CN114702563B

CN114702563B - 蛋白质grmzm2g088112在调控植物抗旱性中的应用

Info

Publication number: CN114702563B
Application number: CN202011484659.0A
Authority: CN
Inventors: 巩志忠; 王瑜; 韩祎楠
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-12-16
Filing date: 2020-12-16
Publication date: 2023-03-24
Anticipated expiration: 2040-12-16
Also published as: CN114702563A

Abstract

本发明公开了蛋白质GRMZM2G088112在调控植物抗旱性中的应用。蛋白质GRMZM2G088112的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。向玉米自交系B73中导入GRMZM2G088112基因，得到转GRMZM2G088112基因玉米。实验证明，与玉米自交系B73相比，转GRMZM2G088112基因玉米的抗旱性提高。由此可见，蛋白质GRMZM2G088112可以调控玉米的抗旱性，本发明具有重要的应用价值。

Description

蛋白质GRMZM2G088112在调控植物抗旱性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质GRMZM2G088112在调控植物抗旱性中的应用。

背景技术

干旱是影响植物生长和农作物产量的最主要的环境因子。干旱已成为影响农业生产的严重问题，利用基因工程手段改良作物的抗旱能力，提高农作物和经济作物对逆境的适应能力是新品种培育亟需解决的关键问题和重大问题。近年来，人们从生理、生化、代谢、生态、以及遗传、进化等角度对植物响应干旱等逆境胁迫的机制进行了大量研究，积累了丰富的资料，特别是随着分子生物学的发展，人们能够在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上认识植物对干旱胁迫的抗逆性机理，为利用基因工程手段改良植物的抗胁迫性能开拓了新的途径。由于植物抗逆性状的复杂性，采用传统的育种方法提高植物的抗逆性十分困难，随着分子生物学的发展，基因工程手段开辟了植物抗逆育种的新途径，但高效抗逆基因的分离成为限制植物抗逆基因工程的主要因素。

玉米是我国重要的粮食作物，其抗旱性研究对解决我国的玉米产量问题意义重大。

发明内容

本发明的目的是提高玉米的抗旱性。

本发明首先保护蛋白质GRMZM2G088112，可为(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

(a1)SEQ ID NO:1所示的蛋白质；

(a2)将SEQ ID NO:1所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱性相关的由其衍生的蛋白质；

(a3)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(a4)来源于玉米且与(a1)具有98％以上同一性且与植物抗旱性相关的蛋白质。

标签具体如表1所示。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL
HA	9	YPYDVPDYA

编码所述蛋白质GRMZM2G088112的核酸分子也属于本发明的保护范围。

具体来说，编码所述蛋白质GRMZM2G088112的核酸分子可为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)的DNA分子：

(b1)编码区如SEQ ID NO:3所示的DNA分子；

(b2)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的DNA分子；

(b3)核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的DNA分子；

(b4)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质GRMZM2G088112的DNA分子；

(b5)来源于玉米且与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质GRMZM2G088112的DNA分子。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，SEQ ID NO:2由2063个核苷酸组成，SEQ ID NO:3由624个核苷酸组成，SEQID NO:3所示的核苷酸编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质GRMZM2G088112的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质GRMZM2G088112的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质GRMZM2G088112，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的所述蛋白质GRMZM2G088112的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

含有上述任一所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围。

构建重组载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此外，构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植物。

所述重组载体具体可为将上述任一所述核酸分子插入植物表达载体的多克隆位点，得到的重组质粒。

所述植物表达载体具体可为pBCXUN载体。

所述重组菌具体可为将所述重组载体导入出发菌，得到的重组菌。所述出发菌可为农杆菌或大肠杆菌。

本发明还保护上述任一所述蛋白质GRMZM2G088112的应用，可为K1)或K2)：

K1)调控植物抗旱性；

K2)培育抗旱性增高的转基因植物。

本发明还保护上述任一所述核酸分子、或、含有上述任一所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌的应用，为K1)或K2)：

K1)调控植物抗旱性；

K2)培育抗旱性增高的转基因植物。

上述任一所述的应用中，所述调控植物抗旱性可为增强植物抗旱性。

上述任一所述的应用中，所述调控为正调控，即通过过表达蛋白质GRMZM2G088112增加植物的抗旱性。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，可包括如下步骤：提高受体植物中上述任一所述蛋白质GRMZM2G088112的含量和/或活性，得到转基因植物；与受体植物相比，转基因植物的抗旱性增高。

上述方法中，所述提高受体植物中所述蛋白质GRMZM2G088112的含量和/或活性通过将编码上述任一所述蛋白质GRMZM2G088112的核酸分子导入受体植物实现。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加受体植物中上述任一所述蛋白质GRMZM2G088112的含量和/或活性，从而使植物抗旱性增高。

