WO2005105991A1 - 放線菌由来のａｍｐデアミナーゼ、及びその使用 - Google Patents

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WO2005105991A1
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amp deaminase
streptomyces
deaminase
nucleic acid
protein
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PCT/JP2005/007892
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English (en)
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Inventor
Ryoko Mizuguchi
Shigeharu Mori
Atsuki Toumoto
Kei-Ichi Ando
Kensuke Yuuki
Original Assignee
Amano Enzyme Inc.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)

Definitions

  • the present invention relates to AMP deaminase. More specifically, it relates to AMP deaminase derived from microorganisms and its use.
  • AMP deaminase which is also known as adenyl deaminase, AMP aminohydrolase, or the like, catalyzes a reaction that hydrolyzes denylic acid to produce inosinic acid and ammonia.
  • AMP deaminase is widely present in animal biological tissues and has been isolated from various tissue forces of various species so far (Tetsuro Fujishima and Hiroshi Yoshino, Amino Acid-Nucleic Acid, No. 16, pp. 45-55 (1967))
  • Non-Patent Document 1 Magdale'na Rosinova 'et al., Collection Czechoslov. Chem. Commun. Vol.
  • Non-Patent Document 2 JP-A-55-120788: Patent Document 1 .
  • the search for AMP deaminase derived from microorganisms has been energetically conducted, mainly from the viewpoint of industrial use.
  • studies on AMP deaminase derived from filamentous fungi have been widely conducted, and some AMP deaminase such as AMP deaminase derived from Aspergillus melleus have been industrially manufactured for the purpose of enhancing umami in the production of yeast extract. It is being used.
  • Patent Document 1 JP-A-55-120788
  • Non-Patent Document 1 Tetsuro Fujishima and Hiroshi Yoshino, Amino Acid-Nucleic Acid, No. 16, pp45-55 (1967)
  • nucleases and AMP deaminase are generally used in the production of yeast extract to enhance umami.
  • the optimal temperature of nuclease is about 65 ° C.
  • currently used AMP derivation from Aspergillus melleus The optimal temperature of aminase is about 50 ° C. Therefore, it was impossible to allow two enzymes to act simultaneously at a high temperature in production, so that the nuclease treatment and the AMP deaminase treatment had to be performed as separate steps. If the AMP deaminase is excellent in thermostability, it can act simultaneously with the nuclease, and the production process can be shortened.
  • thermostable AMP deaminase since it is possible to carry out the treatment step using these two enzymes at a high temperature, it is not necessary to temporarily lower the treatment temperature to about 50 ° C, which is the reaction temperature of AMP deaminase, during the manufacturing process. Bacterial contamination can be effectively prevented. Thus, thermostable AMP deaminase has many advantages especially for industrial use, and it has been eager to find it.
  • the present inventors screened microorganisms for the origin of AMP deaminase and carried out screening. As a result, it was found that Streptomyces genus Actinomycetes produced AMP deaminase having high thermostability. In addition, they found that AMP deaminase produced by Streptomyces murinus has particularly excellent heat stability.
  • the present inventors attempted to identify the enzyme (Streptomyces' AMP deaminase derived from Miulinas). As a result, the enzyme was successfully identified and its amino acid sequence and base sequence were clarified as shown in the Examples below. As a result, it became possible to produce the enzyme as a recombinant, and it was also possible to improve the productivity of the enzyme and the enzyme itself by using gene recombination techniques.o
  • the present invention has been completed based on the above results, and provides the following configurations.
  • the molecular weight is 48,000 ⁇ 2,000 (by gel filtration) and 60,000 ⁇ 3,000 (by SDS-PAGE);
  • the actinomycete is an actinomycete selected from the group consisting of Streptomyces muulinus (Streptomyces murinus), Streptomyces 'celluloflavas (Streptmyces celluloflavus), and Streptomyces' Glyceus (Streptmyces griseus).
  • the AMP deaminase according to [2].
  • a method for producing a yeast extract comprising the step of allowing the AMP deaminase according to any one of [1] to [4] to act.
  • a method for producing a taste substance comprising reacting the 5'-nucleotide with the AMP deaminase according to any one of [1] to [4] and deamidating the 5'-nucleotide.
  • the actinomycete is an actinomycete selected from the group consisting of Streptomyces muulinus (Streptomyces murinus), Streptomyces 'celluloflavas (Streptmyces celluloflavus), and Streptomyces' Glyceus (Streptmyces griseus).
  • Streptomyces muulinus Streptomyces murinus
  • Streptomyces 'celluloflavas Streptmyces celluloflavus
  • Streptomyces' Glyceus Streptomyces griseus
  • a method for producing AMP deaminase comprising the following steps (1) and (2):
  • the AMP polymerase of the present invention has excellent thermostability and can operate under relatively high temperature conditions. Therefore, it is possible to carry out the enzymatic reaction in a situation where there is little risk of contamination by various bacteria. In addition, it can be allowed to act simultaneously with other enzymes that act at high temperature, such as nuclease used in the production process of yeast extract, so that the production process can be simplified and shortened.
  • FIG. 1 is a graph comparing the thermal stability of AMP deminase produced by Aspergillus melleus and Streptomyces murinus.
  • the horizontal axis is the reaction temperature, and the vertical axis is the residual deaminase activity (%).
  • FIG. 2 is a table comparing phosphatase activity / deaminase activity (P / D) of AMP deaminase produced by Aspergillus melleus and Streptomyces murinus (Streptomyces murinus). is there.
  • FIG. 3 is a graph comparing the IMP conversion rates of AMP deaminase produced by Aspergillus melleus and Streptomyces murinus produced by Aspergillus melleus.
  • Fig. 4 shows that during the production process of yeast extract, Streptomyces miyulinas
  • FIG. 4 is a graph showing the IMP conversion rate when AMP deaminase derived from Streptomyces murinus (Streptomyces murinus) was allowed to act.
  • A shows the measurement results when the nuclease treatment and the deaminase treatment were performed in separate steps as in the current production method.
  • (B) shows the result when the nuclease treatment and the nuclease treatment were performed simultaneously.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of chromatography in the process of purifying AMP deaminase derived from Streptomyces murinus (Streptomyces murinus).
  • A is the result of chromatography with HiPrep TM 16/10 ButylFF
  • (b) is the result of chromatography with Superose 12.
  • FIG. 6 (a) is a table summarizing the total enzyme activity, total protein amount, specific activity, and yield in the purification process of AMP deaminase derived from Streptomyces murinus (Streptomyces murinus).
  • FIG. 6 (b) shows the result of analyzing the purified enzyme by SDS-PAGE (CBB staining). Lane II is a sample lane (purified enzyme). Lane I shows the protein molecular weight marker band.
  • the high molecular weight side forces are also phosphorylase b (MW 97,400), bovine serum albumin (MW 66,267), aldolase (MW 42,400), carbonic anhydrase (MW 30,000), trypsin inhibitor (MW 20,100), lysozyme (MW 14,400). ) Band.
  • FIG. 7 (a) is a graph showing the relationship between the reaction temperature and the activity of AMP deaminase derived from Streptomyces murinusl (Streptomyces murinusl. The activity value when reacted at 65 ° C is 100.
  • Figure 7 (b) is a graph showing the thermal stability of AMP deminase from Streptomyces murinus.
  • FIG. 8 (a) is a graph showing the relationship between pH and activity for AMP deaminase derived from Streptomyces murinus. The relative activity is shown assuming that the activity value when reacted at pH 5.6 is 100%.
  • FIG. 8 (b) is a graph showing the pH stability of AMP deaminase derived from Streptomyces murinus.
  • FIG. 9 is a table summarizing the substrate specificities of AMP protease from Streptomyces murinus. It shows the relative activity when the enzyme activity for AMP is 100%.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of analysis of AMP deaminase derived from Streptomyces murinus (Streptomyces murinus) by chromatofocusing.
  • FIG. 11 is a table summarizing various properties of AMP deaminase derived from Streptomyces murinus. For comparison, the optimum pH of nuclease derived from ⁇ -silium ′ citrinum and AMP deaminase derived from Aspergillus meleus are also shown.
  • FIG. 12 shows Streptomyces griseus suosp. Griseus, Streftomyces. 2 is a table comparing the thermal stability and substrate specificity of AMP deaminase produced by Streptomyces griseus and Streptomyces celluloflavus produced by Streptomyces celluloflavus.
  • FIG. 13 shows the results of analyzing the N-terminal amino acid sequence and the internal amino acid sequence of AMP deaminase derived from Streptomyces murinus (Streptomyces murinus).
  • FIG. 14 is a restriction map of AMP deaminase derived from Streptomyces murinus.
  • FIG. 15 is a view showing a flow of constructing a shuttle vector pSVl.
  • FIG. 16 is a view showing a construction flow of an AMP deaminase expression vector pSVSAD.
  • FIG. 17 is a table showing the results of measuring the activity of AMP deaminase produced by the transformant SAD-1 into which the AMP deaminase gene has been introduced. ND in the table means "not detected"
  • FIG. 18 is a graph showing the thermal stability of AMP polymerase produced by the transformant (SAD-1). The horizontal axis is the reaction temperature, and the vertical axis is the residual deaminase activity (%).
  • FIG. 19 is a table summarizing the substrate specificities of the AMP polymerase from the transformant (SAD-1). It shows the relative activity when the enzyme activity for AMP is 100%.
  • FIG. 20 shows the results of analysis of AMP deaminase derived from a transformant (SAD-1) by SDS-PAGE (CBB staining).
  • Lane II is the control sample lane (host culture supernatant) and Lane III is the sample lane (transformant culture supernatant).
  • Lane I shows the protein molecular weight marker band.
  • the high molecular weight forces are also phosphorylase b (MW 97,000), bovine serum albumin (MW 66,000), ovalbumin (MW 45,000), and carbohydrate. It is a band of quanhydrase (MW 30,000) and trypsin inhibitor (MW 20, 100).
  • FIG. 21 is a diagram showing an amino acid sequence of an actinomycete-derived AMP deaminase that has been successfully identified, and a sequence encoding the same (including a promoter region and a terminator region).
  • FIG. 22 A continuation of FIG.
  • FIG. 23 shows the amino acid sequence (not including the signal peptide) of AMP deaminase derived from actinomycetes that was successfully identified.
  • FIG. 24 shows the amino acid sequence (including signal peptide) of actinobacteria-derived AMP deaminase that was successfully identified.
  • FIG. 25 shows a sequence (including a promoter region and a terminator region) encoding an actinomycete-derived AMP deaminase that was successfully identified.
  • FIG. 26 A continuation of FIG. 25.
  • FIG. 27 shows the sequence of the promoter region of the gene encoding AMP deaminase derived from actinomycetes that was successfully identified.
  • FIG. 28 shows the sequence of the structural gene of AMP deaminase derived from actinomycetes that was successfully identified.
  • FIG. 29 shows a sequence of a terminator region of a gene encoding AMP deaminase derived from actinomycetes that was successfully identified.
  • the first aspect of the present invention relates to AMP deaminase.
  • the AMP deaminase of the present invention is derived from actinomycetes.
  • the origin of the AMP deaminase of the present invention is not limited to a specific species of actinomycetes.
  • AMP demina produced by Streptomyces murinus Streptomyces murinus
  • Streptomyces cenorecula Streptmyces celluloflavus
  • Streptomyces griseus Streptomyces griseus
  • the AMP deaminase of the present invention reacts with the following reaction: 5′-adenylic acid + H 0 ⁇ 5 inosinic acid
  • the AMP deaminase of the present invention is 5'-adenyl
  • AMP deaminase derived from Streptomyces murinus, which is one embodiment of the present invention, is 5,-dAMP (5, -dexadenylic acid), ADP (adenosine 5 '). -Diphosphate), ATP (adenosine) 5'-Triphosphate also works well. Therefore, the AMP deaminase of the present invention can be applied not only to a reaction using AMP as a substrate but also to a reaction using any of these as a substrate.
  • the AMP polymerase of the present invention has excellent thermal stability and is stable at a temperature of 65 ° C. or lower (property (2)).
  • stable at a temperature of 65 ° C or lower means that when an enzyme solution adjusted to pH 5.6 with an acetate buffer is treated at 65 ° C for 30 minutes, the enzyme activity in the case of no treatment is measured.
  • the AMP deaminase of the present invention can work well at high temperatures (eg, 60 ° C, 65 ° C, 70 ° C).
  • the present inventors have found an enzyme produced by Streptomyces murinus (Streptomyces murinus) as one of the AMP deaminase having the above properties, and succeeded in purifying it.
  • Streptomyces murinus Streptomyces murinus
  • the obtained AMP deaminase was examined in detail, it was found that it had the following properties.
  • Stable pH is about 6.0 to about 8.5 (in Mcllvaine buffer)
  • reaction temperature is about 40 ° C to about 70 ° C (in acetate buffer (pH 5.6))
  • the range of the action pH is such that the relative activity based on the AMP deaminase activity at the optimum pH (100%) is about 50% or more.
  • the range of the stable pH is such that the residual activity is about 50% or more when the AMP deaminase activity at the untreated, optimum pH is set as a standard (100%).
  • the range of the reaction temperature is such that the relative activity based on the AMP deaminase activity at the optimal temperature (100%) is about 70% or more.
  • AMP deaminase from Streptomyces murinus also acts on 3, -AMP, 5, -dAMP, ADP, ATP, Adenosine (adenosine), and cAMP (cyclic adenosine 3,, 5, -monophosphate), It is clear that it does not work on 2'-AMP, adenine, 5, -GMP, 5, -UMP, and 5, -CMP. In particular, it was found to work well for 5'-dAMP, ADP, and ATP. The effect on adenosine was less than 1/10 of that on weak 5'-AMP.
  • phosphatase activity was undetectable.
  • a conventional AMP deaminase derived from Aspergillus melleus contaminating phosphatase activity is detected.
  • the AMP protease from Streptomyces murinus is significantly different from the conventional AMP deaminase in that the contaminating phosphatase activity is extremely low.
  • AMP deaminase When phosphatases are contaminated, the taste components produced by AMP deaminase action from 5'-AMP are degraded to inosine and further degraded to inosine, resulting in a loss of taste.
  • AMP deaminase from Streptomyces murinus is industrially beneficial.
  • a second aspect of the present invention relates to a method (preparation method) for producing AMP deaminase, which comprises the following steps.
  • the actinomycetes used in step a are not particularly limited as long as they are expected to produce AMP deaminase having excellent thermostability.
