CN105669850A - AtVDAC3蛋白及其编码基因在培育抗逆性植物中的应用 - Google Patents

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CN105669850A CN201610236016.1A CN201610236016A CN105669850A CN 105669850 A CN105669850 A CN 105669850A CN 201610236016 A CN201610236016 A CN 201610236016A CN 105669850 A CN105669850 A CN 105669850A
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Abstract

本发明公开了AtVDAC3蛋白及其编码基因在培育抗逆性植物中的应用。本发明提供了如下1)-3)中任一种物质在调控植物抗逆性中的应用：1)蛋白AtVDAC3；2)编码蛋白的DNA分子；3)含有编码蛋白的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述蛋白为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明的实验证明，本发明发现AtVDAC3编码基因转入拟南芥中，可以提高植物的抗盐性，证明该基因及编码蛋白具有抗盐性，为研究植物对于盐胁迫的响应及耐受的分子机制提供了基础，对于农作物改良和培育耐盐作物具有重要的意义。

Description

AtVDAC3蛋白及其编码基因在培育抗逆性植物中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及AtVDAC3蛋白及其编码基因在培育抗逆性植物中的应用。
背景技术
据不完全统计，世界上有至少20％的耕地和超过50％的灌溉土地在不同程度上受到盐害的影响。一些干旱或半干旱地区，由于蒸发量大、降水量小，致使土壤中的盐分(主要是NaCl和NaCO3)大量积累。一些滨海地带，地下水位较高或海水倒灌，也会导致土壤表层积累较多盐分(主要是NaCl和MgSO4)。而不合理的灌溉方式以及长期的淡水洗盐又造成了大量农田的次生盐渍化。随着世界人口的剧增，发展中国家城市化进程的加剧，以及水资源匮乏造成的可灌溉土地面积的急剧下降，充分开发和利用盐碱地已经成为关系人类生存和发展的重要课题。
盐胁迫是植物生长发育的主要限制因子之一。根据植物对于盐胁迫的耐受性差异，可将植物分成盐生植物和甜土植物两类。盐生植物是能在渗透势低于-3.3MPa的土壤环境中生长并完成生活史的天然植物群体，反之则是甜土植物。
大多数植物尤其是农作物属于甜土植物，对盐胁迫敏感。它们在盐碱地生长时，由于受盐胁迫作用，生长缓慢，往往叶片变黄、死亡、脱落，严重影响光合作用，有时甚至整株植物枯萎死亡，从而造成农作物减产。盐胁迫已经严重的影响了全球的粮食产量，因此，揭示植物应对盐胁迫的机制，并据此提高植物的抗盐能力，已经成为促进农业生产的重要基础。
盐胁迫对植物生长的影响主要表现在以下几个方面：第一，土壤中盐分过高，使土壤的渗透势降低，会造成植物根系吸水困难，导致植物水分亏缺；第二，钠离子、氯离子及硫酸盐的累积造成的离子毒害，并且导致钾、钙、磷、氮摄入量不足，从而造成的营养胁迫；第三，当植物受到盐胁迫时，细胞中会大量积累活性氧，而高浓度的活性氧则会造成膜脂、蛋白质及核酸的破坏。
研究植物对于盐胁迫的响应及耐受的分子机制，寻找抗盐相关基因是近些年来的热点，对于农作物改良和培育耐盐作物具有重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供如下1)-3)中任一种物质的用途。
本发明提供的如下1)-3)中任一种物质在调控植物抗逆性中的应用：
1)蛋白；
2)编码蛋白的DNA分子；
3)含有编码蛋白的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
所述蛋白为如下(1)或(2)：
(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
为了使(1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述(2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
本发明的另一个目的是提供如下1)-3)中任一种物质的另一个用途。
本发明提供的如下1)-3)中任一种物质在培育抗逆植物中的应用：
1)蛋白；
2)编码蛋白的DNA分子；
3)含有编码蛋白的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
所述蛋白为如下(1)或(2)：
(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
上述应用中，所述编码蛋白的DNA分子是如下1)至4)中任一所述的DNA分子：
1)序列表中序列1所示的DNA分子；
2)序列表中序列1第1-822位核苷酸；
3)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
