CN114437191A

CN114437191A - 一个依赖电压的阴离子通道蛋白OsVDAC4及其在调控水稻雄性不育中的应用

Info

Publication number: CN114437191A
Application number: CN202210207259.8A
Authority: CN
Inventors: 周炼; 韩靖鸾; 刘耀光; 祝钦泷; 董景芳; 陈洛; 赵均良; 刘斌
Original assignee: Rice Research Institute Guangdong Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Rice Research Institute Guangdong Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-03-04
Filing date: 2022-03-04
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2042-03-04
Also published as: CN114437191B

Abstract

本发明公开了一个依赖电压的阴离子通道蛋白OsVDAC4及其在调控水稻雄性不育中的应用。依赖电压的阴离子通道蛋白OsVDAC4，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其特征在于，定位于细胞核和细胞质，在酵母细胞中与OsBVF1蛋白互作。本发明首次证明了水稻依赖电压的阴离子通道蛋白OsVDAC4是水稻雄性发育的功能基因，该基因序列变异会导致水稻雄性不育。因此，OsVDAC4生物学功能的研究对于水稻雄性不育分子机制的深入解析有重要的参考意义，为水稻雄性不育遗传工程的应用提供了有潜力的基因。

Description

一个依赖电压的阴离子通道蛋白OsVDAC4及其在调控水稻雄性不育中的应用

技术领域：

本发明属于水稻雄性不育遗传工程技术领域，具体涉及一种依赖电压的阴离子通道蛋白在调控水稻雄性不育中的应用。

背景技术：

杂交稻掀起了水稻生产的第二次“绿色革命”，极大地提高了水稻单产，为保障我国乃至全世界人民的粮食安全作出了重要贡献。随着时代的发展，杂交稻的生产模式也在不断进步，从三系配套(不育系、恢复系、保持系)到两系杂交(不育系、恢复系)，再到如今以遗传工程雄性不育系为遗传工具的第三代杂交水稻，杂交制种变得更加稳定、便捷和高效。未来，超级杂交稻育种将继续面临人口增加、耕地面积减少以及环境恶化的挑战，相关研究需求仍迫在眉睫。

花药是水稻的雄性生殖器官，包含两个药室，再往内依次是花粉囊和花粉粒。花药的正常发育对水稻开花和种子形成至关重要，其育性的调控涉及基因、激素和环境等多个层面，是杂交稻生产中最关键的环节。迄今为止，已报道的参与水稻发药发育的基因多达80个以上，但是整个分子调控网络仍不完整。

依赖电压的阴离子通道蛋白(voltage-dependent anion channels,VDACs)是广泛存在于真核生物的一类孔蛋白，主要存在于线粒体外膜，也被报道定位于细胞质膜、核膜、高尔基体和内质网等，参与能量代谢、细胞程序性死亡、胁迫响应和调控生长发育等过程。由于物种、生理结构和细胞状态的不同，VDACs的定位可能不同；而同一物种中VDACs异构体的不同定位，可能与其功能差异有关。VDACs的序列相似性非常小，但它们都能形成类似的β-桶状结构。水稻OsVDAC4编码的蛋白属于porin3超家族。

基因编辑技术是近些年兴起的一项分子生物学技术，能够快速准确地对目的基因进行敲除、插入和替换，已广泛应用于植物分子遗传工程改良领域。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供依赖电压的阴离子通道蛋白OsVDAC4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的依赖电压的阴离子通道蛋白OsVDAC4由基因Os01g0715500(OsVDAC4基因)编码，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的依赖电压的阴离子通道蛋白OsVDAC4，其蛋白特征是，在亚细胞水平定位于细胞核和细胞质，在酵母细胞中与OsBVF1蛋白发生相互作用。

本发明通过构建OsVDAC4融合GFP的瞬时表达载体，与核定位Marker共转化水稻原生质体，通过激光共聚焦显微镜观察拍照，通过荧光信号显示OsVDAC4的亚细胞定位情况。结果表明OsVDAC4主要定位于细胞核，部分定位于细胞质。

本发明通过将OsVDAC4连接pGADT7载体，与OsBVF1诱饵载体共转酵母感受态，菌液分别涂布SD/-Leu/-Trp二缺培养基和SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His四缺培养基。菌落的生长情况表明，OsVDAC4与OsBVF1确实存在相互作用。

