CN104119430A - 一种与植物耐旱相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

一种与植物耐旱相关的蛋白及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与植物耐旱相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白，称为BhSMP1，来源于苦苣苔科的旋蒴苣苔（Boea hygrometrica），是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明筛选到一个受干旱诱导表达的BhSMP1基因及其编码的蛋白，该蛋白及其编码基因对于培育抗旱、抗盐性提高的作物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定。

Description

一种与植物耐旱相关的蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种与植物耐旱相关的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
随着全球水资源的缺乏和极端气候事件的增长，干旱对作物的产量和品质的影响日趋显著。因此，通过分子操作技术提高作物的抗旱性日显重要。
生物体受到干旱胁迫或其它不良环境因素后，会通过不同途径抵抗不良胁迫。种子成熟过程中也伴随着这耐旱性的获得，包括耐旱相关蛋白的合成与积累，保护物质的产生，有害物质的清除等。种子成熟蛋白的含量与植物的耐旱性的形成具有重要作用，且能提高逆境中的萌发率。
复苏植物因其可以忍受极度干旱的条件，待水份充足时又能很快恢复正常生命活动的特性而被认为是研究抗逆机制和提供抗逆基因的极好的植物资源。旋蒴苣苔（Boeahygrometrica）是在我国分布的一种苦苣苔科复苏植物，该植物的叶片具有很强的耐旱复苏能力，在室温、相对空气湿度为0的条件下生长72小时后，叶片相对含水量降为3％左右，叶片面积皱缩至原叶片面积的1/3以下，光合作用基本停止。只要重新给水，叶片就可以吸水伸展，并恢复成未处理前的叶片表观状态和生理状态（包括光合作用的恢复）。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种与植物耐旱相关的蛋白及其编码基因。
本发明提供的蛋白，称为BhSMP1，来源于苦苣苔科的旋蒴苣苔（Boeahygrometrica），是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。
上述蛋白中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。
上述DNA分子是如下（1）-（3）中任意一种的DNA分子：
（1）编码区为序列表中序列1自5’末端第36-272位核苷酸所示的DNA分子；
（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；
（3）与（1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
上述DNA分子也可以按照如下方法制备：用引物5’-AGGATCCTTAAGGATGTCGGGAGCT-3’和引物5’-TGAATTCCTTAAGCTGTGCCCGTG-3’；以序列表中的序列1所示的DNA分子为模板，扩增得到的PCR产物，再经过BamH I和EcoRI双酶切，得到DNA分子。
上述严格条件为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交,然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。
上述序列表中的序列1由443个碱基组成，其开放阅读框架（ORF）为自5′末端第36-272位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的BhSMP1。
含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
上述重组载体为将上述DNA分子替换掉表达载体Bin19-35S-LEA-polyA中的LEA片段，得到表达上述蛋白的重组载体。在本发明的实施例中，上述重组载体具体可为将上述DNA分子取代Bin19-35S-LEA-polyA的BamH I和EcoR I酶切识别位点间的小片段（LEA片段）得到的重组质粒。上述DNA分子为按照如下方法制备：用引物5’-AGGATCCTTAAGGATGTCGGGAGCT-3’和引物5’-TGAATTCCTTAAGCTGTGCCCGTG-3’；以序列表中的序列1所示的DNA分子为模板，扩增得到的PCR产物，再经过BamH I和EcoRI双酶切，得到DNA分子。