4)与1)或2)所限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC、0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。
上述应用中，所述调控植物抗逆性为提高植物抗逆性。
上述应用中，所述抗逆性为抗盐性。
上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为豆科植物或十字花科植物，具体为拟南芥。
本发明第三个目的是提供一种培育抗逆性提高转基因植物的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：将蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物的抗逆性高于所述目的植物；
所述蛋白为如下(1)或(2)：
(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
上述方法中，所述蛋白的编码基因通过重组载体导入目的植物；
所述重组载体将编码所述蛋白的DNA分子插入表达载体中，得到表达所述蛋白的载体。具体为将序列表的序列1自5’末端第1-822位核苷酸所示的双链DNA分子取代载体pCanG-Myc的KpnI和BamHI酶切位点之间的小片段，得到重组质粒pCanG-Myc-AtVDAC3(即过表达载体)。
本发明第四个目的是提供一种培育抗逆性提高植物的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：将上述方法获得的转基因植物与出发植物杂交，获得抗逆性高于所述出发植物的杂交后代。
上述中，所述抗逆性为抗盐性。
上述中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为豆科植物或十字花科植物。
本发明第五个目的是提供一种重组载体。
本发明提供的重组载体，为将编码蛋白的DNA分子插入表达载体中，得到表达蛋白的重组载体；
所述蛋白为如下(1)或(2)：
(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
上述重组载体中，所述编码蛋白的DNA分子是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
1)序列表中序列1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
3)与1)所限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
所述重组载体具体为将序列表的序列1自5’末端第1-822位核苷酸所示的双链DNA分子取代载体pCanG-Myc的KpnI和BamHI酶切位点之间的小片段，得到重组质粒pCanG-Myc-AtVDAC3(即过表达载体)。
可用现有的植物表达载体构建含有所述AtVDAC3基因的重组表达载体。植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
本发明的实验证明，本发明发现AtVDAC3编码基因转入拟南芥中，可以提高植物的抗盐性，证明该基因及编码蛋白具有抗盐性，为研究植物对于盐胁迫的响应及耐受的分子机制提供了基础，对于农作物改良和培育耐盐作物具有重要的意义。
附图说明
图1为突变体植物盐处理的生长状态的照片。
图2为重组质粒pCanG-Myc-AtVDAC3的结构示意图。
图3为过表达株系中AtVDAC3基因的相对表达量。
图4为过表达植物盐处理的萌发状态的照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。本领域技术人员明白，可以使用其他具体实施方案实现本发明的目的，这些具体实施方案同样包含在本发明的范围内。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
“相关”/“可操作地连接”指两个物理或功能相关的核酸序列。例如，如果启动子或调节DNA序列和编码RNA或蛋白质的DNA序列可操作地连接或定位以至于调节DNA序列将影响编码或结构DNA序列的表达水平，那么称启动子或调节DNA序列与编码RNA或蛋白质的DNA序列“相关”。
“嵌合基因”是重组核酸序列，其中启动子或调节核酸序列可操作地连接编码mRNA或作为蛋白质表达的核酸序列，或与编码mRNA或作为蛋白质表达的核酸序列相关，使得调节核酸序列能调节相关核酸序列的转录或表达。嵌合基因的调节核酸序列不是如自然界中所发现的正常可操作地连接相关核酸序列。
“编码序列”：指直接指定其蛋白质产物的氨基酸序列的核苷酸序列，其可以为DNA、cDNA、合成的或重组的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开放阅读框决定。开放阅读框的5’端由起始密码子界定，而3’端由终止密码子界定。起始密码子通常为ATG，或者也可以是其它起始密码子如GTG或TTG。终止密码子包括例如TAA、TAG、TGA。
“cDNA”是指与RNA分子互补的DNA，其是通过反转录酶从得自真核细胞的成熟的、经过剪接的mRNA分子反转录而来的单链或双链的DNA分子。如此，cDNA中不含本来可能存在于与之对应的基因组DNA序列中的任何内含子。