  • Streptomyces' Myurinus Streptomyces murinus
  • Streptomyces cenoreurus Streptomyces celluloflavus
  • Streptomyces griseus Streptmyces griseus
  • the cultivation of actinomycetes can be performed by a conventional method.
  • the medium contains carbon sources such as glucose, sucrose, gentiobiose, soluble starch, glycerin, dextrin, molasses, and organic acids, ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium phosphate, and ammonium acetate. Or nitrogen sources such as peptone, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, bran, meat extract, and, if necessary, potassium salt, magnesium salt, sodium salt, phosphate, manganese salt, Those containing inorganic chlorides (inorganic ions) such as iron salts and zinc salts can be used. In order to promote the growth of actinomycetes, a medium supplemented with vitamins, amino acids and the like can be used.
  • carbon sources such as glucose, sucrose, gentiobiose, soluble starch, glycerin, dextrin, molasses, and organic acids, ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium phosphate
  • the pH of the medium is adjusted to, for example, 5.0 to 8.0, preferably 5.5 to 7.5.
  • the culture temperature is, for example, in the range of 15 ° C to 50 ° C, preferably in the range of 20 ° C to 40 ° C, and more preferably in the range of 25 ° C to 35 ° C.
  • the culture time is not particularly limited. For example, the culture time is 1 day or more, 3 days or more, 5 days or more.
  • a shaking culture method or an aerobic submerged culture method using a jar armmenter can be used as the culture method.
  • AMP deaminase can be recovered from a culture solution or cells after culturing actinomycetes for a desired time.
  • the culture supernatant should be filtered and centrifuged to remove insolubles, and then separated and purified by a combination of salting out such as ammonium sulfate precipitation, dialysis, and various types of chromatography.
  • salting out such as ammonium sulfate precipitation, dialysis, and various types of chromatography.
  • AMP deaminase can be obtained.
  • hydrophobic chromatography and gel filtration are performed.
  • AMP deaminase when recovering from the cells, can be obtained by, for example, crushing the cells by pressure treatment, ultrasonic treatment, and the like, followed by separation and purification as described above. After the cells have been collected from the culture fluid in advance by filtration, centrifugation, or the like, the above-described series of steps (crushing, separation, and purification of the cells) may be performed. In addition, in each purification step, fractionation is performed using AMP deaminase activity as an index, and the process proceeds to the next step.
  • a third aspect of the present invention relates to the use of the AMP deaminase of the present invention.
  • the AMP deaminase of the present invention can be used for various uses in the same manner as ordinary AMP deaminase (that is, AMP deaminase derived from Aspergillus melleus and the like, which has been used so far).
  • the reaction at a high temperature is preferred because of its excellent heat resistance, and it can be suitably used for various purposes.
  • “reaction at high temperature is preferred! / Use” refers to an application in which it is preferable to react AMP protease at a high temperature in view of production efficiency and contamination of various bacteria.
  • yeast extract As a specific example of the use, production of yeast extract can be mentioned.
  • umami is generally enhanced (improved in taste) by nuclease treatment and AMP deaminase treatment.
  • the AMP deaminase of the present invention which is excellent in thermostability, the AMP deaminase treatment can be performed at the same time as the nuclease treatment performed at a high temperature. As a result, simplification and shortening of the production process can be achieved, and bacterial contamination during enzyme treatment can be effectively prevented.
  • the following step is carried out, that is, a step of adding nuclease and AMP deaminase to the yeast lysate and allowing it to act at a high temperature.
  • the yeast lysate can be prepared by a conventional method. For example, a suspension (pH 7.0) of 10% brewer's yeast or baker's yeast is subjected to a heat treatment, and a commercially available lytic enzyme, YL-NL “Amano” or YL-15 (V, also with Amano Enzym Co., Ltd.) To prepare a yeast lysate.
  • Nuclease is commercially available from various manufacturers (for example, Amano Enzym Co.), and a suitable medium can be appropriately selected and used.
  • a nuclease prepared from a microorganism or the like by a conventional method may be used.
  • a plurality of nucleases may be used in combination.
  • the amount of nuclease and AMP deaminase to be added can be appropriately set in consideration of the type and activity value of the enzyme used.
  • the working temperature is the temperature at which both nuclease and AMP deaminase act.
  • the reaction is carried out at 60 ° C to 80 ° C, preferably at 65 ° C to 75 ° C, more preferably at about 70 ° C.
  • a further aspect of the present invention is based on the above results and relates to an isolated AMP deaminase.
  • the AMP deaminase of the present invention can be a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, for example. As will be shown in the examples below, it has been confirmed that the protein actually exhibits AMP deaminase activity. The sequence containing the signal peptide is shown in SEQ ID NO: 2.
  • a protein having the same function but partially different amino acid sequence when compared with a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 (hereinafter, also referred to as “homologous protein”) AMP deaminase is also provided.
  • a part of the amino acid sequence differs typically means that one or several amino acids constituting the amino acid sequence are deleted, substituted, or added or inserted with one or several amino acids, or Means that the amino acid sequence is mutated by the combination of the two.
  • the difference in the amino acid sequence here is due to the function as AMP deaminase, that is, 5'-adelic acid + H0 ⁇ 5'-
  • the position at which the amino acid sequence differs is not particularly limited as long as this condition is satisfied, and the difference may occur at a plurality of positions.
  • the term “plurality” refers to, for example, a number corresponding to less than about 30% of all amino acids, preferably a number corresponding to less than about 20%, and more preferably a number corresponding to less than about 10%, and more preferably Preferably a number corresponding to less than about 5%, most preferably a number corresponding to less than about 1%.
  • the homologous protein is, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, still more preferably about 95% or more, and most preferably about 70% or more of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2. It has about 99% or more identity.
  • homologous proteins are obtained by making conservative amino acid substitutions at non-essential amino acid residues (“amino acid residues not involved in AMP deaminase activity.”
  • conservative amino acid substitution refers to a certain amino acid residue.
  • An amino acid having a side chain of similar properties Refers to substitution with a residue.
  • Amino acid residues can be basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), uncharged electrode side chains (eg, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine) depending on their side chains.
  • Tyrosine, cysteine non-polar side chains (eg, alanine, palin, leucine, isoleucine, proline, hua-alanine, methionine, tributophane), ⁇ -branched side chains (eg, threonine, norin, isoleucine), aromatic side chains (Eg, tyrosine, fluoranine, tributophan, histidine).
  • Conservative amino acid substitutions are preferably substitutions between amino acid residues within the same family.
  • the identity (%) of two amino acid sequences or two nucleic acids can be determined, for example, by the following procedure. First, align the two sequences for optimal comparison (eg, introducing gaps in the first sequence to optimize alignment with the second sequence! /,). When a molecule (amino acid residue or nucleotide) at a particular position in the first sequence is the same as the molecule at the corresponding position in the second sequence, the molecule at that position is said to be identical.
  • XBLAST Gapped BLAST described in Amino Acids Research 25 (17): 3389-3402
  • the default parameters of the corresponding program eg, XBLAST and NBLAST
  • XBLAST and NBLAST the default parameters of the corresponding program
  • ALIGN program Built into the ALIGN program available on the GENESTREAM network server (IGH adjoin, France) or the ISREC server.
  • AMP deaminase including homologous proteins
  • those possessed by natural actinomycetes can be prepared from the actinomycetes by operations such as extraction and purification.
  • the AMP deaminase of the present invention can also be prepared by genetic engineering techniques based on the sequence information disclosed in the present specification or the attached sequence listing. For example, it can be prepared by transforming a suitable host cell with DNA encoding the AMP deaminase of the present invention, and collecting the protein expressed by the transformant. The recovered protein is appropriately purified according to the purpose.
  • Various modifications are possible when preparing as a recombinant protein.
  • the AMP deaminase of the present invention has no other peptide.
  • a recombinant protein to which the protein is linked can be obtained.
  • addition of sugar chains and Z or lipids, or processing at the N-terminal or C-terminal may occur. Modifications may be made. By the modification as described above, extraction and purification of the recombinant protein can be simplified, or a biological function can be added.
  • isolated when used in the context of the AMP deaminase of the present invention refers to a state of being removed from its original environment (for example, in the case of a natural substance, the natural environment), that is, It means that it exists in a state different from the original existence state due to an artificial operation.
  • AMP deaminase in the isolated state usually does not contain the cell components of the producing bacterium.
  • the content of contaminant components is preferably low.
  • the amount of contaminating proteins is, for example, 50% or less, preferably 40% or less, more preferably 30% or less, even more preferably 20% or less of the total protein amount.
  • a further aspect of the present invention relates to a nucleic acid molecule encoding AMP deaminase.
  • nucleic acid includes DNA (including cDNA and genomic DNA), RNA (including mRNA), DNA analogs, and RNA analogs.
  • the form of the nucleic acid of the present invention is not limited, that is, it may be single-stranded or double-stranded. Preferably, it is double-stranded DNA. Codon degeneracy is also taken into account. That is, as long as a target protein can be obtained as its expression product, it has an arbitrary base sequence.
  • nucleic acid encoding a specific protein refers to a nucleic acid from which the specific protein can be obtained when expressed, and corresponds to the amino acid sequence of the protein. Not only a nucleic acid having a base sequence as described above, but also a nucleic acid (for example, DNA containing one or more introns) obtained by adding a sequence that does not encode an amino acid sequence to such a nucleic acid.
  • isolated nucleic acid refers to a naturally occurring nucleic acid, typically a nucleic acid that has been separated from other nucleic acids that coexist in the natural state. Say. However, it may contain some other nucleic acid components such as a nucleic acid sequence adjacent in the natural state.
  • the "isolated nucleic acid” is preferably a nucleus substantially free of cell components, culture solution and the like. Refers to acid.
  • an ⁇ isolated nucleic acid '' in the case of a nucleic acid produced by chemical synthesis preferably does not substantially contain a precursor (raw material) such as dNTP or a chemical substance used in the synthesis process! /, The state nucleic acid!
  • nucleic acid is present as part of a vector or composition or in a cell as an exogenous molecule, it is "isolated nucleic acid" as long as it is present as a result of artificial manipulation.
  • nucleic acid in the present specification means an isolated nucleic acid.
  • the nucleic acid molecule of the present invention encodes the AMP deaminase of the present invention. That is, the nucleic acid molecule of the present invention encodes a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, or a homologous protein thereof.
  • One specific embodiment of the nucleic acid molecule of the present invention is a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 3.
  • This nucleotide sequence is a DNA encoding an AMP deaminase gene that has been successfully identified, and includes a 5 ′ untranslated region (promoter region) and a 3 ′ untranslated region (terminator region).
  • the promoter and terminator and the structural gene are in an original combination (combination in a natural state), and good gene expression can be expected if AMP deaminase is produced using the DNA. Therefore, an efficient AMP deaminase production system can be constructed.
  • the powerful DNA include a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 4 or 5.
  • the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 4 is a DNA encoding a successfully identified AMP deaminase structural gene (including a region encoding a signal peptide).
  • the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 is a DNA encoding a successfully identified AMP deaminase structural gene (not including a region encoding a signal peptide).
  • the nucleic acid of the present invention can be obtained by using standard genetic engineering techniques, molecular biological techniques, biochemical techniques, and the like, with reference to the sequence information disclosed in the present specification or the attached sequence listing. It can be prepared in an isolated state.
  • the nucleic acid of the present invention can be isolated from an actinomycete genomic DNA library using the hybridization method using the whole or a part of the base sequence of the nucleic acid or its complementary sequence as a probe. .
  • an actinomyces genomic DNA library or an actinomyces genome may be obtained by using a nucleic acid amplification reaction (for example, PCR) using a synthetic oligonucleotide primer designed to specifically hybridize to a part of the base sequence of the nucleic acid.
  • ⁇ can be amplified and isolated from an actinomycete nucleic acid extract.
  • oligonucleotide primers can be easily synthesized using a commercially available automated DNA synthesizer or the like.
  • the plaque hybridization method or colony hybridization method is used depending on the type of library used (Molecular Cloning, Third
  • the colony hybridization method is used for selection of a clone having the nucleic acid of interest.
  • a probe having a sequence specific to the nucleic acid of the present invention is used for selection of a clone having the nucleic acid of interest.
  • the nucleic acid of the clone is converted into type II, and the nucleic acid of the present invention is amplified by PCR or the like using primers specific to the sequence of the nucleic acid of interest. It can be obtained as a product.
  • the nucleic acid possessed by the obtained clone can be subcloned into an appropriate vector and used for subsequent use.
  • an appropriate vector for example, it is possible to construct a recombinant vector for transformation or a plasmid suitable for decoding the nucleotide sequence.
  • a nucleic acid in which the function of a protein encoded by the nucleotide sequence differs when compared with any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 3 to 5 are also provided.
  • a base sequence comprising substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or more bases based on the base sequence of SEQ ID NO: 3 to 5, and having an AMP deaminase activity DNA encoding a protein having the same. Substitution or deletion of a base may occur at a plurality of sites.
  • the term “plurality” here depends on the position and type of amino acid residues in the three-dimensional structure of the protein encoded by the nucleic acid, but is, for example, 2 to 40 bases, preferably It is 2 to 20 bases, more preferably 2 to 10 bases.
  • Mutations such as base substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions as described above include mutations that occur naturally, such as those based on individual differences between microorganisms that carry the AMP deaminase gene and differences in species and genera. Is also included.
  • homologous nucleic acid is a nucleic acid in which a base difference as described above is recognized due to a polymorphism represented by SNP.
  • the homologous nucleic acid as described above is treated with, for example, a restriction enzyme, treatment with exonuclease ⁇ DNA ligase, or the like, and site-directed mutagenesis (Molecular Cloning, Third Edition, napter 13; old Spring Harbor Laboratory). Press, New York) and mutations introduced by Huntam's Natural Cloning, Third Edition, chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
  • Homologous nucleic acids can also be obtained by other methods such as ultraviolet irradiation. Furthermore, it can also be obtained by a method utilizing a known mutation treatment, such as treating an actinomycete carrying the AMP kinase gene with ultraviolet light, and then isolating the modified gene.
  • a genomic (chromosome) DNA is extracted from a natural actinomycete having a homologous nucleic acid and treated with an appropriate restriction enzyme, and then the nucleic acid molecule of the present invention (for example, a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3) or one of them. Select and isolate DNA that hybridizes under stringent conditions in the screening using the part as a probe.