上述任一所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

所述植物为禾本科植物。

所述植物为玉蜀黍属植物。

所述植物为玉米。

所述植物为玉米自交系B73。

由于玉米同一DNA段序列可产生不同转录本，翻译出不同蛋白质，SEQ ID NO:2产生的不同转录本以及翻译出的不同蛋白质均在本发明的保护范围内。

GRMZM2G088112基因的转录本不止一个，其它形式的转录本相应的cDNA过表达后也可能抗干旱胁迫，均属于本发明保护的范围。

向玉米自交系B73中导入GRMZM2G088112基因，得到转GRMZM2G088112基因玉米。实验证明，与玉米自交系B73相比，转GRMZM2G088112基因玉米的抗旱性提高。由此可见，蛋白质GRMZM2G088112可以调控玉米的抗旱性，本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为GRMZM2G088112基因过表达植物的抗旱性鉴定。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、蛋白质GRMZM2G088112及其编码基因的发现

本发明的发明人经过大量实验，从玉米自交系B73(以下简称玉米B73)中发现了GRMZM2G088112基因。玉米B73的基因组DNA中，GRMZM2G088112基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。SEQ ID NO:2中，转录本的读码框为5’末端起第945-1784位核苷酸，包括4个外显子，其中编码外显子3个。3个编码外显子依次为：SEQ ID NO:2中自5’末端起第945-1086位、第1194-1281位和第1391-1784位。

玉米B73的cDNA中，GRMZM2G088112基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

GRMZM2G088112基因编码蛋白质GRMZM2G088112。蛋白质GRMZM2G088112的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

实施例2、转基因植物的获得和抗旱性鉴定

一、重组质粒pBCXUN-GRMZM2G088112的构建

将SEQ ID NO:3所示的DNA分子插入pBCXUN载体中，得到重组质粒pBCXUN-GRMZM2G088112。重组质粒pBCXUN-GRMZM2G088112中，SEQ ID NO:3所示的DNA分子由Ubi启动子启动并由Nos终止子终止，从而表达蛋白质GRMZM2G088112。

pBCXUN载体是将pCXUN载体(GenBank:FJ905215.1，06-JUL-2009)的HYG基因(hptII，潮霉素抗性基因)替换为Bar基因(编码膦丝菌素乙酰转移酶)(GenBank:MG719235.1中的第284-835位核苷酸，02-OCT-2018)，保持pCXUN的其它核苷酸不变得到的表达载体。

二、GRMZM2G088112基因过表达植物的获得

1、将重组质粒pBCXUN-GRMZM2G088112导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。

2、采用步骤1制备的重组农杆菌对玉米B73的胚性愈伤组织进行侵染，然后依次进行共培养、抗性筛选(抗性筛选采用除草剂草丁膦)、然后依次进行预分化、分化、生根，得到T₀代再生植株。

3、T₀代再生植株进行PCR鉴定，筛选获得转基因植株；将T₀代转基因植株自交，得到的种子即为T₁代种子，T₁代种子长成的植株即为T₁代植株；将T₁代植株自交，得到的种子即为T₂代种子，T₂代种子长成的植株即为T₂代植株；将T₂代植株自交，得到的种子即为T₃代种子，T₃代种子长成的植株即为T₃代植株。

4、将T₁代植株以及抽样的T₂代植株进行PCR鉴定。对于某一T₁代植株，如果该植株以及该植株自交得到的T₂代植株均为转基因植株，该植株的自交后代为纯合的转基因株系。

步骤3和步骤4中PCR鉴定的方法如下：提取植株叶片的基因组DNA，采用UbiP-seq(对应于Ubi启动子中)和NosR-seq(对应于Nos终止子中)组成的引物对进行PCR扩增，如果得到特异性扩增产物，该植株为转基因植株。

UbiP-seq:TTTTAGCCCTGCCTTCATACGC

NosR-seq:AGACCGGCAACAGGATTCAATC。

三、GRMZM2G088112基因过表达植物的抗旱性鉴定

供试种子：纯合的转基因株系OE1的T₃代种子、纯合的转基因株系OE2的T₃代种子或玉米B73的种子。

1、将供试种子分别播种于装有营养土的小盆中，25℃培养7天。

2、完成步骤1后，将长势一致的幼苗移栽到装有2500g营养土的长方形大盆中，每个盆中，一半区域种植15株转基因植株，另一半区域种植15株玉米B73植株，正常浇水并培养7天。设置三次重复试验，每次重复试验5盆。

3、完成步骤2后，持续不浇水20天，此时观察转基因植株和玉米B73植株的表型。

部分结果见图1。结果表明，玉米B73植株的叶片大部分发黄且叶片含水量低(呈现萎蔫状)，转基因植株的叶片基本为绿色且叶片含量水较高(未呈现萎蔫状)。转基因植株和玉米B73植株表型差异明显。

由此可见，过表达蛋白质GRMZM2G088112可以提高玉米的抗旱性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110>中国农业大学

<120>蛋白质GRMZM2G088112在调控植物抗旱性中的应用

<160>3

<170> PatentIn version 3.5

<210>1

<211>207

<212> PRT

<213> Zea mays L.