对应于：在本发明上下文中“对应于”意指当不同AtVDAC3基因或蛋白质的核酸编码序列或氨基酸序列互相比对时，“对应于”一些计数位置的核酸或氨基酸是与这些位置比对，但不必是在相对于特定AtVDAC3各自核酸编码序列或氨基酸序列的这些精确数字位置中的核酸或氨基酸。同样，当特定AtVDAC3的编码或氨基酸序列与参照AtVDAC3的编码或氨基酸序列比对时，“对应于”参照AtVDAC3序列一些计数位置的该特定AtVDAC3序列中核酸或氨基酸是与参照AtVDAC3序列的这些位置比对，但不必是在该特定AtVDAC3蛋白质各自核酸编码序列或氨基酸序列的这些精确数字位置中的核酸或氨基酸。
这里所用的“表达盒”意指能指导适合宿主细胞中特定核苷酸序列表达的核酸序列，包含与目的核苷酸序列可操作地连接的启动子，所述目的核苷酸序列可操作地连接终止信号。通常，它也包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少其成分之一相对于至少它的其它成分之一是异源的。表达盒也可以是天然存在的，但以重组形式获得用于异源表达的表达盒。然而，通常，表达盒相对于宿主是异源的，即，表达盒的特定核酸序列不天然出现在宿主细胞中，必须通过转化事件将其引入宿主细胞或宿主细胞的前体。表达盒中核苷酸序列的表达可以受组成型启动子或诱导型启动子控制，其中仅当宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时，所述诱导型启动子才起始转录。如果是多细胞生物体的情况，如植物，启动子也可以是对特定组织，或器官或发育阶段特异的。
“基因”是位于基因组内的限定区域，除了前述编码核酸序列外，包含其它主要是调节性的核酸序列，所述调节性核酸序列负责编码部分的表达，即转录和翻译控制。基因也可以包含其它5’和3’非翻译序列和终止序列。进一步可以存在的元件是，例如内含子。
“核酸分子”或“核酸序列”是可以从任何来源分离的单或双链DNA或RNA的线性片段。在本发明上下文中，优选地，核酸分子是DNA片段。“核酸分子”也称多核苷酸分子。
“植物”是在任何发育阶段的任何植物，特别是种子植物。
“植物细胞”是植物的结构和生理学单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单个细胞或培养细胞形式，或作为高等有组织的单位如，例如植物组织，植物器官或整个植物的一部分。
“植物材料”指叶，茎，根，花或花的部分，果实，花粉，卵细胞，合子，种子，插条，细胞或组织培养物，或植物的任何其它部分或产物。
“启动子”是编码区域上游非翻译的DNA序列，其包含RNA聚合酶的结合位点，并起始DNA的转录。启动子区域也可以包含作为基因表达调节物的其它元件。
两个核酸序列基本相同的另一个指标是两个分子在严格条件下互相杂交。短语“特异性杂交”指当该序列存在于复杂混合物(例如，总细胞的)DNA或RNA中时，在严格条件下，分子仅与特定核苷酸序列结合，形成双螺旋或杂交。“基本结合”指探针核酸和靶核酸间互补杂交，并且包含较少的错配，通过降低杂交介质的严格性可耐受所述的错配，以实现靶核酸序列的期望检测。
在核酸杂交试验如Southern和Northern杂交上下文中“严格杂交条件”和“严格杂交漂洗条件”是序列依赖性的，并且在不同环境参数下是不同的。较长的序列在较高温度特异性杂交。在Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes，第I部分第2章"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays"Elsevier,NewYork中可以发现核酸杂交的大量指南。一般地，对于在限定离子强度和pH下的特定序列，高严格性杂交和漂洗条件选择为低于热熔点(Tm)约5℃。典型地，在“严格条件”下，探针将与其靶亚序列杂交，而不与其它序列杂交。
Tm是(在限定离子强度和pH条件下)50％靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。对于特定的探针，非常严格的条件选择为等于Tm。在Southern或Northern印迹中在滤膜上有多于100个互补残基的互补核酸杂交的一个严格杂交条件的例子是在42℃，具有1mg肝素的50％甲酰胺，过夜进行该杂交。高严格性漂洗条件的例子是72℃，0.15MNaCl约15分钟。严格漂洗条件的例子是在65℃，0.2xSSC漂洗15分钟(参见，Sambrook，下文，SSC缓冲液的描述)。通常，在高严格性漂洗前进行低严格性漂洗以除去背景探针信号。对于例如多于100个核苷酸的双螺旋而言，中严格性漂洗的例子是45℃，1xSSC漂洗15分钟。对于例如多于100个核苷酸的双螺旋而言，低严格性漂洗的例子是40℃，4-6xSSC漂洗15分钟。对于短探针(例如，约10到50个核苷酸)，严格条件通常包括在pH7.0到8.3的少于约1.0MNa离子的盐浓度，通常约0.01到1.0Na离子浓度(或其它盐)，通常温度至少是约30℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可以获得严格条件。一般地，在特定杂交测定中，信噪音比就无关探针所观察到的值高2×(或更高)表明特异杂交的检测。在严格条件下不互相杂交的核酸如果它们编码的蛋白质是基本相同的，那么它们仍是基本相同的。例如，当用遗传密码所允许的最大密码子简并性创造核酸拷贝时，就会出现这种情况。