本发明的第二个目的是提供依赖电压的阴离子通道蛋白OsVDAC4的编码基因-OsVDAC4基因在调控水稻雄性不育中的应用。

优选，是变异OsVDAC4基因使得水稻无花粉形成，雄性不育。

利用CRISPR-GE(http://skl.scau.edu.cn/)网站，选择OsVDAC4编码区序列设计双靶点引物。其中第一个靶点位于第一个外显子，连接OsU6a-sgRNA。第二个靶点位于第三个外显子，连接OsU6b-sgRNA。两个sgRNA依序串联到双元载体pYLCRISPR/Cas9P_ubi-H，命名为VDAC4-Cas9。然后载体质粒通过农杆菌介导的遗传转化技术，转化ZH11。转基因植株通过潮霉素扩增和靶点序列的扩增测序，来确定是否发生编辑。依赖电压的阴离子通道蛋白OsVDAC4基因编辑纯合突变株系的花药表型，即无花粉形成。其在自然环境下可以接受外来花粉形成籽粒，因而可以作为构建人工不育系的候选基因。

本发明的第三个目的是提供一种调控水稻雄性不育的方法，其是将OsVDAC4基因变异，使得水稻无花粉形成，使得雄性不育。

本发明有益效果如下

1.本发明首次证明了水稻依赖电压的阴离子通道蛋白OsVDAC4是水稻雄性发育的功能基因，该基因序列变异会导致水稻雄性不育。因此，OsVDAC4生物学功能的研究对于水稻雄性不育分子机制的深入解析有重要的参考意义。

2.本发明提供了一种利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建水稻雄性不育植株的方法。应用于杂交制种将能极大程度保证种子的杂合度。

附图说明：

图1是OsVDAC4的蛋白基序示意图及蛋白三维结构模型；

图2是用于研究OsVDAC4亚细胞定位情况的载体图谱；

图3是OsVDAC4的蛋白的亚细胞定位情况；

图4是利用酵母双杂交技术证明OsVDAC4与OsBVF1互作；

图5是OsVDAC4基因编辑载体的靶点设计及编辑株系的序列变异情况；

图6是OsVDAC4基因编辑株系的花药形态。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：

1.OsVDAC4的蛋白基序搜索及蛋白三维结构预测

OsVDAC4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，在MOTIF网站(https://www.genome.jp/tools/motif/)进行蛋白基序搜索。依据搜索结果，绘制OsVDAC4的蛋白基序示意图，OsVDAC4蛋白全长317个氨基酸，其中45-310位为porin3结构域(图1A)。

利用OsVDAC4的氨基酸序列在SWISS-MODEL网站(https://swissmodel.expasy.org/interactive)进行蛋白三维结构预测，其结构如图1B所示。结果表明OsVDAC4蛋白也能够形成典型的桶状结构。

2、OsVDAV4的亚细胞定位

本发明以日本晴花药为样品，提取其总RNA，再将RNA反转录成cDNA，以该逆转录产物为模板进行PCR扩增，获得OsVDAC4的cDNA片段(其CDS序列如SEQ ID NO.2所示)。瞬时表达载体pYL322d1-eGFPn(载体图谱如图2A所示)和pYL322d1-eGFPc(载体图谱如图2B所示)用内切酶Pst I线性化后，纯化回收获得322d1-eGFPn-Pst I和322d1-eGFPc-Pst I。通过Ω-PCR程序将VDAC4-GFP-F/R扩增产物(以上述逆转录产物为模板)与322d1-eGFPn-Pst I、GFP-VDAC4-F/R扩增产物(以上述逆转录产物为模板)与322d1-eGFPc-Pst I连接起来，形成环状质粒，连接产物热激转化DH5α感受态细胞，转化产物涂布氯霉素抗性的LB固体培养基。37℃培养过夜，挑3个单克隆，提取质粒，测序鉴定，阳性克隆的分别命名为VDAC4-GFP和GFP-VDAC4。引物序列如下：

VDAC4-GFP-F：actcagatctcgagctcaatggaggcggagacggagt(954bp)

VDAC4-GFP-R：ACTGCAGAATTCGAAGCT gggcttgagaaccagcga

GFP-VDAC4-F：GCTCAAGCTTCGAATTCTGCAatggaggcggagacggagt(957bp)

GFP-VDAC4-R：GCCCGCGGTACCGTCGACtcagggcttgagaaccagcga

分别将VDAC4-GFP和GFP-VDAC4与核定位Marker(GHD-mCherry)共同转化水稻原生质体。通过激光共聚焦显微镜精简和拍照。结果表明OsVDAC4主要定位于细胞质，部分定位于细胞核，具体可能是核膜(图3)。