扩增上述BhSMP1基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pBin19、pBI121、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300或其它衍生植物表达载体。
使用BhSMP1基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子（pUbi）等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物耐逆性中的应用也是本发明保护的范围；在上述应用中所述调控植物耐逆性具体为提高植物耐逆性；所述耐逆性具体为耐旱性；上述耐旱性通过如下体现：在PEG2000胁迫作用下转基因植物种子的萌发率大于所述目的植物。上述植物具体为双子叶植物或单子叶植物，上述双子叶植物进一步具体为拟南芥。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，为将编码上述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
上述方法中，所述耐逆性为耐旱性；
编码上述蛋白的DNA分子通过上述的重组载体导入目的植物。
上述方法中，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物具体为拟南芥。
上述耐旱性通过如下体现：在PEG2000胁迫作用下转基因植物种子的萌发率大于所述目的植物。
携带有本发明的与植物抗旱、抗盐相关蛋白编码基因BhSMP1的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、大豆、烟草、玉米、油菜、高粱、棉花等农作物，也可以是苜蓿、三叶草、冰草等牧草以及草莓、西红柿等果蔬花卉植物。
本发明的实验证明，本发明从复苏植物旋蒴苣苔（Boea hygrometrica）中筛选到一个受干旱诱导表达的BhSMP1基因，将该基因导入拟南芥，得到转BhSMP1拟南芥，转BhSMP1拟南芥的耐旱性明显高于未转基因的拟南芥，说明BhSMP1是与植物耐旱性相关的蛋白。因此，该蛋白及其编码基因对于培育耐旱性提高的作物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
附图说明
图1为BhSMP1基因在旋蒴苣苔（Boea hygrometrica）干旱复苏过程中的表达情况
图2为T2代转BhSMP1拟南芥的RT-PCR检测结果
图3为T2代转BhSMP1拟南芥种子萌发过程中PEG8000耐受能力鉴定
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、BhSMP1基因的获得及在干旱胁迫处理中的表达
一、BhSMP1基因的获得
提取经干旱胁迫（将土培苗小心清洗干净，放于光照培养箱中自然干燥，温度：22.0℃，湿度：50%RH，光周期：16光照/8黑暗）处理8小时的旋蒴苣苔（Boeahygrometrica，记载在如下文献中：Deng Xin,Hu Z,Wang H(1999):mRNA differentialdisplay visualized by silver staining tested on gene expression in resurrection plant Boeahygrometrica.Plant Mol Biol Rep17:279.公众可从中国科学院植物研究所获得）叶片的总RNA，利用文库构建试剂盒(Stratagene，La Jolla,CA)构建cDNA文库。从中随机挑选4800个基因，用BioGrid robot(BioRobotics Ltd,Cambridge,UK)自动化点样在Hybond-N+尼龙膜(Amersham Biosciences，Freiburg,Germany)上，制成cDNA微阵列(cDNA芯片)。将该cDNA芯片分别与未经干旱处理正常生长的旋蒴苣苔叶片和经干旱胁迫处理8小时的旋蒴苣苔叶片的polyA-RNA所制备的33P标记的探针进行杂交，分析它们在正常条件及干旱诱导后基因表达的动态变化。结果发现，有1个经干旱诱导上调的基因。