下面是杂交/漂洗条件设置的例子，所述条件可以用于克隆与本发明参照核苷酸序列基本相同的同源核苷酸序列：参照核苷酸序列与参照核苷酸序列优选在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5MNaPO4，1mMEDTA中杂交，在50℃，2XSSC，0.1％SDS中漂洗，更期望在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5MNaPO4，1mMEDTA中杂交，在50℃，1XSSC，0.1％SDS中漂洗，更期望在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5MNaPO4，1mMEDTA中杂交，在50℃，0.5XSSC，0.1％SDS中漂洗，优选地，在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5MNaPO4，1mMEDTA中杂交，在50℃，0.1XSSC，0.1％SDS中漂洗，更优选地，在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5MNaPO4，1mMEDTA中杂交，在65℃，0.1XSSC，0.1％SDS中漂洗。
“转化”是向宿主细胞或生物体中引入异源核酸的过程，特别地，“转化”意指DNA分子稳定整合进入目的生物体基因组中。
“转化的/转基因的/重组的”指已经引入异源核酸分子的宿主生物体，如细菌或植物。核酸分子可以稳定地整合进入宿主基因组或者核酸分子也可以作为染色体外分子存在。这种染色体外分子可以是自主复制的。转化的细胞，组织，或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因子代。“非转化的”，“非转基因的”，或“非重组的”宿主指不含有异源核酸分子的野生型生物体，例如细菌或植物。
本文所用的术语“多核苷酸”、“多核苷酸分子”、“多核苷酸序列”、“编码序列”、“开放阅读框(ORF)”等包括单链或双链的DNA和RNA分子，可包含一个或多个原核序列，cDNA序列，包含外显子和内含子的基因组DNA序列，化学合成的DNA和RNA序列，以及有义和相应的反义链。
生产和操作本文公开的多核苷酸分子及寡核苷酸分子的方法是本领域技术人员已知的，并可按照已描述的重组技术(参见Maniatis等，1989，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Ausubel等，1989，分子生物学当前技术，GreenePublishingAssociates&WileyInterscience，NY；Sambrook等，1989，分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Innis等(编)，1995，PCR策略，AcademicPress，Inc.，SanDiego；和Erlich(编)，1992，PCR技术，牛津大学出版社，NewYork)完成。
植物转化：
在特别优选实施方式中，在高等生物体例如植物中表达至少一种本发明的赋予盐耐受性的蛋白。可将本发明核苷酸序列插入到表达盒中，然后优选地，表达盒稳定整合在所述植物基因组中。在另一个优选实施方式中，核苷酸序列包含在非致病自我复制的病毒中。在另一个优选实施方式中，核苷酸序列包含在农杆菌中。按照本发明转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于玉米，小麦，大麦，黑麦，甘薯，豆，豌豆，菊苣，莴苣，甘蓝，花椰菜，花茎甘蓝,芜菁，萝卜，菠菜，芦笋，洋葱，大蒜，胡椒，芹菜，笋瓜，南瓜，大麻，夏南瓜，苹果，梨，温桲，瓜，李子，樱桃，桃子，油桃，杏，草莓，葡萄，木莓，黑莓，菠萝，鳄梨，蕃木瓜，芒果，香蕉，大豆，番茄，高粱，甘蔗，甜菜，向日葵，菜籽油菜，三叶草，烟草，胡萝卜，棉花，苜蓿，稻，马铃薯，茄子，黄瓜，拟南芥属和木本植物如针叶树和落叶树。特别优选的是水稻、小麦、大麦、玉米、燕麦、黑麦、甘蔗、甜菜、大豆、马铃薯。优选地，用于本发明的植物是芸薹科植物。优选地，所述植物是芸薹属植物，包括黑芥(Brassicanigra)、欧洲油菜(Brassicanapus)、甘蓝(Brassicaoleraceae)、芜菁(Brassicarapa)、埃塞俄比亚芥(Brassicacarinata)、芥菜(Brassicajuncea)。所述植物也可以是芸薹科的其它植物。
一旦已将期望的核苷酸序列转化进入特定植物物种中，可以在该物种中繁殖它或用常规育种技术将它转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。