3.酵母双杂交验证OsVDAC4的互作因子

OsBVF1的诱饵载体通过双酶切的方法构建：以日本晴花药为样品，提取其总RNA，再将RNA反转录成cDNA，以该逆转录产物为模板，利用引物对BD-BVF1Nde-F/R扩增OsBVF1全长cDNA序列，然后用Nde I和EcoR I分别双酶切扩增产物和pGBKT7载体，分别纯化回收酶切产物。随后用T4 DNA连接酶将纯化后的DNA片段和线性化载体连接，热激转化DH5α感受态细胞，转化产物涂布卡那霉素抗性的LB固体培养基。37℃培养过夜，利用引物对T7-PF/BD-3R进行菌落PCR，筛选阳性克隆。挑3个单克隆，提取质粒，测序鉴定，阳性克隆的质粒命名为BD-BVF1。

以日本晴花药为样品，提取其总RNA，再将RNA反转录成cDNA，以该逆转录产物为模板，利用引物对AD-VDAC4-F/R扩增OsVDAC4全长cDNA序列，通过ClonExpress II One StepCloning Kit(Vazyme公司)同源重组的方法将其连接到pGADT7载体(预先用Cla I单酶切)。连接产物热激转化DH5α感受态细胞，转化产物涂布氨苄霉素抗性的LB固体培养基。37℃培养过夜，利用引物对T7-PF/AD-3R进行菌落PCR，筛选阳性克隆。挑3个单克隆，提取质粒，测序鉴定，阳性克隆的质粒命名为AD-VDAC4。

将AD-VDAC4质粒分别与BD-BVF1和BD空载质粒共同转化Y2H酵母感受态细胞。菌液分别涂布SD/-Leu/-Trp二缺培养基和SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His四缺培养基，分别于2天和4天后拍照记录。结果表明，所有组合在酵母二缺培养基上均能正常生长，说明实验操作没有问题；只有AD-VDAC4和BD-BVF1的组合可以在酵母四缺培养基上生长，说明OsVDAC4和OsBVF1在酵母体内能发生相互作用(图4)。扩增及测序引物如下：

BD-BVF1Nde-F：ggccatatggagagggctaccacctcc(861bp)

BD-BVF1EcoR-R：CCGGAATTCctcttctaatgacgccttgca

AD-VDAC4-F：GAATTCCACCCGGGTGGGCATatggaggcggagacgga(957bp)

AD-VDAC4-R：AGCTCGATGGATCCCGTATCGtcagggcttgagaaccagc

T7-PF：TAATACGACTCACTATAGGGC

BD-3R：GAGTCACTTTAAAATTTGTAT

AD-3R：CGGGGTTTTTCAGTATCTACG

4.OsVDAC4基因编辑载体的构建

通过CRISPR-GE网站(http://skl.scau.edu.cn/)，在Os01g0715500基因第一个外显子和第三个外显子各设计一个靶点。按照Ma等(2015)文章所述方法：VDAC4-U6a-T1F和VDAC4-U6a-T1R，VDAC4-U6b-T2F和VDAC4-U6b-T2R分别于两个离心管中等量混合，通过90℃变性和室温退火的处理分别形成DNA双链接头VDAC4-T1和VDAC4-T2。VDAC4-T1和pYLsgRNA-OsU6a(由刘耀光实验室提供，GENBANKAccession：KR029105)，VDAC4-T2和pYLsgRNA-OsU6b(由刘耀光实验室提供，GENBANKAccession：KR029107)通过边切边连的方法分别连接为VDAC4-U6a和VDAC4-U6b。以VDAC4-U6a连接产物为模板进行两轮PCR：(1)第一轮使用文中提供的引物U-F与VDAC4-U6a-T1R，gR-R与VDAC4-U6a-T1F进行两管扩增；(2)将第一轮两管扩增产物混合并适当稀释作为模板，使用文中提供的引物对Pps-GGL/Pgs-GG2，进行表达盒序列VDAC4-U6a-sgRNA的扩增。同时，以VDAC4-U6b连接产物为模板进行两轮PCR：(1)第一轮使用文中提供的引物U-F/与VDAC4-U6b-T2R，gR-R与VDAC4-U6b-T2F进行两管扩增；(2)将第一轮两管扩增产物混合并适当稀释作为模板，使用文中提供的引物对Pps-GG2/Pgs-GGR，进行表达盒序列VDAC4-U6b-sgRNA的扩增。将VDAC4-U6a-sgRNA和VDAC4-U6b-sgRNA分别纯化回收并等量混合，通过边切边连的方法串联插入双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H(由刘耀光实验室提供，GENBANK Accession：KR029109)，获得载体质粒VDAC4-Cas9。提取阳性克隆的质粒，通过测序进行验证。测序完全正确的质粒用于下一步的遗传转化。

参考文献：Ma X,Zhang Q,Zhu Q,Liu W,Chen Y,Qiu R,Wang B,Yang Z,Li H,LinY,Xie Y,Shen R,Chen S,Wang Z,Chen Y,Guo J,Chen L,Zhao X,Dong Z,Liu YG.ARobust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-Efficiency Multiplex GenomeEditing in Monocot and Dicot Plants.Mol Plant.2015Aug；8(8):1274-84.