提取经干旱胁迫处理8小时的旋蒴苣苔（Boea hygrometrica）叶片的总RNA并以其为模板，用基因特异性引物GSP-Race1:5’-GGCGTCCTCCACCTTTTCTT-3’进行反转录。反应体系为：总RNA（2μg/μl）1.0μl，GSP-Race1（1μM）2μl，dNTP（2mM）5μl，DEPC-H2O6.0μl，5×M-MLV buffer4μl，RNase抑制剂（5u/μl,购自Takara公司）1μl，M-MLV（购自Promega公司）1μl。37℃反应1h后再65℃10min，纯化回收（三博PCR产物回收试剂盒）后加C尾。反应体系为：cDNA5μl，DEPC-H2O13.5μl，5×buffer5μl，dCTP（10mM）0.5μl。75℃反应5min后加入1μl TdT（购自takara公司），再37℃反应1h，得到加C尾的cDNA序列。
以上述获得的加C尾的cDNA序列为模板，进行PCR扩增。所用反应体系为：cDNA1μl，10×PCR buffer1μl，dNTP（2mM）1μl，引物GSP-Race2:5’-GAATCGGTCCAGGTCATCTTTAC-3’（10μM）0.5μl，多聚G锚定引物5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACG-3’（10μM）0.5μl，Taq酶（购自takara公司）0.1μl。反应条件为：先95℃预变性4min，然后94℃变性30秒，55℃退火30秒，再72延伸2分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到450bp左右的条带；回收该450bp左右的条带，与载体pGEM-T（购自promega公司）连接后进行测序，得到443bp的PCR产物。
根据测序结果设计引物5’-AGGATCCTTAAGGATGTCGGGAGCT-3’和引物5’-TGAATTCCTTAAGCTGTGCCCGTG-3’；以干旱胁迫处理8小时的旋蒴苣苔（Boeahygrometrica）叶片的总RNA反转录得到的cDNA为模板（也可以以序列表中的序列1所示的DNA分子为模板），用上述引物进行PCR扩增，反应体系为：cDNA1μl，10×PCRbuffer1μl，dNTP（2mM）1μl，引物各0.5μl，Taq酶（购自takara公司）0.1μl。程序为：95℃预变性4min，94℃变性45秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共27个循环；最后再72℃延伸10分钟。
得到250bp左右的产物，经过测序，该PCR产物具有序列表中序列1自5’末端第36-272位的核苷酸，该PCR产物即为BhSMP1基因全序列，分析发现BhSMP1基因全序列包含完整的BhSMP1基因的开放阅读框（ORF）、5’-UTR(5’-非翻译区)和3’-UTR，其BhSMP1基因ORF为序列1自5′末端第36-272位的脱氧核糖核苷酸，编码蛋白命名为BhSMP1，该蛋白的氨基酸残基序列如序列表中序列2所示。
二、BhSMP1基因在旋蒴苣苔（Boea hygrometrica）干旱复苏过程中的表达情况
对旋蒴苣苔进行8种不同程度的干旱处理，分别为：新鲜植株（F），新鲜植株土里慢速干旱5天（不浇水处理5天，SD5d），新鲜植株土里慢速干旱14天（不浇水处理14天SD14d）。分别提取3种处理旋蒴苣苔叶片的总RNA、反转录获得cDNA。用基因特异性引物BhSMP1-f5’-AGGATCCTTAAGGATGTCGGGAGCT-3’，和BhSMP1-r5’-TGAATTCCTTAAGCTGTGCCCGTG-3’进行Q-PCR扩增。并以18S rRNA基因为内参，扩增引物为18S-f5’-CTTAGTTGGTGGAGCGATTTG-3’，和5’-CCTGTTATTGCCTCAAACTTCC-3’。反应体系为：cDNA1μl，10μl2×SYBR Green Master Mix，引物各0.5μl，dd水8.5μl。程序为：95℃预变性30秒，95℃变性5秒，55℃退火30秒，72℃延伸30分钟，共50个循环。
结果如图1所示，其中，F表示新鲜未处理的旋蒴苣苔，SD5d、SD14d分别表示脱水5天和14天，可以看出该基因明显受干旱诱导。
实施例2、转BhSMP1拟南芥的获得及其功能研究
一、转BhSMP1拟南芥的获得
1、重组载体pBin19-BhSMP1的获得
用引物5’-AGGATCCTTAAGGATGTCGGGAGCT-3’和引物5’-TGAATTCCTTAAGCTGTGCCCGTG-3’；以序列表中的序列1所示的DNA分子为模板，得到258bp的PCR产物。
重组载体pBin19-BhSMP1具体构建方法如下：
1）将258bp的PCR产物经BamH I和EcoR I（购自大连宝生物公司）双酶切后，回收约258bp的片段（具有序列表中序列1自5’末端第36-272位的核苷酸）；