优选地，在转基因植物中表达本发明的核苷酸序列，由此在转基因植物中引起相应的赋予植物抗盐性的蛋白的生物合成。以这种方式，可产生具有改良性状的转基因植物。为了在转基因植物中表达本发明核苷酸序列，本发明核苷酸序列可能需要修饰和优化。所有生物体都有特定的密码子使用偏爱性，这是本领域已知的，可以在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性。而且，从有至少约35％，优选多于约45％，更优选多于50％，最优选多于约60％GC含量的编码序列可以最好地实现植物中高水平的表达。尽管可以在单子叶植物和双子叶植物物种中充分地表达优选的基因序列，但可以修饰序列以适应单子叶植物或双子叶植物的特异密码子偏好和GC含量偏好，因为这些偏好已被证明是不同的(Murray等,Nucl.AcidsRes.17:477-498(1989))。此外，可筛选核苷酸序列以寻找引起信息截断的非常规剪接位点的存在。利用公开专利申请EP0385962(Monsanto),EP0359472(Lubrizol)和WO93/07278(Ciba-Geigy)中所述的方法，用本领域熟知的位点定向诱变技术，PCR和合成基因构建进行在这些核苷酸序列中需要进行的所有改变，如上述那些改变。
在本发明一个实施方式中，根据这里并入作为参考文献的美国专利5,625,136中公开的方法可制备合成基因。在该方法中，利用了玉米优选的密码子，即最常编码玉米中那个氨基酸的单密码子。特定氨基酸的玉米优选密码子可以来源于，例如玉米的已知基因序列。在Murray等，NucleicAcidsResearch17:477-498(1989)中教导了玉米植物28个基因的玉米密码子使用，这里并入这篇文献的公开内容为参考文献。
以这种方式可以优化核苷酸序列以便在任何植物中的表达。公认基因序列的所有或任何部分都可以优化或合成。即，也可以利用合成或部分优化的序列。
为了翻译的有效起始，可能需要修饰邻近起始甲硫氨酸的序列。例如，通过包含已知在植物中有效的序列可以修饰它们。Joshi提出了植物适合的共有序列(NAR15:6643-6653(1987))，Clonetech提出了进一步的翻译起始子共有序列(1993/1994目录,210页)。这些共有序列适合与本发明核苷酸序列一起使用。向包含所述核苷酸序列，直到和包含ATG(同时保持第二个氨基酸没有被修饰)或可替代地直到和包含ATG后的GTC(具有修饰转基因第二个氨基酸的可能性)的构建物中引入该序列。
可将作为其天然序列或作为如上所述优化合成序列的本发明新的AtVDAC3基因可操作地与在植物中表达的各种启动子，包括组成型，诱导型，时序调节，发育调节，化学调节，组织优选和组织特异性启动子相融合以制备重组DNA分子，即嵌合基因。启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种。因此，可以使用在叶，主茎或茎杆，穗，花序(例如，穗状花序，圆锥花序，穗轴等)，根，和/或幼苗中表达本发明核苷酸序列。尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达。然而，没有限制所选启动子的起源，只要启动子起作用驱动期望细胞中核苷酸序列的表达就足够了。
优选的组成型启动子包括CaMV35S和19S启动子(Fraley等，1994年10月4日公布的美国专利号5,352,605)。另外优选的启动子来源于在大多数细胞类型中表达的几种肌动蛋白基因的任何一种。可以容易地修饰McElroy等(Mol.Gen.Genet.231:150-160(1991))所述的启动子表达盒以用于ThLEA1基因的表达，该基因表达盒特别适合在单子叶植物宿主中使用。
另一个优选的组成型启动子来源于泛素，它是已知在许多细胞类型中积累的另一种基因产物。从几种物种，例如向日葵(Binet等，1991.PlantScience79:87-94)，玉米(Christensen等，1989.PlantMolec.Biol.12:619-632)和拟南芥(Norris等1993.PlantMolec.Biol.21:895-906)克隆了泛素启动子，可用于转基因植物中。已发展了转基因单子叶植物系统中的玉米泛素启动子，并且在专利公布EP0342926中公开了其序列和用于单子叶植物转化的载体。泛素启动子适合在转基因植物，特别是单子叶植物中新直立密穗基因的表达。
除了适合启动子的选择外，植物中AtVDAC3蛋白表达的构建可以连接在异源核苷酸序列下游的适合的转录终止子。可得到几种这种终止子，并且它们是本领域已知的(例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9)。任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以用在本发明中。
也可以向本发明所述表达盒中引入其它的序列。这些序列包括已经证明增强表达的序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
有可能优选将本发明核苷酸序列的表达靶向到植物中不同细胞定位。在一些情况下，可能期望定位在细胞溶质中，而在其它情况下，可能优选定位在一些亚细胞细胞器中。转基因所编码的酶的亚细胞定位采用了本领域熟知的技术。通常，操作编码来源于已知靶向细胞器的基因产物的靶肽的DNA，使之融合到核苷酸序列的上游。已知用于叶绿体的许多这种靶序列，并且已知证明了它们在异源构建中的功能。本发明核苷酸序列的表达也可靶向到宿主细胞的内质网或液泡中。实现上述这些目的的技术是本领域熟知的。