<400>1

Met Tyr Val Cys Ala Gly Pro Lys Lys Thr Lys Ser Gly Arg Gly Lys

1 5 10 15

Asp Ala Ala Ala Lys Val Tyr Glu Cys Arg Phe Cys Ser Leu Lys Phe

20 25 30

Gly Lys Ser Gln Ala Leu Gly Gly His Met Asn Arg His Arg Gln Glu

35 40 45

Arg Glu Thr Glu Thr Leu Asn Arg Ala Arg Gln Leu Val Phe Gly Asn

50 55 60

Glu Ser Leu Ala Val Ala Ala Val Gly Ala Gln Met Ser Phe Arg Asp

65 70 75 80

Val Asn Met Ala Gly Ala Ala Pro Pro Thr Val Leu Gly Val Gly Gly

85 90 95

Asn Phe Arg Gly Gly Ala Ala Gly Gly Gly Ser Ile Gly Asp Leu Cys

100 105 110

Val Pro Phe Arg Pro Val Leu Ser Pro Gln Pro Ser Tyr His Tyr Leu

115 120 125

Tyr Thr Ala Pro Ser Thr Leu His Pro Met Ser Tyr Pro Ala Thr Tyr

130 135 140

Pro Gly Pro Leu Arg Gln Pro Ala Val Asp Asp Tyr Ile Ile Gly His

145 150 155 160

Ala Val Ser Ala Gly Gly Asp Thr Leu Met Gln Ser Thr His Arg Gly

165 170 175

Ser Phe Ser Cys Phe Gly Ala Pro Leu Thr Ala Pro Pro Val Ala Ala

180 185 190

Thr Asn Val Gln Ala Asp Lys Val Ile Cys Asn Cys Ser Phe Thr

195 200 205

<210>2

<211>2063

<212> DNA

<213> Zea mays L.

