JP2002537000A - トウモロコシアデノシンデアミナーゼｃＤＮＡおよびその使用 - Google Patents

トウモロコシアデノシンデアミナーゼｃＤＮＡおよびその使用

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JP2002537000A JP2000601173A JP2000601173A JP2002537000A JP 2002537000 A JP2002537000 A JP 2002537000A JP 2000601173 A JP2000601173 A JP 2000601173A JP 2000601173 A JP2000601173 A JP 2000601173A JP 2002537000 A JP2002537000 A JP 2002537000A
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プラモッド ビー． マハジャン，
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パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル， インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、単離されたトウモロコシＡＤＡの核酸およびそれらのコードするタンパク質を提供する。本発明は、植物のトウモロコシＡＤＡ濃度および／または組成を変更することに関する方法および組成物を提供する。本発明はさらに、組換え発現カセット、宿主細胞、トランスジェニック植物および抗体組成物を提供する。好ましい実施形態では、本発明の植物は、単子葉植物または双子葉植物であり、より好ましくはトウモロコシ、ダイズ、ヒマワリ、ソルガム、カノーラ、コムギ、アルファルファ、ワタ、イネ、オオムギおよびキビからなる群より選択される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、一般に、植物分子生物学に関する。より詳細には、本発明は、植物
におけるそれらの発現を調節するための核酸および方法に関する。より詳細には
、本発明は、アデノシンデアミナーゼのような機能を有するポリペプチドをコー
ドする核酸に関する。
【０００２】 （発明の背景） アデノシンデアミナーゼ（本明細書中以下でＡＤＡと略す；ＥＣ３．５．４．
４．）は、アデノシンおよび２’デオキシアデノシンの、対応するイノシン誘導
体への不可逆的な脱アミノを触媒する。この酵素は、プリン代謝のために不可欠
である。ＡＤＡ欠損は、重症複合型免疫不全（すなわち遺伝障害であるＳＣＩＤ
）を生じる。ＤＮＡ合成との干渉をもたらす基質の累積は、ＡＤＡ欠損において
生じる損傷の基礎となる（Ｇｉｂｌｅｔｔ，Ｅ．、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＹ Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ４５１：１−８、１９８５）。ＡＤＡのレベ
ルはまた、種々の白血病、リンパ腫、ＡＩＤＳ、および貧血において影響を受け
る（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｉｎ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏ
ｆ Ｐｕｒｉｎｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅ
ｆｉｃｉｅｎｃｙ、Ｇｅｏｒｇｅ Ｌ．Ｔｒｉｔｓｃｈ編、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第４
５１巻、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ．ｏｆ Ｓｃｉ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ
Ｙ、１９８５）。その結果として、ＡＤＡは、哺乳動物系において詳細に研究さ
れた（Ｄａｄｄｏｎａ，ＰＥおよびＫｅｌｌｅｙ，ＷＮ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．２９：９１−１０１、１９８０；Ｗｉｌｓｏｎ，ＤＫら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２５２：１２７８−１２８４、１９９１；Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ，Ｒ
．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｅｓ．３３（増補）：３５−４１、１９９３；Ｍａｒ
ｋｅｒｔ，ＭＬ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ５，１４１−１５７，１
９９４；Ｍｏｒｇａｎ ＲＡおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，ＷＦ Ａｎｎ Ｒｅｖ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７、１９９３；Ｖｅｇａ，ＭＡ Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１３８：２５３−２６０、１９９２）。
ＡＤＡはまた、無脊椎動物、細菌および真菌において研究された（Ｓｃｈｏｍｂ
ｕｒｇ，Ｄ．およびＳａｌｚｍａｎｎ，Ｍ．、Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｈａｎｄ
ｂｏｏｋ 第４巻、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、１９９１
）。しかし、ＡＤＡ活性は、オオムギ、キュウリ、アーティチョーク、ルピナス
のような植物において、または１７の異なる植物種からの趣旨においては検出さ
れなかった。植物はＡＤＡを含まないことさえ言及されている（Ｄａｎｃｅｒ
ＪＥら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１４：１１９−１２９、１９９７）。
従って、ＡＤＡ遺伝子は、多細胞植物においては存在しないか、または厳格な発
達制御のもとでのみ発現されるということが、一般に容認される（Ｐｅｌｃｈｅ
ｒ，Ｌ．米国特許第５４７４９２９号、１９９３）。ＡＤＡ発現の厳格な制御は
、ＡＤＡ発現が細胞特異的な様式および発達制御された様式の両方で支配される
ことが見出された、マウス組織において示された（Ｃｈｉｎｓｋｙ ＪＭら、Ｄ
ｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ４２：１７２−１８３、１９９０）。
【０００３】 本発明のトウモロコシＡＤＡ遺伝子は、多細胞植物に存在することが報告され
た最初のＡＤＡ遺伝子である。トウモロコシＡＤＡの存在は、多くの利点を提供
する。トウモロコシＡＤＡは、形質転換実験における選択マーカーとして有用で
ある。形質転換した植物または植物細胞の選択において使用するために現在入手
可能な遺伝子の大部分は、抗生物質耐性遺伝子または除草剤耐性遺伝子のいずれ
かである。さらなる選択マーカー遺伝子に対する必要性が存在する。タバコ葉外
植片の成長は、２’−デオキシアデノシンおよびデオキシアデノシンのアナログ
により阻害されることが示された（Ｐｅｌｃｈｅｒ，Ｌ．米国特許第５４７４９
２９号、１９９３）。マウス細胞株由来のＡＤＡ遺伝子で形質転換されたタバコ
細胞は、デオキシアデノシンのアナログを含む培地において増殖することが示さ
れた（Ｐｅｌｃｈｅｒ，Ｌ．米国特許第５４７４９２９号、１９９３）。従って
、ＡＤＡ遺伝子は、形質転換された植物細胞の選択において有用であることが示
された。
【０００４】 本発明により提供されるトウモロコシＡＤＡ ｃＤＮＡ配列は、３’未翻訳領
域を含む。これらの領域は、トウモロコシ集団のＲＦＬＰマップにおけるトウモ
ロコシＡＤＡ遺伝子の遺伝子座をマッピングするために使用され得る、遺伝子特
異的プローブを作製する際に使用するために、適切である。本発明は、ＡＤＡ遺
伝子の選択マーカーとしての使用、３’未翻訳領域の遺伝子特異的プローブとし
ての使用、ならびに他の利点を提供する。
【０００５】 （発明の要旨） 一般に、トウモロコシＡＤＡに関する核酸およびタンパク質を提供することが
、本発明の目的である。１）：本発明のタンパク質の抗原性フラグメント、２）
：本発明の核酸を含むトランスジェニック植物、３）：本発明の核酸の発現をト
ランスジェニック植物において調節するための方法を提供することが、本発明の
目的である。
【０００６】 従って、１つの局面において、本発明は、（ａ）本発明のポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドに対して特定の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチド；およ
び（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド由来の特定の数の連続するヌク
レオチド含むポリヌクレオチド、からなる群から選択されたメンバーを含む単離
された核酸に関する。その単離された核酸は、ＤＮＡであり得る。
【０００７】 別の局面において、本発明は、プロモーターに作動可能に連結した、本発明の
核酸を含む組換え発現カセットに関する。
【０００８】 別の局面において、本発明は、上記の組換え発現カセットが導入された宿主細
胞に関する。
【０００９】 さらなる局面において、本発明は、本発明の単離された核酸によってコードさ
れる特定の数の連続するアミノ酸を有するポリペプチドを含む単離されたタンパ
ク質に関する。
【００１０】 別の局面において、本発明は、ストリンジェントな条件下で、本発明のポリヌ
クレオチドまたはこれらの相補体に選択的にハイブリダイズする特定の長さのヌ
クレオチド長のポリヌクレオチドを含む単離された核酸に関する。
【００１１】 別の局面において、本発明は、前出にて言及したライブラリーから増幅された
核酸を含む組換え発現カセットに関し、ここで、その核酸は、プロモーターに作
動可能に連結している。いくつかの実施形態において、本発明は、この組換え発
現カセットでトランスフェクトされた宿主細胞に関する。いくつかの実施形態に
おいて、本発明は、この宿主細胞から産生された本発明のタンパク質に関する。
【００１２】 なお別の局面において、本発明は、本発明の任意の単離された核酸に作動可能
に連結された植物プロモーターを含む組換え発現カセットを含むトランスジェニ
ック植物に関する。
【００１３】 （定義） 単位、接頭語、および記号は、ＳＩで容認された形態で示され得る。特に示さ
れない限り、核酸は、左から右へ、５’から３’の方向に、アミノ酸配列は、左
から右へ、アミノからカルボキシの方向に、それぞれ記載される。数値の範囲は
、その範囲を規定する数を含み、そして規定された範囲内の各整数を含む。アミ
ノ酸は、本明細書中において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨された、それら
の一般に公知の３文字記号または１文字記号のいずれかによって、言及され得る
。ヌクレオチドも同様に、それらの一般に受容された１文字コードによって言及
され得る。以下に規定されるその用語は、明細書全体を参照することによって、
より十分に規定される。
【００１４】 「増幅された」により、核酸配列の複数のコピーまたはその核酸配列に相補的
な複数のコピーの、その核酸配列の少なくとも１つを鋳型として使用しての、構
築を意味する。増幅系には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）系、リガーゼ連鎖
反応（ＬＣＲ）系、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ、Ｃａｎｇｅｎｅ、Ｍｉ
ｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ）、Ｑ−Ｂｅｔａ複製系、転写に基づく増
幅系（ＴＡＳ）、および鎖置換増幅（ＳＤＡ）が含まれる。例えば、Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐ
ｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｄ．Ｈ．Ｐｅｒｓｉｎｇら、編、
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａ
ｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９３）を参照のこと。増幅の産物は、アンプ
リコンと命名される。
【００１５】 用語「抗体」には、抗体の抗原結合形態（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2）に
対する参照が含まれる。用語「抗体」は、頻繁に、分析物（抗原）を特異的に結
合し、そしてそれを認識する免疫グロブリン遺伝子（単数もしくは複数）または
そのフラグメントによって実質的にコードされたポリペプチドをいう。しかし、
種々の抗体フラグメントが、インタクトな抗体の消化に関して規定され得るが、
当業者は、このようなフラグメントが、デノボで、化学的に、もしくは組換えＤ
ＮＡ法を使用してのいずれかで、合成され得ることを理解する。従って、用語抗
体はまた、本明細書で使用される場合、単鎖Ｆｖ、キメラ抗体のような抗体フラ
グメント（すなわち、異なる種由来の定常領域および可変領域を含む）、ヒト化
抗体（すなわち、すなわち非ヒトの供給源由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含
む）、および異種結合体抗体（例えば、二重特異的抗体）を含む。
【００１６】 用語「抗原」には、抗体が生成され得、そして／または抗体がそれに対して特
異的に免疫反応性である物質への参照が含まれる。抗原内の特異的な免疫反応性
部位は、エピトープまたは抗原決定基として公知である。これらのエピトープは
、ポリマー性組成物中のモノマー（例えば、タンパク質中のアミノ酸）の直線状
の配列であり得るか、またはより複雑な二次構造もしくは三次構造からなり得る
かもしくは含み得る。当業者は、全ての免疫原（すなわち、免疫応答を惹起し得
る物質）が抗原であることを認識する；しかし、いくつかの抗原（例えば、ハプ
テン）は、免疫原ではなく、キャリア分子に結合させることによって免疫原性に
され得る。特定の抗原と免疫的に反応性の抗体は、インビボで、または組換え法
（例えば、ファージもしくは類似のベクター中の組換え抗体のライブラリーの選
択）によって、生成され得る。例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：
１２７５−１２８１（１９８９）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：
５４４−５４６（１９８９）；ならびにＶａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ．１４：３０９−３１４（１９９６）を参照のこと。
【００１７】 本明細書中で使用される場合、「アンチセンス方向」は、アンチセンス鎖が転
写される方向でプロモーターに作動可能に連結される二重鎖ポリヌクレオチド配
列への参照を含む。アンチセンス鎖は、内因性の転写産物の翻訳がしばしば阻害
されるように内因性の転写産物に対して十分に相補的である。
【００１８】 本明細書中で使用される場合、「染色体領域」は、それが含むＤＮＡの直線状
セグメントへの参照によって測定され得る染色体の長さへの参照を含む。この染
色体領域は、２つの独特なＤＮＡ配列（すなわち、マーカー）への参照によって
規定され得る。
【００１９】 用語「保存的に改変された改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に
ついて適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体は、その
アミノ酸配列の同一の改変体または保存的に改変された改変体をコードする核酸
をいう。遺伝子コードの縮重に起因して、機能的に同一な多数の核酸が、所定の
任意のタンパク質をコードする。例えば、コドン、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよ
びＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドン
によって特定されるあらゆる位置において、コドンは、コードされるポリペプチ
ドを変更することなく、記載される対応するコドンのいずれかに変更され得る。
このような核酸の変異は、「非表現型変異」であり、そして保存的に改変された
変異の１つの種を示す。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配
列はまた、遺伝コードの参照により、核酸のあらゆる可能な非表現型変異を記載
する。当業者は、核酸中の各コドン（通常、メチオニンについての唯一のコドン
であるＡＵＧ；およびトリプトファンについての唯一のコドンであるＵＧＧを除
く）が機能的に同一の分子を生じるように改変され得ることを理解する。従って
、本発明のポリペプチドをコードする核酸の各非表現型変異は、記載される各ポ
リペプチド配列に内在し、そして本発明の範囲内である。
【００２０】 アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列中の単一のアミノ酸また
は小さな割合のアミノ酸を変更、付加または欠失する核酸、ペプチド、ポリペプ
チドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加が、「保存的に
改変された改変体」であることを理解する。ここで、その変更により、化学的に
類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換を生じる。従って、１〜１５個からなる整数
の群から選択される任意の数のアミノ酸残基が、このように変更され得る。従っ
て、例えば、１、２、３、４、５、７、または１０個の変更がなされ得る。保存
的に改変された改変体は、代表的に、それらが由来する改変されていないポリペ
プチド配列と類似の生物学的活性を提供する。例えば、基質特異性、酵素活性、
またはリガンド／レセプター結合は、一般に、そのネイティブ基質について、ネ
イティブタンパク質の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８
０％、または９０％である。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表
は、当該分野で周知である。
【００２１】 以下の６つの群は、各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む： １）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）； ２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）； ３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）； ４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）； ５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
および ６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。 Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ
ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙもまた、参照のこと。
【００２２】 特定の核酸に関して「コードする」または「コードされる」とは、特定のタン
パク質への翻訳についての情報を包含することを意味する。タンパク質をコード
する核酸は、その核酸の翻訳領域に非翻訳配列（例えば、イントロン）を含み得
るか、またはそのような介在する非翻訳配列を欠失し得る（例えば、ｃＤＮＡに
おけるように）。タンパク質がコードされるもととなる情報は、コドンの使用に
よって特定される。代表的に、アミノ酸配列は、「普遍（ユニバーサル）」遺伝
コードを使用して核酸によってコードされる。しかし、普遍コードの改変体（例
えば、何らの植物、動物、および真菌のミトコンドリア、細菌Ｍｙｃｏｐｌａｓ
ｍａ ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ、または繊毛Ｍａｃｒｏｎｕｃｌｅｕｓに存在する
もの）は、この核酸がこれらの中で発現される場合に使用され得る。
【００２３】 核酸が合成的に調製または変更される場合、核酸が発現される、目的の宿主の
既知のコドン選択（ｃｏｄｏｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を利用し得る。例えば
、本発明の核酸配列は、単子葉植物種および双子葉植物種の両方において発現さ
れ得るが、コドンの選択は異なることが示されている（Ｍｕｒｒａｙら、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７〜４９８（１９８９））ので、配列は、
単子葉または双子葉の特定のコドン選択およびＧＣ含量選択を考慮して改変され
得る。従って、特定のアミノ酸についてのトウモロコシの好ましいコドンは、ト
ウモロコシ由来の既知の遺伝子配列に由来し得る。トウモロコシ植物由来の２８
個の遺伝子についてのトウモロコシコドンの用法は、Ｍｕｒｒａｙら（前出）の
表４に列挙される。
【００２４】 本明細書中で使用される場合、特定のポリヌクレオチドまたはそのコードする
タンパク質を参照しての「全長配列」は、特定のタンパク質のネイティブ（非合
成）形態、内因性形態、生物学的に活性な形態の全アミノ酸配列を有することを
意味する。配列が全長であるか否かを決定するための方法は、当該分野で周知で
あり、ノーザンブロットまたはウエスタンブロット、プライマー伸長、Ｓ１保護
、およびリボヌクレアーゼ保護のような例示的な技術が挙げられる。例えば、Ｐ
ｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｌａｒｋ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ
（１９９７）を参照のこと。公知の全長相同（オルソロガス（ｏｒｔｈｏｌｏｇ
ｏｕｓ）および／またはパラロガス（ｐａｒａｌｏｇｏｕｓ））配列の比較はま
た、本発明の全長配列を同定するために使用され得る。さらに、代表的に、ｍＲ
ＮＡの５’および３’非翻訳領域に存在するコンセンサス配列は、ポリヌクレオ
チドの全長としての同定を補助する。例えば、コンセンサス配列、ＡＮＮＮＮＡ ＵＧ Ｇ（ここで、下線を付したコドンは、Ｎ末端メチオニンを表す）は、ポリヌ
クレオチドが完全な５’末端を有するか否かを決定することを補助する。３’末
端におけるコンセンサス配列（例えば、ポリアデニル化配列）は、ポリヌクレオ
チドが完全な３’末端を有するか否かを決定することを補助する。
【００２５】 本明細書中で使用される場合、核酸を参照しての「異種（の）」は、外来種か
ら生じる核酸、または同一種から生じる場合、意図的なヒトの介入によって、比
較におけるそのネイティブ形態および／または遺伝子座から実質的に改変される
核酸である。例えば、異種構造的遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターは
、構造的遺伝子の由来する種とは異なる種由来であり、または、同一種由来であ
る場合には、１つまたは両方がそれらの元々の形態から実質的に改変されている
。異種タンパク質は、外来種に由来し得、または同じ種に由来する場合には、意
図的なヒトの介入によってその元々の形態から実質的に改変されている。
【００２６】 「宿主細胞」は、ベクターを含み、そしてそのベクターの複製および／または
発現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核生物細
胞、または酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞、もしくは哺乳動物細胞のような真
核生物細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞は、単子葉植物細胞または双子葉
植物細胞である。特に好ましい単子葉宿主細胞は、トウモロコシ宿主細胞である
。
【００２７】 用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、互いに選択的にハイブリダイズさ
れる２つの一本鎖核酸配列によって形成される二重鎖核酸構造への参照を含む。
【００２８】 「免疫学的に反応性の条件」または「免疫反応性条件」とは、特定のエピトー
プに対して反応性の抗体が、特定のエピトープを含む反応混合物においてその抗
体が実質的に他の全てのエピトープに結合するよりも検出可能に大きい程度（例
えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）でそのエピトープに結合する条件を
意味する。免疫学的に反応性の条件は、抗体結合反応の形式に依存し、そして代
表的に、これらは免疫アッセイプロトコルに利用されるものである。免疫アッセ
イ形式および条件の説明については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）
を参照のこと。
【００２９】 細胞への核酸の挿入の状況における、用語「導入される」は、「トランスフェ
クション」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、そして核酸の原核
生物細胞または真核生物細胞への取込みへの参照を含む。ここで、この核酸は、
その細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチドまたはミトコンド
リアＤＮＡ）へ取込まれ得るか、自律複製レプリコンへ変換され得るか、または
一過性に発現され得る（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）。
【００３０】 用語「単離された（した）」は、核酸またはタンパク質のような物質をいい、
これらの物質は：（１）その天然に存在する環境において見出されるように、そ
れに通常付随するかまたはそれと相互作用する成分を実質的または本質的に含ま
ない。その単離された物質は、必要に応じて、その天然環境においてその物質と
ともに見出されない物質を含む。；あるいは（２）その物質がその天然環境にあ
る場合、その物質は、意図的なヒトの介入によって合成的に（非天然的に）組成
物に変更され、そして／またはその環境において見出される物質についてネイテ
ィブでない細胞中の位置（例えば、ゲノムまたは非細胞のオルガネラ）に配置さ
れる。その合成物質を生じるためのこの変更は、その天然状態内の、またはそこ
から除去された物質において実施され得る。例えば、天然に存在する核酸は、そ
の起源である細胞内で実施されるヒトの介在によって、変更される場合か、また
は変更されたＤＮＡから転写される場合に、単離された核酸となる。例えば、Ｃ
ｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔ
ｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ、Ｋ
ｍｉｅｃ、米国特許第５，５６５，３５０号；Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｈｏｍｏｌｏｇ
ｏｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ
Ｃｅｌｌｓ；Ｚａｒｌｉｎｇら、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８を参照のこと