  • the library may be used as the nucleic acid molecule of the present invention (for example, a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3) or one of them. It can also be obtained by screening under stringent conditions using the part as a probe.
  • Another embodiment of the present invention relates to a nucleic acid having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 3 to 5.
  • nucleotide sequence is at least about 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, % Or 99.9% nucleic acid having the same nucleotide sequence is provided. It is preferable that the identity is as high as possible.
  • stringent conditions refer to conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed.
  • hybridization solution 50% formaldehyde, 10 X SSC (0.15 M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0), 5 X Denhardt solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate, Incubate at about 42 ° C to about 50 ° C with 10 g / ml denatured salmon sperm DNA, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), and then incubate at about 65 ° C with 0.1X SSC, 0.1% SDS. Conditions for washing at C to about 70 ° C can be mentioned.
  • stringent conditions for example, 50% formaldehyde as a hybridization solution, 5 ⁇ SSC (0.15 M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0), 1 ⁇ Denhardt solution, 1% SDS, Examples include conditions using 10% dextran sulfate, 10 / zg / ml denatured salmon sperm DNA, and 50 mM phosphate buffer (pH 7.5).
  • vector refers to a nucleic acid molecule capable of transporting a nucleic acid inserted therein into a target such as a cell.
  • the vector of the present invention can be prepared by incorporating the nucleic acid (typically, DNA) of the present invention into an existing vector or a vector obtained by modifying the vector. As long as it can hold the nucleic acid of the present invention, in principle, even if such a vector is used as a starting material, the type of host cell should be considered according to the intended use (cloning, expression of polypeptide). Then, an appropriate vector is selected.
  • the vector for transformation typically contains an AMP deaminase gene (eg, a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4), a promoter, and a terminator. Upstream to downstream to ensure proper transcription of the structural gene by the promoter , A promoter, an AMP deaminase gene, and a terminator are arranged in this order.
  • an AMP deaminase gene eg, a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4
  • a promoter, an AMP deaminase gene, and a terminator are arranged in this order.
  • the vector of the present invention is preferably an expression vector.
  • An “expression vector” refers to a vector that can introduce a nucleic acid inserted therein into a target cell (host cell) and can express the same in the cell.
  • the expression vector usually contains a promoter sequence necessary for the expression of the nucleic acid, a sequence for promoting the expression, and the like.
  • Expression vectors that contain a selection tool can also be used. When such an expression vector is used, the presence / absence (and the degree) of introduction of the expression vector can be confirmed using a selection marker.
  • Insertion of the nucleic acid of the present invention into a vector, insertion of a selectable marker gene (if necessary), insertion of a promoter (if necessary), etc. are performed using standard recombinant DNA techniques (for example,
  • a vector containing a DNA that also contains a promoter region for example, a DNA having a base sequence of SEQ ID NO: 3
  • the promoter region of the DNA and the other regions are separately prepared.
  • a recombinant vector may be constructed by incorporating each into a vector. In such a case, another sequence may be interposed between the two (promoter region and other region) in the vector, provided that the promoter function is appropriately exerted.
  • a vector holding the promoter region may be constructed first, and then the other regions may be ligated.
  • the above recombinant vector is used for transformation of a host. That is, a transformant into which the nucleic acid molecule of the present invention has been introduced can be prepared using the above-described recombinant vector. (Transformants and their use)
  • the transformation vector is used for transforming a host. That is, a transformant into which the nucleic acid molecule of the present invention has been introduced can be prepared using the above-described transformation vector.
  • the type of host to be used for the transformation is not particularly limited, and Streptomyces miulinas (IFO14802, etc.), Streptomyces 'Ribidans (TK24, etc.), Streptomyces' Griseus Subsp. Griseus (Streptomyces griseus subsp.griseus), Streptomyces 'Glytheus (Streptomyces griseus), Streptomyces' Actinomycetes such as Streptomyces mobaraensis and Streptomyces avermitilis can be suitably used as hosts.
  • Escherichia coli, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, and the like can also be employed as hosts.
  • transformation vector into a host can be performed by a known method.
  • the method can be carried out by the method of D.A. Hopwood et al. (PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS P.229-252 (The John Innes Foundation 2000)) using protoplast-formed cells.
  • the transformant can be used for production of AMP deaminase.
  • the AMP deaminase can be produced by culturing the transformant into which the nucleic acid of the present invention has been introduced under conditions in which the protein (AMP deaminase) encoded by the nucleic acid can be expressed.
  • An appropriate medium is used depending on the host used. For example, commercially available various media or media obtained by adding components necessary for growth, selection, promotion of protein expression and the like of transformants such as proline, leucine, and thiamine can be used.
  • the target protein can be recovered from the culture solution or the cells after culturing for a desired time. When it is produced outside the cells, it can be recovered from the culture solution, otherwise it can be recovered from the cells.
  • the culture supernatant is filtered and centrifuged to remove insolubles, and then separated and purified by a combination of salting out such as ammonium sulfate precipitation, dialysis, and various types of chromatography.
  • the desired protein can be obtained.
  • the cells must be crushed by, for example, pressure treatment or ultrasonic treatment, and then separated and purified in the same manner as above to obtain the target protein. Can be.
  • the above series of steps may be performed. Since the AMP deaminase of the present invention is usually produced outside the cells, its isolation and purification can be carried out in a specific ratio. It is relatively easy.
  • the strain, the method for preparing the enzyme solution, and the method for measuring the enzyme activity used in the following experiments were as follows.
  • Streptomyces' Streptomyces murinus' IFO 14802, Streptomyces' Griseus subespe sp. ) IFO13780 (NBRC13780) was used.
  • Streptomyces murinus (Streptomyces murinus) IFO14802 has been deposited with the international depositary institution as follows.
  • a commercially available AMP deaminase agent "Deamizyme (50,000 u / mg product)" (trade name, product of Amano Enzym) was diluted with water to obtain an enzyme solution.
  • the pH was adjusted to pH 5.7 with 3% of soluble starch 3% and sterilized at 121 ° C for 30 minutes. Inoculate Streptomyces murinus (Streptomyces murinus) IFO14802 and pre-culture at 27 ° C for 1 day The main culture was performed for 5 days to prepare a crude enzyme solution.
  • Sowflower A 2%, NaCl 0.3%, KH PO 0.1%, supplemented MgSO 0.05%, soluble starch
  • Enzyme activity was measured using the decrease in OD during the reaction as an index. 0.017M 5'AMP-2Na
  • 0.5 ml of the sample solution was added to 1.5 ml of a 1: 2 mixture of 1/15 M phosphate buffer (pH 5.6) to give a reaction solution, and the mixture was reacted at 37 ° C for 15 minutes. After 15 minutes, the reaction was stopped by adding a 2% perchloric acid solution, and then 100 ⁇ l was weighed. The OD was measured with 5 ml of water.
  • the measured value was used as a blank. Under the above conditions, when the absorbance difference increased by 0.001 in 30 minutes, 1 unit was defined.
  • the processing temperatures were 30 ° C, 40 ° C, 50 ° C, 60 ° C, 65 ° C, 70 ° C, and 75 ° C.
  • the processing time was 30 minutes.
  • Contaminant phosphatase activities were measured for Aspergillus melleus and Streptomyces murinus.
  • the phosphatase activity / deaminase activity (P / D) determined from the measurement results are summarized in the table of FIG.
  • Aspergillus melleus was found to have contaminating activity.
  • no phosphatase activity was observed in Streptomyces murinus. That is, it became clear that AMP deaminase produced by Streptomyces murinus (Streptomyces murinus) has extremely low contaminating phosphatase activity.
  • the AMP conversion rate of AMP deaminase produced by Aspergillus melleus and Streptomyces murinus was examined by HPLC. Specifically, a 1.1% AMP solution was prepared using a 1/15 M phosphate buffer (pH 7.0), and 0.5 ml of the enzyme solution was added to 5 ml of the 1.1% AMP solution at 50 ° C. The reaction was carried out for 4 hours, followed by a heat treatment at 100 ° C for 10 minutes, followed by filtration with a filter (0.45 m) and analysis by HPLC.
  • nuclease treatment and deaminase treatment were performed in separate steps as in the current production method. Specifically, processing was performed in the following procedure, and the IMP conversion rate was obtained.
  • nuclease ⁇ Amano '' G manufactured by Amano Enzym Co., 0.1% w / w yeast solid, was added to yeast lysate (YL-15, 0.2%), and the mixture was added at 70 ° C and pH5. The reaction was performed for 3 hours.
  • test enzyme Aspergillus melleus
  • -derived AMP deaminase agent “Deamizyme (50,000 u / mg product)” (trade name, manufactured by Amano Enzym Co., 0.01-0.04% w / w yeast solid) or A crude enzyme solution prepared from Streptomyces murinus (Streptomyces murinus) was added, and the mixture was reacted at 50 ° C and pH 6 for 5 hours. Subsequently, after heat treatment, it was subjected to HPLC analysis.
  • the amount of AMP protease from Streptomyces murinus was determined by the activity value of “Deamisym (50,000 u / mg product)” (trade name, manufactured by Amano Enzym Co., Ltd.). The amount was the same as the value.
  • nuclease treatment and deaminase treatment were performed simultaneously. Specifically, processing was performed according to the following procedure, and the IMP conversion rate was obtained.
  • nuclease “Amano” G manufactured by Amano Enzym, 0.1% w / w yeast solid
  • an AMP deaminase agent derived from the test enzyme (Aspergillus melleus) were added to the yeast lysate (YL-15, 0.2%).
  • Streptomyces murinus Streptomyces murinus was added in an amount such that its activity value was the same as the activity value of the deazyme (50,000 u / mg product).
  • FIG. 4 (a) shows the results of Test 1.
  • Streptomyces' Miyuri The AMP deaminase derived from eggplant (Streptomyces murinus) showed an IMP conversion rate equivalent to that of AMP deaminase derived from Aspergillus melleus (deamizym: 50,000 u / mg).
  • Streptomyces' Myurinus (Streptomyces murinus) (IFO14802) was cultured by the above method, the produced enzyme was concentrated twice by an ultrafiltration membrane (AIP1 010), and water was added to the concentrated solution. After concentrating to remove the low molecular fraction, it was freeze-dried to obtain the crude enzyme. This crude enzyme was dissolved in purified water, and ammonium sulfate fractionation was performed using 48% of saturated ammonium sulfate. The precipitate fraction was dissolved in 20 mM KPB (pH 7.0) to obtain an enzyme solution.
  • AIP1 010 ultrafiltration membrane
  • the resulting enzyme solution was passed through HiPrep TM 16/10 ButylFF (Pharmacia) equilibrated with 20 mM KPB (pH 7.0) containing 30% ammonium sulfate. Subsequently, elution was performed with a concentration gradient of 20 mM KPB pH 7.0 containing ammonium sulfate 30% to 0% and ammonium sulfate 30% to 0%. Thereafter, concentration was performed, and the active fraction was subjected to gel filtration using a Superose 12 column (Pharmacia), and eluted with 50 mM KPB PH7.0 containing 150 mM NaCl. Active fractions (fractions 15 and 16) were collected and used as a purified enzyme.
  • FIG. 5 (a) The results of chromatography with HiPrep TM 16/10 ButylFF are shown in FIG. 5 (a), and the results of chromatography with Superose 12 are shown in FIG. 5 (b). Also, the total enzyme activity at each stage , Total protein amount, specific activity, and yield are shown in the table of FIG. 6 (a). The specific activity at the final stage was 96 times higher than that of the crude enzyme.
  • the purified enzyme was subjected to SDS-PAGE (CBB staining) to confirm the protein purity.
  • Lane II is a sample lane (purified enzyme). It shows a single band, indicating that the purity of the purified enzyme is high.
  • the lane I shows a protein molecular weight marker band. High-molecular-weight forces also include bands for phosphorylase b (MW 97,400), bovine serum albumin (MW 66,267), aldolase (MW 42,400), carbonic anhydrase (MW 30,000), trypsin inhibitor (MW 20,100), and lysozyme (MW 14,400). It is.
  • thermostability of the enzyme was examined by the following procedure. 2.8 g (total protein amount) of the enzyme solution (0.15 ml) was adjusted to pH 5.6 using an acetate buffer of pH 5.0, and then adjusted to each temperature (40 ° C, 50 ° C, 60 ° C, 65 ° C). C, 70 ° C, 75 ° C) for 30 minutes, and the residual activity (% of the enzyme activity in the case of no treatment) was measured.
  • Figure 7 (b) shows the measurement results. Under treatment conditions of 65 ° C or less, the activity is maintained at about 90% or more. Also, it maintains about 55% activity even when treated at 70 ° C. Thus, the enzyme was found to be extremely excellent in thermostability.
  • Figure 8 (a) shows the measurement results.
  • the graph in FIG. 8 (a) shows the relative activity when the activity value when reacted at pH 5.6 is 100%. Relatively high reactivity is observed when the pH is in the range of about 4.5 to about 8.5, and about 70% or more is observed in the range of about 5.0 to about 8.0. Also, it can be seen that about 40% reactivity can be obtained even under the condition of pH 9.0.
  • Non-Patent Document 2 It has been reported that adenosine deaminase derived from Streptomyces aureofaciens has a wide range of substrate properties, such as having the catalytic activity of AMP.
  • AMP the catalytic activity of AMP
  • its substrate specificity was examined. The results are shown in the table of FIG.
  • the relative activity is shown when the enzyme activity for 5 'AMP is 100%. The enzyme worked best on 5 'AMP.
  • AMP deaminase from Streptomyces murinus has a molecular weight of about 48,000 ⁇ 2,000 by gel filtration (the molecular weight by SDS-PAGE is 60,000 ⁇ 3,000), and an optimal pH of about 5.6, Optimum temperature is about 65 ° C, isoelectric point is 8.12, Km value is 0.95 mM, Vmax force is 10 7
  • Streptomyces murinus (Streptomyces murinus), one of the actinomycetes belonging to the genus Streptomyces, produces metabolic AMP deaminase. It was predicted that there was a possibility that thermostable AMP deaminase could be obtained. Therefore, AMP deaminase-producing bacteria were screened in the Streptomyces genus of the Amano Enzym strain. As a result, those that produce AMP deaminase are Streptomyces griseus subsp.
  • thermostability was higher than that of the deaminase derived from Reus (Aspergillus melleus), which suggests that the strains produced by actinomycetes of the genus Streptomyces generally have higher thermostability and tend to have higher thermostability.