<400>2

accatccgat atataccccg tcctccactt ctgttttccc tcgatctcct tcaaaataaa 60

ccgccattgc atcatagtgt tcatctgtca ctccaccatg taagaaccat aactaccctt 120

cgtcactttt ctggttgttg cttgcattgt tcatctccat gtcttgtaca tatcttcttg 180

tgagccacta ttattgcctc tctctctctg tgtgtgtgtg tgtgttttgt ttgctagtac 240

atgtgtagta gtgctgagcg cctgagctct taatcagctt gtgctatcaa aaggcagaaa 300

cctggatctt cgtcaacacc ttgtttgtct agatgcatga ctagaacact cttgtgctaa 360

ttaagaccaa ttgctacttc acttttttcc tcgctagcta gctgctttta ctgatctgct 420

ttaacattgt ccttcgatct atatatctat acgaaactgt tcttcaattc tcgggcaaga 480

atttaatttc tttcgtgtgt tcgtccccat ggcgtgtgtg tgttgactcc aggaggcaag 540

acgggagccc attggacctc aacaacttgc cggaggagta cggcaagcaa gcggcagaga 600

gctccacgac caccgccaca tcaagcgttc atgcagttat tagtaaggaa ctacagcact 660

aatattctct tgtttgtttt gaagtcgaag cagttgtagt tctagttgcg tcatgaaagg 720

aagtcctgca attttgagca gcaatgcagt tttagctttc ttaaagttct gcgcttttaa 780

cattctcggc tacatatacc tagctatata tagtttgcac aactaatatg ctaggtgagt 840

tgatgccaag gattcctcgt gaatgatcta cagtgtcatg aacaaaatat tctactcact 900

ttctacactt tgtagtgcag attgcagaag gccgggactg atcgatgtat gtgtgtgcag 960

ggccaaagaa gacgaagagc ggtagaggga aggatgctgc tgcgaaggtg tatgagtgcc 1020

ggttttgctc cctcaagttc ggcaagtctc aagcgcttgg tggccatatg aaccgccatc 1080

gacaaggcaa gatcatacac cactataacc ctagctaatt tcttcacaac gcttacattt 1140

ccttccattt ttatgggtta ttattgactt aatttctggg cttgctcttc cagagaggga 1200

gactgaaacc cttaaccgtg cccggcaact cgtcttcggc aacgagagcc tcgccgtcgc 1260

cgccgtcggc gcgcagatga ggtaaagcat actcgctcta ctgcagtctg cagaagatct 1320

atcacgatcg cgccttctct ttgattaggg tttgtcggtt ctcacacccg ttgcaattct 1380

gtgggtacag tttcagggat gtaaatatgg caggtgctgc cccaccgacc gtactcggag 1440

tcggagggaa cttccgggga ggcgccgccg gtggcggcag catcggcgac ctgtgcgtcc 1500

cgttccggcc ggtgctgtcg ccgcagcctt cgtaccatta cctctacacg gcgccatcaa 1560

cattgcaccc gatgagctac ccggcgacgt accctggccc actgcgccag cctgctgtcg 1620

acgactacat catcggccac gcagtctccg ccggcgggga cacactaatg caatcgacac 1680

accgcggcag cttctcctgc ttcggagctc cactcaccgc tccgccggtg gcggcaacga 1740

acgtgcaggc cgacaaagtt atctgcaact gcagcttcac ttgaatgcct ccggccggct 1800

ccacttgagc agatgcatgt agttaagtta gtgtaaagag ccaagaattt aaattagatg 1860

ttgcgtgttt tggacattaa atacagaatg aagtcttccg ggttctactt cgaagtatat 1920

gatgtctgca ctggatttct ggatccaaac tatatcttta gctttgcatg aattgttagt 1980

tatttcggta ctcagtacaa aacgtatttc acagcggatg tttggaaaag tgtttagtca 2040

atctcttatt tcaggaaaaa aaa 2063

<210> 3

<211> 624

<212> DNA

<213> Zea mays L.

<400> 3

atgtatgtgt gtgcagggcc aaagaagacg aagagcggta gagggaagga tgctgctgcg 60

aaggtgtatg agtgccggtt ttgctccctc aagttcggca agtctcaagc gcttggtggc 120

catatgaacc gccatcgaca agagagggag actgaaaccc ttaaccgtgc ccggcaactc 180

gtcttcggca acgagagcct cgccgtcgcc gccgtcggcg cgcagatgag tttcagggat 240

gtaaatatgg caggtgctgc cccaccgacc gtactcggag tcggagggaa cttccgggga 300

ggcgccgccg gtggcggcag catcggcgac ctgtgcgtcc cgttccggcc ggtgctgtcg 360

ccgcagcctt cgtaccatta cctctacacg gcgccatcaa cattgcaccc gatgagctac 420

ccggcgacgt accctggccc actgcgccag cctgctgtcg acgactacat catcggccac 480

gcagtctccg ccggcgggga cacactaatg caatcgacac accgcggcag cttctcctgc 540

ttcggagctc cactcaccgc tccgccggtg gcggcaacga acgtgcaggc cgacaaagtt 600

atctgcaact gcagcttcac ttga 624

Claims

1.蛋白质GRMZM2G088112，为(a1)或(a2)：

(a1)SEQ ID NO:1所示的蛋白质；

(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白。

2.编码权利要求1所述蛋白质GRMZM2G088112的核酸分子。

3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)的DNA分子：

(b1)编码区如SEQ ID NO:3所示的DNA分子；

(b2)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的DNA分子；

(b3)核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的DNA分子；

(b4)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质GRMZM2G088112的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌。

5.权利要求1所述蛋白质GRMZM2G088112的应用，为K1)或K2)：

K1)增加植物抗旱性；

K2)培育抗旱性增高的转基因植物；

所述植物为单子叶植物。

6.权利要求2或3所述核酸分子，或权利要求4所述重组载体、表达盒或重组菌的应用，为K1)或K2)：

K1)增加植物抗旱性；

K2)培育抗旱性增高的转基因植物；

所述植物为单子叶植物。

7.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：提高受体植物中权利要求1所述蛋白质GRMZM2G088112的含量和/或活性，得到转基因植物；与受体植物相比，转基因植物的抗旱性增高；

所述提高受体植物中权利要求1所述蛋白质GRMZM2G088112的含量和/或活性通过将编码权利要求1所述蛋白质GRMZM2G088112的核酸分子导入受体植物实现；

所述植物为单子叶植物。

8.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中权利要求1所述蛋白质GRMZM2G088112的含量和/或活性，从而使植物抗旱性增高；

所述增加目的植物中权利要求1所述蛋白质GRMZM2G088112的含量和/或活性通过将编码权利要求1所述蛋白质GRMZM2G088112的核酸分子导入目的植物实现；

所述植物为单子叶植物。