。同様に、天然に存在する核酸（例えば、プロモーター）は、その核酸に対して
ネイティブでないゲノムの遺伝子座に、天然に存在しない手段によって導入され
る場合に、単離されたことになる。本明細書中で定義される「単離された（した
）」核酸はまた、「異種」核酸としてもいわれる。
【００３１】 特に示されない限り、用語「トウモロコシＡＤＡ核酸」とは、本発明の核酸で
あり、そしてトウモロコシＡＤＡポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレ
オチド（「トウモロコシＡＤＡポリヌクレオチド」）を意味する。「トウモロコ
シＡＤＡ遺伝子」とは、本発明の遺伝子であり、そして全長トウモロコシＡＤＡ
ポリヌクレオチドの異種ゲノム形態を参照する。
【００３２】 本明細書中で使用される場合、特定のマーカーに関して、「〜によって規定さ
れ、そして〜を含む染色体領域内に局在した」とは、示されるマーカーによって
規定され、そしてそのマーカーを含む染色体の連続する長さへの参照を含む。
【００３３】 本明細書中で使用される場合、「マーカー」は、染色体上の独特の位置を同定
するために役立つ染色体上の遺伝子座への参照を含む。「多型性マーカー」は、
複数の形態（対立遺伝子）で現れるマーカーへの参照を含み、その結果，そのマ
ーカーの異なる形態は、それらが同種の対において存在する場合，従われるべき
その対において各々の染色体の伝達を可能にする。遺伝子型は、１つまたは複数
のマーカーの使用によって規定され得る。
【００３４】 本明細書中で使用される場合、「核酸」は、一本鎖形態または二本鎖形態のい
ずれかにおけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーへ
の参照を含み、そして特に限定されない限り、この用語は，天然に存在するヌク
レオチド（例えば、ペプチド核酸）と類似の様式で一本鎖核酸にハイブリダイズ
する点で、天然のヌクレオチドの本質的な性質を有する公知のアナログを含む。
【００３５】 「核酸ライブラリー」とは、特定の生物のゲノムの転写された画分全体を含み
、そして実質的にそれを代表する単離されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子の収集物を
意味する。例示的な核酸ライブラリー（例えば、ゲノムライブラリーおよびｃＤ
ＮＡライブラリー）の構築は，標準的な分子生物学の参考文献（例えば、Ｂｅｒ
ｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
、第１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ
，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻（１９
８９）；ならびにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，
Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との共同事業（１９
９４））において教示される。
【００３６】 本明細書中で使用される場合、「作動可能に連結された」は、プロモーターと
第２の配列との間の機能的連結への参照を含む。ここで、そのプロモーター配列
は、第２の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始し、そして媒介する。一般に
、作動可能に連結された、は、連結される核酸配列が隣接し、そして２つのタン
パク質コード領域を連結することが必要であれば、隣接し、かつ同じリーディン
グフレーム中にあることを意味する。
【００３７】 本明細書中で使用される場合、用語「植物」は、植物全体、植物器官（例えば
、葉、茎、根など）、種子、および植物細胞、それらの子孫に対する言及を含む
。本明細書中で使用される場合、植物細胞としては、種子、培養懸濁物、胚、分
裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉、および小
胞子が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の方法に使用され得る植物の
科は一般に、単子葉植物および双子葉植物の両方を含めて、形質転換技術を施す
ことのできる限り広い科の高等植物である。特に好ましい植物は、Ｚｅａ ｍａ
ｙｓである。
【００３８】 本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボポリヌ
クレオチド、リボポリヌクレオチド、またはストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件下で、天然に存在するヌクレオチドと実質的に同じヌクレオチド配
列に対しハイブリダイズし、および／もしくは、天然に存在するヌクレオチドと
同じアミノ酸への翻訳を許容するという点で天然リボヌクレオチドの本質的性質
を保有するそれらのアナログに対する言及を含む。ポリヌクレオチドは、ネイテ
ィブまたは異種の構造遺伝子または調節遺伝子の全長または部分配列であり得る
。別に示されない限り、この用語は、指定した配列およびその相補配列に対する
言及を含む。従って、安定性についてまたは他の理由について改変された骨格を
有するＤＮＡまたはＲＮＡは、この用語が本明細書中で意図するような「ポリヌ
クレオチド」である。さらに、ほんの２つの例を挙げると、イノシンのような異
常な塩基またはトリチル化塩基のような改変塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、
この用語が本明細書中で使用されるようなポリヌクレオチドである。当業者に対
して公知な多くの有用な目的を与えるＤＮＡおよびＲＮＡに対して、多種多様の
改変が行なわれていることは認識される。本明細書中で使用されるような用語ポ
リヌクレオチドは、このような化学的、酵素的、または代謝的に改変された形態
のポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞（とりわけ、単純細胞および
複雑細胞を含む）に特有な化学形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。
【００３９】 用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中で
アミノ酸残基のポリマーを言及するのに交換可能に使用される。この用語は、１
つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学アナ
ログであるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用
される。天然に存在するアミノ酸のそのようなアナログの本質的な性質は、タン
パク質の中に組み込まれたとき、そのタンパク質が、同じであるがすべて天然に
存在するアミノ酸からなるタンパク質に対して惹起される抗体に対して特異的に
反応性であることである。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパ
ク質」はまた、以下を含むがこれらに制限されない改変を含む：グリコシル化、
脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化お
よびＡＤＰ−リボシル化。周知かつ上記のように、ポリペプチドが必ずしも完全
に直鎖状でないことが認識される。例えば、ポリペプチドは、ユビキチン化の結
果として分岐し得、そしてポリペプチドは、一般的には翻訳後事象（天然のプロ
セシング事象および自然には生じない人為的操作によって引き起こされた事象を
含む）の結果として、分岐を伴うかまたは伴わない環状であり得る。環状ポリペ
プチド、分岐ポリペプチド、および分岐した環状ポリペプチドは、非翻訳自然プ
ロセスおよび完全合成的な方法によっても合成され得る。さらに、本発明は、本
発明のタンパク質のメチオニン含有アミノ末端改変体およびメチオニンのないア
ミノ末端改変体の両方の使用を意図する。
【００４０】 本明細書中で使用される場合、「プロモーター」は、転写の開始から上流にあ
り、そして転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認
識および結合に関与するＤＮＡ領域に対する言及を含む。「植物プロモーター」
は、起源が植物細胞ではなくても、植物細胞の中で転写の開始が可能なプロモー
ターである。例示的な植物プロモーターとしては、以下から得られる植物プロモ
ーターが挙げられるがこれらに制限されない：植物、植物ウイルス、およびＡｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＲｈｉｚｏｂｉｕｍのような、植物細胞の中で発
現する遺伝子を含む細菌。発生制御下にあるプロモーターの例としては、特定の
組織（例えば、葉、根、または種子）中で優先的に転写を開始するプロモーター
が挙げられる。そのようなプロモーターは、「組織優先的」と言及される。転写
を特定の組織中のみで開始するプロモーターは、「組織特異的」と言及される。
「細胞型」特異的プロモーターは、１つ以上の器官中の特定の細胞型（例えば、
根または葉の維管束細胞）において発現を主に駆動する。「誘導性」または「セ
制御」プロモーターは、環境的な制御下にあるプロモーターである。誘導性プロ
モーターによる転写をもたらし得る環境条件の例としては、嫌気的条件または光
の存在が挙げられる。組織特異的、組織優先的、細胞型特異的および誘導性プロ
モーターは、「非構成的」プロモーターのクラスを構成する。「構成的」プロモ
ーターは、ほとんどの環境条件下で活性であるプロモーターである。
【００４１】 用語「トウモロコシＡＤＡポリペプチド」は、本発明のポリペプチドであり、
そしてグリコシル化形態または非グリコシル化形態の１つ以上のアミノ酸配列を
いう。この用語はまた、そのフラグメント、改変体、ホモログ、対立遺伝子また
は前駆体（例えば、プレプロタンパク質またはプロタンパク質）を含む。「トウ
モロコシＡＤＡタンパク質」は、本発明のタンパク質であり、そしてトウモロコ
シＡＤＡポリペプチドを包含する。
【００４２】 本明細書中で使用される場合「組換え体」は、異種核酸の導入によって改変さ
れた細胞もしくはベクターまたはそのように改変された細胞に由来する細胞に対
する言及を含む。従って、例えば、組換え細胞は、ネイティブ（非組換え体）形
態の細胞中で同一の形態で見出されない遺伝子を発現するか、または他の場合に
は異常に発現されるか、過少発現されるか、もしくは全く発現されないネイティ
ブ遺伝子を意図的な人為的介入の結果として発現する。本明細書中で使用される
場合用語「組換え体」は、意図的な人的介入なしに起こる変化のような、天然に
存在する事象（例えば、自然変異、自然形質転換／形質導入／転移）による細胞
またはベクターの変更は含まない。
【００４３】 本明細書中で使用される場合「組換え発現カセット」は、宿主細胞中で特定の
核酸の転写を可能にする一連の特異的核酸エレメントを有する、組換え的または
合成的に生成された、核酸構築物である。組換え発現カセットは、プラスミド、
染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルスまたは核酸フラグ
メント中に組み込まれ得る。代表的に、発現ベクターの組換え発現カセット部分
は、他の配列の中でも、転写されるべき核酸、およびプロモーターを含む。
【００４４】 用語「残基」または「アミノ酸残基」または「アミノ酸」は、タンパク質、ポ
リペプチド、またはペプチド（集合的に「タンパク質」）中に組み込まれるアミ
ノ酸を言及するために、本明細書中では交換可能に使用される。アミノ酸は、天
然に存在するアミノ酸であり得、そして特に限定されない限り、天然に存在する
アミノ酸と類似の様式で機能し得る天然アミノ酸の非天然アナログを含み得る。
【００４５】 用語「選択的にハイブリダイズする」は、ストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件下における、非標的核酸配列に対するハイブリダイゼーションより
も検出可能に高い程度（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍を超える）
および非標的核酸の実質的排除までの特定の核酸標的配列に対する核酸配列のハ
イブリダイゼーションに対する言及を含む。選択的にハイブリダイズする配列は
、代表的に互いに少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは９０％配列同一
性、そして最も好ましくは１００％の配列同一性（すなわち相補的）を有する。
【００４６】 用語「特異的に反応性」は、抗体とその抗体の抗原結合部位によって認識され
るエピトープを有するタンパク質との間の結合反応に対する言及を含む。この結
合反応は、タンパク質および他の生物学的物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）からなる
不均質集団の存在の中に、認識されるエピトープを有するタンパク質が存在する
ことの決定因である。従って、指定された免疫アッセイ条件下で、特定の抗体は
、サンプル中に存在しエピトープを欠く他の実質的にすべての分析物に対してよ
りも、実質的に高い程度（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍を超える
）で、認識されるエピトープを有する分析物に結合する。
【００４７】 そのような条件下での抗体に対する特異的結合は、ある特定のタンパク質につ
いての特異性に対して選択された抗体を必要とし得る。例えば、本発明のポリペ
プチドに対して惹起された抗体は、本発明のポリペプチドと特異的に反応する抗
体を獲得するために選択され得る。免疫原として使用されるタンパク質は、ネイ
ティブなコンフォメーションであり得、もしくは直鎖状のエピトープを与えるた
めに変性され得る。
【００４８】 多様な免疫アッセイ形式は、特定のタンパク質（または他の分析物）と特異的
に反応する抗体の選択に用いられ得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイは
、あるタンパク質と特異的に免疫反応性なモノクローナル抗体を選択するために
慣用的に使用される。選択的な反応性の決定に使用され得る免疫アッセイ形式お
よび条件の記載については以下を参照のこと：ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１
９８８）。
【００４９】 用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件」は、他の配列よりも検出可能に高い程度（例えば、バックグラウ
ンドの少なくとも２倍を超える）まで、プローブが標的配列にハイブリダイズす
る条件に対する言及を含む。ストリンジェントな条件は、配列依存的でありそし
て異なる状況において異なる。ハイブリダイゼーション条件および／または洗浄
条件のストリンジェンシーを制御することによって、プローブに対して１００％
相補的である標的配列が同定され得る（相同プロービング）。あるいは、ストリ
ンジェントな条件は、配列中のいくつかのミスマッチを許容するために調整され
得、ゆえにより低い程度の類似性が検出される（非相同プロービング）。一般的
に、プローブは約１０００ヌクレオチド長未満であり、好ましくは５００ヌクレ
オチド長未満である。
【００５０】 代表的に、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．５Ｍ Ｎａイオン未満
であり、代表的には約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（もしくは他の塩）
で、ｐＨは７．０〜８．３、そして温度は、短いプローブ（例えば、１０〜５０
ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いプローブ（例えば、
５０より長いヌクレオチド）については少なくとも約６０℃である条件である。
ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によっても
達成され得る。例示的な低ストリンジェンシー条件としては、３０〜３５％ホル
ムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液
を用いた３７℃におけるハイブリダイゼーション、そして５０〜５５℃における
１×〜２× ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍ クエン酸
三ナトリウム）中の洗浄が挙げられる。例示的な中程度のストリンジェンシー条
件としては、４０〜４５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中の３７
℃におけるハイブリダイゼーション、そして５５〜６０℃における０．５×〜１
× ＳＳＣ中の洗浄が挙げられる。例示的な高ストリンジェンシー条件としては
、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中の３７℃におけるハイブ
リダイゼーション、そして６０〜６５℃における０．１× ＳＳＣ中の洗浄が挙
げられる。
【００５１】 特異性は、代表的にハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、その重要
な因子は最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリ
ッドについて、Ｔmは、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，１３８：２６７〜２８４（１９８４）の方程式から概算され得、その
式は：Ｔm＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６
１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌであり；ここでＭは一価陽イオンのモル濃度であ
り、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドの
百分率であり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百
分率であり、そしてＬは塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔmは、（規定
したイオン強度およびｐＨの下で）５０％の相補的標的配列が、完全に一致した
プローブとハイブリダイズする温度である。Ｔmは、１％のミスマッチあたり約
１℃減少し；従って、Ｔm、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は
、所望の同一性の配列とハイブリダイズするように調整され得る。例えば、≧９
０％同一性を有する配列が求められる場合、Ｔmは１０℃低下され得る。一般的
に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配
列およびその相補体についての熱融点（ｔｈｅｒｍａｌ ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏ
ｉｎｔ）（Ｔm）より約５℃低いように選択される。しかしながら、苛酷にスト
リンジェントな条件は、熱融点（Ｔm）より１、２、３または４℃低いハイブリ
ダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；中程度にストリンジェントな条
件は、熱融点（Ｔm）より６、７、８、９、または１０℃低いハイブリダイゼー
ションおよび／または洗浄を利用し得；低いストリンジェンシー条件は、熱融点
（Ｔm）より１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低いハイブリダイゼー
ションおよび／または洗浄を利用し得る。この方程式、ハイブリダイゼーション
および洗浄組成、ならびに所望のＴmを使用して、当業者は、ハイブリダイゼー
ションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーのバリエーションが本質的
に記載されることを理解する。所望の程度のミスマッチが、４５℃（水溶液）ま
たは３２℃（ホルムアミド溶液）より低いＴmをもたらす場合、ＳＳＣ濃度を上
げるのが好ましく、その結果、より高い温度が使用され得る。核酸のハイブリダ
イゼーションに対する広範なガイドは以下に見出される：Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、第Ｉ部、第２章「Ｏｖ
ｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐ
ｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３
）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（
１９９５）。
【００５２】 本明細書で使用される場合、「トランスジェニック植物」は、そのゲノムの中
に異種のポリヌクレオチドを含有する植物に対する言及を含む。一般的に、異種
のポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが、連続した世代に伝えられるよ
うにゲノムの中に安定に組み込まれる。異種のポリヌクレオチドは、単独で、ま
たは組換え発現カセットの一部としてゲノム中に組み込まれ得る。「トランスジ
ェニック」は本明細書中で、遺伝子型が、異種核酸の存在によって変更されてい
る、任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物の一部または植物を含むように使
用される。トランスジェニックとしては、初めにそのように変更されたトランス
ジェニック、および初めのトランスジェニックから有性交雑または無性繁殖によ
って作製されたトランスジェニックが挙げられる。本明細書中で使用される場合
、用語「トランスジェニック」は、従来の植物育種方法または天然に存在する事
象（例えば、ランダム交雑受精、非組換えウイルス感染、非組換え細菌形質転換
、非組換え転移もしくは自然変異によるゲノム（染色体または染色体外）の変化
は含まない。
【００５３】 本明細書中で使用される場合、「ベクター」は、宿主細胞のトランスフェクシ
ョンに使用される核酸であって、その中にポリヌクレオチドが挿入され得る核酸
に対する言及を含む。ベクターは、しばしばレプリコンである。発現ベクターは
、発現ベクターに挿入された核酸の転写を許容する。
【００５４】 以下の用語は、２以上の核酸またはポリヌクレオチドの間の配列の関係を記載
するために使用される：（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較ウィンドウ」、（ｃ
）「配列同一性」、（ｄ）「配列同一性の百分率」、および（ｅ）「実質的な同
一性」。
【００５５】 （ａ）本明細書中で使用される場合、「参照配列」は、配列比較の基礎として
用いられる規定された配列である。参照配列は、指定した配列のサブセットまた
は全体であり得る：例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、ま
たは完全ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列。
【００５６】 （ｂ）本明細書中で使用される場合、「比較ウィンドウ」の意味は、ポリヌク
レオチド配列の連続しかつ指定されたセグメントに対する言及を含み、ここでこ
のポリヌクレオチド配列は参照配列と比較され得、そしてここで比較ウインドウ
中のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適な整列のために参照配列
（これは付加も欠失も含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャッ
プ）を含み得る。一般的に、比較ウィンドウは、少なくとも２０の連続したヌク
レオチド長であり、そして必要に応じて３０、４０、５０、１００またはより長
くであり得る。当業者は、ポリヌクレオチド配列中にギャップを含むことによる
、参考配列に対する高い類似性を避けるために、ギャップペナルティーが代表的
に導入されそして一致の数から差し引かれることを理解する。
【００５７】 比較のための配列整列の方法は、当該分野で周知である。比較に最適な配列整
列は、以下によって行なわれ得る：ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ
．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム；
ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３
（１９７０）の相同性整列アルゴリズム；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４（１９８８）の類似性
方法についての検索；以下に挙げられるこれらに限定されないアルゴリズムのコ
ンピューター化された実施：Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉ
ｎ Ｖｉｅｗ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａによるＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム中のＣＬ
ＵＳＴＡＬ；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａ
ｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５
７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ
中の、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ
；ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ
７３：２３７−２４４（１９８８）；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢ
ＩＯＳ ５：１５１−１５３（１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１０８８１−９０（１９８８）；Ｈｕａ
ｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ ８：１５５−６５（１９９２）；およびＰｅａｒｓｏｎら、
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４：３０７−
３３１（１９９４）によってよく記載される。
【００５８】 データベース類似性検索に使用され得るＢＬＡＳＴファミリーのプログラムと
しては、以下が挙げられる：ヌクレオチドデーターベース配列に対するヌクレオ
チド照会配列についてのＢＬＡＳＴＮ；タンパク質データーベース配列に対する
ヌクレオチド照会配列についてのＢＬＡＳＴＸ；タンパク質データーベース配列
に対するタンパク質照会配列についてのＢＬＡＳＴＰ；ヌクレオチドデーターベ
ース配列に対するタンパク質照会配列についてのＴＢＬＡＳＴＮ；およびヌクレ
オチドデーターベース配列に対するヌクレオチド照会配列についてのＴＢＬＡＳ
ＴＸ。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、第１９章、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１
９９５）を参照のこと。
【００５９】 ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、公的に入手可能である（例
えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ
．ｇｏｖ／）を通して）。このアルゴリズムは、照会配列中の長さＷの短いワー
ドを同定することにより高スコアの配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含
み、これは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列される場合、何れか
の正の値の閾値スコアＴと一致するかまたはＴを満たすかのどちらかである。Ｔ
は、隣接ワードスコア閾値として言及される。これら初期隣接ワードヒットは、
それらを含む、より長いＨＳＰを見出す探索の開始に対する種として作用する。
それから累積整列スコアが増加し得る限り、ワードヒットは、各配列に添って両
方の方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメー
ターＭ（一対の一致した残基に対するリワード（ｒｅｗａｒｄ）スコア；常に＞
０）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティースコア；常に＜０）を用い
て計算される。アミノ酸配列については、得点付け行列は、累積スコアを計算す
るために用いられる。各方向へのワードヒットの伸長は、以下の場合停止される
：累積整列スコアがその最大達成値から量Ｘ減少した場合；１以上の負の得点付
け残基整列の蓄積によって累積スコアがゼロ以下になる場合；またはどちらかの
配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およ
びＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオ
チド配列について）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００の
カットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較をデフォルトとして使用する
。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長（Ｗ）、１
０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２得点付け行列をデフォルトとして使
用する（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照のこと）。
【００６０】 パーセント配列同一性を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、
２配列間の類似性の統計的分析も実施する（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔ
ｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９
０：５８７３−５８７７を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって与え
られる類似性の１つの尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌ
クレオチドまたはアミノ酸の配列の間の一致が偶然起こる確率の指標を与える。
【００６１】 ＢＬＡＳＴ検索は、タンパク質がランダム配列としてモデル化され得ると仮定
する。しかし、多くの実際のタンパク質は、ランダムでない配列の領域を含み、
これはホモポリマーの区域、短期反復、または１つ以上のアミノ酸が豊富な領域
であり得る。このように複雑性が低い領域は、たとえそのタンパク質の他の領域
が全く異なるとしても、関係のないタンパク質の間で整列され得る。多くの低複
雑性フィルタープログラムは、このような複雑性が低い整列を減らすために用い
られ得る。例えば、ＳＥＧ（ＷｏｏｔｅｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ、Ｃｏｍｐｕ
ｔ．Ｃｈｅｍ．、１７：１４９−１６３（１９９３））およびＸＮＵ（Ｃｌａｖ
ｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．、１７：１９１−２０
１（１９９３）低複雑性フィルターは、単独で、または組み合わせて用いられ得
る。
【００６２】 ＧＡＰは、一致数を極大化しかつギャップ数を極小化する２つの完全配列の整
列を見出すためにＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．４８：４４３−４５３、１９７０）のアルゴリズムを使用する。ＧＡＰは全
ての可能な整列およびギャップの位置を考慮し、そして最大数の一致塩基および
最少のギャップを有する整列を作成する。これは、一致塩基を単位にしたギャッ
プ作成ペナルティーおよびギャップ伸長ペナルティーの供給を可能にする。ＧＡ
Ｐは、その挿入する各ギャップに対する一致のギャップ作成ペナルティー数の利
益を得なければならない。ゼロより大きいギャップ伸長ペナルティーが選択され
た場合、さらに、ＧＡＰは、（ギャップの長さ）×（ギャップ伸長ペナルティー
）という挿入された各ギャップについて利益を得なければならない。ギャップ作
成ペナルティーのデフォルト値およびギャップ伸長ペナルティーのデフォルト値
は、タンパク質配列についてのＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆ
ｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅの第１０版中ではそれぞれ８および２である。ヌク
レオチド配列については、ギャップ伸長ペナルティーのデフォルトは３であるが
、ギャップ作成ペナルティーのデフォルトは５０である。ギャップ作成ペナルテ
ィーおよびギャップ伸長ペナルティーは、０〜２００からなる整数の群より選択
される整数として表現され得る。従って、例えば、ギャップ作成ペナルティーお
よびギャップ伸長ペナルティーは、それぞれ独立して、０、１、２、３、４、５
、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、
５５、６０、６５以上であり得る。
【００６３】 ＧＡＰは、最良の整列のファミリーの１つのメンバーを表す。このファミリー
には多くのメンバーが存在し得るが、他のどのメンバーもより良い品質を有さな
い。ＧＡＰは、整列についてのメリットの４つの数字を表示する：品質、割合、
同一性、および類似性。品質は、配列を整列させるために最大化された測定基準
である。割合は、より短いセグメント中の塩基数で割った品質である。パーセン
ト同一性は、実際に一致した記号のパーセントである。パーセント類似性は、類
似する記号のパーセントである。ギャップの向かいの記号は無視される。類似性
は、一対の記号に対する得点行列値が、類似性の閾値である０．５０以上である
場合、得点付けされる。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａ
ｒｅ Ｐａｃｋａｇｅの第１０版中で使用される得点付け行列は、ＢＬＯＳＵＭ
６２である（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照のこと）。
【００６４】 他に明記しない限り、本明細書中で与えられる配列の同一性／類似性値は、デ
フォルトパラメーターを用いたＢＬＡＳＴ２．０プログラムのパッケージ（Ａｌ
ｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４
０２、１９９７；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２１５：４０３−
４１０、１９９０）を用いて得られる値、またはデフォルトパラメーターを用い
たＧＡＰプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒ
ｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣ
Ｇ）、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
、ＵＳＡを参照のこと）を用いて得られる値を言及する。
【００６５】 （ｃ）本明細書中で使用される場合、２つの核酸またはポリペプチドの配列の
状況で、「配列同一性」または「同一性」は、指定された比較ウインドウについ
て最大一致となるように整列化された場合に同一である、２つの配列中の残基に
対する言及を含む。配列同一性のパーセンテージがタンパク質に関連して使用さ
れる場合、同一でない残基の位置は、しばしば保存的アミノ酸置換によって異な
ることが認識され、ここでアミノ酸残基は、類似の化学的特性（例えば、電荷ま
たは疎水性）を有する他のアミノ酸残基について置換され、そしてそれゆえ分子
の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換によって異なる場合には、パー
セント配列同一性は、置換の保存的性質に対し補正すために上向きに調整され得
る。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似
性」を有すると言われる。この調整を行うための手段は、当業者に対して周知で
ある。代表的に、これは、全体のミスマッチよりはむしろ部分的なミスマッチと
して保存的置換を得点付けすることを含み、それによって配列同一性のパーセン
テージが増加する。従って、例えば、同一のアミノ酸に得点１が与えられ、かつ
非保存的置換に得点ゼロが与えられるとき、保存的置換にはゼロと１との間の得
点が与えられる。保存的置換の得点付けは、例えば、ＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌ
ｌｅｒ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．、４：１１−１
７（１９８８）のアルゴリズムに従って、例えばＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌ
ｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｕ
ＳＡ）プログラム中で実行されるように計算される。
【００６６】 （ｄ）本明細書中で使用される場合「配列同一性のパーセンテージ」は、比較
ウィンドウについて２つの最適に整列された配列の比較によって決定される値を
意味し、ここで、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配
列の最適なアラインメントに対して、参照配列（これは付加または欠失を含まな
い）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテ
ージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列中で生じて一致した位置の
数を得る位置の数を決定し、一致した位置の数を比較ウインドウ中の合計位置数
で割り、そしてその結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得るこ
とによって計算される。
【００６７】 （ｅ）（ｉ）ポリヌクレオチド配列の用語「実質的な同一性」は、ポリヌクレ
オチドが、標準的なパラメーターを用いて記載されるアラインメントプログラム
の内の１つを用いて、参照配列と比較して少なくとも７０％配列同一性、好まし
くは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましく
は少なくとも９５％を有する配列を含むことを意味する。当業者は、コドン縮重
、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置決定などを考慮することによっ
て、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性
を決定するためにこれらの値が適切に調整され得ることを認識する。これらの目
的のために、アミノ酸配列の実質的同一性は、通常は、少なくとも６０％、より
好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、そして最も好ましくは少なくと
も９５％の配列同一性を意味する。
【００６８】 ヌクレオチド配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子がストリンジ
ェントな条件下で互いにハイブリダイズするかどうかである。しかし、ストリン
ジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、その核酸がコードする
ポリペプチドが実質的に同一である場合、それでもなお実質的に同一である。こ
れは、例えば、核酸のコピーが遺伝コードによって許容される最大コドン縮重を
用いて作製される場合に起こり得る。２つの核酸配列が実質的に同一である１つ
の指標は、１番目の核酸がコードするポリペプチドが、２番目の核酸によってコ
ードされるポリペプチドと免疫学的に交叉反応性であることである。
【００６９】 （ｅ）（ｉｉ）ペプチドの状況における用語「実質的同一性」は、ペプチドが
、指定した比較ウィンドウについて参照配列に対して少なくとも７０％配列同一
性、参照配列に対して好ましくは８０％、より好ましくは８５％、最も好ましく
は少なくとも９０％または９５％配列同一性を有する配列を含有することを示す
。必要に応じて、最適なアラインメントは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓ
ｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメン
トアルゴリズムを用いて行なわれる。２つのペプチド配列が実質的に同じである
という指標は、１つ目のペプチドが２番目のペプチドに対して惹起された抗体と
免疫学的に反応性であることである。従って、例えば、２つのペプチドが保守的
な置換によってのみ異なる場合には、ペプチドは２番目のペプチドと実質的に同
一である。「実質的類似」であるペプチドは、同一でない残基の位置が保存的ア
ミノ酸変化によって異なり得る以外、上記に述べたような配列を共有する。
【００７０】 （発明の詳細な説明） （概要） 本発明は、とりわけ、植物中の本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド
のレベルを調節する（すなわち、増加または減少させる）ための組成物および方
法を提供する。特に、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、組換え
操作されていない植物に特徴的でない、例えば、発生段階において、組織中で、
および／または量で、時間的にかまたは空間的に発現され得る。従って、植物の
形質転換における選択マーカーのような例示的な適用において有用性を提供する
。
【００７１】 本発明はまた、遺伝子転写物の検出、定量、または、単離におけるプローブま
たは増幅プライマーとして使用するための本発明の遺伝子に対して十分な長さお
よび相補性のポリヌクレオチドを含む、単離された核酸を提供する。例えば、本
発明の単離された核酸は、所望のトランスジェニック植物についてのスクリーニ
ングにおけるｍＲＮＡレベルの欠乏を検出する際にプローブとして、遺伝子中の
変異（例えば、置換、欠失、または付加）を検出するのために、発現のアップレ
ギュレーションまたは化合物のスクリーニングアッセイにおける酵素活性の変化
のモニタリングのために、遺伝子の任意の数の対立遺伝子改変体（多型性）、オ
ルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）、パラログ（ｐａｒａｌｏｇ）の検出のために、
または真核生物細胞における部位特異的変異誘発のために、使用され得る（例え
ば米国特許第５，５６５，３５０号を参照のこと）。本発明の単離された核酸は
また、それらのコードされたポリペプチドの組換え発現のために、または抗体の
調製および／もしくはスクリーニングにおける免疫原として使用するために、使
用され得る。本発明の単離された核酸はまた、宿主細胞、組織、または植物中の
本発明の一つ以上の遺伝子のセンス抑制またはアンチセンス抑制の使用に用いら
れ得る。本発明の単離された核酸に対して、結合、インターカレート、切断、お
よび／または架橋する化学薬剤の付着はまた、転写または翻訳の調節に使用され
得る。
【００７２】 本発明はまた、本発明のポリペプチド（例えば、プレプロ酵素、プロ酵素、ま
たは酵素）を含む単離されたタンパク質を提供する。本発明はまた、本発明のポ
リペプチド由来の少なくとも一つのエピトープを含むタンパク質を提供する。本
発明のタンパク質は、酵素機能の酵素アゴニストもしくは酵素アンタゴニストの
アッセイにおいて、または本発明のタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を得
るための免疫原もしくは抗原としての使用のために用いられ得る。そのような抗
体は、発現レベルのアッセイにおいて発現ライブラリー由来の本発明の核酸の同
定および／もしくは単離のために、他の種由来の相同ポリペプチドの同定のため
に、または本発明のポリペプチドの精製のために使用され得る。
【００７３】 本発明の単離された核酸およびタンパク質は、広範囲の植物種、特に、Ｈｏｒ
ｄｅｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ（例えば、Ｓ．ｂ
ｉｃｏｌｏｒ）およびＺｅａ（例えば、Ｚ．ｍａｙｓ）を含むＧｒａｍｉｎｅａ
ｅ科の種のような単子葉植物に渡って使用され得る。本発明の単離された核酸お
よびタンパク質はまた、以下の属由来の種に使用され得る：Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ
、Ｒｏｓａ、Ｖｉｔｉｓ、Ｊｕｇｌａｎｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｌｏｔｕｓ、Ｍ
ｅｄｉｃａｇｏ、Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｔｒｉｇｏｎｅ
ｌｌａ、Ｖｉｇｎａ、Ｃｉｔｒｕｓ、Ｌｉｎｕｍ、Ｇｅｒａｎｉｕｍ、Ｍａｎｉ
ｈｏｔ、Ｄａｕｃｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｒａｐｈ
ａｎｕｓ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ａｔｒｏｐａ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、
Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｓｏ
ｌａｎｕｍ、Ｐｅｔｕｎｉａ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ、Ｍａｊｏｒａｎａ、Ｃｉａ
ｈｏｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｂｒｏｍｕｓ、Ａｓｐ
ａｒａｇｕｓ、Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ、Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ、Ｎｅｍｅ
ｓｉｓ、Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ、Ｐａｎｉｅｕｍ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、Ｒ
ａｎｕｎｃｕｌｕｓ、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ、Ｃｕｃｕｍ
ｉｓ、Ｂｒｏｗａａｌｉａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｐｉｓｕｍ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ
、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｏｒｙｚａ、およびＡｖｅｎａ。
【００７４】 （核酸） 本発明は、とりわけ、本発明のポリヌクレオチドを含む、ＲＮＡ、ＤＮＡなら
びにそれらのアナログおよび／またはキメラの単離された核酸を提供する。
【００７５】 本発明のポリヌクレオチドは、以下を含む： （ａ）配列番号２、４、および６のポリペプチド、ならびにそれらの保存的に
改変された改変体および多型性の改変体をコードするポリヌクレオチド（配列番
号１、３、５の例示的なポリヌクレオチドを含む）；本発明のヌクレオチド配列
はまた、割り当て登録番号２０７０５６、２０７０５７、および２０７０５８と
してＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ
ＴＣＣ）に寄託されたプラスミド中に含まれるようなトウモロコシＡＤＡ遺伝子
配列を含む。
【００７６】 （ｂ）配列番号１、３および５、ならびにＡＴＣＣ寄託割り当て登録番号２０
７０５６、２０７０５７、および２０７０５８に含まれるような配列からなる群
より選択されるポリヌクレオチド中の遺伝子座に対して、ストリンジェントな条
件下において選択的にハイブリダイズするプライマー対を使用した、Ｚｅａ ｍ
ａｙｓ核酸ライブラリー由来の増幅産物であるポリヌクレオチド；ここで、この
ポリヌクレオチドは、配列番号１、３、および５からなる群より選択されるポリ
ヌクレオチドに対する実質的な配列同一性を有する；または、ＡＴＣＣ寄託割り
当て登録番号２０７０５６、２０７０５７、および２０７０５８に含まれるよう
な配列。
【００７７】 （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする
ポリヌクレオチド； （ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリヌクレオチドとの指定された配列
同一性を有するポリヌクレオチド； （ｅ）プロトタイプポリペプチド由来の指定された数の連続したアミノ酸を有
するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで、このタンパク
質は、このタンパク質の提示によって誘発された抗血清により特異的に認識され
、そして、ここでこのタンパク質は、このタンパク質に十分に免疫吸着された抗
血清に対して検出可能に免疫反応しないポリヌクレオチド； （ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）のポリヌクレオチドの相
補的な配列；ならびに （ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のポリヌクレオ
チド由来の少なくとも特定の数の連続したヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチ
ド。
【００７８】 配列番号１、３、および５のポリヌクレオチドは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に、１９９９年１月１
９日に寄託され、そして、それぞれ登録番号２０７０５６、２０７０５７、およ
び２０７０５８を割り当てられたプラスミドに含まれる。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎは、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に位置
する。
【００７９】 ＡＴＣＣ受託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペス
ト条約の約定の下で、維持される。受託物は、当業者への便宜として提供され、
そして米国特許法第１１２条の下で寄託が要求されるという承認ではない。寄託
された配列、およびその配列によりコードされるポリペプチドは、本明細書に参
考として、そして本出願における記載について何らかの矛盾（例えば、配列決定
の誤り）がある場合の統制手段として、採用される。
【００８０】 （Ａ．本発明のポリペプチド、またはその保存的に改変された改変体もしくは
多型性改変体をコードするポリヌクレオチド） 上記（ａ）に記載されたように、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む
単離された核酸を提供し、ここで、このポリヌクレオチドは、本発明のポリペプ
チド、または、その保存的に改変された改変体もしくは多型性改変体をコードす
る。従って、本発明は、配列番号１、３、および５のポリヌクレオチド、ならび
にＡＴＣＣ寄託割り当て登録番号２０７０５６、２０７０５７、および２０７０
５８に含まれるような配列、ならびに、配列番号２、４、６のポリペプチドをコ
ードするポルヌクレオチドのサイレントバリエーションを含む。本発明はさらに
、配列番号２、４、６のポリペプチドの保存的に改変された改変体をコードする
ポリヌクレオチドを含む単離された核酸を提供する。保存的に改変された改変体
は、非改変体ポリペプチドに対して免疫反応性の抗体を生成または選択するため
に使用され得る。加えて、本発明はさらに、ポリペプチド／ポリヌクレオチドの
一つ以上の対立遺伝子（多型性）改変体をコードするポリヌクレオチドを含む単
離された核酸を提供する。多型性の改変体は、例えば、作物の改良のためのマー
カー補助的選択方法において染色体領域の分離を追跡するために、頻繁に使用さ
れる。
【００８１】 （Ｂ．Ｚｅａ ｍａｙｓ核酸ライブラリーから増幅されたポリヌクレオチド） 上記（ｂ）に示されたように、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む単
離された核酸を提供する、ここでこのポリヌクレオチドは、Ｚｅａ ｍａｙｓ核
酸ライブラリーから増幅される。Ｚｅａ ｍａｙｓ系統Ｂ７３、ＰＨＲＥ１、Ａ
６３２、ＢＭＳ−Ｐ２＃１０、Ｗ２３、およびＭｏ１７は既知であり、そして公
に入手可能である。他の公に既知であり、そして入手可能なトウモロコシ系統は
、Ｍａｉｚｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ（Ｕｒｂａｎａ，Ｉ
Ｌ）より、得られ得る。核酸ライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムラ
イブラリー、または、概してイントロンプロセシングの任意の段階における核転
写物より構築されたライブラリーであり得る。ｃＤＮＡライブラリーは、相対的
に稀なｃＤＮＡの提示を増加させるために基準化され得る。任意の実施形態では
、ｃＤＮＡライブラリーは、全長ｃＤＮＡ合成方法を使用して構築される。その
ような方法の例としては、Ｏｌｉｇｏ−Ｃａｐｐｉｎｇ（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ
．およびＳｕｇａｎｏ，Ｓ．Ｇｅｎｅ １３８：１７１−１７４，１９９４）、
Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＣＡＰ Ｔｒａｐｐｅｒ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ，Ｐ．
，Ｋｖａｎ，Ｃ．ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３７：３２７−３３６，１９９６）、
およびＣＡＰ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（Ｅｄｅｒｙ，Ｅ．，
Ｃｈｕ，Ｌ．Ｌ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ １５：３３６３−３３７１，１９９５）が挙げられる。ｃＤＮＡ合
成はしばしば、ＲＮＡ二次構造の形成を防ぐために、５０℃〜５５℃において触
媒される。これらの温度において比較的安定である逆転写酵素の例は、Ｓｕｐｅ
ｒＳｃｒｉｐｔＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎ
ｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、およびＲｅ
ｔｒｏＡｍｐ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔ
ｒｅ）である。急速に増殖する組織、または急速に分裂する細胞は、好ましくは
ｍＲＮＡ源として使用される。
【００８２】 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドの部分配列を提供する。種々の部分
配列は、本発明のポリヌクレオチド中の少なくとも２つの部位に、または本発明
のポリヌクレオチドに隣接し、そしてこれを含む核酸中の２つの部位に、または
本発明のポリヌクレオチド中の１つの部位および本発明のポリヌクレオチドを含
む核酸中の１つの部位にストリンジェントな条件下において選択的にハイブリダ
イズするプライマーを使用して得られ得る。プライマーは、本発明のポリヌクレ
オチドに対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的にハ
イブリダイズするように選択される。概して、プライマーは、それらが増幅する
標的核酸の部分配列に対して相補的である。当業者が理解するように、プライマ
ー対が選択的にハイブリダイズする部位は、所望される増幅条件下で単一の連続
した核酸が形成され得るように選択される。
【００８３】 任意の実施形態では、プライマーは、それらが本発明のポリヌクレオチドのカ
ルボキシ末端またはアミノ末端のアミノ酸残基（すなわち、それぞれ、３’末端
をコードする領域および５’末端をコードする領域）をコードするコドンを含む
標的核酸中の配列（またはそれの相補体）に対してストリンジェントな条件下で
選択的にハイブリダイズするように構築される。これらの実施形態において任意
に、プライマーは、ｃＤＮＡ標的の増幅産物がそのｃＤＮＡのコード領域からな
るように本発明の標的ポリヌクレオチドのコード領域内全体に選択的にハイブリ
ダイズするように構築される。プライマーのヌクレオチド長は、少なくとも１５
から５０までからなる整数の群より選択される。従って、プライマーは、少なく
とも１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、または５０のヌクレオチド長
であり得る。当業者は、長くしたプライマー配列が、標的配列に対する結合特異
性（すなわち、アニーリング）を増加させるために使用され得ると認識する。プ
ライマーの５’末端のアニーリングしない配列（「テイル」）は、例えば、アン
プリコンの末端にクローニング部位を導入するために付加され得る。
【００８４】 増幅産物は、当業者に周知の、そして以下に記載のような発現系を使用して翻
訳され得る。得られる翻訳産物は、例えば、適切な触媒活性（例えば、特異的活
性および／または基質特異性）についてアッセイすることによって、または、本
発明のポリペプチドに対して特異的な一つ以上の直鎖状エピトープの存在を確認
することによって本発明のポリペプチドであると確認され得る。ＰＣＲ由来の鋳
型からのタンパク質合成の方法は、当該分野において公知であり、そして市販さ
れている。例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．
の１９９７年カタログ、３５４頁を参照のこと。
【００８５】 ベクター挿入物の５’末端および／または３’末端を得るための方法は、当該
分野において周知である。例えば、Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．，ＰＣＲ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｊ．Ｊ．Ｓｎｉ
ｎｓｋｙ，Ｔ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ編（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，
Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ），２８−３８頁（１９９０）に記載されたような、ＲＡＣ
Ｅ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａ
ｒｙ Ｅｎｄｓ）を参照のこと；米国特許第５，４７０，７２２号およびＣｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
Ｕｎｉｔ １５．６，Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９
９５）；ＦｒｏｈｍａｎおよびＭａｒｔｉｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １：１６
５（１９８９）もまた参照のこと。
【００８６】 （Ｃ．（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする
ポリヌクレオチド） 上記の（ｃ）に示したように、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む単
離された核酸を提供し、ここで、このポリヌクレオチドは、選択的なハイブリダ
イゼーション条件下で、上で議論したように段落（Ａ）または（Ｂ）のポリヌク
レオチドに選択的にハイブリダイズする。従って、この実施形態のポリヌクレオ
チドは、（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドを含んでいる核酸を単離、検出
、および／または定量するために使用され得る。例えば、本発明のポリヌクレオ
チドは、寄託されたライブラリーにおいて、部分または全長のクローンを同定、
単離、または増幅するために使用され得る。いくつかの実施形態において、その
ポリヌクレオチドは、双子葉植物または単子葉植物の核酸ライブラリーから単離
されたゲノム配列もしくはｃＤＮＡ配列であるか、さもなければそのようなライ
ブラリー由来のｃＤＮＡに相補的である。単子葉植物および双子葉植物の例示的
な種としては、トウモロコシ、カノーラ、ダイズ、ワタ、コムギ、ソルガム、ヒ
マワリ、オートムギ、サトウキビ、キビ、オオムギ、およびイネが挙げられるが
、これらに限定されない。必要に応じて、ｃＤＮＡライブラリーは、少なくとも
８０％の全長の配列、好ましくは、少なくとも８５％または９０％の全長配列、
そしてより好ましくは、少なくとも９５％の全長配列を含む。ｃＤＮＡライブラ
リーは、稀な配列の提示を増加させるために正規化され得る。低いストリンジェ
ンシーのハイブリダイゼーション条件は代表的に、排他的にではないが、相補的
な配列に対して低下した配列同一性を有する配列と共に用られる。中程度および
高いストリンジェンシー条件は、より同一性が高い配列のために必要に応じて使
用され得る。低いストリンジェンシー条件は、約７０％配列同一性を有する配列
の選択的ハイブリダイゼーションを可能にし得、そしてオーソロガス配列または
パラロガス配列を同定するために使用され得る。
【００８７】 （Ｄ．（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のポリヌクレオチドとの特定の配列同一性
を有するポリヌクレオチド） 上記（ｄ）で示したように、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む単離
された核酸を提供し、ここで、このポリヌクレオチドは、上記の段落（Ａ）、（
Ｂ）または（Ｃ）において上で開示したようなポリヌクレオチドに対してヌクレ
オチドレベルで指定された同一性を有する。参照配列に対する同一性のパーセン
テージは、少なくとも６０％であり、そして最も近い整数に切上げて、６０から
９９までからなる整数の群から選択される整数として表され得る。従って、例え
ば、参照配列に対する同一性のパーセンテージは、少なくとも７０％、７５％、
８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、
８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、
９８％、または９９％であり得る。
【００８８】 必要に応じて、この実施形態のポリヌクレオチドは、段落（Ａ）、（Ｂ）また
は（Ｃ）のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドとエピトープを共
有するポリペプチドをコードする。従って、これらのポリヌクレオチドは、（Ａ
）、（Ｂ）または（Ｃ）のポリヌクレオチドによりコードされる第２のポリペプ
チドに特異的に反応性な抗体を含む抗血清の産生を誘発する第１のポリペプチド
をコードする。しかし、抗血清を、第１のポリペプチドと完全に免疫吸着したと
き、第１のポリペプチドは、それ自体に対して惹起される抗血清に結合しない。
それ故、この実施形態のポリヌクレオチドは、例えば、（Ａ）、（Ｂ）もしくは
（Ｃ）のポリヌクレオチドを含む核酸の発現ライブラリーのスクリーニングにお
いて使用するための抗体を産生するために、または（Ａ）、（Ｂ）もしくは（Ｃ
）のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの精製もしくは免疫アッ
セイのために使用され得る。この実施形態のポリヌクレオチドは、本発明のポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドへの選択的なハイブリダイゼーションの
ために使用され得る核酸配列を含む。
【００８９】 抗血清への特異的な結合についてポリペプチドをスクリーニングすることは、
ペプチドディスプレイライブラリーを使用して、好都合に達成され得る。この方
法は、所望する機能または構造を有する個々のメンバーについて、ペプチドの大
きな収集物をスクリーニングする工程を含む。ペプチドディスプレイライブラリ
ーの抗体スクリーニングは、当該分野で周知である。そのディスプレイされたペ
プチド配列は、３から５０００またはそれよりも多いアミノ酸長、頻繁に５から
１００アミノ酸長、そしてしばしば約８から１５アミノ酸長であり得る。ペプチ
ドライブラリーを産生するための、直接的な化学合成方法に加えて、いくつかの
組換えＤＮＡ法が記載されている。あるタイプは、バクテリオファージまたは細
胞の表面でのペプチド配列のディスプレイを含む。各バクテリオファージまたは
細胞は、ディスプレイされた特定のペプチド配列をコードするヌクレオチド配列
を含む。このような方法は、ＰＣＴ特許公開番号９１／１７２７１号、同第９１
／１８９８０号、同第９１／１９８１８号および同第９３／０８２７８号に記載
されている。ペプチドのライブラリーを作成するための他の系は、インビトロ化
学合成および組換え方法の両方の局面を有する。ＰＣＴ特許公開番号第９２／０
５２５８号、第９２／１４８４３号および同第９６／１９２５６号を参照のこと
。米国特許番号第５，６５８，７５４号；および同第５，６４３，７６８号もま
た参照のこと。ペプチドディスプレイライブラリー、ベクターおよびスクリーニ
ングキットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のような供給
業により市販されている。
【００９０】 Ｅ．プロトタイプポリペプチド由来の部分配列を有し、そしてプロトタイプポ
リペプチドに対して交差反応性であるタンパク質をコードするポリヌクレオチド 上記のように、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む単離された核酸を
提供し、ここで、そのポリヌクレオチドは、上記に提供されるような本発明のプ
ロトタイプポリペプチド由来の連続するアミノ酸の部分配列を有するタンパク質
をコードする。プロトタイプポリペプチド由来の連続するアミノ酸の長さは、少
なくとも１０からそのプロトタイプ配列内のアミノ酸の数からなる整数の群から
選択される。従って、例えば、そのポリヌクレオチドは、プロトタイプポリペプ
チドからの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、また
は５０の連続するアミノ酸を有する部分配列を有するポリペプチドをコードし得
る。さらに、本実施形態のポリヌクレオチドによってコードされるこのような部
分配列の数は、１〜２０からなる群から選択される任意の整数（例えば、２、３
、４、または５）であり得る。その部分配列は、１からその配列内のヌクレオチ
ドの数までのヌクレオチドの任意の整数（例えば、少なくとも５、１０、１５、
２５、５０、１００、または２００ヌクレオチド）によって分離され得る。
【００９１】 この実施形態のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、免疫源
として提示される場合、上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドによってコ
ードされるポリペプチドのような、しかし、これらに限定されないプロトタイプ
ポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体の産生を誘発する。一般に
、しかし、この実施形態のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は
、その抗血清がプロトタイプポリペプチドに充分に免疫吸着されている場合、こ
のプロトタイプポリペプチドに対して惹起された抗血清に結合しない。抗体結合
特異性／親和性を作製するためおよびアッセイするための方法は、当該分野で周
知である。例示的な免疫アッセイ形式には、ＥＬＩＳＡ、競合イムノアッセイ、
ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット、間接的免疫蛍光アッセイなどが含
まれる。
【００９２】 好ましいアッセイ方法には、プロトタイプポリペプチドに対して惹起された充
分に免疫吸着され、かつプールされた抗血清が、そのタンパク質を試験するため
に競合結合アッセイにおいて使用され得る。抗血清のそのプロトタイプポリペプ
チドに対する結合の５０％を阻害するのに必要とされるプロトタイプポリペプチ
ドの濃度が決定される。結合を阻害するために要求されるそのタンパク質の量が
、プロトタイプタンパク質の量の二倍未満である場合、そのタンパク質は、その
免疫原に対して惹起された抗血清に特異的に結合すると言われる。従って、本発
明のタンパク質は、対立遺伝子改変体、保存的に改変された改変体、およびプロ
トタイプポリペプチドに対するわずかな組換え修飾を包含する。
【００９３】 本発明のポリヌクレオチドは、必要に応じて、本発明の全長非グリコシル化ポ
リペプチドの分子量の２０％以内のその非グリコシル化タンパク質としての分子
量を有するタンパク質をコードする。分子量は、容易に、還元条件下でＳＤＳ−
ＰＡＧＥによって決定され得る。必要に応じて、その分子量は、本発明の全長ポ
リペプチドの１５％以内であり、より好ましくは、１０％もしくは１５％以内、
そして最も好ましくは、本発明の全長ポリペプチドの３％、２％、または１％以
内である。
【００９４】 必要に応じて、この実施形態のポリヌクレオチドは、本発明の天然の、内因性
の全長ポリペプチドを含む細胞抽出物の少なくとも５０％、６０％、８０％、ま
たは９０％の特定の酵素活性を有するタンパク質をコードする。さらに、この実
施形態のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、必要に応じて、
天然の内因性の全長タンパク質と実質的に類似の親和性定数（Ｋm）および／ま
たは触媒活性（すなわち、微視的速度定数、ｋcat）を有する。当業者は、ｋcat ／Ｋm値が競合する基質に対する特異性を決定し、そしてしばしばその特異性定
数として言及されることを認識する。この実施形態のタンパク質は、そのポリペ
プチドの内因性基質を使用して決定された本発明の全長ポリペプチドの少なくと
も１０％のｋcat／Ｋm値を有し得る。必要に応じて、ｋcat／Ｋm値は、本発明の
全長ポリペプチドのｋcat／Ｋm値の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％
、そして最も好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または
９５％である。ｋcat、Ｋm、およびｋcat／Ｋmの決定は、当業者に周知の任意の
数の手段によって決定され得る。例えば、開始速度（すなわち、反応の最初の５
％以下）は、迅速な混合およびサンプリングの技術（例えば、連続流、ストップ
ドフロー、または迅速クエンチング技術）、フラッシュ光分解、または緩和法（
例えば、温度ジャンプ）を、分光光度法、分光蛍光分析、核磁気共鳴、または放
射能手順のような例示的な測定の方法と組み合わせて、使用して決定され得る。
動力学的な値は、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ＢｕｒｋまたはＥａｄｉｅ−Ｈｏｆｓ
ｔｅｅプロットを使用して、都合良く得られる。
【００９５】 Ｆ．（Ａ）〜（Ｅ）のポリヌクレオチドに対する相補的ポリヌクレオチド 上記（ｆ）に示されるように、本発明は、上記段落Ａ〜Ｅのポリヌクレオチド
に相補的なポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを包含する単離された
核酸を提供する。当業者は、セクション（Ａ）から（Ｅ）のポリヌクレオチドと
その長さの全体にわたって相補的な配列塩基対（すなわち、その全体の長さにわ
たって１００％の配列同一性を有する）を認識する。相補的な塩基は、二本鎖核
酸において水素結合を介して結合する。例えば、以下の塩基対は、相補的である
：グアニンおよびシトシン；アデニンおよびチミン；なぜならアデニンおよびウ
ラシル。
【００９６】 Ｇ．（Ａ）から（Ｆ）のポリヌクレオチドの部分配列であるポリヌクレオチド 上記（ｇ）に示されるように、本発明は、上記のセクション（Ａ）から（Ｆ）
のポリヌクレオチドからの少なくとも１５の連続する塩基を包含するポリヌクレ
オチドを包含する単離された核酸を提供する。そのポリヌクレオチドの長さは、
少なくとも１５から、そのポリヌクレオチドがその部分配列である核酸配列の長
さまでからなる群から選択される整数として与えられる。従って、例えば、本発
明のポリヌクレオチドは、（Ａ）から（Ｆ）のポリヌクレオチドからの、少なく
とも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７
０、７５、８０、９０、１００、１５０、または２００の連続するヌクレオチド
長を含むポリヌクレオチドを包含する。必要に応じて、この実施形態のポリヌク
レオチドによってコードされるこのような部分配列の数は、１〜２０からなる群
から選択される任意の整数（例えば、２、３、４、または５）であり得る。その
部分配列は、１から、少なくとも５、１０、１５、２５、５０、１００、または
２００ヌクレオチドのような配列におけるヌクレオチドの数の、ヌクレオチドの
任意の整数によって分離され得る。
【００９７】 本発明の部分配列は、それが由来する配列の構造的な特徴を包含し得る。ある
いは、部分配列は、それが由来したより大きな配列の特定の構造的特徴を欠き得
る。例えば、上記（ａ）に提供されるプロトタイプポリペプチド配列に共通する
少なくとも１つの直線状のエピトープを有するポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドからの部分配列は、そのプロトタイプ配列に共通するエピトープをコ
ードし得る。あるいは、部分配列は、そのプロトタイプに共通するエピトープを
コードしないかもしれないが、例えば、それが由来した配列との核酸ハイブリダ
イゼーションによって、より大きな配列を単離するために使用され得る。部分配
列は、核酸に結合し、インターカレートし、切断し、および／または架橋するそ
の部分配列化合物に導入することによって、遺伝子発現を調節または検出するた
めに使用され得る。例示的な化合物には、アクリジン、ソラレン、フェナントロ
リン、ナフトキノン、ダウノマイシン、またはクロロエチルアミノアリール結合
体が含まれる。
【００９８】 核酸の構築 本発明の単離された核酸は、（ａ）標準的な組換え法、（ｂ）合成技術、また
はそれらの組み合わせを使用して作製され得る。いくつかの実施形態において、
本発明のポリヌクレオチドは、クローニングされ、増幅され、またはそうでなけ
れば、単子葉植物から構築される。好ましい実施形態において、単子葉植物は、
Ｚｅａ ｍａｙｓである。
【００９９】 核酸は、都合良く、本発明のポリヌクレオチドに加えて、配列を含み得る。例
えば、１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を包含するマルチクローニング部
位は、核酸中に挿入され得、ポリヌクレオチドの単離を補助し得る。また、翻訳
可能な配列は、本発明の翻訳されたポリヌクレオチドの単離を補助するために挿
入され得る。例えば、ヘキサヒスチジンマーカー配列は、本発明のタンパク質を
精製するための都合良い手段を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、本発明
のポリヌクレオチドの発現のために、クローニングおよび／または発現のために
、ベクター、アダプター、またはリンカーに結合され得る。さらなる配列は、ク
ローニングおよび／または発現におけるそれらの機能を最適化するために、その
ポリヌクレオチドの単離を補助するために、またはそのポリヌクレオチドの細胞
への導入を改善するために、このようなクローニングおよび／または発現配列に
付加され得る。代表的には、本発明のポリヌクレオチドの長さのよりも短い本発
明の核酸の長さは、２０キロベース対よりも短く、しばしば、１５ｋｂよりも短
く、そして頻繁に、１０ｋｂよりも短い。クローニングベクター、発現ベクター
、アダプタ、およびリンカーの使用は、周知であり、そして広範に当該分野にお
いて記載されている。種々の核酸の記載については、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｓ，Ｃａｔａｌｏｇｓ １９９５，１９９６
，１９９７（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）；およびＡｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｔａｌｏｇ ’９７（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅ
ｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を参照のこと。
【０１００】 Ａ．核酸の構築のための組換え法 本発明の単離された核酸組成物（例えば、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、
またはこれらのハイブリッド）は、当該分野で公知の任意の数のクローニング方
法論を使用して、植物の生物学的供給源から得られ得る。いくつかの実施形態に
おいて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明のポリヌ
クレオチドに選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブは、ｃＤ
ＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーにおいて、所望の配列を同定するために使
用され得る。ＲＮＡの単離、ｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムＤＮＡライブラ
リーの構築が当業者に周知である一方、以下は、利用される方法のいくつかを強
調する。
【０１０１】 Ａ１．ｍＲＮＡ単離および精製 植物細胞からの総ＲＮＡは、ミトコンドリアＲＮＡ、葉緑体ＲＮＡ、ｒＲＮＡ
、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよびｍＲＮＡのような核酸を包含する。総ＲＮＡ調製
物は、代表的には、細胞の溶解、および細胞小器官およびタンパク質の除去、続
いて、核酸の沈降を包含する。植物細胞からの総ＲＮＡの抽出は、種々の手段に
より達成され得る。頻繁に、抽出緩衝液は、強力な界面活性剤（例えば、ＳＤＳ
）および有機変性剤（例えば、グアニジンイソチオシアネート、グアニジンＨＣ
ｌまたはフェノール）を含む。総ＲＮＡの単離の後、ｐｏｌｙ（Ａ）+ｍＲＮＡ
は、代表的には、オリゴ（ｄＴ）セルロースを使用して、残りのＲＮＡから精製
される。例示的な総ＲＮＡおよびｍＲＮＡ単離プロトコルは、Ｐｌａｎｔ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
Ｃｌａｒｋ，編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９７
）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａ
ｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）
に記載される。総ＲＮＡおよびｍＲＮＡ単離キットは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（
ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、
Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）および５’−３’（Ｐａｏ
ｌｉ Ｉｎｃ．，ＰＡ）のような供給業者から市販されている。米国特許第５，
６１４，３９１号；および同第５，４５９，２５３号を参照のこと。ｍＲＮＡは
、サイズ範囲が約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、または３．０ｋｂ
の集団へと画分化され得る。これらの画分の各々について合成されたｃＤＮＡは
、ベクターを挿入する前に、そのｍＲＮＡと同じサイズ範囲へとサイズ選択され
得る。この方法は、不完全な逆転写ｍＲＮＡによって形成された短縮されたｃＤ
ＮＡを排除するのを助ける。
【０１０２】 Ａ２．ｃＤＮＡライブラリーの構築 ｃＤＮＡライブラリーの構築は、一般に、５つの工程を包含する。第１に、最
初の鎖ｃＤＮＡ合成が、ｐｏｌｙ（ｄＴ）プライマーまたはランダムヘキサヌク
レオチドを使用して、ｐｏｌｙ（Ａ）+ｍＲＮＡテンプレートから開始される。
第２に、得られるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは、代表的には、ＲＮＡｓｅ Ｈ
およびＤＮＡポリメラーゼＩ（またはクレノウフラグメント）の組み合わせによ
って、二本鎖ｃＤＮＡに変換される。第３に、二本鎖ｃＤＮＡの末端は、アダプ
ターに連結される。アダプターの連結は、クローニングのための粘着性の末端を
生成し得る。第４に、二本鎖ｃＤＮＡのサイズ選択は、過剰のアダプターおよび
プライマーフラグメントを排除し、そしてｍＲＮＡの分解または逆転写酵素の完
全な第一鎖の合成ミスに起因する部分ｃＤＮＡ分子を排除する。第５に、ｃＤＮ
Ａは、クローニングベクターに連結され、パッケージングされる。ｃＤＮＡ合成
プロトコルは、当業者に周知であり、そして以下のような標準的な参考文献に記
載されている：Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｌａｒｋ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９７）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｇｒｅｅ
ｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ
，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）。ｃＤＮＡ合成キットは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅまたはＰｈａｒｍａｃｉａのような種々の市販の供給業者から入手可能である
。