  • the deaminase produced by the three strains acted better on AMP than adenosine, and was confirmed to be AMP deaminase.
  • Streptomyces murinus (Streptomyces murinus) IFO14802 was cultured to obtain a purified enzyme.
  • the purification was performed up to the purification using a Butyl Sepharose column using HiPrep TM 16/10 ButylFF (Pharmacia).
  • the fractionated sample was subjected to SDS-PAGE using gel PAG Mini "DAIICHI” 10/20 (Daiichi Pure Chemicals).
  • the gel after electrophoresis was transferred to a PVDF membrane using a Towbin buffer (Tris 25 mM, glycine 192 mM, methanol 5%) containing 0.01% SDS as a transfer buffer.
  • the transfer operation was performed using a buffer tank type transfer device under the conditions of a constant voltage of 20 V, 4 ° C, and 18 hours.
  • CBB Kiasi-Brilliant Blue R250
  • full strength staining was performed, and a band corresponding to the enzyme was cut out to obtain a sample for N-terminal amino acid sequence analysis.
  • the gel after electrophoresis was subjected to CBB staining, a band corresponding to the enzyme was cut out, and used as it was as a sample for internal amino acid sequence analysis.
  • Figure 13 shows the results of analyzing the amino acid sequences of these samples.
  • Streptomyces murinus IFO14802 was cultured, and the culture was filtered using a Buchner funnel and a Nutsche suction bottle to obtain cells. 10 g of TE (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), ImM EDTA) containing 4 mg / ml lysozyme (Roche's diagnostics) and 2 mg / ml chromopeptidase (Wako Pure Chemical Industries) And lysed at 30 ° C for 1 hour.
  • TE 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), ImM EDTA) containing 4 mg / ml lysozyme (Roche's diagnostics) and 2 mg / ml chromopeptidase (Wako Pure Chemical Industries)
  • the mixture was centrifuged (1,500 g, room temperature, 5 minutes) to obtain a supernatant, and this operation was repeated twice, and lOmg / ml RNase A (Sigma-Aldrich Japan) 72 was added to the supernatant. 1 and incubated for 1 hour at 37 ° C. After mixing and mixing 4.5 ml of 5M NaCl, 11.25 ml of a 30% polyethylene glycol 6000 (Wako Pure Chemical) solution was added and mixed, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. Wind up the precipitated genomic DNA using a Pasteur pipette, and add 70% ethanol After washing with air and air-drying, it was dissolved in 1 ml of TE solution to obtain a genomic DNA solution of about 1 mg / ml.
  • a specifically amplified DNA fragment of about 240 bp was extracted using GENECLEAN TM III (BIO101). After subcloning the extracted DNA fragment into pGEM TM -T Easy (Promega), the inserted DNA fragment is extracted again, and DIG-labeled using DIG High Prime (Roche Diagnostics), and the AMP deaminase gene Probe.
  • Agarose electrophoresis was performed by applying genomic DNA completely digested with an arbitrary restriction enzyme in an amount of 6 ⁇ g per lane. After electrophoresis, the membrane was treated with a 0.25N HC1 solution for 30 minutes, neutralized with the buffer used for electrophoresis, and then blotted on a Zeta-Probe TM membrane (Bio-Rad) by alkaline blotting using a 0.4N NaOH solution. . The transfer was carried out using 2016 VacuGene (Pharmacia LKB Biotechnology) at a degree of vacuum of 50 cm'H 0 for 90 minutes.
  • the one dephosphorylated using Alkaline Phosphatase was used as a vector for library preparation.
  • the insert and the vector were ligated using Ligation Kit ver.2 (Takara Shuzo) and E. coli DH5 strain competent cells (Toyobo) were prepared according to the method of Hanahan (J Mol Biol. 1983 Jun 5; 166 (4): 557-80, Transformation was performed using Hanahan D., Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.
  • the obtained clones were spread so as to form about 500 colonies per LA plate (ampicillin (Sigma-Aldrich Japan) 100 ⁇ g / ml), and incubated at 37 ° C. overnight to grow the colonies.
  • nucleotide sequence analysis was performed from the outside of the insert using M13 Primer M4 and M13 Primer RV (Takara Shuzo). Based on the nucleotide sequence analysis of the isolated clone and the DNA fragment used for the probe, a synthetic primer (sigma dienosis) was designed again based on the sequence of the enzyme gene, and the nucleotide sequence was analyzed. Repeat these operations The full-length DNA sequence was analyzed by the performed primer walking. Nucleotide sequence analysis is performed using BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit and dGTP BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems Japan). Analysis is performed using ABI PRISM TM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Japan). did. The synthetic primers used for the nucleotide sequence analysis are shown below.
  • MAD--Fl 5, -AAGCAACTCGCCGACCAG- -3, (SEQ ID NO: 8)
  • MAD- -F2 5, -TGGTCCATGCAGGACTTC- -3, (SEQ ID NO: 9)
  • MAD- -F3 5, -CTGGAGAACTACAGCCTC- -3, (SEQ ID NO: 10)
  • MAD- -F5 5, -CTCCAGTACGCCTTCCTG- -3, (SEQ ID NO: 12)
  • MAD- -F6 5, -GTCGGGTCCTGGACACCG- -3, (SEQ ID NO: 13)
  • MAD- -F8 5, -GGACAGGAAGACGGACAC-3, (SEQ ID NO: 15)
  • MAD- -R2 5, -CAGGGACAGGACACTGAG- -3, (SEQ ID NO: 18)
  • MAD- -R3 5,-GATGTCGACATGGCCCTG- -3, (SEQ ID NO: 19)
  • MAD- -R4 5, -CCCAGTCGATCGCGTGAG- -3, (SEQ ID NO: 20)
  • MAD- -R6 5,-CTCGAACGCCGCGAACGC -3, (SEQ ID NO: 22)
  • a promoter region, a coding region (SEQ ID NO: 4), and a terminator region were revealed by annotation using homology search and motif search (FIGS. 21 to 22).
  • FIG. 27 shows the sequence of the promoter region
  • FIG. 28 shows the sequence of the coding region
  • FIG. 29 shows the sequence of the terminal region.
  • the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence is shown in FIG. 23 (signal peptide is not included! / ⁇ , SEQ ID NO: 1) and FIG. 24 (signal map). It is shown in SEQ ID NO: 2), including tide.
  • Streptomyces lividans 313KATCC 35287 carrying plasmid PIJ702 was cultured at 30 ° C for 2 days under the following medium conditions.
  • TE-Sucrose 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA, 25% Sucrose.
  • 2 ml of TE-Sucrose containing 4 mg of lysozyme (Sigma-Aldrich Japan) and 4 ml of a 0.25 mM EDTA solution were added, and the mixture was incubated at 37 ° C for 30 minutes.
  • 2 ml of a 20% SDS solution was added, 5 ml of a 5 M NaCl solution was further added, and the mixture was gently stirred and incubated at 0 ° C for 1 minute.
  • 30% polyethylene glycol 6000 (Wako Pure Chemical Industries) solution is added to the supernatant obtained by centrifugation (100,000g, 4 ° C, 40 minutes) to a final concentration of 10%, and the mixture is added at 0 ° C for 4.5 hours. Incubated. Then, the mixture was centrifuged (900 g, 4 ° C, 5 minutes), and the precipitate was dissolved in a TE solution containing 50 mM NaCl.
  • 1.2 ml of a solution prepared by dissolving ethidium bromide in a TE solution to a concentration of 16.8 g of cesium and 10 mg / ml of cesium was added, and centrifuged (l, 300 g, room temperature, 15 minutes). After removing the residue, centrifugation (230,000 g, 20 ° C, 12 hours) was performed again. After centrifugation, a plasmid DNA layer was obtained under ultraviolet irradiation. Next, extraction with butanol saturated with a TE solution was performed to remove ethidium bromide. This extraction was repeated three times. The obtained plasmid DNA solution was subjected to 1 ⁇ dialysis at 4 ° C.
  • a DNA fragment obtained by digesting the Escherichia coli vector pUC19 (Takara Shuzo) with the restriction enzyme BamHI and a DNA fragment containing the thiostrepton resistance gene (tsr) obtained by digesting the actinomycete vector PIJ702 with Bel I (Takara Shuzo) Were prepared and ligated using DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo) to produce pUCTSR.
  • a DNA fragment (long fragment) obtained by digesting pUCTSR with Kpn I and Cla I (Takara Shuzo) and a DNA fragment (short fragment) obtained by digesting pIJ702 with Kpn I and Cla I (Takara Shuzo) are prepared. These were ligated using DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo) and transformed into Escherichia coli DH5 strain (Toyobo). A plasmid in which the PUC19 fragment and the pIJ702 fragment of the transformant thus obtained were ligated was used as a shuttle vector pSVl and used in a subsequent operation (FIG. 15).
  • PSAD carrying the AMP deaminase gene was digested with the restriction enzyme Not I (Takara Shuzo) to prepare the gene fragment. Further, the shuttle vector pSVl was digested with a restriction enzyme XbaI to prepare one vector fragment. Both ends were blunt-ended using a DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) to prepare an insert fragment and a vector fragment, respectively. The pSVl-derived vector fragment was further dephosphorylated using Alkaline Phosphatase (Takara Shuzo). The insert and the vector were ligated using DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo), and then transformed into Escherichia coli DH5 strain (Toyobo). The plasmid thus obtained was used as an expression vector pSVSAD for transformation (FIG. 16).
  • TK24 protoplast Streptomyces lividans is a strain having streptomycin metabolism derived from Streptomyces lividans 66 , DA Hopwood (John Innes Institute ⁇ Colney Lane, Norwich NR4 7UH, UK) It was provided. Streptomyces lividans TK24 was cultured in YEME medium (0.5% glycine) at 30 ° C for 2 days.
  • a 1% monopotassium phosphate solution was separately prepared, and immediately before use, 1 ml of potassium hydroxide was added per 100 mlP buffer.
  • a buffer containing 20% polyethylene glycol 1000 was gently mixed by 1.5 ml strength pipetting, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 minutes. This mixture was centrifuged (1,700 g, room temperature, 10 minutes) to precipitate. The protoplasts obtained as a precipitate were washed twice with P buffer. After resuspending the pellet in 0.3 ml of P buffer, 100 1 drops were added to R-2 medium. Then, 3 ml of R-2 top agarose medium kept at 55 ° C. was poured per plate, and protoplasts were spread over the entire plate. Plates were dried in a clean bench for 2 hours until the top agarose solidified. After drying, the cells were cultured at 30 ° C. for 16 hours.
  • R-2 medium was prepared by separately preparing the following R-2 / A and R-2 / B and combining them.
  • the medium containing agar was used as R-2 plate and the medium containing agarose was used as R-2 top agarose medium.
  • the mixture was mixed at a rate of 1 ml per 200 ml final volume.
  • Yeast extract lO.Og (Saccharose 203gZUpH7.4)
  • the enzyme activity of the sample obtained above was measured according to the method described in the examples ( ⁇ Enzyme activity measurement method>).
  • the reaction was stopped by adding a 2% perchloric acid solution, and 1001 was weighed out.
  • the OD was measured with 5 ml of water. The same measurement was performed with the reaction time set to 0 minutes.
  • Fig. 17 shows the measurement results.
  • the culture supernatant obtained after culturing Streptomyces lividans TK24 under the same conditions was used as a control sample.
  • thermostability of AMP polymerase produced by the transformant (SAD-1) was measured. After treating the culture supernatant of SAD-1 prepared by the above-mentioned method at a predetermined temperature, the residual AMP kinase activity was measured (pH 5.6).
  • the processing temperatures were 30 ° C, 40 ° C, 50 ° C, 60 ° C, 65 ° C, and 70 ° C. C and 75 ° C.
  • the processing time was 30 minutes.
  • the deaminase derived from the transformant (SAD-1) was similar to the AMP deaminase derived from Streptomyces murinus and was an AMP deaminase. It was also found that the enzyme can be suitably used in reactions using 5 'dAMP, ADP and ATP as substrates.
  • FIG. 20 shows the results of SDS-PAGE.
  • Lane II is the control (host bacterial culture supernatant).
  • Lane III is the culture supernatant of the transformant (SAD-1).
  • SAD-1 the control bacterial culture supernatant
  • Lane I shows the protein molecular weight marker band.
  • the present inventors succeeded in closing the gene encoding AMP deaminase derived from Streptomyces miulinas.
  • a transformant into which the gene was introduced was successfully obtained using an actinomycete transformation system, and the expression of the gene was confirmed.
  • (1) indicates high production (2) production of a high-productivity transformant by using a highly productive strain as a host and construction of a high-production system using the same, (3) nucleotide sequence By modifying the amino acid sequence, productivity, stability, and / or substrate specificity can be improved.
  • the AMP polymerase of the present invention is excellent in thermal stability. Therefore, it is suitably used in applications where a reaction at a high temperature is desired.
  • the AMP deaminase of the present invention can be used as an enzyme for enhancing umami in the production of yeast extract or as an enzyme for producing 5'-inosinic acid as a seasoning.
  • the AMP protease of the present invention can be used in various reactions starting from substrates such as ADP, ⁇ , and 5 'dAMP. Is also possible.

