：SEQIDNO.2和R1：SEQIDNO.3为上下游引物，以反转录合成的cDNA为模板，通过PCR扩增ZFP214基因全长；通过TA-克隆系统将ZFP214基因片段连接到pMD18-T载体，获得重组质粒pMD18T-ZFP214。
一种针对cDNA序列如SEQIDNO.1所示的锌指蛋白基因ZFP214的过量表达载体。
上述的表达载体，通过以下方法构建：
(1)提取水稻总RNA，以提取的水稻总RNA为模板反转录合成cDNA第一链；
(2)以F1：SEQIDNO.2和R1：SEQIDNO.3为上下游引物，以反转录合成的cDNA为模板，通过PCR扩增ZFP214基因全长；通过TA-克隆系统将ZFP214基因片段连接到pMD18-T载体，获得重组质粒pMD18T-ZFP214；
(3)以重组质粒pMD18T-ZFP214为模板，以ZFP214OEF：CAGGTACCGCATCATACAAAAAT(SEQIDNO.6)和ZFP214OER：CGCTGCAGGATGCTACTATAAAT(SEQIDNO.7)为上下游引物，通过PCR扩增ZFP214基因全长；利用KpnⅠ与PstⅠ将ZFP214全长正向插入植物双元表达载体pCAMBIA1300s的CaMV35S启动子下游，获得针对锌指蛋白基因ZFP214的过量表达载体pCAMBIA1300s-ZFP214。
上述的针对cDNA序列如SEQIDNO.1所示的锌指蛋白基因ZFP214的过量表达载体在作物品种改良中的应用。
上述的针对cDNA序列如SEQIDNO.1所示的锌指蛋白基因ZFP214的过量表达载体在构建具有抗旱能力的转基因作物中的应用。
上述的应用，其在于将上述的针对锌指蛋白基因ZFP214的过量表达载体导入水稻，通过锌指蛋白基因ZFP214在水稻中的过量表达，提高水稻的耐旱性。
所述的针对锌指蛋白基因ZFP214的过量表达载体通过以下方法构建：根据SEQIDNO.1所示的锌指蛋白基因ZFP214的基因序列，以重组质粒pMD18T-ZFP214为模板，设计引物ZFP214OEF：CAGGTACCGCATCATACAAAAAT(SEQIDNO.6)和ZFP214OER：CGCTGCAGGATGCTACTATAAAT(SEQIDNO.7)，通过PCR扩增ZFP214基因全长；利用KpnⅠ与PstⅠ将ZFP214全长正向插入植物双元表达载体pCAMBIA1300s的CaMV35S启动子下游，获得重组质粒pCAMBIA1300s-ZFP214。
本发明水稻锌指蛋白基因ZFP214的cDNA序列如SEQIDNO.1，ZFP214参与水稻耐旱响应，过量表达ZFP214可以提高水稻的耐旱性，并能促进植株生长，提高株高和穗粒数，利于水稻抗逆性遗传改良。
本发明的有益效果
1、本发明公开了一种过量表达水稻ZFP214基因的耐旱性基因工程应用。该基因来自水稻(OryzasativaL.)，在水稻各组织中稳定表达，过量表达该基因可以提高水稻的耐旱性，利于水稻耐逆性遗传改良。
2、本发明人提供的ZFP214基因功能是参与植物的干旱应答反应，定量反转录聚合酶链式反应(QuantityRT-PCR)分析表明ZFP214基因在脱落酸(ABA)、高盐(100mMNaCl)和渗透胁迫(20％PEG)条件下上调表达。
3、利用本发明ZFP214基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子、Actin启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，对除草剂具有抗性的酶，也可利用颜色变化(例如β-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。
附图说明
图1.重组载体pCAMBIA1300s-ZFP214的构建
A.重组质粒pCAMBIA1300s-ZFP214的载体结构图；B.重组质粒pCAMBIA1300s-ZFP214双酶切鉴定。1：重组质粒pCAMBIA1300s-ZFP214经KpnⅠ与PstⅠ双酶切，2：重组质粒pCAMBIA1300s-ZFP214，M：DNA分子标记DL2000plus。
图2.重组载体pTCK303-ZFP214的构建