【０１０３】 ｃＤＮＡ合成プロトコルの数は、記載されており、これは、実質的に純粋な全
長ｃＤＮＡライブラリーを提供する。実質的に純粋な全長ｃＤＮＡライブラリー
は、インサートを含有するクローンのなかの少なくとも９０％、そしてより好ま
しくは少なくとも９３％または９５％の全長インサートを包含するように構築さ
れる。このようなライブラリー中のインサートの長さは、０〜８、９、１０、１
１、１２、１３、またはそれより多いキロベースの対であり得る。これらのサイ
ズのインサートを収容するベクターは、当該分野で公知であり、そして市販され
ている。例えば、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのラムダＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（０〜
１２ｋｂのクローニング能力を有するｃＤＮＡクローニングベクター）を参照の
こと。
【０１０４】 ９５％より大きい純粋な全長ｃＤＮＡライブラリーを構築する例示的な方法は
、Ｃａｒｎｉｎｃｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３７：３２７−３３６（１９９６）
によって記載されている。そのプロトコルにおいて、真核生物ｍＲＮＡのキャッ
プ構造は、ビオチンで化学的に標識されている。ストレプトアビジンで被覆した
磁気ビーズを使用することにより、全長の第一鎖ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッ
ドのみが、ＲＮａｓｅＩ処理の後に選択的に回収される。この方法は、開始ｍＲ
ＮＡ集団のバイアスされていないものを表示する高収量のライブラリーを提供す
る。全長ライブラリーを生成する他の方法は、当該分野で公知である。例えば、
Ｅｄｅｒｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１５（６）：３３６３−３３７
１（１９９５）；およびＰＣＴ出願ＷＯ９６／３４９８１を参照のこと。
【０１０５】 Ａ３．規格化またはサブトラクトされたｃＤＮＡライブラリー 非規格化ｃＤＮＡライブラリーは、それが作製された組織のｍＲＮＡ集団をあ
らわす。単独のクローンよりも、高度に発現された遺伝子に由来するクローンの
ほうが数が多いので、それらの単離は労力を要するものであり得る。ｃＤＮＡラ
イブラリーの規格化は、各クローンがより等しく表されるライブラリーを作製す
るプロセスである。
【０１０６】 ｃＤＮＡライブラリーを規格化するアプローチの数は、当該分野で公知である
。１つのアプローチは、ゲノムＤＮＡにハイブリダイズすることに基づく。得ら
れる規格化されたライブラリー中の各ハイブリダイズされたｃＤＮＡの頻度は、
ゲノムＤＮＡ中の各対応する遺伝子の頻度に比例する。別のアプローチは、動力
学に基づく。ｃＤＮＡの再アニーリングが二次の動力学に従う場合、よりめずら
しい種は、より迅速ではなくアニーリングし、そしてｃＤＮＡの残りの一本鎖画
分は、ハイブリダイゼーションの経過の間、進行的により規格化される。任意の
種のｃＤＮＡの特異的な損失は、その豊富さにかかわらず、任意のＣｏｔ値で生
じない。規格化したライブラリーの構築は、Ｋｏ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅ
ｓ．，１８（１９）：５７０５−５７１１（１９９０）；Ｐａｔａｎｊａｌｉら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：１９４３−１９４７（
１９９１）；米国特許第５，４８２，６８５号および同第５，６３７，６８５号
に記載されている。Ｓｏａｒｅｓらによって記載される例示的な方法において、
規格化は、４桁の範囲からわずか１桁の狭い範囲まで、クローンの豊富さを減少
させる。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１：９２２８−９２
３２（１９９４）。
【０１０７】 サブトラクトされたｃＤＮＡライブラリーは、豊富さのより低いｃＤＮＡ種の
比率を増大させる別の手段である。この手順において、ｍＲＮＡの１つのプール
から調製されたｃＤＮＡは、ハイブリダイゼーションによりｍＲＮＡの第２のプ
ールに存在する配列を枯渇する。ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡハイブリッドは除去され、
そして残りのハイブリダイズされていないｃＤＮＡプールが、そのプールに対し
て独特の配列に対して富化される。Ｆｏｏｔｅら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｌａｒｋ
編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９７）；Ｋｈｏおよ
びＺａｒｂｌ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，３（２）：５８−６３（１９９１）；Ｓｉ
ｖｅおよびＳｔ．Ｊｏｈｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６（２２）：
１０９３７（１９８８）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ（１９９５）；およびＳｗａｒｏｏｐら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．，１９）８）：１９５４（１９９１）を参照のこと。ｃＤＮＡサブトラクショ
ンキットは、市販されている。例えば、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を参照のこと。
【０１０８】 Ａ４．ゲノムライブラリーの構築 ゲノムライブラリーを構築するために、ゲノムＤＮＡの大きなセグメントを、
ランダムフラグメント化によって、例えば、制限エンドヌクレアーゼを使用して
、作製し、そしてベクターＤＮＡに連結して、適切なベクターにパッケージング
され得るコンカテマーを形成する。これらの目的を達成するための方法論および
核酸配列を評価するための配列決定法は、当該分野で周知である。適切な分子生
物学的技術の例および当業者を多くの構築、クローニング、およびスクリーニン
グ方法に導くのに充分な説明は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１〜３巻（１９８９）
、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２：Ｇｕｉｄｅ
ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｂｅｒｇ
ｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、編、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８７），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９９５）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｃｌａｒｋ，編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ
−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９７）に見出される。ゲノムライブラリー
の構築のためのキットもまた、市販されている。
【０１０９】 Ａ５．核酸スクリーニングおよび単離法 ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーは、本明細書に開示されるような本発明の
ポリヌクレオチドの配列に基づいたプローブを使用してスクリーニングされ得る
。プローブは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列を用いてハイブリダイズし、同
じかまたは異なる植物種における相同な遺伝子を単離するために使用され得る。
当業者は、ハイブリダイゼーションの種々の程度のストリンジェンシーが、アッ
セイにおいて利用され得ること；およびハイブリダイゼーションまたは洗浄培地
のいずれかが、ストリンジェントであり得ることを理解する。ハイブリダイゼー
ションの条件がよりストリンジェントになるにつれ、二重鎖の形成が生じるため
には、プローブと標的との間により大きな程度の相補性が存在しなければならな
い。ストリンジェントの程度は、温度、イオン強度、ｐＨおよび部分的に変性性
の溶媒（例えば、ホルムアミド）の存在によって制御され得る。例えば、ハイブ
リダイゼーションのストリンジェンシーは、０％〜５０％の範囲内でホルムアミ
ドの濃度を操作することによって、反応溶液の極性を変化させることによって、
都合良く、変化される。検出可能な結合のために要求される相補性（配列同一性
）の程度は、ハイブリダイゼーション培地および／または洗浄培地のストリンジ
ェンシーに従って、変化する。相補性の程度は、至適には、１００パーセントで
あるが、しかし、プローブおよびプライマーにおけるわずかな配列の変動は、ハ
イブリダイゼーションおよび／または洗浄培地のストリンジェンシーを減少させ
ることによって補償され得ることが理解されるべきである。
【０１１０】 目的の核酸はまた、増幅技術を使用して核酸サンプルから増幅され得る。例え
ば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、本発明のポリヌクレオチドの配列
、およびゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーから直接由来する関連遺伝子
を増幅させるために使用され得る。ＰＣＲおよびその他のインビトロ増幅法はま
た、例えば、発現されるべきタンパク質をコードする核酸配列をクローニングす
るため、所望のｍＲＮＡのサンプル中での存在を検出するためのプローブとして
使用するための核酸を作製するため、核酸配列決定のため、またはその他の目的
のために有用であり得る。インビトロ増幅法によって当業者を導くために充分な
技術の例は、Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，およびＡｕｓｅｂｅｌ、ならび
にＭｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７）；およびＰＣ
Ｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓら、編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に見出される。ゲノムＰＣＲ
増幅のための市販のキットは、当該分野で公知である。例えば、Ａｄｖａｎｔａ
ｇｅ−ＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を参照のこ
と。Ｔ４遺伝子３２タンパク質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）は
、長いＰＣＲ産物の収量を改善させるために使用され得る。
【０１１１】 ＰＣＲに基づくスクリーニング方法はまた、記載されている。Ｗｉｌｆｉｎｇ
ｅｒらは、ＰＣＲに基づく方法を記載する。そこでは、最も長いｃＤＮＡが、第
１の工程で同定され、その結果、不完全なクローンが、研究から排除され得る。
ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２２（３）：４８１−４８６（１９９７）。その
方法において、プライマー対は、所望のｃＤＮＡのセンス鎖の５’末端にアニー
リングする１つのプライマーおよびベクターに対する他のプライマーを用いて合
成される。クローンは、プールされて、大規模スクリーニングされる。この手順
により、可能な限り最も長いクローンが、候補クローンのなかから同定される。
さらに、ＰＣＲ産物は、所望のｃＤＮＡの存在の診断としてのみ使用され、そし
てＰＣＲ産物自体を利用しない。このような方法は、上記の全長ｃＤＮＡ構築物
方法と組み合わせて特に効果的である。
【０１１２】 Ｂ．核酸を構築するための合成法 本発明の単離された核酸もまた、Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ
．６８：９０−９９（１９７９）のホスホジエステラーゼ法；Ｂｒａｗｎら、Ｍ
ｅｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１（１９７９）のホスホジエステル
法；Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２（
１９８１）のジエチルホスホルアミダイト法；ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｕｔ
ｈｒｓ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９−１８６２（１９８
１）によって記載される固相ホスホルアミダイトトリエステル法（例えば、Ｎｅ
ｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．，１２：６１５９−６１６８（１９８４）に記載されるような、例えば、自動
合成機を使用する）；ならびに米国特許第４，４５８，０６６号の固相支持体法
、のような方法による、直接化学合成によって調製され得る。化学合成は、一般
に、一本鎖オリゴヌクレオチドを産生する。これは、相補的配列とのハイブリダ
イゼーションによって、または一本鎖をテンプレートとして使用するＤＮＡポリ
メラーゼとのポリマー形成によって、二本鎖ＤＮＡに変換され得る。当業者は、
ＤＮＡの化学合成が、約１００以下の塩基の配列に最も良く利用され、より長い
配列は、より短い配列の連結によって得られ得ることを認識する。
【０１１３】 組換え発現カセット 本発明は、さらに、本発明の核酸を含む発現カセットを提供する。本発明の所
望のポリヌクレオチドをコードする核酸配列（例えば、本発明の全長ポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は、所望の宿主細胞に導入され得
る組換え発現カセットを構築するために導入され得る。組換え発現カセットは、
代表的には、意図される宿主細胞（例えば、形質転換された植物の組織）におい
てポリヌクレオチドの転写を指向する転写開始調節配列に作動可能に連結した本
発明のポリヌクレオチドを包含する。
【０１１４】 例えば、植物発現ベクターは、（１）５’および３’調節配列の転写制御下で
クローン化した植物遺伝子、および（２）優勢選択マーカーを含み得る。このよ
うな植物発現ベクターはまた、所望であれば、プロモーター調節領域（例えば、
誘導性または構成性の、環境的にまたは発達的に調節された、または細胞特異的
もしくは組織特異的／選択的発現を付与するもの）、転写開始部位、リボソーム
結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位、および／またはポリア
デニル化シグナルを含有し得る。
【０１１５】 再生植物の全ての組織において本発明のポリヌクレオチドの発現を指向する植
物プロモーターフラグメントが、利用され得る。このようなプロモーターは、本
明細書において、「構成性」プロモーターとして言及され、そして最も環境的な
条件下および発達または細胞分化の状態で活性である。構成性プロモーターの例
には、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域、Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡ由来の１’または
２’プロモーター、ユビキチン１プロモーター、Ｓｍａｓプロモーター、桂皮ア
ルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（米国特許第５，６８３，４３９号）、
Ｎｏｓプロモーター、ｐＥｍｕプロモーター、ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター、Ｇ
ＲＰ１−８プロモーター、および当業者に公知の種々の植物遺伝子からの他の転
写開始領域が含まれる。１つの例示的なプロモーターは、胚または胚性カルス（
特に、トウモロコシ）において本発明の発現を駆動するために使用され得るユビ
キチンプロモーターである。
【０１１６】 あるいは、植物プロモーターは、特定の組織において本発明のポリヌクレオチ
ドの発現を指向し得るか、またはさもなければ、より正確な環境的制御下もしく
は発達的制御下であり得る。このようなプロモーターは、本発明において「誘導
性」プロモーターと呼ばれる。誘導性プロモーターによって転写をもたらし得る
環境条件には、病原攻撃、無酸素条件、または光の存在が含まれる。誘導性プロ
モーターの例は、低酸素または低温ストレスによって誘導性であるＡｄｈ１プロ
モーター、熱ストレスによって誘導性のＨｓｐ７０プロモーター、および光によ
って誘導されるＰＰＤＫプロモーターである。
【０１１７】 発生制御下にあるプロモーターの例としては、特定の組織（例えば、葉、根、
果実、種子、または花）においてのみ、またはこれらの組織において優先的に、
転写を開始するプロモーターが、挙げられる。例示的プロモーターとしては、葯
特異的プロモーター５１２６（米国特許第５，６８９，０４９号および第５，６
８９，０５１号）、ｇｌｏｂ−１プロモーター、およびγ−ゼインプロモーター
が、挙げられる。プロモーターの作動はまた、ゲノム中のその位置に依存しても
変化し得る。従って、誘導性プロモーターは、特定の位置にて、完全にかまたは
部分的に、構成的になり得る。
【０１１８】 異種プロモーターおよび非異種（すなわち、内因性）プロモーターの両方が、
本発明の核酸の発現を指向するために使用され得る。これらのプロモーターはま
た、例えば、所望の組織において本発明のタンパク質の濃度および／または組成
を、減少、増加、または変化させるようにアンチセンス核酸の発現を駆動するた
めの組換え発現カセットにおいても、使用され得る。従って、いくつかの実施形
態において、この核酸構築物は、本発明のポリヌクレオチドに作動可能に連結さ
れた、植物細胞（例えば、Ｚｅａ ｍａｙｓ）において機能的なプロモーターを
含む。これらの実施形態において有用なプロモーターは、本発明のポリペプチド
の発現を駆動する内因性プロモーターを含む。
【０１１９】 いくつかの実施形態において、プロモーターエレメントまたはエンハンサーエ
レメントとして作用する単離された核酸が、本発明のポリヌクレオチドの発現を
アップレギュレートまたはダウンレギュレートするように、非異種形態の本発明
のポリヌクレオチドの適切な位置（一般的には上流）に導入され得る。例えば、
内因性プロモーターが、変異、欠失、および／または置換によってインビボで変
化され得るか（Ｋｍｉｅｃ、米国特許第５，５６５，３５０；Ｚａｒｌｉｎｇら
、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８を参照のこと）、または単離されたプロモータ
ーが、本発明の遺伝子から適切な方向および距離に、この遺伝子の発現を制御す
るように植物細胞に導入され得る。遺伝子発現は、植物細胞において本発明のポ
リペプチドの総濃度を変化させ、そして／またはその組成を変化させるように、
植物生長に適切な条件下で調節され得る。従って、本発明は、ネイティブの内因
性（すなわち、非異種）形態の本発明のポリヌクレオチドに作動可能に連結され
た、異種プロモーターおよび／またはエンハンサーを作製するための、組成物お
よび方法を提供する。
【０１２０】 例えば、組織型、細胞型、発生段階、および／または環境条件に関して、特定
の発現パターンを有するプロモーターを同定するための方法は、当該分野で周知
である。例えば、Ｔｈｅ Ｍａｉｚｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第１１４〜１１５章
、ＦｒｅｅｌｉｎｇおよびＷａｌｂｏｔ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ（１９９４）；Ｃｏｒｎ ａｎｄ Ｃｏｒｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ、第３
版、第６章、Ｓｐｒａｇｕｅ ａｎｄ Ｄｕｄｌｅｙ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓ
ｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
（１９８８）を参照のこと。プロモーター単離法における代表的工程は、標的組
織においていくらかの程度の特異性で発現される遺伝子産物の同定である。方法
論の範囲の中にあるのは、以下である：ｃＤＮＡライブラリーに対するディファ
レンシャルハイブリダイゼーション；差し引きハイブリダイゼーション；ディフ
ァレンシャル２次元タンパク質ゲル電気泳動；ＤＮＡプローブアレイ；および標
的組織においていくらかの特異性を伴って発現されることが既知のタンパク質の
単離。このような方法は、当業者に周知である。プロモーターを同定するための
市販の製品（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）のＵｎｉ
ｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ Ｋｉｔ）は、当該分野で公知であ
る。
【０１２１】 タンパク質に基づく方法について、同定されたタンパク質の少なくとも一部の
アミノ酸配列を得ること、次いでそのタンパク質配列を、標的組織から調製され
たライブラリーからゲノムＤＮＡを直接同定するかまたは好ましくはｃＤＮＡク
ローンを同定するかのいずれかのためのプローブとして使用され得る核酸を調製
するための基礎として使用することが有用である。一旦このようなｃＤＮＡクロ
ーンが同定されると、その配列は、望ましい遺伝子の転写物の５’末端の配列を
同定するために使用され得る。ディファレンシャルハイブリダイゼーション、差
し引きハイブリダイゼーション、差し引きハイブリダイゼーションおよびディフ
ァレンシャルディスプレイについて、標的組織において濃縮されていると同定さ
れた核酸配列は、所望の遺伝子の転写物の５’末端の配列を同定するために使用
される。一旦このような配列が同定されると、タンパク質配列または核酸配列の
いずれかから開始して、その遺伝子転写物由来であると同定されたこれらの配列
のいずれかが、標的生物から調製されたゲノムライブラリーをスクリーンするた
めに使用され得る。この転写開始部位を同定および確認するための方法は、当該
分野で周知である。
【０１２２】 特定の環境条件またはストレス下で、または特定の組織にて、または特定の発
生段階で、発現されるプロモーターを単離するプロセスにおいて、所望の環境下
でか、所望の組織でか、または所望の段階で、発現される多数の遺伝子が同定さ
れる。さらなる分析によって、その植物の他の１つ以上の組織における特定の遺
伝子各々の発現が明らかになる。所望の組織または条件で活性を有するが他のど
の通常の組織でも活性を有さない、プロモーターが、同定され得る。
【０１２３】 そのプロモーター配列を同定するために、本明細書中に記載されるクローンの
５’部分が、プロモーター配列の特徴である配列について分析される。例えば、
プロモーター配列エレメントは、ＴＡＴＡボックスコンセンサス配列（ＴＡＴＡ
ＡＴ）を含み、この配列は、転写開始部位の約２０〜４０塩基対上流に位置する
、通常５〜１０ｂｐのＡＴリッチなストレッチである。このＴＡＴＡボックスの
同定は、当該分野で周知である。例えば、このエレメントの位置を推定するため
の１つの方法は、標準的ＲＮＡマッピング技術（例えば、プライマー伸長法、Ｓ
１分析、および／またはリボヌクレアーゼプロテクション法）を使用して、転写
開始部位を同定することである。このＡＴリッチな配列の存在を確認するために
、構造−機能分析が、実施され得、この分析は、推定領域の変異誘発および連結
された下流のレポーター遺伝子の発現に対するこの変異の効果の定量化を含む。
例えば、Ｔｈｅ Ｍａｉｚｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第１１４章、Ｆｒｅｅｌｉｎ
ｇおよびＷａｌｂｏｔ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）を
参照のこと。
【０１２４】 植物において、このＴＡＴＡボックスからさらに上流、−８０〜−１００位に
、トリヌクレオチドＧ（またはＴ）ＮＧを囲む一連のアデニンを有する、プロモ
ーターエレメント（すなわち、ＣＡＡＴボックス）が代表的には存在する。Ｊ．
Ｍｅｓｓｉｎｇら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｐｌａｎ
ｔｓ、Ｋｏｓａｇｅ、ＭｅｒｅｄｉｔｈおよびＨｏｌｌａｅｎｄｅｒ編、２２１
〜２２７頁、１９８３。トウモロコシにおいて、十分に保存されたＣＡＡＴボッ
クスは存在しないが、いくつかの短い、ＴＡＴＡボックスの上流の保存されたタ
ンパク質結合モチーフが存在する。これらは、光調節、嫌気性誘導、モルモン調
節、またはアントシアニン生合成に関与するトランス作用性転写因子のモチーフ
を、各遺伝子について適切なように、含む。
【０１２５】 一旦プロモーター配列および／または遺伝子配列が既知となると、適切な大き
さの領域が、転写開始部位または翻訳開始部位の５’側にあるゲノムＤＮＡから
選択され、次いでこのような配列が、コード配列に連結される。この転写開始部
位が融合点として使用される場合、多数の可能な５’非翻訳領域のいずれかが、
この転写開始部位と部分的コード配列との間で使用され得る。特定のプロモータ
ーの３’末端の翻訳開始部位が使用される場合、次いでこの翻訳開始部位はコー
ド配列のメチオニン開始コドンに直接連結される。
【０１２６】 ポリペプチドの発現が所望される場合、ポリヌクレオチドコード領域の３’末
端にポリアデニル化領域を含むことが一般に所望され得る。このポリアデニル化
領域は、天然の遺伝子、種々の他の植物遺伝子、またはＴ−ＤＮＡに由来し得る
。付加されるべき３’末端配列は、例えば、ノパリンシンターゼ遺伝子もしくは
オクトピンシンターゼ遺伝子、または別の植物遺伝子、あるいはそれほど好まし
くないが他の任意の真核生物遺伝子に、由来し得る。
【０１２７】 イントロン配列は、部分的コード配列の５’非翻訳領域またはコード配列に付
加されて、細胞質ゾルに蓄積する成熟メッセージの量を増加させ得る。スプライ
ス可能なイントロンを植物および動物の両方の発現構築物において転写単位で含
めることは、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方で１０００倍まで遺
伝子発現を増加させることが示されている。ＢｕｃｈｍａｎおよびＢｅｒｇ，Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：４３９５−４４０５（１９８８）；Ｃａｌｌｉ
ｓら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：１１８３−１２００（１９８７）。遺伝子発現
のこのようなイントロン増強は代表的に、転写単位の５’末端付近に置かれた場
合、最大である。トウモロコシのイントロンＡｄｈ１−Ｓイントロン１、２およ
び６、ならびにＢｒｏｎｚｅ−１イントロンの使用は、当該分野で公知である。
一般に、Ｔｈｅ Ｍａｉｚｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第１１６章，Ｆｒｅｅｌｉｎ
ｇおよびＷａｌｂｏｔ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）を
参照のこと。
【０１２８】 本発明のポリヌクレオチド由来の配列を含むベクターは代表的に、植物細胞に
対して選択可能な表現型を付与するマーカー遺伝子を含む。通常、選択可能なマ
ーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性をコードし、適切な遺伝子としては、抗生物質
スペクチノマイシンに対する抵抗性をコードする遺伝子（例えば、ａａｄａ遺伝