Abstract

　微生物由来の耐熱性AMPデアミナーゼを提供することを課題とする。以下の性質を備えるAMPデアミナーゼが開示される。(1)5'-アデニル酸＋H2O　→　5'-イノシン酸＋NH3の反応を触媒する；(2)65°C以下の温度で安定である（酢酸緩衝液（pH5.6）中）；(3)ゲルろ過による分子量が48,000 ±2,000である；(4)至適pHが5.6付近にある（マッキュルバイン（McIlvaine）緩衝液中）。

Description

放線菌由来の AMPデアミナーゼ及びその利用
技術分野
[0001] 本発明は AMPデァミナーゼに関する。詳しくは、微生物由来の AMPデァミナーゼ及 びその利用に関する。
背景技術
[0002] AMPデアミナーゼは、別名アデ-ルデァミナーゼ、 AMPアミノヒドロラーゼ等とも呼 ばれ、アデ二ル酸を加水分解的に脱ァミノしてイノシン酸とアンモニアを生成する反 応を触媒する。 AMPデァミナーゼは動物生体組織に広く存在し、これまでに様々な 種の様々な組織力 分離されている（藤島鉄郎及び吉野宏 , Amino Acid -Nucleic Acid,第 16号 ,pp45- 55 (1967年）：非特許文献 1、 Magdale'na Rosinova'ら， Collection Czechoslov. Chem. Commun.第 43卷 ,pp2324- 2329(1978年)：非特許文献 2、特開昭 55— 120788号公報:特許文献 1)。一方、主に工業的利用の見地から、微生物由 来の AMPデァミナーゼの探索が精力的に行われてきた。特に、糸状菌由来の AMP デアミナーゼに関する研究は多ぐァスペルギルス'メレウス（Aspergillus melleus)由 来の AMPデアミナーゼ等、一部の AMPデアミナーゼについては、酵母エキスの製造 における旨味増強などを目的としてその工業的な利用が図られている。
[0003] 特許文献 1：特開昭 55— 120788号公報
非特許文献 1：藤島鉄郎及び吉野宏 , Amino Acid -Nucleic Acid,第 16号 ,pp45-55 ( 1967年）
特 §午文献 2 : Magdale na Rosinova ら, Collection czechoslov. し hem. し ommun.第 43卷 ,pp2324- 2329(1978年）
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 現在、酵母エキスの製造において一般に、旨味増強のためヌクレアーゼと AMPデ アミナーゼが使用されている。一般にヌクレア一ゼの至適温度は約 65°Cである。一方 で現在使用されているァスペルギルス'メレウス（Aspergillus melleus)由来の AMPデ アミナーゼの至適温度は約 50°Cである。従って、製造上、高温で同時に二つの酵素 を作用させることは不可能であって、ヌクレアーゼ処理と、 AMPデアミナーゼ処理とを 別個の工程として行わざるを得な力つた。耐熱性に優れた AMPデァミナーゼであれ ば、これをヌクレアーゼと同時に作用させることができ、製造工程の短縮ィ匕が達成さ れる。また、これら二つの酵素による処理工程を高温で実施することが可能となること から、製造過程にお!、て処理温度を AMPデァミナーゼの反応温度である約 50°Cに 一旦下げる必要がなくなり、雑菌汚染を有効に防止することができる。このように、特 に工業的利用をする上で耐熱性 AMPデァミナーゼは多くの利点を有するものであつ て、それを見出すことが切望されていた。
課題を解決するための手段
本発明者らは以上の背景の下、 AMPデァミナーゼの由来を微生物に求めてスクリ 一-ングを実施した。その結果、ストレブトマイセス属の放線菌カ 熱安定性の高い AMPデァミナーゼを生産していることを見出した。また、ストレブトマイセス 'ミユリナス（ Streptomyces murinus)の産生する AMPデァミナーゼが特に熱安定性に優れるとの 知見を得た。
以上の知見を得た後、本発明者らは当該酵素 (ストレブトマイセス 'ミユリナス由来の AMPデァミナーゼ）を同定することを試みた。その結果、後述の実施例に示すように 当該酵素の同定に成功し、そのアミノ酸配列及び塩基配列を明らかにした。この成 果によって当該酵素を組み換え体として生産することが可能となり、また遺伝子組換 えの手法を用いて当該酵素の生産性の向上や酵素本体の改良を行うことが可能とな つた o
本発明は以上の成果に基づき完成されたものであって、以下の構成を提供する。
[1] 以下の性質を備える AMPデァミナーゼ：
(1) 5'-アデニル酸 + H 0 → 5しイノシン酸 + NHの反応を触媒する；
2 3
(2) 65°C以下の温度で安定である（酢酸緩衝液 (pH5.6)中）；
(3)分子量が 48,000 ±2,000(ゲルろ過による)、 60,000 ±3,000 (SDS-PAGEによる）で ある；
(4)至適 pHが 5.6付近にある（マッキュルバイン（Mcllvaine)緩衝液中）； [2] 以下の性質を備える放線菌由来の AMPデァミナーゼ：
(1) 5'-アデニル酸 + H 0 → 5しイノシン酸 + NHの反応を触媒する；
2 3
(2) 65°C以下の温度で安定である（酢酸緩衝液 (pH5.6)中）。
[3] 前記放線菌が、ストレブトマイセス属に属する放線菌である、 [2]に記載の AMP デァミナーゼ。
[4] 前記放線菌が、ストレプトマイセス ·ミユリナス（Streptomyces murinus)、ストレプ トマイセス 'セルロフラバス（Streptmyces celluloflavus)、及びストレプトマイセス 'グリセ ウス（Streptmyces griseus)力 なる群より選択される放線菌である、 [2]に記載の AMPデァミナーゼ。
[5] [1]〜 [4]のいずれかに記載の AMPデァミナーゼを作用させるステップ、を含 んでなる、酵母エキスの製造方法。
[6] 5'—ヌクレオチドに [1]〜 [4]の 、ずれかに記載の AMPデァミナーゼを作用さ せ、該 5 '—ヌクレオチドを脱アミド化してなる呈味物質の製造方法。
[7] ストレブトマイセス属に属する放線菌を栄養培地で培養し、培養液中に [1]記 載の AMPデァミナーゼを生成せしめ、これを採取することを特徴とする AMPデァミナ ーゼの製造方法。
[8] 前記放線菌が、ストレプトマイセス ·ミユリナス（Streptomyces murinus)、ストレプ トマイセス 'セルロフラバス（Streptmyces celluloflavus)、及びストレプトマイセス 'グリセ ウス（Streptmyces griseus)からなる群より選択される放線菌である、 [7]に記載の製 造方法。
[9] 以下の (a)又は (b)力 なる単離された AMPデァミナーゼ：
(a)配列番号： 1のアミノ酸配列を有するタンパク質；
(b)配列番号： 1のアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列を有し、 AMPデァミナ ーゼとして機能するタンパク質。
[10] [9]に記載の AMPデァミナーゼをコードする単離された核酸分子。
[11] 以下の (a)〜(c)のいずれかの塩基配列を有する、 [10]に記載の単離された核 酸分子：
(a)配列番号： 3〜5の!、ずれかの塩基配列； (b) (a)の塩基配列の一部が改変されてなる塩基配列であって、 AMPデァミナーゼと して機能するタンパク質をコードする塩基配列；
(c) (a)又は (b)の塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジ ントな条件下でノ、 イブリダィズする塩基配列であって、 AMPデァミナーゼとして機能するタンパク質をコ ードする塩基配列。
[12] [9]〜 [ 11 ]の 、ずれかに記載の核酸分子を保持するベクター。
[13] [9]〜[11]のいずれかに記載の核酸分子が導入されている形質転換体。
[14] 以下の (1)及び (2)のステップを含む、 AMPデァミナーゼの生産方法：
(1) [13]に記載の形質転換体を、前記核酸分子のコードするタンパク質を産生可能 な条件で培養するステップ；及び
(2)産生されたタンパク質を回収するステップ。
発明の効果
[0006] 本発明の AMPデァミナ一ゼは熱安定性に優れ、比較的高温の条件下で作用する ことが可能である。従って、酵素反応を雑菌汚染のおそれの少ない状況下で実施す ることが可能となる。また、例えば酵母エキスの製造過程において使用するヌクレア ーゼなど、高温下で作用させる他の酵素と同時に作用させることができ、製造工程の 簡略ィ匕及び短縮ィ匕を図れる。
図面の簡単な説明
[0007] [図 1]図 1は、ァスペルギルス'メレウス（Aspergillus melleus)及びストレプトマイセス 'ミ ユリナス（Streptomyces murinus)が生産する AMPデァミナ一ゼの熱安定性を比較し たグラフである。横軸は反応温度、縦軸は残存デァミナーゼ活性 (％)である。
[図 2]図 2は、ァスペルギルス'メレウス（Aspergillus melleus)及びストレプトマイセス 'ミ ユリナス（Streptomyces murinus)が生産する AMPデァミナーゼについて、ホスファタ ーゼ活性/デァミナーゼ活性 (P/D)を比較した表である。
[図 3]図 3は、ァスペルギルス'メレウス（Aspergillus melleus)及びストレプトマイセス 'ミ ユリナス（Streptomyces murinus)が生産する AMPデァミナーゼについて、 IMP変換率 を比較したグラフである。
[図 4]図 4は、酵母エキスの製造工程にお 、てストレブトマイセス ·ミユリナス ( Streptomyces murinus)由来 AMPデァミナーゼを作用させた場合の IMP変換率を示 すグラフである。（a)は、現行の製造方法と同様にヌクレアーゼ処理とデァミナーゼ処 理を別々の工程とした場合の測定結果である。（b)は、ヌクレアーゼ処理とデァミナ一 ゼ処理を同時に行った場合の結果である。
[図 5]図 5は、ストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)由来 AMPデァミナ ーゼの精製過程におけるクロマトグラフィーの結果を示すグラフである。（a)は HiPrep ™16/10 ButylFFによるクロマトグラフィーの結果であり、（b)は Superose 12によるクロマ トグラフィ一の結果である。
[図 6]図 6(a)は、ストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)由来 AMPデアミ ナーゼの精製過程における全酵素活性量、全タンパク質量、比活性、及び収率をま とめた表である。図 6(b)は、精製酵素を SDS-PAGE (CBB染色)で分析した結果を表 す。レーン IIがサンプルレーン（精製酵素）である。レーン Iにはタンパク質分子量マー カーのバンドが示される。高分子量側力も順にフォスフオリラーゼ b(M.W. 97,400)、牛 血清アルブミン (M.W. 66,267)、アルドラーゼ (M.W. 42,400)、カルボニックアンヒドラ一 ゼ (M.W. 30,000)、トリプシンインヒビター (M.W. 20,100)、リゾチーム (M.W. 14,400)の バンドである。
[図 7]図 7(a)は、ストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinusl由来 AMPデアミ ナーゼについて、反応温度と活性の関係を示すグラフである。 65°Cで反応させたとき の活性値を 100%とした場合の相対活性 (%)を表した。図 7(b)は、ストレブトマイセス 'ミュ リナス（Streptomyces murinus)由来 AMPデァミナ一ゼの熱安定性を示すグラフである
[図 8]図 8(a)は、ストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)由来 AMPデアミ ナーゼについて、 pHと活性の関係を示すグラフである。 pH5.6で反応させたときの活 性値を 100%とした場合の相対活性を表した。図 8(b)は、ストレブトマイセス 'ミユリナス（ Streptomyces murinus)由来 AMPデァミナーゼの pH安定性を示すグラフである。
[図 9]図 9は、ストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)由来 AMPデァミナ 一ゼの基質特異性をまとめた表である。 AMPに対する酵素活性を 100%とした場合の 相対活性を表している。 [図 10]図 10は、ストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)由来 AMPデアミ ナーゼをクロマトフォーカシングで分析した結果のグラフである。
[図 11]図 11は、ストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)由来 AMPデアミ ナーゼの諸性質をまとめた表である。比較のために、ぺ-シリウム'シトリナム（ Penicillium citrinum)由来ヌクレアーゼ及びァスペルギルス ·メレウス（Aspergillus meleus)由来 AMPデァミナ一ゼの至適 pH等も示される。
[図 12]図 12は、ストレプトマイセス'グリセウスサブエスピーグリセウス（Streptomyces griseus suosp. griseus)、ス卜レフ。卜マイセス-グリセウス (Streptomyces griseus) ^及ひ ストレプトマイセス ·セルロフラバス (Streptomyces celluloflavus)が生産する AMPデアミ ナーゼの熱安定性及び基質特異性を比較した表である。
[図 13]ストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)由来 AMPデァミナーゼの N末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列を解析した結果である。
[図 14]ストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)由来 AMPデァミナーゼの 制限酵素地図である。
[図 15]シャトルベクター pSVlの構築フローを示す図である。
[図 16]AMPデアミナーゼ発現用ベクター pSVSADの構築フローを示す図である。
[図 17]AMPデァミナーゼ遺伝子が導入された形質転換体 SAD-1が産生する AMPデ アミナーゼの活性を測定した結果を示す表である。表中の NDは「検出されず」を表す
[図 18]図 18は形質転換体 (SAD-1)が生産する AMPデァミナ一ゼの熱安定性を示す グラフである。横軸は反応温度、縦軸は残存デァミナーゼ活性 (％)である。
[図 19]図 19は、形質転換体 (SAD-1)由来 AMPデァミナ一ゼの基質特異性をまとめ た表である。 AMPに対する酵素活性を 100%とした場合の相対活性を表して ヽる。
[図 20]図 20は、形質転換体（SAD-1)由来 AMPデァミナーゼを SDS-PAGE (CBB染色 )で分析した結果を表す。レーン IIがコントロールサンプルレーン (宿主培養上清）、レ ーン IIIがサンプルレーン (形質転換体培養上清)である。レーン Iにはタンパク質分子 量マーカーのバンドが示される。高分子量側力も順にフォスフオリラーゼ b(M.W. 97,000)、牛血清アルブミン (M.W. 66,000)、オボアルブミン (M.W. 45,000)、カルボ-ッ クアンヒドラーゼ (M.W. 30,000)、トリプシンインヒビター (M.W. 20, 100)のバンドである。
[図 21]同定に成功した放線菌由来 AMPデァミナーゼのアミノ酸配列、及びそれをコ ードする配列（プロモーター領域及びターミネータ一領域を含む）を示す図である。
[図 22]図 21の続き。
[図 23]同定に成功した放線菌由来 AMPデァミナーゼのアミノ酸配列（シグナルぺプ チドを含まない）である。
[図 24]同定に成功した放線菌由来 AMPデァミナーゼのアミノ酸配列（シグナルぺプ チドを含む)である。
[図 25]同定に成功した放線菌由来 AMPデァミナーゼをコードする配列（プロモーター 領域及びターミネータ一領域を含む)である。
[図 26]図 25の続き。
[図 27]同定に成功した放線菌由来 AMPデァミナーゼをコードする遺伝子のプロモー ター領域の配列である。
[図 28]同定に成功した放線菌由来 AMPデァミナーゼの構造遺伝子の配列である。
[図 29]同定に成功した放線菌由来 AMPデァミナーゼをコードする遺伝子のターミネ 一ター領域の配列である。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 本発明の第 1の局面は AMPデアミナーゼに関する。本発明の AMPデァミナーゼは 放線菌に由来する。本発明の AMPデァミナーゼの由来は、放線菌の特定の種に限 定されるものではない。本発明者らの検討の結果、ストレブトマイセス 'ミユリナス（ Streptomyces murinus)を始めとしてストレプトマイセス ·セノレ口フラノくス (Streptmyces celluloflavus)やストレプトマイセス'グリセウス（Streptmyces griseus)が生産する AMP デァミナ一ゼも高 、耐熱性を備えることが判明した。
[0009] 本発明の AMPデアミナーゼは、次の反応： 5'-アデニル酸 + H 0 → 5しイノシン酸
2
+ NHを触媒する（性質 (1))。このように、本発明の AMPデァミナーゼは 5'-アデ-ル
3