A.重组载体pTCK303-ZFP214结构图；B.重组质粒pTCK303-ZFP214双酶切鉴定。1：重组质粒pTCK303-ZFP214经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切；2：重组质粒pTCK303-ZFP214经SacⅠ和SpeⅠ双酶切；3重组质粒pTCK303-ZFP214经SacⅠ和BamHⅠ双酶切；4：重组质粒pTCK303-ZFP214；M：DNA分子标记DL2000plus。
图3.ZFP214转基因水稻植株的鉴定
A.ZFP214过表达转基因株系qRT-PCR鉴定；B.ZFP214RNAi转基因株系qRT-PCR鉴定。横坐标轴为株系名，纵坐标轴为表达量，WT为野生型(中花11)对照。
图4.ZFP214过量表达能提高转基因水稻的耐旱性
A.ZFP214转基因水稻苗期耐旱性鉴定；B：经过干旱处理后各转基因株系和WT存活率统计；C：干旱条件下各转基因株系和WT的脯氨酸积累量。OE：过量表达株系；Ri：RNAi转基因株系；WT：野生型(中花11)。
图5.ZFP214转基因水稻成株期表型
A-C.ZFP214转基因水稻成株期植株、穗型以及粒型的表型；D-H.ZFP214转基因水稻成株期株高、穗长、结实率、千粒重以及单株产量的统计。OE：过量表达株系；Ri：RNAi转基因株系；WT：野生型(中花11)。
具体实施方式
实施例1
选用水稻品种“中花11”，于人工气候培养箱(16h光照/8h黑暗，白天30℃夜晚26℃)中水培生长，营养液采用国际水稻所常规营养液配方。待幼苗生长至3-4叶期时，取幼苗于液氮中速冻并于-80℃冰箱中保存备用。取保存的水稻幼苗样品，参照Invitrogen公司的Trizol法提取总RNA的提取。总RNA的质量以及浓度通过1％琼脂糖凝胶电泳分析，获得符合质量的总RNA进一步用于合成cDNA第一链。cDNA第一链的合成参照Ferments公司反转录系统的操作手册进行。设计引物，上游F1：CCAAACCAAGAGCACATAACGT(SEQIDNO.2)；下游R1：ACGAATATAAAGACGGTCGAAGAG(SEQIDNO.3)，采用RT-PCR方法进行cDNA克隆。PCR扩增使用PrimeStarHSDNA聚合酶(Takara,Dalian,China)。PCR程序如下：98℃预变性5min，98℃变性5s，58℃复性10s，72℃延伸15s，28个循环后，72℃10min，将PCR产物加入普通Tag酶72℃延伸30min，通过TA-克隆系统将克隆片段连入pMD18-T载体，利用热激转化法将其转入大肠杆菌菌株DH5α中，获得质粒pMD18T-ZFP214，测序后获得具有完整编码区的ZFP214cDNA序列SEQIDNO.1。ZFP214ORF全长600bp，BioXM软件(版本2.6)分析表明ZFP214共编码199个氨基酸，估算其等电点pI＝9.02，分子量MW＝21.24KDa。
实施例2
根据测序所得序列设计上游引物F2：TCGTCGAGCGTGAGGAACTTTG(SEQIDNO.4)，下游引物R2：AGCTCCAATGATGGGCTTGACAG(SEQIDNO.5)，进行实时定量RT-PCR分析ZFP214基因在水稻幼苗中的表达，以水稻18SrRNA的表达为内参，结果表明，ZFP214的表达在ABA处理20min后显著增强，其表达量约为对照的5倍；ZFP214基因的表达在高盐(100mMNaCl)处理1h后即表达量增加，其表达量约为对照的8倍；在渗透胁迫(20％PEG)处理条件下，ZFP214基因的表达在1h处理后即表达量增加，24h时表达量达到最高，其表达量约为对照的100倍。本发明报道的水稻锌指蛋白基因ZFP214为水稻中的首次报道，有望应用于植物尤其是单子叶植物的耐旱性遗传改良。
实施例3
根据水稻ZFP214基因的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，上游引物ZFP214OEF：CAGGTACCGCATCATACAAAAAT(SEQIDNO.6)包含入KpnⅠ限制性内切酶位点，下游引物ZFP214OER：CGCTGCAGGATGCTACTATAAAT(SEQIDNO.7)包含PstⅠ限制性内切酶位点。以实施例1中获得的测序正确的重组载体pMD18T-ZFP214为模板，进行PCR扩增，所得产物通过KpnⅠ和PstⅠ酶切反应后，进一步克隆到植物双元表达载体pCAMBIA1300s，获得过量表达载体pCAMBIA1300s-ZFP214(图1)。