然后载体质粒VDAC4-Cas9通过农杆菌介导的遗传转化技术，转化ZH11。转基因植株通过潮霉素扩增和靶点序列的扩增测序，来确定是否发生编辑。获得转基因阳性植株Cas11和Cas37。

靶点引物序列如下：

VDAC4-U6a-T1F：GCCggaggcggagacggagtgca

VDAC4-U6a-T1R：AAACtgcactccgtctccgcctc

VDAC4-U6b-T2F：GTTgaagagcaataatgtgatgc

VDAC4-U6b-T2R：AAACgcatcacattattgctctt

U-F：CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG

gR-R：CGGAGGAAAATTCCATCCAC

PPs-GGL：TTCAGAggtctcTctcgACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG

Pgs-GG2：AGCGTGggtctcGtcagggTCCATCCACTCCAAGCTC

Pps-GG2:TTCAGAggtctcTctgacacTGGAATCGGCAGCAAAGG

Pgs-GGR：AGCGTGggtctcGaccgACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC

5.OsVDAC4基因编辑株系的序列变异分析

在靶点上下游各100-200bp处设计扩增引物，以阳性转基因植株gDNA为模板进行PCR扩增，对PCR产物进行测序，测序结果通过CRISPR-GE网站(http://skl.scau.edu.cn/)的DSDecodeM板块或者手动进行解码，分析各个靶点的基因编辑情况。扩增测序引物如下：

VDAC4U6a-TF：CATCTCACAACCAGCTCCT(385bp)

VDAC4U6a-TR：GATGAAGAGCGCGTGTA

VDAC4U6b-TF：GCAGATTGCGTTGGATATCT(427bp)

VDAC4U6b-TR：CTTCCCAGCTGTCTGGT

结果如图5所示，从图5B可以看出，与野生型参考序列相比，OsVDAC4-Cas11的基因组序列在OsVDAC4第一个靶点PAM上游第6个碱基处有一个A/T的异源纯合插入，在第二个靶点PAM上游第三个碱基处有一个A插入/G缺失的异源纯合突变，会导致OsVDAC4编码序列的变异。OsVDAC4-Cas37的基因组序列在OsVDAC4第一个靶点PAM上游第9个碱基处发生24碱基的杂合缺失，在第二个靶点PAM上游第三个碱基处发生一个GA/T的异源纯合缺失，会导致OsVDAC4编码序列的变异。

6.OsVDAC4基因编辑株系的花药形态观察

选取转基因阳性植株Cas11、Cas37以及野生型水稻ZH11发育成熟的小花，用镊子或小刀去掉内外粰，将整个花药和柱头剥出，在解剖镜下进行观察和拍照。结果如图6所示，从图6可以看出，与野生型相比，Cas11和Cas37的柱头没有明显变异，但花药瘦小发白；取单个花药放大观察，会发现Cas37的花粉囊呈透明状，药室空瘪，内无成熟花粉粒。说明突变OsVDAC4基因可以导致水稻花药无花粉形成，也即水稻雄性不育。

序列表

<110> 广东省农业科学院水稻研究所

<120> 一个依赖电压的阴离子通道蛋白OsVDAC4及其在调控水稻雄性不育中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 317

<212> PRT

<213> 稻(Oryza sativa)