酸 (AMP)に作用する。後述の実施例に示すように、本発明の一実施態様である、ス トレプトマイセス ·ミユリナス（Streptomyces murinus)由来の AMPデァミナーゼは 5， - dAMP(5，-デォキシアデ-ル酸）、 ADP (アデノシン 5'-二リン酸）、 ATP (アデノシン 5'-三リン酸）にも良好に作用する。従って、 AMPを基質とする反応のみならず、これ らのいずれかを基質とする反応に対しても本発明の AMPデァミナーゼを適用すること ができる。
一方、本発明の AMPデァミナ一ゼは熱安定性に優れ、 65°C以下の温度で安定で ある (性質 (2))。ここで、「65°C以下の温度で安定である」とは、酢酸緩衝液で pH5.6に 調整した酵素溶液を 65°Cで 30分処理したときに、未処理の場合の酵素活性を基準（ 100%)として 5%以上、好ましくは 10%以上、更に好ましくは 30%以上、より一層好ましくは 50%以上、最も好ましくは 90%以上の活性が残存することをいう（65°Cよりも低い温度条 件で同様に処理したときには通常、残存活性はより多くなる）。このように優れた熱安 定性を備えることによって、本発明の AMPデァミナーゼは高温下 (例えば 60°C、 65°C 、 70°C)で良好に作用することが可能となる。
後述の実施例に示すように、本発明者らは以上の性質を備える AMPデアミナーゼ の一つとしてストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)が生産する酵素を 見出し、これを精製することに成功した。得られた AMPデァミナーゼを詳細に検討し たこところ、以下の性質を備えることが明らかとなった。
(3)ゲルろ過による分子量が 48,000 ±2,000である。尚、 SDS-PAGEによる分子量は 、 60,000 ±3,000である。
(4)至適 pHが 5.6付近にある（マッキュルバイン（Mcllvaine)緩衝液中）
(5)作用 pHが約 4.5〜約 8.5である（マッキュルバイン（Mcllvaine)緩衝液中）
(6)安定 pHが約 6.0〜約 8.5である（マッキュルバイン（Mcllvaine)緩衝液中）
(7)反応温度が約 40°C〜約 70°Cである（酢酸緩衝液 (pH5.6)中）
(8)至適温度が 65°C付近にある（酢酸緩衝液 (pH5.6)中）
(9)温度安定性が 65°C以下で安定である（酢酸緩衝液 (pH5.6)中）
作用 pHの範囲は、至適 pHでの AMPデアミナーゼ活性を基準（100%)としたときの相 対活性が約 50%以上の範囲としている。一方、安定 pHの範囲は、未処理、至適 pHで の AMPデァミナーゼ活性を基準 (100%)としたときの残存活性が約 50%以上の範囲とし ている。
熱安定性に関しては、酢酸緩衝液で PH5.6に調整した酵素溶液を 65°Cで 30分処理 したときに、未処理の場合の酵素活性を基準（100%)として約 90%の残存活性が認め られた。処理温度を 70°Cに上昇させても、約 55%の活性を保持していた。
又、反応温度の範囲は、至適温度での AMPデァミナーゼ活性を基準（100%)とした ときの相対活性が約 70%以上の範囲として 、る。
一方、基質特異性について調べたところ、ストレブトマイセス 'ミユリナス（
Streptomyces murinus)由来の AMPデァミナーゼは 3，- AMP、 5，- dAMP、 ADP、 ATP、 Adenosine (アデノシン）、及び cAMP (サイクリックアデノシン 3,， 5， -一リン酸）にも作用 する一方で、 2' -AMP, adenine (アデ-ン）、 5，- GMP、 5，- UMP、及び 5，- CMPには 作用しないことが明ら力となった。特に、 5' -dAMP、 ADP、 ATPに対して良好に作用 することが認められた。アデノシンに対する作用は弱ぐ 5' -AMPに対する作用の 1/10以下であった。
また、ホスファターゼ活性は検出されな力つた。これに対してァスペルギルス'メレゥ ス（Aspergillus melleus)に由来する従来の AMPデァミナーゼでは、夾雑ホスファタ一 ゼ活性が検出される。このように、夾雑ホスファターゼ活性が極めて少ないという点に おいて、ストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)由来の AMPデァミナ一 ゼは従来の AMPデァミナーゼと顕著に相違する。
ホスファタ一ゼが夾雑すると、 5'-AMPより AMPデアミナーゼ作用によって生成され た呈味成分のイノシン酸力 さらにイノシンにまで分解されて呈味性がなくなってしま う故、夾雑ホスファターゼの極めて少な 、ストレプトマイセス ·ミユリナス（Streptomyces murinus)由来の AMPデァミナーゼは産業上有益である。
結局のところ、以上の性質 (3)〜(8)、熱安定性、基質特異性、及び夾雑ホスファタ一 ゼが極めて少な!/、こと等の特徴をストレプトマイセス ·ミユリナス（Streptomyces murinus)由来の AMPデァミナーゼは有する。
尚、熱安定性試験などの各種試験における AMPデァミナーゼ活性は原則として、 後述の実施例に示す方法 (デアミナーゼ活性測定方法)で測定するものとする。 本発明の第 2の局面は AMPデァミナーゼの製造方法 (調製方法）に関し、以下のス テツプを含むことを特徴とする。
a)ストレブトマイセス属に属する放線菌を培養する培養ステップ。 b)前記培養ステップ後の培養液から AMPデァミナーゼを精製する精製ステップ。 ステップ aで使用する放線菌は、熱安定性に優れる AMPデァミナーゼを生産すると 予想されるものであればその種類は特に問わない。例えば、ストレブトマイセス 'ミユリ ナス (Streptomyces murinus)、ストレプトマイセス ·セノレ口フラノくス (Streptmyces celluloflavus)又はストレプトマイセス ·グリセウス（Streptmyces griseus)を使用すること ができる。放線菌の培養は常法で行うことができる。培地にはグルコース、シュクロー ス、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の 炭素源、硫酸アンモ-ゥム、炭酸アンモ-ゥム、リン酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ-ゥ ム、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカ一、カゼイン加水分解物、 ふすま、肉エキス等の窒素源、及び必要に応じてカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリ ゥム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩化物（無機イオン)を含むも のを用いることができる。放線菌の生育を促進するために、ビタミン、アミノ酸などを添 加した培地を用いることもできる。培地の pHは例えば 5.0〜8.0、好ましくは 5.5〜7.5に 調整する。培養温度は例えば 15°C〜50°Cの範囲であり、好ましくは 20°C〜40°Cの範 囲であり、更に好ましくは 25°C〜35°Cの範囲である。培養時間は特に限定されない 力 例えば 1日以上、 3日以上、 5日以上である。培養法としては例えば振盪培養法、 ジャーフアーメンターによる好気的深部培養法を利用できる。
上述した各種の培養条件などは培養する対象に応じて適宜変更され、本発明の AMPデァミナーゼが生産される条件であれば、その条件等は限定されな!、。
放線菌を所望時間培養した後の培養液又は菌体より AMPデァミナーゼを回収する ことができる。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理して 不溶物を除去した後、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマトグラフィーなどを組み 合わせて分離、精製を行うことにより AMPデァミナーゼを得ることができる。好ましくは 、硫安沈殿等の塩析による分画の後、疎水性クロマトグラフィー及びゲルろ過を行う。 他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などに よって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより AMPデァミナーゼを得る ことができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液力も菌体を回収した後、上 記一連の工程 (菌体の破砕、分離、精製)を行ってもよい。 尚、各精製工程では原則として AMPデァミナーゼ活性を指標として分画を行い、次 のステップへと進む。
[0012] 本発明の第 3の局面は、上記本発明の AMPデァミナーゼの利用に関する。本発明 の AMPデアミナーゼは、通常の AMPデアミナーゼ（即ち、これまでに利用されている 、ァスペルギルス'メレウス（Aspergillus melleus)等に由来する AMPデァミナーゼ）と同 様に様々な用途に利用される。但し、耐熱性に優れるという特徴を活力ゝして、高温下 での反応が好まし 、用途にぉ 、て好適に利用され得る。ここでの「高温下での反応 が好まし!/、用途」とは、製造効率や雑菌汚染などの観点力も AMPデァミナ一ゼを高 温下で反応させることが好ましい用途のことをいう。当該用途の具体例として酵母ェ キスの製造を挙げることができる。酵母エキスの製造にぉ 、ては一般にヌクレアーゼ 処理と AMPデアミナーゼ処理によって旨味増強（味質改善）が行われる。熱安定性に 優れる本発明の AMPデァミナーゼを使用すれば、高温下で実施されるヌクレアーゼ 処理と同時に AMPデァミナーゼ処理を行うことができる。これによつて、製造工程の 簡略化及び短縮化が達成されるとともに、酵素処理中の雑菌汚染を有効に防止でき る。
本発明の AMPデァミナーゼを利用した酵母エキスの製造方法では、好ま ヽー態 様として、次のステップ、即ち酵母溶菌液に対してヌクレアーゼと AMPデァミナーゼを 添加し、高温下で作用させるステップを実施する。酵母溶菌液は常法で調製すること ができる。例えば、 10%ビール酵母又はパン酵母等の懸濁液 (pH7.0)に加熱処理を 行 ヽ、市販の溶菌酵素である YL-NL「ァマノ」又は YL-15 (V、ずれも天野ェンザィム社 製品）を添加して溶菌させることによって酵母溶菌液を調製する。ヌクレア一ゼは様 々なメーカー（例えば天野ェンザィム社）によって市販されており、その中力 好適な ものを適宜選択して用いることができる。微生物などから常法で調製したヌクレアーゼ を使用してもよい。複数種類のヌクレアーゼを併用してもよい。ヌクレアーゼと AMPデ アミナーゼの添加量は、使用する酵素の種類や活性値を考慮して適宜設定すること ができる。作用温度はヌクレアーゼと AMPデァミナーゼがともに作用する温度とする。 例えば 60°C〜80°C、好ましくは 65°C〜75°C、更に好ましくは約 70°Cで反応させる。
[0013] (単離された AMPデァミナーゼ） 後述の実施例に示すように、本発明者らはストレブトマイセス 'ミユリナス由来の AMP デァミナーゼのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の配列を同定することに成 功した。これによつて AMPデァミナーゼを組み換え体として生産することが可能となつ た。
本発明の更なる局面は以上の成果に基づき、単離された AMPデァミナーゼに関す る。本発明の AMPデァミナーゼは例えば配列番号： 1のアミノ酸配列を有するタンパ ク質カもなる。後述の実施例で示されるように、当該タンパク質については実際に AMPデァミナーゼ活性を示すことが確認されている。尚、シグナルペプチドを含む配 列を配列番号： 2に示す。
本発明の一態様では、配列番号： 1又は 2のアミノ酸配列を有するタンパク質と比較 した場合にその機能は同等であるものの一部においてアミノ酸配列が相違するタン パク質 (以下、「相同タンパク質」ともいう）力もなる AMPデァミナーゼが提供される。「 一部においてアミノ酸配列が相違する」とは、典型的には、アミノ酸配列を構成する 1 〜数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは 1〜数個のアミノ酸の付加、挿入、又はこれ らの糸且合せによりアミノ酸配列に変異 (変ィ匕）が生じていることをいう。ここでのアミノ酸 配列の相違は、 AMPデアミナーゼとしての機能、即ち 5'-アデ-ル酸 + H 0 → 5'-
2 イノシン酸 + NHの反応を触媒すると!/、う機能（「AMPデァミナーゼ活性」とも 、う）が
3
保持される限り許容される。この条件を満たす限りアミノ酸配列が相違する位置は特 に限定されず、また複数の位置で相違が生じていてもよい。ここでの複数とは例えば 全アミノ酸の約 30%未満に相当する数であり、好ましくは約 20%未満に相当する数で あり、さらに好ましくは約 10%未満に相当する数であり、より一層好ましくは約 5%未満 に相当する数であり、最も好ましくは約 1%未満に相当する数である。即ち相同タンパ ク質は、配列番号： 1又は 2のアミノ酸配列と例えば約 70%以上、好ましくは約 80%以上 、さらに好ましくは約 90%以上、より一層好ましくは約 95%以上、最も好ましくは約 99% 以上の同一性を有する。
好ましくは、保存的アミノ酸置換を非必須アミノ酸残基（「AMPデァミナーゼ活性に 関与しないアミノ酸残基）に生じさせることによって相同タンパク質を得る。ここでの「 保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸 残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖 (例えばリシ ン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばァスパルギン酸、グルタミン酸）、非荷 電極性側鎖（例えばグリシン、ァスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン 、システィン）、非極性側鎖 (例えばァラニン、パリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン 、フエ-ルァラニン、メチォニン、トリブトファン）、 β分岐側鎖 (例えばスレオニン、ノ リ ン、イソロイシン）、芳香族側鎖 (例えばチロシン、フ -ルァラニン、トリブトファン、ヒ スチジン)のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好 ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
ここで、二つのアミノ酸配列又は二つの核酸 (以下、これらを含む用語として「二つ の配列」を使用する）の同一性（％)は例えば以下の手順で決定することができる。ま ず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる（例えば、第一の配列にギャップを 導入して第二の配列とのァライメントを最適化してもよ!/、)。第一の配列の特定位置の 分子 (アミノ酸残基又はヌクレオチド）が、第二の配列における対応する位置の分子と 同じであるとき、その位置の分子が同一であるという。二つの配列の同一性は、その 二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（すなわち、同一性（％) =同一 位置の数 Ζ位置の総数 X 100)、好ましくは、ァライメントの最適化に要したギャップ の数およびサイズも考慮に入れる。
二つの配列の比較及び同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて実現可能で ある。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、 Karlinおよび Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264- 68に記載され、 Karlinおよび Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873- 77において改変されたアルゴリ ズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、 Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403- 10に記載の NBLASTプログラムおよび XBLASTプログラ ム (バージョン 2.0)に組み込まれている。本発明の核酸に相同的なヌクレオチド配列 を得るには例えば、 NBLASTプログラムで score = 100、 wordlength = 12として BLAST ヌクレオチド検索を行えばよい。本発明のタンパク質に相同的なアミノ酸配列を得る には例えば、 XBLASTプログラムで score = 50、 wordlength = 3として BLASTポリぺプ チド検索を行えばよい。比較のためのギャップァライメントを得るためには、 Altschulら (1997) Amino Acids Research 25(17):3389- 3402に記載の Gapped BLASTが利用可 能である。 BLASTおよび Gapped BLASTを利用する場合は、対応するプログラム（例 えば XBLASTおよび NBLAST)のデフォルトパラメータを使用することができる。詳しく は http：〃 www. ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。配列の比較に利用可能な他の数学 的ァノレゴリズムの例としては、 Myersおよび Miller (1988) Comput Appl Biosci.