同时根据ZFP214氨基酸序列的特点，并利用Clontech公司在线RNAi靶定位点预测软件(http://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner；http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.htmL)，避开保守结构域，选取ZFP214基因前端包含5’-UTR的1-197bp特异核苷酸序列作为干涉载体插入区域。以重组质粒pMD18T-ZFP214的DNA为模板，利用引物214C1F：GGTACCAAGAGCACATAACGTATCC(SEQIDNO.8)、214C1R：GGATCCATGTCGATCTGCTGTT(SEQIDNO.9)通过BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点将该序列反向插入pTCK303植物干涉表达载体，同时以质粒pMD18T-ZFP214的DNA为模板，利用引物214C2F：ACTAGTAAGAGCACATAACGTATCCA(SEQIDNO.10)、214C2R：GAGCTCATGTCGATCTGCTGT(SEQIDNO.11)通过SacⅠ和SpeⅠ酶切位点将该序列正向插入pTCK303植物干涉表达载体，从而获得该基因的干涉表达载体pTCK303-ZFP214(图2)。
将获得的重组表达载体pCAMBIA1300s-ZFP214和pTCK303-ZFP214通过热激法转入农杆菌菌株EHA105，利用农杆菌介导的水稻遗传转化将重组载体的T-DNA区整合到水稻粳稻品种中花11的基因组中，从而获得ZFP214过量表达和RNAi抑制表达的转基因水稻。
转基因水稻成苗后，对各株系进行qRT-PCR鉴定。取少量转基因水稻叶片，参照Invitrogen公司的Trizol法提取总RNA的提取，反转成cDNA。设计ZFP214基因qRT-PCR特异引物F3：GACTACGTCTCCCTCTGCCTCA(SEQIDNO.12)、R3：GTGCCATGTCGATCTGCTGTTT(SEQIDNO.13)及内参18srRNA基因引物18s-F：ATGGTGGTGACGGGTGAC(SEQIDNO.14)、18s-R：CAGACACTAAAGCGCCCGGTA(SEQIDNO.15)对转基因株系进行qRT-PCR验证(图3)。
对ZFP214转基因水稻幼苗进行耐旱性分析，取阳性的T3代转基因和野生型种子，30℃浸种直至露白，然后播种于秧盘中，每穴18粒种子，每个转基因株系以及野生型水稻均播种三穴，常规土肥管理，培养至3叶期时，停止浇水直至出现萎蔫表型后恢复一周统计存活率。游离脯氨酸含量测定采用磺基水杨法(TrollandLindsley,1955)。转基因植株和野生型水稻幼苗的低温处理结果显示，过量表达转基因水稻幼苗(即转pCAMBIA1300s-ZFP214载体的转基因植株)相对于WT更耐旱，各株系的存活率均高于野生型对照；而RNAi转基因株系(即转pTCK303-ZFP214载体的转基因植株)对干旱更敏感，各株系的存活率都低于野生型对照(图4)。分别检测干旱处理前和干旱处理4d时转基因株系和野生型幼苗积累的游离脯氨酸含量，结果显示过表达株系的脯氨酸积累量明显大于野生型，而干涉抑制表达株系的脯氨酸积累量明显小于野生型(图4)，说明水稻植株在干旱胁迫处理时，过量表达ZFP214基因能提高水稻对渗透调节物质的积累，增强植株耐旱性。以上结果表明ZFP214正调控水稻中干旱响应过程。
实施例4
转基因株系和野生型(ZH11)种子浸种露白后，播种于江浦农场，四周龄秧苗移栽至学校网室，用于成株期农艺性状考察。每个株系2行，行距20cm，每行种植10株，每株间距15cm，常规土肥管理。灌浆结束后，量取转基因和野生型水稻每行中间8株的株高、分蘖数和穗长，进行统计析。种子成熟后将转基因和野生型的株高、分蘖数和穗长，进行统计析。种子成熟后将转基因野生型水稻的穗茎节剪下，种子42℃烘干5d后进行考种分析，分别量取各株水稻的穗长、分别量取各株水稻的穗长、每穗饱满种子个数、每穗总粒数。统计结果显示，ZFP214过量表达株系的水稻植株，相较于野生型对照，在成株期株高更高，穗长和粒长也更长，对农艺性状的数据统计结果显示，过量表达转基因水稻植株在株高、穗长、结实率、千粒重和单株产量方面都高于野生型(如图5所示)，RNAi转基因水稻在这些方面低于野生型，说明ZFP214参与植株生长发育的正调控。