可用于植物转化的大量转化载体是植物转化领域技术人员已知的，并且本发明的核酸分子可以与任何这种载体联合使用。载体的选择将依赖于用于转化的优选转化技术和靶植物物种。对于一些靶物种，可以优选不同的抗生素或除草剂选择性标记。通常用在转化中的选择性标记包括赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因(Messing&Vierra.,1982.Gene19:259-268；和Bevan等,1983.Nature304:184-187)，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因,(White等,1990.Nucl.AcidsRes18:1062,和Spencer等,1990.Theor.Appl.Genet79:625-631)，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger&Diggelmann,MolCellBiol4:2929-2931)，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因(Bourouis等,1983.EMBOJ.2(7):1099-1104)，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因(U.S.专利号：4,940,935和5,188,642)，和提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因(美国专利号5,767,378和5,994,629)。然而，选择性标记的选择对本发明不是至关重要的。
在另一个优选的实施方式中，将本发明的核苷酸序列直接转化到质体基因组中。质体转化的主要优点是质体通常不需要实质修饰就能表达细菌基因，并且质体能表达单启动子控制下的多个开放读框。在美国专利5,451,513、5,545,817和5,545,818中，PCT申请号WO95/16783中和McBride等，(1994)Proc.Nati.Acad.Sci.USA91,7301-7305中详尽地描述了质体转化技术。叶绿体转化的基本技术包括例如利用生物轰击或原生质体转化(例如氯化钙或PEG介导的转化)将位于目的基因和选择标记侧翼的克隆质体DNA的区域一起引入适合的靶组织中。1到1.5kb侧翼区域，称为导向序列，可促进与质体基因组的同源重组，因此允许原质体系特定区域的置换或修饰。最初，可利用在提供了对壮观霉素和/或链霉素抗性的叶绿体16SrRNA和rps12基因的点突变作为转化的选择标记(Svab,Z.,Hajdukiewicz,P.,和Maliga,P.(1990)Proc.Nati.Acad.Sci.USA87,8526-8530；Staub,J.M.,和Maliga,P.(1992)PlantCell4,39-45)。这以约每100次靶叶片轰击1次的频率产生了稳定的同质转化体。这些标记间存在的克隆位点可以用来产生用于导入外源基因的质体靶向载体(Staub,J.M.,和Maliga,P.(1993)EMBOJ.12,601-606)。通过用显性选择标记，编码壮观霉素去毒酶(spectinomycin-cletoxifyingenzyme)氨基糖苷类-3’-腺苷酰转移酶的细菌aadA基因置换隐性rRNA或r-蛋白质抗生素抗性基因可获得转化频率的显著增加(Svab,Z.和Maliga,P.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90,913-917)。以前，该标记成功地用于高频率转化绿藻Chlamydomonasreinhardtii质体基因组(Goldschmidt-Clermont,M.(1991)Nucl.AcidsRes.19:4083-4089)。其它用于质体转化的选择标记是本领域已知的，并且包含在本发明范围内。通常，转化后需要约15到20个细胞分裂周期以达到同质状态。通过同源重组将基因插入每个植物细胞中存在的所有几千个环形质体基因组拷贝中的质体表达利用了拷贝数大大高于核表达基因的优势，使得表达水平可以容易地超过总可溶植物蛋白质的10％。在优选实施方式中，将本发明核苷酸序列插入到质体靶向载体中，并且转化进入期望的植物宿主质体基因组中。获得了对于含有本发明核苷酸序列的质体基因组而言属同质的植物，优选地，该植物具有高水平地表达核苷酸序列的能力。
MS培养基的成分见表2，1/2MS培养基组分为表2的一半。
表2MS培养基成分
载体pCanG-Myc(植物二元表达载体)：改造自pCambia1300-221(参考文献：YiyueZhang,ChengweiYang,YinLi,NuoyanZheng,HaoChen,QingzhenZhao,TingGao,HuishanGuoandQiXie(2007)SDIR1IsaRINGFingerE3LigaseThatPositivelyRegulatesStress-ResponsiveAbscisicAcidSignalinginArabidopsis.PlantCell.19(6):1912–1929)；将6×Myc序列(序列3)替换pCambia1300-221载体的KpnI和XbalI位点间的GUS基因得到的载体，由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供。