2）将含CaMV35Sq启动子和pA的载体Bin19-35S-LEA-polyA（Liu X.,Wang Z,WangL.L.,Wu R.H.Phillips J.and Deng X。LEA4group genes from the resurrectionplant Boea hygrometrica confer dehydration tolerance in transgenic tobacco，Plant Science176(2009)90–98；公众可从中国科学院植物研究所获得）用BamH I和EcoR I酶切去掉LEA片段，回收约13kb的载体骨架，将载体骨架与1）得到的258bp的片段连接，获得重组载体pBin19-BhSMP1（用BamH I和EcoR I酶切验证，得到258bp为阳性）。
经过测序，该重组载体pBin19-BhSMP1为将258bp的片段（具有序列表中序列1自5’末端第36-272位的核苷酸）取代载体Bin19-35S-LEA-polyA的BamH I和EcoR I酶切位点间的小片段（LEA片段），得到的载体。
该重组载体pBin19-BhSMP1受35S启动子（Odell,JT;Nagy,F;Chua,NH.Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus35Spromoter.Nature.313(2005):810–812）控制。
2、重组菌的获得
将上述1得到的重组载体pBin19-BhSMP1转化到农杆菌Gv3101细胞（公众可从中国科学院植物研究所获得，记载在如下文献中：Holsters M,Silva B,VanVliet F,Genetello C,De Block M,Dhaese P,Depicker A,Inz6D,Engler G,Villaroel R,Van Montagu M,Schell J(1980)The functionalorganization of the nopaline A.tumefaciens plasmid pTiC58.Plasmid3:212-230）中，用含有50μg/ml硫酸卡那霉素、50μg/ml庆大霉素和50μg/ml利福平的YEB固体平板培养基进行筛选,得到转化子，提取转化子的质粒送去测序，质粒为pBin19-BhSMP1，则将含有该质粒的转化子命名为重组菌Gv3101/pBin19-BhSMP1。
3、转BhSMP1拟南芥的获得及分子鉴定
1）转BhSMP1拟南芥的获得
将重组菌Gv3101/pBin19-BhSMP1采用花器官浸泡法转化野生型拟南芥Col-0（ecotype columbia，Arabidopsis thaliana；公众可从中国科学院植物研究所获得，记载在如下文献中：Arabidopsis,a useful weed.Meyerowitz EM，Cell（1989）56：263-270.）的花，得到T0代转BhSMP1拟南芥。转化方法如下：将重组菌50uL接种于50mL含35mg/L利福平、50mg/L硫酸庆大霉素、50mg/L卡那霉素的YEB培养基中,28℃，160rpm摇至OD值1.5左右，离心收集菌体，用同体积的5%蔗糖重悬，并加入10uL助渗剂，将拟南芥花浸于重旋液中浸泡1分钟即可。完成浸花后用黑色塑料袋遮光1天，第二天恢复自然光照，得到T0代转BhSMP1拟南芥。
将T0代转BhSMP1拟南芥自交，收集T1代转BhSMP1拟南芥种子，取100粒播种于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的MS培养基上，将在上述含有100μg/ml硫酸卡那霉素的MS培养基上抗性分离比为3：1的T1代转BhSMP1拟南芥的成活幼苗移至温室培养，收集种子，播种，共获得3个T2代转BhSMP1拟南芥纯合株系：OE10-4、OE26-3、OE31-2。
2）转BhSMP1拟南芥的分子鉴定
提取50天苗龄的上述3个T2代转BhSMP1拟南芥纯合株系：OE10-4、OE26-3、OE31-2的果荚的总RNA，反转录为cDNA为模板，以SMP1-f2
5‘-AGGATCCTTAAGGATGTCGGGAGCT-3’和SMP1-r2
5‘-TGAATTCCTTAAGCTGTGCCCGTG-3’为引物进行RT-PCR，同时以未转基因的野生型拟南芥（WT）作为对照。
内参基因为Actin，引物为actinF:5‘-AGGAACACCCTGTTCTCCTGACTG-3’,actinR:5‘-CAGAGAAAGCACAGCCTGGATAG-3’。