4: 11-17に記載のァノレゴリズムがある。このようなァノレゴリズムは、例えば
GENESTREAMネットワークサーバー（IGH Montpellier,フランス）または ISRECサー バーで利用可能な ALIGNプログラムに組み込まれて 、る。アミノ酸配列の比較に ALIGNプログラムを利用する場合は例えば、 PAM120残基質量表を使用し、ギャップ 長ペナルティ = 12、ギャップペナルティ =4とすることができる。
二つのアミノ酸配列の同一性を、 GCGソフトウェアパッケージの GAPプログラムを用 いて、 Blossom 62マトリックスまたは PAM250マトリックスを使用し、ギャップカ卩重 = 12、 10、 8、 6、又は 4、ギャップ長加重 =2、 3、又は 4として決定することができる。また、二 つの核酸配列の相同度を、 GCGソフトウェアパッケージ（http：〃 www. gcg.comで利用 可能）の GAPプログラムを用いて、ギャップ加重 = 50、ギャップ長加重 =3として決定 することができる。
本発明の AMPデアミナーゼ (相同タンパク質を含む）の中で天然の放線菌が有する ものについては、当該放線菌より抽出、精製等の操作によって調製することができる 。また、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を基にして遺伝子工学的 手法を用いて本発明の AMPデアミナーゼ (相同タンパク質を含む）を調製することも できる。例えば、本発明の AMPデァミナーゼをコードする DNAで適当な宿主細胞を 形質転換し、形質転換体が発現したタンパク質を回収することにより調製することが できる。回収されたタンパク質は目的に応じて適宜精製される。組換えタンパク質とし て調製する場合には種々の修飾が可能である。例えば、本発明の AMPデァミナーゼ をコードする DNAと他の適当な DNAとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用い て組換えタンパク質の生産を行えば、本発明の AMPデァミナーゼに他のペプチドな いしタンパク質が連結された組換えタンパク質を得ることができる。また、糖鎖及び Z 又は脂質の付加や、あるいは N末端若しくは C末端のプロセッシングが生ずるような 修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便 ィ匕、又は生物学的機能の付加等が可能である。
[0017] ここで、本発明の AMPデアミナーゼに関して使用する場合の「単離された」とは、そ の本来の環境 (例えば天然の物質の場合は天然の環境)から取り出された状態、即 ち、人為的操作によって、本来の存在状態と異なる状態で存在していることをいう。 単離された状態の AMPデァミナーゼは通常、産生菌の菌体成分を含まない。また 夾雑成分 (夾雑タンパク質、組換え DNA技術によって生産する場合の宿主に由来す る他の成分、培養液成分等)の含有量は少ないことが好ましい。本発明の単離された AMPデアミナーゼでは夾雑タンパク質の量が例えば全タンパク質量の 50%以下、好ま しくは 40%以下、更に好ましくは 30%以下、より一層好ましくは 20%以下である。
[0018] (AMPデァミナーゼをコードする核酸分子）
本発明の更なる局面は、 AMPデァミナーゼをコードする核酸分子に関する。
本明細書における用語「核酸」は、 DNA(cDNA及びゲノム DNAを含む）、 RNA ( mRNAを含む）、 DNA類似体、及び RNA類似体を含む。本発明の核酸の形態は限定 されず、即ち 1本鎖及び 2本鎖のいずれであってもよい。好ましくは 2本鎖 DNAである。 またコドンの縮重も考慮される。即ち、その発現産物として目的のタンパク質が得られ る限り任意の塩基配列を有して 、てよ 、。
[0019] 本明細書にぉ 、て「特定のタンパク質をコードする核酸」とは、それを発現させた場 合に当該特定のタンパク質が得られる核酸のことをいい、当該タンパク質のアミノ酸 配列に対応する塩基配列を有する核酸は勿論のこと、そのような核酸にアミノ酸配列 をコードしな 、配列が付加されてなる核酸 (例えば 1又は複数個のイントロンを含む DNA)をも含む。
[0020] 本明細書において用語「単離された核酸」とは、もともと天然に存在している核酸の 場合、典型的には、天然状態において共存するその他の核酸から分離された状態 の核酸をいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列など一部の他の核酸成分 を含んでいてもよい。
[0021] 例えば cDNA分子など遺伝子組み換え技術によって生産される核酸の場合の「単 離された核酸」は好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない状態の核 酸をいう。同様に、化学合成によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は 好ましくは、 dNTPなどの前駆体 (原材料)や合成過程で使用される化学物質等を実 質的に含まな!/、状態の核酸を!、う。
核酸がベクターや組成物の一部として存在していても又は外来性分子として細胞 内に存在していても、人為的操作の結果として存在している限り「単離された核酸」で ある。
尚、特に言及しない限り、本明細書において単に「核酸」と記載した場合には、単離 された状態の核酸を意味する。
[0022] 本発明の核酸分子は上記本発明の AMPデァミナーゼをコードする。即ち本発明の 核酸分子は、配列番号： 1又は 2のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその相同タ ンパク質をコードする。本発明の核酸分子の具体的一態様は、配列番号: 3の塩基 配列を有する DNAである。この塩基配列は、同定に成功した AMPデァミナーゼ遺伝 子をコードする DNAであって 5'非翻訳領域 (プロモーター領域)及び 3'非翻訳領域（ ターミネータ一領域）を含む。このような DNAではプロモーター及びターミネータ一と 構造遺伝子が本来の組合せ (天然状態の組合せ)となること力ゝら、当該 DNAを利用し ての AMPデァミナーゼ生産を行えば良好な遺伝子発現を期待できる。したがって、 効率的な AMPデァミナーゼ生産系を構築できる。
本発明の他の態様は、配列番号: 3の塩基配列から、その 5'非翻訳領域又はその 一部、及び 3，非翻訳領域又はその一部の 、ずれか一つ以上が欠失した DNAを提供 する。力かる DNAの具体例としては、配列番号: 4又は 5の塩基配列を有する DNAを 挙げることができる。配列番号: 4の塩基配列を有する DNAは、同定に成功した AMP デァミナーゼの構造遺伝子 (シグナルペプチドをコードする領域を含む）をコードする DNAである。同様に、配列番号： 5の塩基配列を有する DNAは、同定に成功した AMP デァミナーゼの構造遺伝子 (シグナルペプチドをコードする領域を含まな 、）をコード する DNAである。
[0023] 本発明の核酸は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、 標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いること によって、単離された状態に調製することができる。 例えば、本発明の核酸は、当該核酸の塩基配列又はその相補配列の全体又は一 部をプローブとしたノヽイブリダィゼーシヨン法を利用して放線菌ゲノム DNAライブラリ 一より単離することができる。また、当該核酸の塩基配列の一部に特異的にハイプリ ダイズするようにデザインされた合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅 反応 (例えば PCR)を利用して放線菌ゲノム DNAライブラリー又は放線菌ゲノム、或 ヽ は放線菌核酸抽出物より増幅及び単離することができる。尚、オリゴヌクレオチドブラ イマ一は一般に、市販の自動化 DNA合成装置などを用いて容易に合成することがで さる
使用するライブラリーの種類に応じてプラークハイブリダィゼーシヨン法あるいはコロ ニーハイブリダィゼーシヨン法などが利用される（Molecular Cloning, Third
Edition, Cola Spring Harbor Laboratory Press, New York等を参照)。 f列？ J プフス^ ドを用いて構築されたライブラリーの場合を例に採ればコロニーハイブリダィゼーショ ン法が利用される。 目的の核酸を保有するクローンの選択には、本発明の核酸に特 異的な配列を有するプローブが用いられる。 目的とするクローンが選択されれば、こ のクローンが保有する核酸を铸型とし、 目的の核酸の配列に特異的なプライマーを 用いた PCR法等を実施することにより、本発明の核酸を増幅産物として得ることがで きる。
得られたクローンが保有する核酸を適当なベクターにサブクローユングして以降の 利用に供することができる。これによつて例えば、形質転換用の組換えベクターの構 築や、或は塩基配列解読に適したプラスミドの構築ができる。
本発明の他の態様では、配列番号： 3〜5のいずれかの塩基配列と比較した場合 にそれがコードするタンパク質の機能は同等であるものの一部において塩基配列が 相違する核酸 (以下、「相同核酸」ともいう）が提供される。相同核酸の例として、配列 番: 3〜5の塩基配列を基準として 1若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、 又は逆位を含む塩基配列カゝらなり、かつ AMPデァミナーゼ活性を有するタンパク質 をコードする DNAを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じ ていてもよい。ここでの「複数」とは、当該核酸がコードするタンパク質の立体構造に おけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば 2〜40塩基、好ましくは 2〜20塩基、より好ましくは 2〜 10塩基である。
上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異には AMPデァミナ ーゼ遺伝子を保持する微生物の個体差、種ゃ属の違いに基づく場合など、天然に 生じる変異も含まれる。
相同核酸の他の例として、 SNPに代表される多型に起因して上記のごとき塩基の相 違が認められる核酸を挙げることができる。
[0025] 以上のような相同核酸は例えば、制限酵素処理、ェキソヌクレアーゼゃ DNAリガ一 ゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, し napter 13 ，し old Spring Harbor Laboratory Press, New York)やフンタム夹然 異 導入法 (Molecular Cloning, Third Edition, chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)による変異の導入などによって得られる。また、紫外線 照射など他の方法によっても相同核酸を得ることができる。さらには、 AMPデァミナ一 ゼ遺伝子を保有する放線菌を紫外線で処理し、その後改変された遺伝子を単離す ることなど、公知の変異処理を利用した方法によっても取得することができる。
[0026] 相同核酸の調製方法の具体例を以下に示す。相同核酸を保有する天然の放線菌 からゲノム (染色体) DNAを抽出し、これを適当な制限酵素で処理した後に本発明の 核酸分子 (例えば配列番号： 3の塩基配列を有する DNA)又はその一部をプローブと したスクリーニングにおいてストリンジェントな条件でハイブリダィズする DNAを選択、 単離する。相同核酸を保有するクローンを含むゲノム (染色体) DNAライブラリーを利 用可能な場合には、当該ライブラリーを本発明の核酸分子 (例えば配列番号: 3の塩 基配列を有する DNA)又はその一部をプローブとしてストリンジェントな条件下でスク リーユングすること〖こよっても得ることができる。
[0027] 本発明の他の態様は、配列番号： 3〜5の塩基配列に対して相補的な塩基配列を 有する核酸に関する。
本発明の更に他の態様は、配列番号： 3〜5の塩基配列、或いはこれらいずれかに 相補的な塩基配列に対して少なくとも約 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 99%、または 99.9% 同一な塩基配列を有する核酸を提供する。尚、同一性はできるだけ高い方が好まし い。 本発明の更に別の態様は、配列番号： 3〜5の塩基配列又はその相同塩基配列に 相補的な塩基配列に対してストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を 有する核酸に関する。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイ ブリツドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなス トリンジェントな条件は当業者に公知であって例えば Molecular Cloning (Third Edi tion, Cold spring Harbor Laboratory Press, New York)やし urrent protocols in molecular biology (edited by Frederick M. Ausubel et al, 1987)を参照して設定する ことができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダィゼーシヨン液 (50%ホ ルムアルデヒド、 10 X SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、 5 X Denhardt 溶液、 1% SDS、 10%デキストラン硫酸、 10 g/mlの変性サケ精子 DNA、 50mMリン 酸バッファー (pH7.5))を用いて約 42°C〜約 50°Cでインキュベーションし、その後 0.1 X SSC、 0.1% SDSを用いて約 65°C〜約 70°Cで洗浄する条件を挙げることができる。更 に好まし 、ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダィゼーシヨン液として 50%ホ ルムアルデヒド、 5 X SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、 1 X Denhardt 溶液、 1%SDS、 10%デキストラン硫酸、 10 /z g/mlの変性サケ精子 DNA、 50mMリン酸 ノ ッファー (pH7.5))を用いる条件を挙げることができる。
[0028] (ベクター）
本発明のさらに他の局面は、本発明の核酸を含有するベクターに関する。本明細 書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸を細胞等のターゲット内へと 輸送することができる核酸性分子を 、う。
本発明のベクターは、既存のベクター又はそれに改変を施したベクター内に本発 明の核酸 (典型的には DNA)を組込むことにより作製することができる。本発明の核酸 を保持し得るものであれば原則として 、かなるベクターを出発材料としても 、が、使 用目的（クロー-ング、ポリペプチドの発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮し て適当なベクターが選択される。
[0029] 形質転換用のベクターには、典型的には、 AMPデァミナーゼ遺伝子 (例えば配列 番号: 4の塩基配列を有する DNA)、プロモーター、およびターミネータ一が含有され る。プロモーターによる構造遺伝子の適切な転写が達成されるように、上流から下流 に向かって順にプロモーター、 AMPデアミナーゼ遺伝子、及びターミネータ一が配置 される。
本発明のベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、それに挿 入された核酸を目的の細胞 (宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内に おいて発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、核酸の発現に 必要なプロモーター配列や、発現を促進させるェンノヽンサ一配列等を含む。選択マ 一力一を含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場 合には、選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無 (及びその程度）を確 認することができる。
本発明の核酸のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入 (必要な場合）、 プロモーターの挿入 (必要な場合)等は標準的な組換え DNA技術 (例えば、