根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105株：参考文献：YiyueZhang,ChengweiYang,YinLi,NuoyanZheng,HaoChen,QingzhenZhao,TingGao,HuishanGuoandQiXie(2007)SDIR1IsaRINGFingerE3LigaseThatPositivelyRegulatesStress-ResponsiveAbscisicAcidSignalinginArabidopsis.PlantCell.19(6):1912–1929。
哥伦比亚生态型拟南芥(ArabidopsisthalianaecotypeColumbia)col-0：购自ABRC(ArabidopsisBiologicalResourceCenter)。
实施例1、AtVDAC3基因突变体植株的抗盐性鉴定
取atvdac3基因突变体(ABRC，与clo-0相比，仅atvdac3基因发生突变，其余基因没有变化)株系的种子及哥伦比亚生态型clo-0拟南芥(WT)植株的种子，分别进行如下抗盐性鉴定：
1、将种子用10％漂白剂进行表面灭菌，然后用无菌水洗涤3次。
2、分组处理
实验组：将无菌种子悬浮在0.15g/100mL的琼脂糖水溶液中并铺板到含100mMNaCl、125mMNaCl和150mMNaCl的1/2MS培养基平板上，将平板在4℃黑暗条件下放置3天，然后移入24℃的组织培养室(每天16小时光照)，培养14天，拍照并观察植株的生长状态。
对照组：将无菌种子悬浮在0.15g/100mL的琼脂糖水溶液中并铺板到1/2MS培养基平板上，将平板在4℃黑暗条件下放置3天，然后移入24℃的组织培养室(每天16小时光照)，培养14天，拍照并观察植株的生长状态。。
照片见图1。在对照组处理中，各个株系的植物的生长状态没有显著差异。在实验组处理中，哥伦比亚生态型拟南芥(col.WT)的生长状态显著优于突变体株系(atvdac3)植株。结果表明，AtVDAC3基因突变能够明显降低植物的抗盐性。
实施例2、AtVDAC3基因的功能验证
一、过表达载体的构建
AtVDAC3基因的核苷酸序列为序列1，开放阅读框为序列1第1-825位核苷酸，其编码的蛋白AtVDAC3的氨基酸序列为序列2。
将序列表的序列1自5’末端第1-822位核苷酸所示的双链DNA分子取代载体pCanG-Myc的KpnI和BamHI酶切位点之间的小片段，得到重组质粒pCanG-Myc-AtVDAC3(即过表达载体)。重组质粒pCanG-Myc-AtVDAC3的结构示意图见图2，AtVDAC3基因由35S双启动子调控。
二、转AtVDAC3拟南芥的获得
1、将上述一制备的过表达载体pCanG-Myc-AtVDAC3导入根癌土壤杆菌EHA105株中，得到重组根癌土壤杆菌(提取质粒，测序验证阳性)。
2、将步骤1得到的重组根癌土壤杆菌通过植株真空渗入法(BentAF和CloughSJ(1998)Agrobacteriumgerm-linetransformation:transformationofArabidopsiswithouttissueculture.InPlantMolecularBiologyManual,2nded,S.B.GelvinandR.A.Schilperoot,eds(Dordrecht,TheNetherlands:KluwerAcademicPublishers):1-14)转化哥伦比亚生态型拟南芥col-0(以下也成为野生型拟南芥)，收获种子(T0代的种子，该种子长成的植株为T1代植株)。
3、将步骤2收获的种子置于含50μg/mL卡那霉素的1/2MS培养基平板上，将平板先在4℃黑暗条件下放置4天，然后移入24℃的组织培养室(每天16小时光照)培养1周，然后移入24℃的温室进行培养并收获种子(T1代的种子，该种子长成的植株为T2代植株)。
4、将步骤3收获的种子置于含50μg/mL卡那霉素的1/2MS培养基平板上进行抗性筛选，并收获单拷贝的转基因植株得到的T2代抗性植株的种子(该种子长成的植株为T3代植株)。如果某一T1代植株得到的T2植株中抗性植株和非抗性植株的数量比约为3:1，说明该T1代植株为单拷贝的转基因植株。
5、将步骤4收获的种子置于含50μg/mL卡那霉素的1/2MS培养基平板上进行抗性筛选。如果某一T2代植株得到的T3代植株均为抗性植株，说明该T2代植株为纯合的转基因植株，该T2代植株及其后代为纯合的过表达株系，命名为T2代转AtVDAC3拟南芥。
采用同样的方法将空载体pCanG-Myc转入野生型拟南芥中，培育，得到T2代转pCanG-Myc拟南芥。
三、分子鉴定
随机取两个T2代转AtVDAC3拟南芥株系AtVDAC3-1和AtVDAC3-2的2周龄幼苗，取野生型拟南芥(col0)植株的2周龄幼苗，提取总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板对各个株系的植株中AtVDAC3基因的表达量进行PCR鉴定，采用Actin2基因作为内参基因，以野生型拟南芥中AtVDAC3基因的表达量的表达量作为1，计算其它各个株系中AtVDAC3基因的相对表达量。