子）、ストレプトマイシン抵抗性をコードするストレプトマイシンホスホトラン
スフェラーゼ（ＳＰＴ）遺伝子、カナマイシン抵抗性またはジェネティシン抵抗
性をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、
ハイグロマイシン抵抗性をコードするハイグロマイシンホスホトランスフェラー
ゼ（ＨＰＴ）遺伝子、アセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）の作用を阻害する
ように作用する除草剤（特にスルホニルウレア型除草剤）に対する抵抗性をコー
ドする遺伝子（例えば、このような抵抗性をもたらす変異（特にＳ４変異および
／またはＨｒａ変異）を含むアセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子）、
グルタミンシンターゼの作用を阻害するように作用する除草剤（例えば、ホスフ
ィノトリシンまたはバスタ（ｂａｓｔａ））に対する抵抗性をコードする遺伝子
（例えば、ｂａｒ遺伝子）、または当該分野で公知の他のこのような遺伝子が挙
げられる。ｂａｒ遺伝子は、除草剤バスタに対する抵抗性をコードし、ｎｐｔＩ
Ｉ遺伝子は、抗生物質カナマイシンおよびジェネティシンに対する抵抗性をコー
ドし、そしてＡＬＳ遺伝子は除草剤クロルスルフロン（ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒ
ｏｎ）に対する抵抗性をコードする。
【０１２９】 高等植物における遺伝子の発現に有用な代表的なベクターは、当該分野で周知
であり、そしてＲｏｇｅｒｓら，Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：
２５３−２７７（１９８７）によって記載されるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの腫瘍誘導性（Ｔｉ）プラスミドに由来するベクターを
含む。これらのベクターは、形質転換に際し、ベクターがベクターＤＮＡの一部
を宿主植物のゲノムに組み込むので、植物組み込みベクターである。本明細書中
で有用な例示的なＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓベクターは、Ｓｃｈａｒｄｌら，
Ｇｅｎｅ，６１：１−１１（１９８７）およびＢｅｒｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６：８４０２−８４０６（１９８９
）のプラスミドｐＫＹＬＸ６およびｐＫＹＬＸ７である。本明細書中の別の有用
なベクターは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａ
ｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から入手可能である、プラスミドｐＢＩ１０１．２であ
る。
【０１３０】 本発明のポリヌクレオチドは、所望により、センスまたはアンチセンスのいず
れの方向でも発現され得る。センスまたはアンチセンスのいずれかの方向での遺
伝子発現の制御が、観察可能な植物の特徴に直接的な影響を有し得ることが理解
される。アンチセンス技術は、植物における遺伝子発現のために便利に用いられ
得る。これを達成するために、所望の遺伝子由来の核酸セグメントは、クローニ
ングされ、そしてこのアンチセンス鎖のＲＮＡが転写されるように、プロモータ
ーに作動可能に連結される。次いで、この構築物が植物中に形質転換され、そし
てアンチセンス鎖のＲＮＡが生成される。植物細胞では、アンチセンスＲＮＡが
、目的の酵素をコードするｍＲＮＡの蓄積を防止することにより、遺伝子発現を
阻害することが示されている（例えば、Ｓｈｅｅｈｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：８８０５−８８０９（１９８８）；およ
びＨｉａｔｔら，米国特許第４，８０１，３４０号を参照のこと）。
【０１３１】 別の抑制方法は、センス抑制である。センス方向に構成された核酸の導入は、
標的遺伝子の転写をブロックする有効な手段であることが示されている。内在性
遺伝子の発現を調節するためのこの方法の使用の例については、Ｎａｐｏｌｉら
，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：２７９−２８９（１９９０）および米国
特許第５，０３４，３２３号を参照のこと。
【０１３２】 触媒性ＲＮＡ分子すなわちリボザイムをまた用いて、植物遺伝子の発現を阻害
し得る。事実上任意の標的ＲＮＡと特異的に対合し、そして特定の位置でホスホ
ジエステル骨格を切断し、それにより、標的ＲＮＡを機能的に不活化するリボザ
イムを設計することが可能である。この切断を実施する際に、リボザイムは、そ
れ自体は変更されず、従って、再生利用し得そして他の分子を切断し得、その他
の分子を真の酵素とする。アンチセンスＲＮＡ内にリボザイム配列を含むことは
、ＲＮＡ切断活性をそのアンチセンスＲＮＡに付与し、それにより構築物の活性
を増大させる。標的ＲＮＡ特異的リボザイムの設計および使用は、Ｈａｓｅｌｏ
ｆｆら，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１（１９８８）に記載される。
【０１３３】 種々の架橋剤、アルキル化剤および本発明のポリヌクレオチド上のペンダント
基のようなラジカル生成種を用いて、核酸を結合、標識、検出および／または切
断し得る。例えば、Ｖｌａｓｓｏｖ，Ｖ．Ｖ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ（１９８６）１４：４０６５−４０７６は、標的配列に対して相補的な
ヌクレオチドのアルキル化誘導体との一本鎖ＤＮＡフラグメントの共有結合を記
載する。同じグループによる類似の研究の報告は、Ｋｎｏｒｒｅ，Ｄ．Ｇ．ら，
Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ（１９８５）６７：７８５−７８９による報告である。Ｉｖ
ｅｒｓｏｎおよびＤｅｒｖａｎはまた、切断を活性化し得る、改変されたヌクレ
オチドの取り込みによって媒介される一本鎖ＤＮＡの配列特異的切断を示した（
Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ（１９８７）１０９：１２４１−１２４３）。Ｍｅ
ｙｅｒ，Ｒ．Ｂ．ら，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ（１９８９）１１１：８５１
７−８５１９は、一本鎖標的ヌクレオチド配列に対して相補的なアルキル化剤を
用いて、標的ヌクレオチドに対する共有結合的架橋をもたらす。ソラレンによっ
て媒介される一本鎖オリゴヌクレオチドに対する光活性化された架橋は、Ｌｅｅ
，Ｂ．Ｌ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８８）２７：３１９７−３２０
３によって開示された。三重らせん形成プローブにおける架橋の使用はまた、Ｈ
ｏｍｅら，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ（１９９０）１１２：２４３５−２４３
７により開示された。一本鎖オリゴヌクレオチドに対して架橋するためのアルキ
ル化剤としてのＮ４，Ｎ４−エタノシトシン（Ｎ４，Ｎ４−ｅｔｈａｎｏｃｙｔ
ｏｓｉｎｅ）の使用はまた、ＷｅｂｂおよびＭａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｊ Ａｍ Ｃ
ｈｅｍ Ｓｏｃ（１９８６）１０８：２７６４−２７６５；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８６）１４：７６６１−７６７４；Ｆｅｔｅｒｉｔｚら
，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：４０００（１９９１）によって記載さ
れている。核酸を結合し、検出し、標識し、そして／または切断する種々の化合
物が、当該分野において公知である。例えば、米国特許第５，５４３，５０７号
；同第５，６７２，５９３号；同第５，４８４，９０８号；同第５，２５６，６
４８号；および同第５，６８１，９４１号を参照のこと。
【０１３４】 （タンパク質） 本発明の単離されたタンパク質は、上記でより十分に考察したように、本発明
のポリヌクレオチドのいずれか１つによってコードされる少なくとも１０アミノ
酸を有するポリペプチド、またはその保存的に改変された改変体であるポリペプ
チドを含む。本発明のタンパク質またはその改変体は、本発明のポリペプチド由
来の任意の数の連続したアミノ酸残基を含み得、ここで、その数は、１０から本
発明の全長ポリペプチドにおける残基の数までからなる整数の群より選択される
。必要に応じて、連続したアミノ酸のこの部分配列は、少なくとも１５、２０、
２５、３０、３５または４０アミノ酸長であり、しばしば少なくとも５０、６０
、７０、８０または９０アミノ酸長である。さらに、このような部分配列の数は
、１〜２０からなる群より選択される任意の整数（例えば、２、３、４または５
）であり得る。
【０１３５】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドとの特定の配列同一性を有するポリペ
プチドを含むタンパク質を提供する。配列同一性の百分率は、５０〜９９からな
る群より選択される整数である。例示的な配列同一性の値としては、６０％、６
５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８
６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９
５％、９６％、９７％、９８％および９９％が挙げられる。配列同一性は、例え
ば、ＧＡＰアルゴリズムまたはＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、決定され得
る。
【０１３６】 当業者が認識するように、本発明は、触媒的に活性な本発明のポリペプチド（
すなわち、酵素）を含む。触媒的に活性なポリペプチドは、ネイティブな（非合
成の）内在性ポリペプチドの比活性の少なくとも２０％、３０％または４０％、
そして好ましくは少なくとも５０％、６０％または７０％、そして最も好ましく
は少なくとも８０％、９０％または９５％の比活性を有する。さらに、基質特異
性（ｋcat／Ｋm）は、必要に応じて、ネイティブな（非合成の）内在性ポリペプ
チドに実質的に類似する。代表的に、Ｋmは、ネイティブな（非合成の）内在性
ポリペプチドのＫmの少なくとも３０％、４０％または５０％であり；そしてよ
り好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％である。酵素活性
および基質特異性（ｋcat／Ｋm）の尺度をアッセイおよび定量する方法は、当業
者に周知である。
【０１３７】 一般に、本発明のタンパク質は、免疫原として提示される場合、本発明のポリ
ペプチドに対して特異的に反応性の抗体の産生を惹起する。さらに、本発明のタ
ンパク質は、同じポリペプチドで十分に免疫吸着した、本発明のポリペプチドに
対して惹起された抗血清に対して結合しない。結合を決定するための免疫アッセ
イは、当業者に周知である。好ましい免疫アッセイは、以下で考察されるような
競合免疫アッセイである。従って、本発明のタンパク質は、免疫アッセイまたは
タンパク質精製技術のような例示的な用途のために、本発明のタンパク質に対し
て免疫反応性である抗体を構築するための免疫原として用いられ得る。
【０１３８】 （宿主細胞におけるタンパク質の発現） 本発明の核酸を用いて、本発明のタンパク質を、組換え操作された細胞（例え
ば、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物または好ましくは植物の細胞）において発現し
得る。この細胞は、（例えば、量、組成、位置および／または時間について）非
天然の条件でこのタンパク質を生成する。なぜなら、これらは、ヒトの介入によ
ってそうするように遺伝的に変更されているからである。
【０１３９】 当業者は、本発明のタンパク質をコードする核酸の発現に利用可能な多数の発
現系を良く知っていることが期待される。原核生物または真核生物におけるタン
パク質の発現について公知の種々の方法を詳細に記載する試みは行わない。
【０１４０】 手短にまとめると、本発明のタンパク質をコードする単離された核酸の発現は
代表的に、例えば、ＤＮＡまたはｃＤＮＡをプロモーター（これは構成性または
誘導性のいずれかである）に作動可能に連結し、続いて発現ベクターに組み込む
ことにより達成される。ベクターは、原核生物または真核生物のいずれかでの複
製および組み込みに適切であり得る。代表的な発現ベクターは、転写および翻訳
のターミネーター、開始配列および本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発
現調節に有用なプロモーターを含む。クローニングされた遺伝子の高レベルの発
現を得るために、少なくとも、転写を指向する強力なプロモーター、翻訳開始の
ためのリボソーム結合部位、および転写／翻訳ターミネーターを含む発現ベクタ
ーを構築することが所望され得る。当業者は、生物学的活性を低下させずに、本
発明のタンパク質に対して改変が行われ得ることを認識する。いくつかの改変は
、標的分子のクローニング、発現または融合タンパク質への組み込みを容易にす
るために行われ得る。このような改変は当業者に周知であり、そして例えば、開
始部位を提供するためにアミノ末端に付加されたメチオニン、または便利に配置
された精製配列を作製するためにいずれかの末端に配置されたさらなるアミノ酸
（例えば、ポリＨｉｓ）を含む。制限部位または終結コドンもまた、導入され得
る。
【０１４１】 （Ａ．原核生物における発現） 原核生物細胞は、発現のための宿主として用いられ得る。原核生物は最も頻繁
には、Ｅ．ｃｏｌｉの種々の株によって代表される；しかし、他の微生物株もま
た用いられ得る。本明細書中で、転写開始のためのプロモーターを（必要に応じ
てオペレーターとともに）リボソーム結合部位配列と一緒に含むと定義される通
常用いられる原核生物制御配列は、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラ
クトース（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ １９８：１
０５６（１９７７））、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄ
ｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０））な
らびにλ由来のＰＬプロモーターおよびＮ遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍ
ａｔａｋｅら，Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８（１９８１））のような通常用い
られるプロモーターを含む。選択マーカーを、Ｅ．ｃｏｌｉ中にトランスフェク
トされるＤＮＡベクターに含めることもまた有用である。このようなマーカーの
例としては、アンピシリン、テトラサイクリンまたはクロラムフェニコールに対
する耐性を指定する遺伝子が挙げられる。
【０１４２】 このベクターは、適切な宿主細胞への導入を可能にするように選択される。細
菌ベクターは代表的に、プラスミドまたはファージゲノム起源のものである。適
切な細菌細胞を、ファージベクター粒子で感染させるか、または裸のファージベ
クターＤＮＡでトランスフェクトさせる。プラスミドベクターを用いる場合、細
菌細胞は、プラスミドベクターＤＮＡでトランスフェクトされる。本発明のタン
パク質を発現させるための発現系は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．およびＳａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ（Ｐａｌｖａら，Ｇｅｎｅ ２２：２２９−２３５（１９８３）；
Ｍｏｓｂａｃｈら，Ｎａｔｕｒｅ ３０２：５４３−５４５（１９８３））を用
いて利用可能である。
【０１４３】 （Ｂ．真核生物における発現） 酵母、昆虫細胞株、植物および哺乳動物の細胞のような種々の真核生物発現系
は、当業者に公知である。以下で手短に説明するように、本発明のポリヌクレオ
チドは、これらの真核生物系において発現され得る。いくつかの実施形態では、
形質転換／トランスフェクトした植物細胞は、以下で考察するように、本発明の
タンパク質の生成のための発現系として用いられる。
【０１４４】 酵母における異種タンパク質の合成は周知である。Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．ら，
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）は、酵母においてタンパ
ク質を生成するために利用可能な種々の方法を記載する、十分に認識された研究
である。真核生物タンパク質の生成のための２つの広範に利用される酵母は、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓ
ｔｏｒｉｓである。ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＰｉｃｈｉａにおける発
現のためのベクター、株およびプロトコルは当該分野で公知であり、そして商業
的供給業者（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手可能である。適切なベク
ターは通常、発現制御配列（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたはア
ルコールオキシダーゼを含む、プロモーター）および所望により複製起点、終結
配列などを有する。
【０１４５】 本発明のタンパク質は、一旦発現されると、細胞を溶解し、そして標準的なタ
ンパク質単離技術を溶解産物に適用することによって酵母から単離され得る。精
製プロセスのモニタリングは、ウェスタンブロット技術または他の標準的な免疫
アッセイ技術の放射免疫アッセイを用いることにより達成され得る。
【０１４６】 本発明のタンパク質をコードする配列はまた、例えば、哺乳動物、昆虫または
植物起源の細胞培養物をトランスフェクトする際の使用のために種々の発現ベク
ターに連結され得る。ペプチドの生成に有用な細胞培養物の例は、哺乳動物細胞
である。哺乳動物細胞系はしばしば、細胞の単層の形態であるが、哺乳動物細胞
懸濁物もまた使用され得る。インタクトなタンパク質を発現し得る多数の適切な
宿主細胞株が、当該分野で開発されており、そしてＨＥＫ２９３細胞株、ＢＨＫ
２１細胞株およびＣＨＯ細胞株を含む。これらの細胞についての発現ベクターは
、発現制御配列（例えば、複製起点、プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモータ
ー、ＨＳＶ ｔｋプロモーターまたはｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プ
ロモーター）、エンハンサー（Ｑｕｅｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：
４９（１９８６）））、ならびに必要なプロセシング情報部位（例えば、リボソ
ーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０
ラージＴ ＡｇポリＡ付加部位）および転写ターミネーター配列）を含み得る。
本発明のタンパク質の生成のために有用な他の動物細胞は、例えば、Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である
。
【０１４７】 昆虫細胞において本発明のタンパク質を発現するための適切なベクターは通常
、ＳＦ９バキュロウイルスに由来する。適切な昆虫細胞株としては、カ幼虫、カ
イコ、ヨトウムシ、蛾およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞株（例えば、Ｓｃｈｎｅ
ｉｄｅｒ細胞株（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐ
ｈｏｌ．２７：３５３−３６５（１９８７）を参照のこと））が挙げられる。
【０１４８】 酵母については、より高等な動物または植物の宿主細胞を用いる場合、ポリア
デニル化配列または転写ターミネーター配列が、代表的に、ベクターに組み込ま
れる。ターミネーター配列の例は、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル
化配列である。転写物の正確なスプライシングのための配列もまた含まれ得る。
スプライシング配列の例は、ＳＶ４０由来のＶＰ１イントロンである（Ｓｐｒａ
ｇｕｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：７７３−７８１（１９８３））。さらに、宿
主細胞における複製を制御するための遺伝子配列が、ウシパピローマウイルス型
ベクター中に見出されるベクターのようなベクターに組み込まれ得る。Ｓａｖｅ
ｒｉａ−Ｃａｍｐｏ，Ｍ．，Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｐｉｌｌｏｍａ Ｖｉｒｕｓ
ＤＮＡ ａ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ，ＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ 第ＩＩ巻 ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．
Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｖｉｒｇｉｎ
ｉａ ２１３−２３８頁（１９８５）。
【０１４９】 （細胞のトランスフェクション／形質転換） 形質転換／トランスフェクションの方法は、本発明には重大ではない；形質転
換またはトランスフェクションの種々の方法が、現在利用可能である。作物また
は他の宿主細胞を形質転換するために、より新しい方法が利用可能である場合、
これらは直接適用され得る。従って、宿主細胞のゲノムへＤＮＡ配列を挿入し、
この配列の転写および／または翻訳を得てこの生物体における表現型の変化をも
たらすための広い多様性の方法が、開発された。従って、効率的な形質転換／ト
ランスフェクションを提供する任意の方法が、用いられ得る。
【０１５０】 （Ａ．植物形質転換） 本発明の所望のポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列（例えば、全長のタ
ンパク質をコードするｃＤＮＡ配列またはゲノム配列）は、所望の植物へ導入さ
れ得る組換え発現カセットを構築するのに用いられる。
【０１５１】 本発明の単離された核酸は、当該分野において公知の技術によって植物へ導入
され得る。一般に、上述に記載されるような組換え発現カセットおよび植物細胞
の形質転換に適切な組換え発現カセットが、調製される。次いで、本発明の単離
された核酸は、形質転換に使用され得る。このようにして、遺伝的に改変された
植物、植物細胞、植物組織、種子などが得られ得る。形質転換プロトコールは、
形質転換の標的とされる植物細胞の型（単子葉植物または双子葉植物）に依存し
て変化し得る。植物細胞を形質転換する適切な方法としては、以下が挙げられる
：微量注入（Ｃｒｏｓｓｗａｙら（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４
：３２０−３３４）、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓら（１９８６）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５６０２−５６０６）、Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（例えば、Ｚｈａｏら、米国特許第５，
９８１，８４０号；Ｈｉｎｃｈｅｅら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
６：９１５−９２１を参照のこと）、直接的遺伝子導入（ｄｉｒｅｃｔ ｇｅ
ｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ
．３：２７１７−２７２２）、および弾道粒子加速（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｐａ
ｒｔｉｃｌｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄら、米国
特許４，９４５，０５０号；Ｔｏｍｅｓら「Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓ
ｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｉｎｔａｃｔ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｍｉｃｒ
ｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ」ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈ
ｉｌｌｉｐｓ（編）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ
Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９５）；およびＭｃＣａｂｅら（１９８
８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３−９２６）を参照のこと）。また
、Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２
２：４２１−４７７；Ｓａｎｆｏｒｄら（１９８７）Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：２７−３７（タマネギ）
；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｉｓｉｏｌ．８７：６７１
−６７４（ダイズ）；ＭｃＣａｂｅら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ ６：９２３−９２６（ダイズ）；Ｄａｔｔａら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ ８：７３６−７４０（イネ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４３０５−４３０９（トウモ
ロコシ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：５５９
−５６３（トウモロコシ）；Ｔｏｍｅｓら、「Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ Ｔｒａｎ
ｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｉｎｔａｃｔ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ Ｖｉａ Ｍｉｃ
ｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ」ＧａｍｂｏｒｇおよびＰ
ｈｉｌｌｉｐｓ（編）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａ
ｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｓｐｒｉｎｇ
ｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９５）（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎ
ら（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０−４４４（トウモロ
コシ）Ｆｒｏｍｍら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３−８
３９（トウモロコシ）；Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎおよび
Ｈｏｏｙｋａａｓ（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１１：７６３−
７６４；Ｂｙｔｅｂｉｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８４：５３５４−５３４９（ユリ）；Ｄｅ Ｗｅｔら（１９８５）
Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕ
ｌｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｇ．Ｐ．Ｃｈａｐｍａｎら（編）、１９７−２０９頁
Ｌｏｎｇｍａｎ，ＮＹ（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒら（１９９０）Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：４１５−４１８；ならびにＫａｅｐｐｌｅｒら
（１９９２）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８４：５６０−５６６（ウイ
スカー（ｗｈｉｓｋｅｒ）媒介形質転換）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら（１９９２）
Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４：１４９５−１５０５（エレクトロポレーション）；
Ｌｌら（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １２：２５０−２
５５ならびにＣｈｒｉｓｔｏｕおよびＦｏｒｄ（１９９５）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ
Ｂｏｔａｎｙ ７５：７４５−７５０（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓを介するトウモロコシ）；（これらの全ては、本明細書中に参
考として援用される）を参照のこと。
【０１５２】 形質転換された細胞を、従来の方法に従って植物中で生長させ得る。例えば、
ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，５
：８１−８４を参照のこと。次いでこれらの植物を、生長させ得、そして同じ形
質転換された系統または異なる系統のいずれかで受粉させ得、そして同定された
所望の表現型特性を有するハイブリッドが生じる。その対象の表現型特性が安定
に維持されそして遺伝されることを保証するために、２世代以上を生長させ得、
次いで所望の表現型または他の特性が達成されたことを保証するために種子が収
集される。
【０１５３】 （Ｂ．原核生物、下等真核生物、および動物細胞のトランスフェクション） 動物および下等真核生物（例えば、酵母）宿主細胞は、種々の手段によるトラ
ンスフェクションにコンピテントであるかまたはコンピテントにされる。動物細
胞へＤＮＡを導入するいくつかの周知の方法が、存在する。これらは、以下を含
む：リン酸カルシウム沈殿、ＤＮＡを含む細菌プロトプラストとのレシピエント
細胞の融合、ＤＮＡを含むリポソームでのレシピエント細胞の処理、ＤＥＡＥデ
キストラン、エレクトロポレーション、バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉ
ｃｓ）、および細胞への直接的なＤＮＡの微量注入。トランスフェクトされた細
胞は、当該分野において周知の手段によって培養される。Ｋｕｃｈｌｅｒ，Ｒ．
Ｊ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ ａｎｄ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｄｏｗｄｅｎ、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ａｎ
ｄ Ｒｏｓｓ、Ｉｎｃ．（１９７７）。
【０１５４】 （タンパク質の合成） 本発明のタンパク質は、非細胞性合成法を用いて構築され得る。約５０アミノ
酸未満の長さのタンパク質の固相合成は、不溶性支持体へのこの配列のＣ末端ア
ミノ酸の結合、引き続いてこの配列中の残りのアミノ酸の連続付加によって達成
され得る。固相合成のための技術は、以下によって記載される：Ｂａｒａｎｙお
よびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ、３−２８４頁 Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第２巻：Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ａ．；Ｍｅｒｒｉ
ｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５６（１９
６３）、およびＳｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏ
ｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）。より長いタンパク質は、より短いフラグメントの
アミノ末端およびカルボキシ末端の縮合によって合成され得る。カルボキシ末端
の活性化によってペプチド結合を形成する方法（例えば、カップリング試薬Ｎ，
Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｃｙｃｙｌｏｈｅｘｙ
ｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）の使用による）は、当業者に公知である。
【０１５５】 （タンパク質の精製） 本発明のタンパク質は、当業者に周知の標準技術によって精製され得る。本発
明の組換え的に産生されたタンパク質は、直接的に発現され得るかまたは融合タ
ンパク質として発現され得る。組換えタンパク質は、細胞溶解（例えば、超音波
処理、フレンチプレス）およびアフィニティクロマトグラフィーの組合せによっ
て精製される。融合産物に関して、適切なタンパク質分解酵素を用いた融合タン
パク質の引き続く切断は、所望の組換えタンパク質を遊離させる。
【０１５６】 本発明のタンパク質、組換え体または合成物は、界面活性剤可溶化、硫酸アン
モニウムのような物質での選択的沈殿、カラムクロマトグラフィー、免疫精製法
などを含む当該分野において周知の標準技術によってかなりの純度まで精製され
得る。例えば、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅ
ｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｇｕｉｄｅ
ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ（１９９０）を参照のこと。例えば、抗体は、本明細書中に記載されるよう
なタンパク質に対して惹起され得る。Ｅ．ｃｏｌｉからの精製は、米国特許第４
，５１１，５０３号に記載される手順に従って達成され得る。次いでタンパク質
は、このタンパク質を発現する細胞より単離され得、そしてさらに本明細書中に
記載されるような標準タンパク質化学技術によって精製され得る。発現タンパク
質の検出は、当該分野において公知の方法によって達成され、そして例えば、ラ
ジオイムノアッセイ、ウエスタンブロッティング技術または免疫沈降法を含む。
【０１５７】 （トランスジェニック植物の再生） 植物発現ベクターによって形質転換された植物細胞は、例えば、標準植物組織
培養技術によって単一細胞、カルス組織または葉ディスクより再生され得る。ほ
とんど任意の植物由来の種々の細胞、組織、および器官が、植物全体を再生する
ように首尾よく培養され得ることは当該分野において周知である。培養されたプ
ロトプラスト由来の植物再生物は、以下に記載される：Ｅｖａｎｓら、Ｐｒｏｔ
ｏｐｌａｓｔｓ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｈａｎｄｂｏ
ｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｍａｃｍｉｌｌｉｌａｎ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１２４−１７６
頁（１９８３）；およびＢｉｎｄｉｎｇ、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ
ｌａｎｔｓ、Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏ
ｃａ Ｒａｔｏｎ、２１−７３頁（１９８５）。
【０１５８】 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって導入される外来遺伝子を含む植物の葉外
植片からの再生は、Ｈｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７：１２２９−１２
３１（１９８５）によって記載されるように達成され得る。この手順において、
形質転換体を、選択薬剤の存在下およびＦｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）、８０：４８０３（１９８３）によって記
載されるように形質転換された植物種においてシュートの再生を誘導する培地中
で生長させる。この手順は、代表的に２〜４週間以内にシュートを生じ、そして
これらの形質転換のシュートは、次いで細菌の増殖を防ぐ選択薬剤および抗生物
質を含む適切な根誘導培地（ｒｏｏｔ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）に移
植される。本発明のトランスジェニック植物は、稔性または不稔性であり得る。
【０１５９】 再生物はまた、植物カルス、外植片、器官、またはその一部より入手し得る。
このような再生技術は、Ｋｌｅｅら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈ
ｙｓ．３８：４６７−４８６（１９８７）に一般的に記載される。単一植物プロ
トプラストまたは種々の外植片のいずれか由来の植物の再生は、当該分野におい
て周知である。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａ．ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＨ．Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ
編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉ
ｆ．（１９８８）を参照のこと。この再生および成長プロセスは、形質転換体細
胞およびシュートの選択、形質転換体シュートの発根ならびに土壌中での小植物
の成長の工程を含む。トウモロコシの細胞培養および再生に関して、一般的に以
下を参照のこと：Ｔｈｅ Ｍａｉｚｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｆｒｅｅｌｉｎｇお
よびＷａｌｂｏｔ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）；Ｃｏ
ｒｎ ａｎｄ Ｃｏｒｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ、第３版、Ｓｐｒａｇｕｅお
よびＤｕｄｌｅｙ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏ
ｍｙ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（１９８８）。
【０１６０】 当業者は、組換え発現カセットがトランスジェニック植物に安定して組み込ま
れかつ作動可能であることが確認されたあと、有性交雑によって他の植物へ導入
され得ることを認識する。任意の多数の標準育種技術は、交雑される種に依存し
て用いられ得る。
【０１６１】 栄養繁殖される作物において、成熟トランスジェニック植物は、挿し木を行う
ことによってかまたは組織培養技術によって多数の同一植物を産生するために繁
殖され得る。望ましいトランスジェニックの選択が行われ、そして新しい品種が
得られ、そして商業的な使用のために栄養繁殖される。種子繁殖される作物にお
いて、成熟トランスジェニック植物は、ホモ接合性近交系植物を産生するために
自家交雑され得る。近交系植物は、新しく導入された異種核酸を含む種子を産生
する。これらの種子を生長させて、選択された表現型を生じる植物を産生し得る
。
【０１６２】 再生された植物から得られる部分（例えば、花、種子、葉、枝、果実など）は
、本発明に含まれる。ただし、これらの部分は、本発明の単離された核酸を含む
細胞を含む。再生植物の子孫および改変体、ならびに変異体もまた、本発明の範
囲内に含まれる。ただし、これらの部分は、導入された核酸配列を含む。
【０１６３】 選択可能なマーカーを発現するトランスジェニック植物は、例えば、標準イム
ノブロット技術およびＤＮＡ検出技術によって、本発明の核酸の伝達のためにス
クリーニングされ得る。トランスジェニック系統はまた代表的に、異種核酸の発
現レベルについて評価される。ＲＮＡレベルでの発現は、発現陽性植物を同定お
よび定量するのに最初に決定され得る。ＲＮＡ分析のための標準技術が用いられ
得、そして異種ＲＮＡ鋳型のみを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチド
プライマーを用いるＰＣＲ増幅アッセイおよび異種核酸特異的プローブを用いる
溶液ハイブリダイゼーションアッセイを含む。次いでこのＲＮＡ陽性植物は、本
発明の特異的な反応性の抗体を用いるウエスタンイムノブロット分析によってタ
ンパク質発現について分析され得る。さらに、標準プロトコルによるインサイチ
ュハイブリダイゼーションおよび免疫細胞化学は、トランスジェニック組織内の
発現の部位を局在化するために、それぞれ異種核酸特異的なポリヌクレオチドプ
ローブおよび抗体を用いて行われ得る。一般的に、多数のトランスジェニック系
統は、最も適切な発現プロフィールを伴う植物を同定および選択するために、組
み込まれた核酸について通常スクリーニングされる。
【０１６４】 好ましい実施形態は、付加された異種核酸に関してホモ接合性であるトランス
ジェニック植物である；すなわち、２つの付加された核酸配列を含むトランスジ
ェニック植物であって、１つの遺伝子が、染色体対の各々の染色体上の同一の遺
伝子座に存在するトランスジェニック植物である。ホモ接合性トランスジェニッ
ク植物は、単一の付加された異種核酸を含むヘテロ接合性トランスジェニック植
物を有性交配（自家受粉）し、産生された種子のいくつかを出芽させ、そしてコ
ントロール植物（すなわち、ネイティブな、非トランスジェニック）と比べて、
本発明のポリヌクレオチドの変化した発現について、産生された得られた植物を
分析することによって得られ得る。親植物への戻し交配および非トランスジェニ
ック植物との異系交雑もまた、意図される。
【０１６５】 （ポリペプチドレベルおよび／またはポリペプチド組成の調節） 本発明はさらに、植物またはその一部における本発明のポリペプチドの濃度ま
たは組成を調節する（すなわち、増加させるかまたは減少させる）ための方法を
提供する。調節は、植物中の濃度および／または組成（すなわち、本発明のポリ
ペプチドの比率）を増加させるかまたは減少させることによって達成され得る。
この方法は、以下の工程を含む：形質転換された植物細胞を得るための上述のよ
うな本発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現カセットを用いて植物細胞に導
入する工程；植物細胞成長条件下において形質転換植物細胞を培養させる工程；
ならびに植物中または植物部分中の濃度および／または組成を調節するのに十分
な時間にわたって、植物中に本発明のポリヌクレオチドの発現を誘導または抑制
する工程。
【０１６６】 いくつかの実施形態において、植物中の本発明のポリペプチドの含量および／
または組成は、遺伝子発現を上方制御または下方制御するために、遺伝子のプロ
モーターをインビボまたはインビトロで変化させることによって調節され得る。
いくつかの実施形態において、本発明のネイティブな遺伝子のコード領域は、こ
のコードされた酵素の活性を減少させるための置換、付加、挿入または欠失を介
して変えられ得る。例えば、Ｋｍｉｅｃ、米国特許第５，５６５，３５０号；Ｚ
ａｒｌｉｎｇら、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８を参照のこと。そしていくつか
の実施形態において、プロモーター配列を含む単離された核酸（例えば，ベクタ
ー）は、植物細胞内へトランスフェクトされる。引き続いて、本発明のポリヌク
レオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む植物細胞は、当業者に公知
の手段（例えば、サザンブロット、ＤＮＡ配列決定、またはこのプロモーターお
よびこの遺伝子に特異的なプライマーを用い、そしてこの遺伝子から産生される
アンプリコンを検出するＰＣＲ分析であるが、これらに限定されない）によって
選択される。上記の実施形態によって変更または改変された植物または植物の部
分を、植物中の本発明のポリペプチドの濃度および／または組成を調節するのに
十分な時間にわたって、植物形成条件下において生長させる。植物形成条件は、
当該分野において周知であり、そして前出に、手短に議論される。
【０１６７】 通常、濃度または組成は、上記の組換え発現カセットを欠く、ネイティブコン
トロール植物、植物部分、または細胞と比べて少なくとも５％、１０％、２０％
、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％増加または
減少される。本発明における調節は、発生の所望の段階まで植物を生長させる間
および／または生長に引き続いて生じ得る。時間的なおよび／または特定の組織
中の核酸発現の調節は、例えば、前出においてより詳細に議論されるように、セ
ンス配向性またはアンチセンス配向性における本発明のポリヌクレオチドに作動
可能に連結された適切なプロモーターを用いることによって制御され得る。本発
明のポリヌクレオチドの発現の誘導もまた、誘導化合物の有効量の外来性の投与
によって制御され得る。誘導可能なプロモーターおよびこれらのプロモーターか
らの発現を活性化する誘導化合物は、当該分野において周知である。好ましい実
施形態において、本発明のポリペプチドは、単子葉植物、特にトウモロコシにお
いて調節される。
【０１６８】 （分子マーカー） 本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む植物を遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔ
ｙｐｉｎｇ）する方法を提供する。必要に応じて、植物は単子葉植物（例えば、
トウモロコシまたはソルガム）である。遺伝子型決定は、染色体対のホモログを
識別する手段を提供し、そして植物の集団における分離個体を識別するために使
用され得る。分子マーカー方法は、系統発生研究のため、作物品種間の遺伝的関
係を特徴付けるため、交雑または体細胞ハイブリッドを同定するため、単一遺伝
子形質をもたらす染色体セグメントを位置付けるため、マップに基づいたクロー
ニングのため、そして量的遺伝の研究のために使用され得る。例えば、Ｐｌａｎ
ｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ、第７章、Ｃｌａｒｋ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉ
ｎ（１９９７）を参照のこと。分子マーカー方法については、一般的に、Ａｎｄ
ｒｅｗ Ｈ．Ｐａｔｅｒｓｏｎ １９９６（第２章）Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｐｐｉ
ｎｇ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ（Ａｎｄｒｅｗ Ｈ．Ｐａｔｅｒｓｏｎ編）（Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ／Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｉｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ａｕｓｔｉ
ｎ、Ｔｅｘａｓ、第７〜２１頁）によるＴｈｅ ＤＮＡ Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ
を参照のこと。
【０１６９】 本発明における遺伝子型決定の特定の方法は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）の
ような（しかし、これに限定されない）、かなり多数の分子マーカー分析技術を
使用し得る。ＲＦＬＰは、ヌクレオチド配列のにより引き起こされるＤＮＡ制限
フラグメント間の対立遺伝子差異の産物である。当業者に周知のように、ＲＦＬ
Ｐは代表的に、ゲノムＤＮＡの抽出および制限酵素での消化によって検出される
。一般的に、生じたフラグメントをサイズに従って分離し、そしてプローブ（単
一コピーのプローブが好ましい）でハイブリダイズさせる。相同染色体由来の制
限フラグメントが示される。対立遺伝子間のフラグメントのサイズにおける差異
がＲＦＬＰを表す。従って、本発明はさらに、本発明の遺伝子または核酸ならび
にこれらの遺伝子または核酸に遺伝的に連鎖した染色体配列の分離を、ＲＦＬＰ
分析のような技術を使用して追跡するための手段を提供する。連鎖した染色体配
列は、本発明の遺伝子の５０センチモルガン（ｃＭ）以内、しばしば４０ｃＭ以
内または３０ｃＭ以内、好ましくは２０ｃＭ以内または１０ｃＭ以内、より好ま
しくは５ｃＭ以内、３ｃＭ以内、２ｃＭ以内、または１ｃＭ以内に存在する。
【０１７０】 本発明では、植物の核ゲノムの分子マーカーマッピングのために使用される核
酸プローブは、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、本発明のポリヌクレオ
チドをコードする遺伝子に選択的にハイブリダイズする。好ましい実施形態では
、プローブを、本発明のポリヌクレオチドから選択する。代表的に、これらのプ
ローブは、ｃＤＮＡプローブまたは制限酵素処理（例えば、Ｐｓｔ Ｉ）ゲノム
クローンである。プローブの長さは、前出においてより詳細に考察されているが
、代表的には、少なくとも１５塩基の長さ、より好ましくは少なくとも２０、２
５、３０、３５、４０、または５０塩基の長さである。しかし、一般的に、プロ
ーブは約１キロ塩基未満の長さである。好ましくは、プローブは、半数体染色体
の相補体における固有の遺伝子座にハイブリダイズする、単一コピーのプローブ
である。ＲＦＬＰマッピングに使用されるいくつかの例示的な制限酵素は、Ｅｃ
ｏＲＩ、ＥｃｏＲｖ、およびＳｓｔＩである。本明細書中で使用される場合、用
語「制限酵素」は、特定のヌクレオチド配列を認識し、そして単独または別の組
成物との組み合わせにおいて、その特定のヌクレオチド配列を切断する組成物へ
の参照を含む。
【０１７１】 ＲＦＬＰを検出する方法は、以下の工程を包含する：（ａ）植物のゲノムＤＮ
Ａを制限酵素で消化する工程；（ｂ）選択的ハイブリダイゼーション条件下で、
このゲノムＤＮＡの中の本発明のポリヌクレオチドの配列に、核酸プローブをハ
イブリダイズさせる工程；（ｃ）そこからＲＦＬＰを検出する工程。本発明のポ
リヌクレオチドの多型性（対立遺伝子）改変体を識別する他の方法は、当業者に
周知の分子マーカー技術を使用することにより得、これには以下のような技術が
含まれる：１）一本鎖コンホメーション分析（ＳＳＣＡ）；２）変性剤濃度勾配
ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）；３）ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ；４）対立
遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）；５）ヌクレオチドのミスマッチを
認識するタンパク質（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＳタンパク質）の使用；お
よび６）対立遺伝子特異的ＰＣＲ。２つの相補的ＤＮＡ鎖の間のミスマッチ検出
に基づく他のアプローチとしては、クランプ型（ｃｌａｍｐｅｄ）変性ゲル電気
泳動（ＣＤＧＥ）；ヘテロ二重鎖分析（ＨＡ）；および化学的ミスマッチ切断（
ＣＭＣ）が挙げられる。従って、本発明はさらに、ストリンジェントなハイブリ
ダイゼーション条件下で、本発明のポリヌクレオチドを含むことが疑われるサン
プルと核酸プローブとを接触させる工程を包含する、遺伝子型決定方法を提供す
る。一般的に、サンプルは植物サンプルである；好ましくは、本発明のトウモロ
コシのポリヌクレオチド（例えば、遺伝子、ｍＲＮＡ）を含むことが疑われるサ
ンプルである。核酸プローブは、ストリンジェントな条件下で、多型性マーカー
を含む本発明のポリヌクレオチドの部分配列に選択的にハイブリダイズする。核
酸プローブの多型性マーカー核酸配列への選択的ハイブリダイゼーションは、ハ
イブリダイゼーション複合体を産出する。ハイブリダイゼーション複合体の検出
は、サンプルにおけるその多型性マーカーの存在を示す。好ましい実施形態では
、核酸プローブは、本発明のポリヌクレオチドを含む。
【０１７２】 （ＵＴＲおよびコドンの優先度（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）） 一般的に、翻訳効率は、ＲＮＡの５’非コード領域または非翻訳領域（５’Ｕ
ＴＲ）における特定の配列エレメントによって調節されることが見出された。正
の配列モチーフとしては、翻訳開始コンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：８１２５（１９８７））および７−メチルグ
アノシンキャップ構造（Ｄｒｕｍｍｏｎｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１３：７３７５（１９８５））が挙げられる。負のエレメントとしては、
安定な分子内５’ＵＴＲステムループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造（Ｍｕｅｓｉ
ｎｇら、Ｃｅｌｌ ４８：６９１（１９８７））およびＡＵＧ配列または５’Ｕ
ＴＲにおいて適切なＡＵＧの後ろの短いオープンリーディングフレーム（Ｋｏｚ
ａｋ、前出、Ｒａｏら、Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２８４（１
９８８））が挙げられる。従って、本発明は、異種コード配列の翻訳の調節のた
めの５’および／または３’ＵＴＲ領域を提供する。
【０１７３】 さらに、本発明のポリヌクレオチドのポリペプチドコードセグメントを改変し
て、コドン使用頻度を変更し得る。変更したコドン使用頻度を使用して、所望の
宿主における発現のために、翻訳効率を変更し得および／またはコード配列を最
適化し得、例えば、トウモロコシにおける発現のために、異種配列におけるコド
ン使用頻度を最適化し得る。本発明のポリヌクレオチドのコード領域におけるコ
ドン使用頻度を、市販のソフトウェアパッケージ（例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏ
ｕｐから入手可能な「Ｃｏｄｏｎ Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」（Ｄｅｖｅｒｅａｕ
ｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５（１９８４
）を参照のこと）またはＭａｃＶｅｃｔｏｒ４．１（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａ
ｋ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、Ｃｏｎｎ．））を使用して、統計的に解析し
得る。従って、本発明は、本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチドのコード
領域に特徴的なコドン使用頻度を提供する。コドン使用頻度を決定するために使
用され得るポリヌクレオチドの数は、１から本明細書中に提供されるような本発
明のポリヌクレオチドの数までの任意の整数であり得る。必要に応じて、ポリヌ
クレオチドは全長配列である。統計解析のための例示的な配列数は、少なくとも
１、５、１０、２０、５０、または１００であり得る。
【０１７４】 （配列シャッフリング） 本発明は、本発明のポリヌクレオチドを使用した配列シャッフリングの方法、
およびそれから生じる組成物を提供する。配列シャッフリングは、ＰＣＴ公開番
号ＷＯ９７／２００７８に記載される。Ｚｈａｎｇ，Ｊ．−Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４５０４−４５０９（１９９７）
もまた参照のこと。一般的に、配列シャッフリングは、選択またはスクリーニン
グされ得る所望の特徴を有するポリヌクレオチドのライブラリーを生成するため
の手段を提供する。組換えポリヌクレオチドのライブラリーは、実質的な配列同
一性を有し、かつインビトロまたはインビボで相同的に組換えされ得る配列領域
を含む、関連した配列のポリヌクレオチドの集団から生成される。配列を組換え
たポリヌクレオチドの集団は、所望されるかまたは有利な特徴を保有するポリヌ
クレオチドの部分集団を含み、そしてこれは、適切な選択方法またはスクリーニ
ング方法により選択され得る。特徴は、スクリーニング系において選択または検
出され得る任意の特性または属性であり得、そして以下の特性を含み得る：コー
ドされるタンパク質、転写エレメント、転写、ＲＮＡプロセシング、ＲＮＡ安定
性、クロマチンのコンホメーション、翻訳、または遺伝子もしくは導入遺伝子の
他の発現特性を制御する配列、複製エレメント、タンパク質結合エレメントなど
（例えば、選択可能または検出可能な特性を付与する任意の特徴）。いくつかの
実施形態では、選択された特徴は、本明細書中で提供されるような、野生型タン
パク質に対するＫmの減少および／またはＫcatの増加である。他の実施形態では
、配列シャッフリングから生成されるタンパク質またはポリヌクレオチドは、シ
ャッフリングされてない野生型ポリヌクレオチドよりも高いリガンド結合親和性
を有する。このような特性における増加は、野生型の値の少なくとも１１０％、
１２０％、１３０％、１４０％、または少なくとも１５０％であり得る。
【０１７５】 （一般配列およびコンセンサス配列） 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはさらに、以下を含む：（ａ）
本発明の、それぞれ、少なくとも２つの相同なポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドの一般配列；および（ｂ）本発明の、それぞれ、少なくとも３つの相同なポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドのコンセンサス配列。本発明の一般配列は、
それぞれ、一般的なポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列によって取り
囲まれる各種のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む。アミノ酸または核
酸のコンセンサス配列を有するポリヌクレオチドによって取り囲まれる個々の種
を使用して、他の種、属、科、目、綱、門、または界におけるホモログをスクリ
ーニングするための抗体を産生し得るか、または核酸プローブもしくはプライマ
ーを生成し得る。例えば、Ｚｅａ ｍａｙｓの遺伝子ファミリー由来のコンセン
サス配列を有するポリヌクレオチドを使用して、コムギ、イネ、またはソルガム
のような他のＧｒａｍｉｎｅａｅ種に対する抗体または核酸プローブもしくはプ
ライマーを生成し得る。あるいは、オーソロガス遺伝子から生成されたコンセン
サス配列を有するポリヌクレオチドを使用して、他の分類群のオーソログ（ｏｒ
ｔｈｏｌｏｇ）を同定または単離し得る。代表的に、コンセンサス配列を有する
ポリヌクレオチドは、少なくとも９、１０、１５、２０、２５、３０、または４
０アミノ酸の長さ、または２０、３０、４０、５０、１００、または１５０ヌク
レオチドの長さである。当業者が知るように、整列された配列間で異なるが、上
記で考察したような同じ保存的置換の群由来であるアミノ酸について、保存的ア
ミノ酸置換が使用され得る。必要に応じて、１または２を超えない保存的アミノ
酸が、コンセンサス配列の各１０アミノ酸長に対して置換される。
【０１７６】 コンセンサス配列または一般配列の作製のために使用される類似の配列として
は、本明細書中に提供されるような、同一遺伝子、オーソロガス配列、またはパ
ラロガス配列の任意の数および組み合わせの対立遺伝子改変体が挙げられる。必
要に応じて、コンセンサス配列または一般配列を作成する際に使用される類似の
配列を、ＢＬＡＳＴアルゴリズムの最小和確率（Ｐ（Ｎ））を使用して同定する
。配列解析ソフトウェアの種々の供給業者は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら
編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎ
ｃ．との間の合併会社）（補遺３０）の第７章に列挙される。参照核酸に対する
試験核酸の比較において最小和確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１
未満または約０．００１未満、そして最も好ましくは約０．０００１未満または
約０．００００１未満である場合、ポリヌクレオチド配列を、参照配列に対して
類似するとみなす。類似のポリヌクレオチドを整列し得、そして多数の商業的供
給業者（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉ
ｓｏｎ、ＷＩ）のＰＩＬＥＵＰソフトウェア、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｎｏｒｔ
ｈ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）のＡＬＩＧＮＸ、またはＧｅｎｅｃｏｄｅ（Ａｎ
ｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）のＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ）から入手可能な複数配列整列
ソフトウェアを使用して、コンセンサス配列または一般配列を作成し得る。都合
よく、このようなソフトウェアのデフォルトのパラメーターを使用して、コンセ
ンサス配列または一般配列を作成し得る。
【０１７７】 （酵素活性または発現を調節する化合物についてのアッセイ） 本発明はまた、本発明の触媒的に活性なポリペプチドに結合し（例えば、基質
）、および／またはその酵素活性を増加もしくは減少（すなわち、調節）する化
合物を同定する手段を提供する。本方法は、酵素に結合するかまたは酵素活性を
調節する能力が決定されるべき化合物と、本発明のポリペプチドを接触させる工
程を包含する。使用されるポリペプチドは、本発明のネイティブな全長ポリペプ
チド（例えば、酵素）の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％または
４０％、より好ましくは少なくとも５０％または６０％、そして最も好ましくは
少なくとも７０％または８０％の比活性を有する。一般的に、ポリペプチドは、
化合物の効果を決定するに十分な範囲（代表的に、約１ｎＭ〜１０μＭ）で存在
する。同様に、化合物は、約１ｎＭ〜１０μＭの濃度で存在する。当業者は、酵
素濃度、リガンド濃度（すなわち、基質、生成物、インヒビター、アクチベータ
ー）、ｐＨ、イオン強度、および温度のような因子を制御して、有用な反応速度
データを得、そしてポリペプチドに結合するかまたはポリペプチド活性を調節す
る化合物の存在または非存在を決定することを理解する。酵素反応速度を測定す
る方法は、当該分野において周知である。例えば、Ｓｅｇｅｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ
Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７６）を参照のこと。
【０１７８】 （選択可能マーカーとしてのトウモロコシアデノシンデアミナーゼの使用） 本発明は、形質転換株の選択のための方法として、すなわち、選択可能マーカ
ーとして使用され得る。プロモーターに作動可能に連結され、次いで上記の任意
の方法によって植物細胞に形質転換されたトウモロコシアデノシンデアミナーゼ
遺伝子は、アデノシンデアミナーゼを発現する。植物細胞が、培地中でデオキシ
アデノシンまたはアナログの存在下に置かれた場合、形質転換細胞のみが増殖す
る。デオキシアデノシンアナログの例は、２−デオキシアデノシン、コルジセピ
ン（３−デオキシアデノシン）、ａｒａ−Ａ（９−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル
アデニン）、ｘｙｌ−Ａ（９−Ｂ−Ｄ−キシロフラノシルアデニン）、２，６−
ジアミノプリンリボシド、６−クロロプリンリボシド、６−メトキシプリンリボ
シド、および２’，３’−ジデオキシアデノシン、ならびに２−クロロアデノシ
ンである（Ａｇａｒｗａｌ ＲＰ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１７：３
９９〜４２９，１９８２；Ｐｅｌｃｈｅｒ，Ｌ．米国特許第５４７４９２９，１
９９３を参照のこと）。デオキシアデノシンまたはアナログの存在下における植
物細胞の増殖は、トウモロコシアデノシンデアミナーゼについてコードし、従っ
て基質を脱アミノ化し解毒するコード配列を発現するように形質転換された植物
細胞の生存を支持する。トウモロコシアデノシンデアミナーゼカセットが、目的
の別の遺伝子と同時形質転換され、次いでデオキシアデノシンまたはアナログの
存在下に置かれた場合、本発明は、目的の遺伝子を含む植物細胞のみの選択を可
能にする。過去において、抗菌耐性遺伝子が、選択可能なマーカーとして使用さ
れている。抗菌遺伝子を使用する消費者および環境保護主義者による現在の関心
、およびこの使用に起因して生じる耐性微生物の可能性を考えると、本発明のよ
うな非抗菌耐性の選択可能マーカー系は、この非常に重要な必要性を満たす。
【０１７９】 本発明を、理解の明確化の目的で、例示および例として幾分詳細に記載してい
るが、特定の変化および改変が、添付の特許請求の範囲の範囲内で実施され得る
ことは明らかである。
【０１８０】 （実施例１） 本実施例は、ｃＤＮＡライブラリーの構築を記載する。
【０１８１】 （総ＲＮＡの単離） 配列番号１のＲＮＡを、Ｂ７３トウモロコシ株の２つの実由来の未成熟の実組
織から単離した。特許のＰｉｏｎｅｅｒ Ｈｉ−Ｂｒｅｄ Ｉｎｔ’ｌ Ｉｎｃ
．近交系の苗条培地、ＰＨＲＥ１（米国特許第５，４１６，２５４号）（これは
、２７３Ｎ培地（Ａｐｐｅｎｄｉｘ）上に保持される）は、配列番号３のＲＮＡ
の供給源であった。配列番号５のライブラリを調製するために使用したポリＡ
ＲＮＡを、後期減数分裂から有糸分裂１の細胞学的段階にあり、小胞子組織を含
むことが決定された４房のＡ６３２株から調製した。総ＲＮＡを、Ｃｈｏｍｃｚ
ｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．およびＳａｃｃ
ｈｉ，Ｎ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２、１５６（１９８７））によっ
て記載されるグアニジンイソチオシアネート／酸−フェノール手順の改変版を使
用して、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いてトウモロコシ組織から単離した。簡潔には
、植物組織サンプルを、ＴＲＩＺＯＬ試薬の添加の前に液体窒素中で粉砕し、次
いで、乳鉢および乳棒でさらにホモジナイズした。水相および有機相の分離のた
めに、遠心分離前にクロロホルムの添加を実施した。総ＲＮＡを、水相からのイ
ソプロピルアルコールでの沈澱によって回収した。
【０１８２】 （ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの単離） 総ＲＮＡからのポリ（Ａ）＋ＲＮＡの選択を、ＰＯＬＹＡＴＴＲＡＣＴシステ
ム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用
して実施した。簡潔には、ビオチン化オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して、ｍ
ＲＮＡの３’ポリ（Ａ）テイル（ｔａｉｌ）にハイブリダイズした。常磁性粒子
に結合したストレプトアビジンおよび磁気分離スタンドを使用して、ハイブリッ
ドを捕捉した。ｍＲＮＡを高ストリンジェントな条件で洗浄し、そしてＲＮａｓ
ｅを含まない脱イオン水によって溶出した。
【０１８３】 （ｃＤＮＡライブラリーの構築） ｃＤＮＡ合成を実施し、そしてＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓ
ｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕ
ｒｇ、ＭＤ）を使用して、単方向性ｃＤＮＡライブラリーを構築した。ｃＤＮＡ
の第１鎖を、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴ（ｄＴ）プライマーをプライミングする
ことによって合成した。反応を、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔ
ｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＩＩによって、４５℃で触媒した。ｃＤＮＡの第２
鎖を、α−32Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、そして反応物の一部を、アガロースゲル電
気泳動により分析してｃＤＮＡのサイズを決定した。５００塩基対未満のｃＤＮ
Ａ分子および連結されていないアダプターを、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ−Ｓ４００ク
ロマトグラフィーによって取り除いた。選択されたｃＤＮＡ分子を、ｐＳＰＯＲ
Ｔ１ベクター中に、ＮｏｔＩ部位とＳａｌＩ部位との間で連結した。
【０１８４】 （実施例２） 本実施例は、ｃＤＮＡ配列決定およびライブラリーの差引きを記載する。
【０１８５】 （配列決定テンプレートの調製） 個々のコロニーを拾い上げ、そしてＭ１３正方向プライマーおよびＭ１３逆方
向プライマーを用いるＰＣＲによってか、またはプラスミド単離によってかのい
ずれかでＤＮＡを調製した。すべてのｃＤＮＡクローンを、Ｍ１３逆方向プライ
マーを使用して、配列決定した。
【０１８６】 （Ｑ−ｂｏｔ差引き手順） 差引き手順に供したｃＤＮＡライブラリーを、１プレートあたり約３，０００
コロニーの密度で、２２×２２ｃｍ2の寒天プレート上にプレートした。このプ
レートを、３７℃のインキュベーター内で１２〜２４時間インキュベートした。
コロニーを、ロボット型コロニー拾い上げ機Ｑ−ｂｏｔ（ＧＥＮＥＴＩＸ Ｌｉ
ｍｉｔｅｄ）によって、３８４ウェルプレート中に拾い上げた。これらのプレー
トを、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１８７】 一旦、十分なコロニーが拾い上げられると、Ｑ−ｂｏｔを用いて、それらを２
２×２２ｃｍ2のナイロンメンブレン上に固定した。各メンブレンは、９，２１
６コロニーまたは３６，８６４コロニーを含んでいた。これらのメンブレンを、
適切な抗生物質を有する寒天プレート上に配置した。このプレートを、３７℃で
一晩インキュベートした。
【０１８８】 ２日目にコロニーを回収した後、これらのフィルターを変性溶液で予め湿らせ
た濾紙上に４分間配置し、次いで、沸騰水浴の上面でさらに４分間インキュベー
トした。次いで、このフィルターを中和溶液で予め湿らせた濾紙上に４分間配置
した。乾燥濾紙上にこのフィルターを１分間配置することによって過剰な溶液を
取り除いた後、このフィルターのコロニー側をＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液中
に配置し、３７℃で４０〜５０分間インキュベートした。このフィルターを乾燥
濾紙上に配置して、一晩で乾燥させた。次いで、ＵＶ光処理によって、ＤＮＡを
ナイロンメンブレンに架橋した。
【０１８９】 コロニーハイブリダイゼーションを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃ
ｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版）によって記載される
ように実施した。以下のプローブを、コロニーハイブリダイゼーションにおいて
使用した： １．大半の重複したクローンを除去するための、ライブラリーを作製したのと同
じ組織に由来する第１鎖ｃＤＮＡ、 ２．以前の配列決定データに基づいた、同じライブラリー由来の４８〜１９２の
大半の重複したｃＤＮＡクローン、 ３．トウモロコシ配列データベース全体における１９２の大半の重複したｃＤＮ
Ａクローン、 ４．ポリＡテイルを含むが、ｃＤＮＡを含まないクローンを除く、配列番号３に
列挙されるＳａｌ−Ａ２０オリゴヌクレオチド、 ５．ｒＲＮＡ由来のｃＤＮＡクローン。
【０１９０】 オートラジオグラフィの画像をコンピューターで走査し、そして各コロニーの
シグナル強度および非放射性コロニーの所在（ｃｏｌｄ ｃｏｌｏｎｙ ａｄｄ
ｒｅｓｓ）を分析した。３８４ウェルプレートから９６ウェルプレートへの、コ
ールドコロニーの再配置を、Ｑ−ｂｏｔを使用して実施した。
【０１９１】 （実施例３） 本実施例は、コンピューター相同性検索からの遺伝子の同定を記載する。
【０１９２】 遺伝子の正体を、ＢＬＡＳＴの「ｎｒ」データベース（すべての非重複性Ｇｅ
ｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳産物、３次元構造Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ由来の配列、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列デー
タベース、ＥＭＢＬ、およびＤＤＢＪデータベースの最新の主要な公開物、を含
む）に含まれる配列に対する類似性について、デフォルトパラメーターの下でＢ
ＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏ
ｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２
１５：４０３−４１０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳ
Ｔ／もまた参照のこと）検索を実行して、決定した。ｃＤＮＡ配列を、ＢＬＡＳ
ＴＮアルゴリズムを用いて、「ｎｒ」データベース中に含まれる公的に利用可能
なすべてのＤＮＡ配列に対する類似性について分析した。ＤＮＡ配列をすべての
読み取り枠で翻訳し、そしてＮＣＢＩにより提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズ
ム（Ｇｉｓｈ，Ｗ．およびＳｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ ３：２６６−２７２（１９９３））を使用して、「ｎｒ」データベース中
に含まれる公的に利用可能なすべてのタンパク質配列に対する類似性を比較した
。いくつかの場合では、ＤＮＡの重複するセグメントを含む２つ以上のクローン
由来の配列決定データを、連続したＤＮＡ配列を構築するために使用した。
【０１９３】 （実施例４） 本実施例は、トウモロコシＡＤＡタンパク質配列を例示し、そして金属イオン
（Ｚ++）の結合に関与するアミノ酸の保存、ならびに触媒部位残基の保存を記載
する。
【０１９４】
【表１】 強調した残基（マウスＡＤＡおいてＺｎ++原子の配位に関与することが示された
；Ｗｉｌｓｏｎ ＤＫら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１２７８〜１２８４、１９
９１を参照のこと）は、トウモロコシ酵素中に保存される。下線部のアミノ酸は
、原核生物および真核生物のＡＤＡ中に保存される。
【０１９５】
【表２】 上記の実施例を、本発明を例示するために提供するが、本発明の範囲を制限す
るためではない。本発明の他の改変は当業者に容易に明らかであり、そして添付
の特許請求の範囲に包含される。本明細書中に引用されるすべての刊行物、特許
、および特許出願を、本明細書中で参考として援用する。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 9/78 5/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA06 CA17 CA19 CB03 CD03 CD07 CD10 4B024 AA01 AA08 BA11 CA04 CA09 CA12 HA14 HA17 4B050 CC03 DD03 LL01 LL03 4B065 AA88Y AB01 CA31 CA44 CA46

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離された植物アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）ポリヌク
    レオチドであって、以下： （ａ）配列番号１、３および５からなる群より選択されるポリヌクレオチドと
    少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドであって、ここで該配
    列同一性パーセントは、各参照配列のコード領域全体に基づき、そしてデフォル
    トパラメータの下でＧＡＰアルゴリズムによって計算される、ポリヌクレオチド
    ； （ｂ）配列番号２、４および６からなる群より選択されるポリペプチドをコー
    ドするポリヌクレオチド； （ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、３
    および５からなる群より選択されるポリヌクレオチド内の遺伝子座に対して選択
    的にハイブリダイズするプライマーを用いて、Ｚｅａ ｍａｙｓ核酸ライブラリ
    ーから増幅されたポリヌクレオチド； （ｄ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および０．１×ＳＳＣ
    中での６０℃での洗浄下で、配列番号１、３および５からなる群より選択される
    ポリヌクレオチドに対して選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド； （ｅ）配列番号１、３および５からなる群より選択されるポリヌクレオチド；
    ならびに （ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）のポリヌクレオチドに対
    して相補的であるポリヌクレオチド、 からなる群より選択されるメンバーを含む、核酸。
  2. 【請求項２】 センスまたはアンチセンスの配向で、プロモーターに作動可
    能に連結された請求項１に記載のメンバーを含む、組換え発現カセット。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載の組換え発現カセットを含む、細菌、酵母ま
    たは植物宿主細胞。
  4. 【請求項４】 請求項２に記載の組換え発現カセットを含む、トランスジェ
    ニック植物。
  5. 【請求項５】 前記植物が単子葉植物である、請求項４に記載のトランスジ
    ェニック植物。
  6. 【請求項６】 前記植物が双子葉植物である、請求項４に記載のトランスジ
    ェニック植物。
  7. 【請求項７】 前記植物が、トウモロコシ、ダイズ、ヒマワリ、ソルガム、
    カノーラ、コムギ、アルファルファ、ワタ、イネ、オオムギおよびキビからなる
    群より選択される、請求項４に記載のトランスジェニック植物。
  8. 【請求項８】 請求項４に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジ
    ェニック種子。
  9. 【請求項９】 植物においてアデノシンデアミナーゼのレベルを調節する方
    法であって、以下： （ａ）プロモーターに作動可能に連結された請求項１に記載のアデノシンデア
    ミナーゼポリヌクレオチドを含む組換え発現カセットを植物細胞に導入する工程
    ； （ｂ）植物細胞が増殖する条件下で該植物細胞を培養する工程； （ｃ）形質転換された遺伝子型を保有する植物を再生する工程；および （ｄ）該ポリヌクレオチドの発現を、該植物におけるアデノシンデアミナーゼ
    のレベルを調節するに十分な時間にわたって誘導する工程、 を包含する、方法。
  10. 【請求項１０】 前記植物がトウモロコシである、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 植物の形質転換方法であって、該方法は、以下： （ａ）デオキシアデノシン、２’−デオキシアデノシン、またはそれらのアナ
    ログによって、成長阻害に対して感受性の植物種の細胞に、作動可能に連結され
    た成分を含むＤＮＡ構築物、該食物細胞において機能的なプロモーター、該デオ
    キシアデノシン、２’−デオキシアデノシン、またはそれらのアナログを解毒し
    得る請求項１に記載のアデノシンデアミナーゼをコードするＤＮＡ配列、および
    該植物細胞において機能的な転写終結領域を、導入する工程： （ｂ）該デオキシアデノシン、２’−デオキシアデノシン、またはそれらのア
    ナログを含む植物成長培地中で該植物細胞を培養し、そして該デオキシアデノシ
    ン、２’−デオキシアデノシン、またはそれらのアナログに対して耐性を示す形
    質転換された植物細胞を選択する工程、 を包含する、方法。
  12. 【請求項１２】 単離された植物アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）タンパ
    ク質であって、以下： （ａ）配列番号２および４からなる群より選択されるポリペプチド由来の少な
    くとも２０の連続したアミノ酸のポリペプチド； （ｂ）配列番号２および４からなる群より選択されるポリペプチド； （ｃ）配列番号２および４からなる群より選択されるポリペプチドに対して少
    なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ該ポリペプチドと共通の少なくとも１
    つの直鎖状エピトープを保有するポリペプチドであって、ここで該同一性パーセ
    ントが、デフォルトパラメータの下でＧＡＰアルゴリズムによって決定される、
    ポリペプチド；ならびに （ｄ）請求項１に記載のメンバーによってコードされる少なくとも１つのポリ
    ペプチド、 からなる群より選択されるメンバーを含む、タンパク質。
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