<400> 1

Met Glu Ala Glu Thr Glu Cys Lys Val Pro Gly Val Tyr Ser Glu Thr

1 5 10 15

Gly Ile Pro Val Glu Asp Pro Ala Pro Gly Leu Asn Ser Asp Val Ser

20 25 30

Lys Lys Asp Ala Pro Pro Ala Val Ala Ala Pro Gly Pro Gly Leu Tyr

35 40 45

Phe Glu Ile Gly Lys Lys Ala Arg Asp Leu Leu Tyr Lys Asp Phe His

50 55 60

Thr Asp Gln Lys Phe Thr Leu Thr Thr Tyr Thr Asn Asn Gly Val Val

65 70 75 80

Ile Thr Ala Ala Ser Thr Met Lys Asp Glu Ala Ile Phe Ser Glu Ile

85 90 95

Gln Thr Lys Leu Lys Ser Asn Asn Val Met Leu Asp Val Lys Ala Thr

100 105 110

Ser Asp Ser Gln Val Leu Thr Thr Ile Thr Thr Glu Asp Leu Gly Val

115 120 125

Ser Gly Leu Lys Gln Ile Val Ser Leu Pro Phe Pro Tyr Gln Thr Ala

130 135 140

Gly Lys Ala Glu Leu Gln Tyr Leu His Asp Tyr Ala Gly Ile Ser Leu

145 150 155 160

Gly Val Gly Leu Thr Ser Lys Pro Leu Val Asn Leu Ser Gly Val Phe

165 170 175

Gly Asn Lys Ser Val Ala Val Gly Ala Asp Val Ala Val Asp Thr Ser

180 185 190

Thr Gly Asp Phe Thr Lys Tyr Asp Ala Gly Leu Thr Ile Asn Asn Ser

195 200 205

Asp Leu Ala Ala Asp Leu Thr Leu Asn Asn Lys Gly Asp Ser Leu Thr

210 215 220

Ala Ser Tyr Tyr His Leu Val Asn Lys Glu Ser Gly Thr Ala Ala Gly

225 230 235 240

Ala Glu Leu Thr His Ser Phe Ser Thr Lys Glu Asn Thr Leu Ser Phe

245 250 255

Gly Met Gln His Ala Leu Asp Pro Leu Thr Thr Val Lys Ala Arg Tyr

260 265 270

Asn Asn His Gly Met Val Ser Ala Leu Ile Gln His Glu Trp Arg Pro

275 280 285

Lys Ser Phe Leu Thr Leu Ser Ala Glu Val Asp Thr Lys Ala Ile Asp

290 295 300

Lys Ala Ser Lys Val Gly Leu Ser Leu Val Leu Lys Pro

305 310 315

<210> 2

<211> 954

<212> DNA

<213> 稻(Oryza sativa)

<400> 2

atggaggcgg agacggagtg caaggtcccc ggcgtctact ccgagaccgg cattcccgtg 60

gaggatccgg ctcccggcct caactccgac gtcagcaaga aggacgcccc tcctgccgtt 120

gcggcgccgg gtcccggcct ctacttcgag atcggcaaga aggccagaga tcttctgtac 180

aaggacttcc acacggacca gaagtttacc ctgaccacct acaccaacaa tggagttgta 240

atcactgctg caagcacaat gaaagatgaa gctatcttta gcgagatcca gaccaagctg 300

aagagcaata atgtgatgct ggatgtgaaa gctacttccg attctcaggt gttaactaca 360

atcacaactg aagaccttgg tgtatcaggc ttgaagcaaa tcgtatcact tccttttcca 420

taccagacag ctgggaaggc tgaactccag tacctgcatg actacgctgg tatcagcctc 480

ggtgttggcc tgacctcaaa gcctttggtt aacctttctg gtgtgttcgg caacaaatct 540

gttgctgtcg gtgctgatgt tgcagttgat acttctactg gggacttcac caagtacgat 600

gctggactga ccatcaacaa ttcagatctt gctgctgatc tgacgctgaa caacaaaggg 660

gacagcctca ctgcgtccta ctaccatctg gtgaacaaag agtcaggtac ggctgctgga 720

gcggagctga cccacagctt ctcgaccaag gagaacaccc tcagcttcgg gatgcagcac 780

gccctggacc ctctcactac cgtgaaggcg cgctacaaca accacggcat ggtcagcgcc 840

ctcatccagc acgagtggag acccaagtct ttcttaacgc tctccgccga ggtcgacacc 900

aaggcgatcg acaaggcctc caaggttgga ctgtcgctgg ttctcaagcc ctga 954

Claims

1.依赖电压的阴离子通道蛋白OsVDAC4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的依赖电压的阴离子通道蛋白OsVDAC4的编码基因-OsVDAC4基因。

3.根据权利要求2所述的OsVDAC4基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.权利要求2或3所述的OsVDAC4基因在调控水稻雄性不育中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，是变异OsVDAC4基因使得水稻无花粉形成，雄性不育。

6.一种调控水稻雄性不育的方法，其特征在于，是将权利要求2或3所述的OsVDAC4基因变异，使得水稻无花粉形成，雄性不育。