用于鉴定AtVDAC3基因的引物序列如下：
AtVDAC3-qPCR-FW：5’-CATCACTGTCGGAACTCA-3’；
AtVDAC3-qPCR-Rv：5’-ACCTTGGCACTCTTATCG-3’。
用于鉴定Actin2基因的引物序列如下：
Actin2-qPCR-FW:5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’；
Actin2-qPCR-Rev:5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。
进行三次重复实验，取平均值，结果见图3，可以看出，与野生型拟南芥相比，T2代转AtVDAC3拟南芥株系AtVDAC3-1和AtVDAC3-2中AtVDAC3基因的表达量显著增高。
采用上述方法检测T2代转pCanG-Myc拟南芥，结果与野生型拟南芥无显著差异。
将上述T2代的种子收种、播种，得到T3代。
四、转AtVDAC3拟南芥的抗盐性鉴定
将T3代转AtVDAC3拟南芥株系AtVDAC3-1、T3代转AtVDAC3拟南芥株系AtVDAC3-2、野生型拟南芥(col-0)和T3代转pCanG-Myc拟南芥的种子，每个株系50个种子，实验重复3次，结果取平均值。将各株系种子分别进行如下抗盐性鉴定：
1、将各株系种子用10％漂白剂进行表面灭菌，然后用无菌水洗涤3次。
2、分组处理
实验组：将无菌种子悬浮在0.15g/100mL的琼脂糖水溶液中并铺板到含200mMNaCl的1/2MS培养基平板上，将平板在4℃黑暗条件下放置3天，然后移入24℃的组织培养室(每天16小时光照)进行萌发观察。
对照组：将无菌种子悬浮在0.15g/100mL的琼脂糖水溶液中并铺板到1/2MS培养基平板上，将平板在4℃黑暗条件下放置3天，然后移入24℃的组织培养室(每天16小时光照)进行萌发观察。
结果如图4(纵坐标为萌发率，横坐标为生长时间)，可以看出，在对照组处理(正常培养)中，各个株系的植物的生长状态没有显著差异；在实验组处理中(盐胁迫培养)，T3代转AtVDAC3拟南芥株系AtVDAC3-1和T3代转AtVDAC3拟南芥株系AtVDAC3-2的萌发状态显著优于野生型拟南芥。
T3代转pCanG-Myc拟南芥与野生型拟南芥无显著差异。
上述结果表明，AtVDAC3基因能够增加植物的抗盐性。

Claims (10)

1.如下1)-3)中任一种物质在调控植物抗逆性中的应用：
1)蛋白；
2)编码蛋白的DNA分子；
3)含有编码蛋白的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
所述蛋白为如下(1)或(2)：
(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
2.如下1)-3)中任一种物质在培育抗逆植物中的应用：
1)蛋白；
2)编码蛋白的DNA分子；
3)含有编码蛋白的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
所述蛋白为如下(1)或(2)：
(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述编码蛋白的DNA分子是如下1)至4)中任一所述的DNA分子：
1)序列表中序列1所示的DNA分子；
2)序列表中序列1第1-822位核苷酸；
3)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
4)与1)或2)所限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述调控植物抗逆性为提高植物抗逆性。
5.一种培育抗逆性提高转基因植物的方法，包括如下步骤：将蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物的抗逆性高于所述目的植物；
所述蛋白为如下(1)或(2)：
(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述蛋白的编码基因通过重组载体导入目的植物；
所述重组载体将编码所述蛋白的DNA分子插入表达载体中，得到表达所述蛋白的载体。
7.一种培育抗逆性提高植物的方法，包括如下步骤：将权利要求5或6所述方法获得的转基因植物与出发植物杂交，获得抗逆性高于所述出发植物的杂交后代。
8.根据权利要求1-4中任一所述的应用或权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：所述抗逆性为抗盐性。
9.根据权利要求1-4中任一所述的应用或权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为豆科植物或十字花科植物。
10.一种重组载体，为将编码蛋白的DNA分子插入表达载体中，得到表达蛋白的重组载体；
所述蛋白为如下(1)或(2)：
(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
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