PCR扩增程序为：95℃预变性4min，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共28个循环；最后再72℃延伸10分钟；同时以actin基因做为内参，PCR扩增程序为：95℃预变性4min，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共28个循环；最后再72℃延伸10分钟。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，每组样品进行2次重复，结果如图2所示，可以看出，未转基因的野生型拟南芥（WT）中没有扩增出条带，T2代转BhSMP1拟南芥纯合株系：OE10-4、OE26-3、OE31-2中，皆有258bp目的基因BhSMP1表达。进一步证明，T2代转BhSMP1拟南芥纯合株系为阳性转基因植株。
采用同样的方法，将空载体Bin19-35S-LEA-polyA转入野生型拟南芥中，得到T0代转pBin19拟南芥；将T0代转pBin19拟南芥收种、播种，直到得到T2代转pBin19拟南芥。
二、转BhSMP1拟南芥的耐旱研究
检测T2代转BhSMP1拟南芥种子萌发过程中对PEG8000耐受能力从而体现出其耐旱：
将收获一月后的上述一获得的3个株系T2代转BhSMP1拟南芥纯合株系：OE10-4、OE26-3、OE31-2、T2代转pBin19拟南芥和野生型拟南芥的种子分别均匀的撒播于含有15%（质量百分含量）、20%（质量百分含量）PEG8000的萌发盒中，4℃春化4天后，培养在22℃、50%湿度、光照16h和黑暗8h的条件下，从培养开始第一天每天统计萌发率，5天后照相并完成统计。实验共设三次重复，每次重复中每个株系200颗种子。
结果如图3所示，A为含15%PEG的萌发盒中拟南芥的萌发率统计图,B为含20%PEG的萌发盒中拟南芥的萌发率统计,C为含15%PEG的萌发盒中拟南芥的萌发照片；
T2代转BhSMP1拟南芥纯合株系OE10-4在培养第1、2、3、4、5天的萌发率分别为86.91%、95.92%、97.83%、99.85%、99.85%；
T2代转BhSMP1拟南芥纯合株系OE26-3在培养第1、2、3、4、5天的萌发率分别为75.63%、89.31%、90.68%、94.12%、94.72%；
T2代转BhSMP1拟南芥纯合株系OE31-2在培养第1、2、3、4、5天的萌发率分别为72.13%、86.77%、89.77%、97.83%、99.03%；
野生型拟南芥（col）在培养第1、2、3、4、5天的萌发率分别为30.23%、46.85%、55.53%、61.13%、62.63%。
T2代转pBin19拟南芥和野生型拟南芥无显著差异。
从图3中可以看出，T2代转BhSMP1拟南芥种子比野生型拟南芥相比，在PEG8000的胁迫下，萌发率提高，说明T2代转BhSMP1拟南芥具有很强的耐PEG性，表明，T2代转BhSMP1拟南芥具有很强的耐旱性。
结果表明，T2代转BhSMP1拟南芥的耐旱性明显优于野生型拟南芥，说明BhSMP1是与植物耐旱相关的蛋白。

Claims (10)

1.一种蛋白，是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。
3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子是如下（1）-（3）中任一种的DNA分子：
（1）编码区为序列表中序列1自5’末端第36-272位核苷酸所示的DNA分子；
（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；
（3）与（1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：
所述重组载体为将权利要求2或3所述DNA分子替换掉表达载体Bin19-35S-LEA-polyA中的LEA片段，得到表达权利要求1所述蛋白的重组载体。
6.扩增权利要求2或3所述DNA分子全长或其任意片段的引物对。
7.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物耐逆性中的应用；
所述耐逆性具体为耐旱性；
所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物。
8.一种培育转基因植物的方法，为将编码权利要求1所述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为耐旱性；
所述编码权利要求1所述蛋白的DNA分子通过权利要求4或5所述的重组载体导入目的植物。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：
所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。
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