上述实施例表明本发明中克隆的水稻锌指蛋白基因ZFP214，为水稻中首次公开。实施例3表明该基因与水稻的干旱胁迫响应密切相关，过量表达该基因能提高转基因水稻的耐旱性。实施例4表明过量表达转基因水稻植株具有更好的表型，可以利用转基因方法进行水稻的耐旱性遗传改良。

Claims (9)

1.cDNA序列如SEQIDNO.1所示的锌指蛋白基因ZFP214的耐旱性基因工程应用，其特征在于过量表达该基因，能够提高水稻的耐旱性。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于将针对锌指蛋白基因ZFP214的过量表达载体导入水稻，提高锌指蛋白基因ZFP214的表达，能够提高水稻的耐旱性。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的针对锌指蛋白基因ZFP214的过量表达载体通过以下方法构建：根据SEQIDNO.1所示的锌指蛋白基因ZFP214的基因序列，以重组质粒pMD18T-ZFP214为模板，设计引物ZFP214OEF：SEQIDNO.6和ZFP214OER：SEQIDNO.7，通过PCR扩增ZFP214基因全长；利用KpnⅠ与PstⅠ将ZFP214全长正向插入植物双元表达载体pCAMBIA1300s的CaMV35S启动子下游，获得针对锌指蛋白基因ZFP214的过量表达载体pCAMBIA1300s-ZFP214。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的质粒pMD18T-ZFP214通过以下方法获得：
(1)提取水稻总RNA，以提取的水稻总RNA为模板反转录合成cDNA第一链；
(2)以F1：SEQIDNO.2和R1：SEQIDNO.3为上下游引物，以反转录合成的cDNA为模板，通过PCR扩增ZFP214基因全长；通过TA-克隆系统将ZFP214基因片段连接到pMD18-T载体，获得重组质粒pMD18T-ZFP214。
5.一种针对cDNA序列如SEQIDNO.1所示的锌指蛋白基因ZFP214的过量表达载体。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于通过以下方法构建：
(1)提取水稻总RNA，以提取的水稻总RNA为模板反转录合成cDNA第一链；
(2)以F1：SEQIDNO.2和R1：SEQIDNO.3为上下游引物，以反转录合成的cDNA为模板，通过PCR扩增ZFP214基因全长；通过TA-克隆系统将ZFP214基因片段连接到pMD18-T载体，获得重组质粒pMD18T-ZFP214；
(3)以重组质粒pMD18T-ZFP214为模板，以ZFP214OEF：SEQIDNO.6和ZFP214OER：SEQIDNO.7为上下游引物，通过PCR扩增ZFP214基因全长；利用KpnⅠ与PstⅠ将ZFP214全长正向插入植物双元表达载体pCAMBIA1300s的CaMV35S启动子下游，获得针对锌指蛋白基因ZFP214的过量表达载体pCAMBIA1300s-ZFP214。
7.权利要求5或6所述的针对cDNA序列如SEQIDNO.1所示的锌指蛋白基因ZFP214的过量表达载体在作物品种改良中的应用。
8.权利要求5或6所述的针对cDNA序列如SEQIDNO.1所示的锌指蛋白基因ZFP214的过量表达载体在构建具有抗旱能力的转基因作物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于将权利要求5或6所述的针对锌指蛋白基因ZFP214的过量表达载体导入水稻，通过锌指蛋白基因ZFP214在水稻中的过量表达，提高水稻的耐旱性。
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