Molecularし loning, Third Edition, 1.84, Cold spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及び DNAリガーゼを用いた周知の方法）を用 いて行うことができる。尚、プロモーター領域をも含む DNA (例えば配列番号： 3の塩 基配列を有する DNA)を保持するベクターを構築する場合には、当該 DNAのプロモ 一ター領域とその他の領域とを別個に用意し、それぞれをベクターに組込むことによ り組換えベクターを構築してもよい。このような場合には、プロモーター機能が適切に 発揮されることを条件として、ベクター内にお 、て両者 (プロモーター領域とその他の 領域)の間に他の配列が介在していてもよい。また、まずプロモーター領域を保持す るベクターを構築し、その後にその他の領域の連結を行ってもょ 、。 以上の組換えベクターは宿主の形質転換に利用される。即ち、以上の組換えべク ターを用いて、本発明の核酸分子が導入された形質転換体を調製することができる。 (形質転換体及びその利用）
形質転換用ベクターは宿主の形質転換に利用される。即ち、上記の形質転換用べ クタ一を用いて、本発明の核酸分子が導入された形質転換体を調製することができ る。
形質転換に供される宿主の種類は特に限定されず、ストレブトマイセス ·ミユリナス（ IFO14802等）、ストレプトマイセス 'リビダンス（TK24等）、ストレプトマイセス'グリセウス サブエスピーグリセウス (Streptomyces griseus subsp. griseus)、ストレプトマイセス' グリセウス (Streptomyces griseus)、ストレプトマイセス 'セノレ口フラノくス (Streptomyces celluloflavus)、ストレプトマイセス 'セリカラー (Streptomyces coelicolor)、ストレプトマイ セス 'モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis)、ストレプロマイセス 'アベルミチリス (Streptomyces avermitilis)等の放線菌を宿主として好適に用いることができる。その 他、エスケリツチア'コライ（Escherichia coli)、バシラス'サチルス（Bacillus subtilis)、 サッカロマイセス 'セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス'ボンべ ( Saccharomyces pombe)等を宿主として採用することもできる。
[0031] 形質転換用ベクターの宿主への導入 (形質転換）は公知の方法で行うことができる 。例えば、プロトプラスト化した菌体を用いた D.A. Hopwoodらの方法（PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS P.229-252 (The John Innes Foundationゝ 2000) )により 行うことができる。
[0032] 形質転換体は AMPデァミナーゼの生産に利用され得る。具体的には、本発明の核 酸が導入された形質転換体を、当該核酸のコードするタンパク質 (AMPデァミナーゼ )が発現可能な条件で培養することにより、 AMPデァミナ一ゼを産生させることができ る。培地は使用する宿主に応じて適切なものが用いられる。例えば市販の各種培地 又はこれらにプロリン、ロイシン、チアミン等の形質転換体の生育、選択、タンパク質 の発現促進などに必要な成分を添加した培地を用いることができる。
[0033] 所望時間培養した後の培養液又は菌体より目的のタンパク質 (AMPデァミナーゼ） を回収することができる。菌体外に産生された場合には培養液より、それ以外であれ ば菌体内より回収することができる。培養液から回収する場合には、例えば培養上清 をろ過、遠心処理して不溶物を除去した後、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマト グラフィーなどを組み合わせて分離、精製を行うことにより目的のタンパク質を取得す ることができる。他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音 波処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより目的のタン ノ ク質を取得することができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌 体を回収した後、上記一連の工程 (菌体の破砕、分離、精製)を行ってもよい。尚、本 発明の AMPデァミナーゼは通常菌体外に産生されることから、その分離、精製は比 較的容易である。
[0034] 以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限 定されるものではない。
実施例 1
[0035] ストレプトマイセス ·ミユリナス由来 AMPデァミナーゼの精製
1.実験方法及び材料
以下の実験に使用した菌株、酵素液の調製方法、及び酵素活性測定方法は次の 通りとした。
<使用菌株 >
ストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus) IFO 14802、ストレプトマイセス' グリセウス サブエスピー グリセウス（Streptomyces griseus subsp. griseus) JCM4681 、ストレプトマイセス 'グリセウス（Streptomyces griseus) IF03355(NBRC3355)及びスト レプトマイセス'セルロフラバス（Streptomyces celluloflavus) IFO13780(NBRC13780) を使用した。 尚、ストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)IFO14802は、 以下の通り、国際寄託機関に寄託されている。
国際寄託機関
名称：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
住所：干305-8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号 中央第 6
寄託日： 2004年 3月 29日
寄託番号： FERM BP-08673
[0036] <酵素液の調製方法 >
(1)ァスペルギルス'メレウス（Aspergillus melleus)由来酵素液
市販の AMPデァミナーゼ剤である「デアミザィム（50,000 u/mg品）」（商標名、天野 ェンザィム社製品）を水で希釈し、酵素液とした。
(2)ストレプトマイセス ·ミユリナス（Streptomyces murinus)由来酵素液
ソルピー NY 2%、ミースト PIG 0.5%、 NaCl 0.3%、 KH PO 0.1%、食添 MgSO 0.05%、可
2 4 4 溶性デンプン 3%をカ卩えて pH5.7に調整し、 121°Cで 30分間殺菌を行った。ストレプト マイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)IFO14802を植菌し、 27°Cで前培養を 1日 、本培養を 5日間行ない粗酵素液を調製した。
(3)放線菌由来酵素液
ソーャフラワー A 2%、 NaCl 0.3%、 KH PO 0.1%、食添 MgSO 0.05%、可溶性デンプ
2 4 4
ン 3%をカ卩えて pH5.7に調整し、 121°Cで 30分間殺菌を行った。植菌し、 27°Cで前培養 を 1日、本培養を 5日間行ない粗酵素液を調製した。
[0037] <酵素活性測定方法 >
(1) AMPデァミナーゼ活性測定方法
反応時の OD の減少を指標として酵素活性を測定した。 0.017Mの 5'AMP-2Naと
265
1/15Mリン酸塩緩衝液 (pH 5.6)を 1:2の割合で混合した溶液 1.5mlに試料溶液 0.5mlを 添加して反応液とし、 37°Cで 15分間反応させた。 15分後に 2%過塩素酸溶液を添加し て反応を停止させた後、 100 μ 1を量り取った。水をカ卩えて 5mlとして OD を測定した。
265
反応時間を 0分として同様に測定したものをブランクとした。以上の条件下、 60分間に 吸光度差が 0.001減少するときを 1単位とした。
(2)ホスファターゼ活性測定方法
0.025Mの 5，IMP- 2Naと 0.036Mバルピタールナトリウム ·塩酸緩衝液 (pH 5.6)を 1:2の 割合で混合した溶液 1.5mlに試料溶液 0.5mlを添加して反応液として、 37°Cで 30分間 反応させた。反応終了後に 200 1を量りとり、 5mlの 6%過塩素酸で反応を停止させた 。 0.05Mのアミドール溶液 0.25mlを入れて混ぜ合わせた後、 0.067Mのモリブテン酸ァ ンモ-ゥム溶液を 0.25ml入れて混ぜ合わせ、更に水を 0.25ml入れて混ぜ合わせた。 続いて流水中に 15分間放置した後、 OD を測定した。反応時間を 0分として同様に
750
測定したものをブランクとした。以上の条件下、 30分間に吸光度差が 0.001増加したと きを 1単位とした。
[0038] 2.実験結果
(1)熱安定性
ァスペルギルス'メレウス（Aspergillus melleus)及びストレプトマイセス ·ミユリナス（ Streptomyces murinus )が生産する AMPデァミナ一ゼの熱安定性を比較した。ァスぺ ルギルス'メレウス（Aspergillus melleus)及びストレプトマイセス ·ミユリナス）（
Streptomyces murinus)について、上記の方法で調製した 1%酵素溶液を所定の温度 で処理した後、残存 AMPデァミナーゼ活性を測定した (pH 5.6)。尚、処理温度は、 30°C、 40°C、 50°C、 60°C、 65°C、 70°C、及び 75°Cとした。また、処理時間は 30分間とし た。
測定結果を図 1のグラフに示す。ストレプトマイセス ·ミユリナス（Streptomyces murinus)由来の AMPデァミナ一ゼが熱安定性に非常に優れていることが分力る。
[0039] (2)夾雑ホスファターゼ
ァスペルギルス'メレウス（Asperugillus melleus)及びストレプトマイセス ·ミユリナス（ Streptomyces murinus)について、夾雑ホスファターゼ活性を測定した。測定結果か ら求めたホスファターゼ活性/デアミナーゼ活性 (P/D)を図 2の表にまとめた。ァスぺ ルギルス'メレウス (Aspergillus melleus)では夾雑活性が存在することが分かった。一 方、ストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)ではホスファターゼ活性は 認められなかった。即ちストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)が生産 する AMPデアミナーゼは、夾雑ホスファターゼ活性が極めて低いものであることが明 らかとなつた。
[0040] (3)IMP変換反応
ァスペルギルス'メレウス（Aspergillus melleus)及びストレプトマイセス ·ミユリナス（ Streptomyces murinus)が生産する AMPデァミナーゼについて、 HPLCによる IMP変 換率を調べた。具体的には 1/15Mリン酸緩衝液 (pH7.0)を用いて 1.1%AMP溶液を調 製し、 1.1%AMP溶液 5mlに対し、酵素溶液 0.5mlを添カ卩して 50°C、 4時間反応を行い、 その後 100°C、 10分の加熱処理し、フィルターろ過（0.45 m)を行い HPLCによる分 析を行った。
測定結果を図 3のグラフに示す。ストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)の生産する AMPデァミナーゼの IMP変換率（変換速度）は、ァスペルギルス 'メレウス（Aspergillus melleus)由来 AMPデァミナーゼと同等であった。上記のように、 ストレプトマイセス ·ミユリナス（Streptomyces murinus)では夾雑ホスファターゼ活性が 認められな力 たため副生産物の特定を行った。その結果、副生産物（ヒポキサンチ ン）の割合はァスペルギルス'メレウス（Aspergillus melleus)の場合よりも少なかった（ 結果を図示せず)。 [0041] (4)実用化試験
実際の酵母エキスの製造にぉ 、てストレプトマイセス ·ミユリナス（Streptomyces murinus)由来の AMPデァミナーゼが有効であることを確認するために以下の試験（ 試験 1、試験 2)を行った。
a)試験 1
試験 1では、現行の製造方法と同様に、ヌクレアーゼ処理とデァミナーゼ処理を別 々の工程とした。具体的には次の手順で処理し、 IMP変換率を求めた。まず、酵母溶 菌液 (YL- 15、 0.2 %)にヌクレアーゼ「ァマノ」 G (天野ェンザィム社製、 0.1% w/w yeast solid, )を添カ卩し、 70°C、 pH 5の条件で 3時間反応させた。次に、被験酵素（ァスペル ギルス'メレウス（Aspergillus melleus)由来の AMPデァミナーゼ剤の「デアミザィム（ 50,000 u/mg品）」（商標名、天野ェンザィム社製、 0.01〜0.04% w/w yeast solid)又は ストレプトマイセス ·ミユリナス（Streptomyces murinus)から調製した粗酵素溶液）を添 加し、 50°C、 pH 6の条件で 5時間反応させた。続いて熱処理した後、 HPLC分析に供 した。尚、ストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)由来 AMPデァミナ一 ゼの添加量は、その活性値が「デアミザィム (50,000 u/mg品)」（商標名、天野ェンザ ィム社製)の添加量活性値と同じとなる量とした。
b)試験 2
試験 2では、ヌクレアーゼ処理とデァミナーゼ処理を同時に行うこととした。具体的 には次の手順で処理し、 IMP変換率を求めた。まず、酵母溶菌液 (YL-15、 0.2 %)にヌ クレアーゼ「ァマノ」 G (天野ェンザィム社製、 0.1% w/w yeast solid)及び被験酵素（ ァスペルギルス'メレウス（Aspergillus melleus)由来の AMPデァミナーゼ剤の「デアミ ザィム（50,000単位品）」（商標名、天野ェンザィム社製、 0.01〜0.04% w/w yeast solid)又はストレプトマイセス ·ミユリナス（Streptomyces murinus)から調製した粗酵素 溶液)を添加し、 70°C、 pH 5の条件で所定時間（3時間又は 5時間）反応させた。続い て熱処理した後、 HPLC分析に供した。尚、ストレブトマイセス 'ミユリナス（
Streptomyces murinus)由来 AMPデァミナ一ゼの添カ卩量は、その活性値がデアミザィ ム（50,000 u/mg品）の添カ卩量活性値と同じとなる量とした。
[0042] 試験 1の結果を図 4(a)に示す。図 4(a)から明らかなように、ストレプトマイセス 'ミユリ ナス（Streptomyces murinus)由来 AMPデァミナーゼは、ァスペルギルス'メレウス（ Aspergillus melleus)由来の AMPデァミナーゼ（デアミザィム： 50,000u/mg品）と同等の IMP変換率を示した。
一方、試験 2の結果を同図 (b)に示す。グラフ中の 3hrsは、ストレプトマイセス 'ミユリ ナス（Streptomyces murinus)由来 AMPデァミナーゼを同時に 3時間作用させたときの 測定結果であり、 5hrsは同様に 5時間作用させたときの測定結果である。尚、ァスぺ ルギルス'メレウス（Aspergillus melleus)由来の AMPデァミナーゼ（デアミザィム： 50,000 u/mg品）を使用した場合 (3時間の反応及び 5時間の反応のいずれにおいて も）には IMPの生成が認められなかった。図 4(b)から明らかなように、ストレプトマイセ ス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)由来 AMPデァミナーゼを使用した場合には、ヌ クレアーゼと同時に高温で作用させても IMPの生成が認められた。このように、ストレ プトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)由来の AMPデァミナ一ゼはヌクレア ーゼと同時に反応させることが可能であることが確認された。
(5)ストレプトマイセス ·ミユリナス（Streptomyces murinus)由来 AMPデァミナ一ゼの酵 素学的諸性質
以下の手順でストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)由来の AMPデ アミナーゼの精製を試みた。まず、ストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus) (IFO14802)を上記の方法で培養し、生産された酵素を限外ろ過膜 (AIP1 010)による 2倍濃縮し、濃縮液に水を加えて、更に濃縮して低分子画分を除去後、 凍結乾燥して粗酵素とした。この粗酵素を精製水に溶解し、飽和硫安 48%による硫安 分画を行った。沈殿画分を 20mM KPB(pH7.0)に溶解し酵素液とした。得られた酵素 液を、 30%硫安を含む 20mM KPB(pH7.0)で平衡化を行った HiPrep™16/10 ButylFF (フアルマシア製）に通した。続いて、硫安 30%〜0%を含む 20mM KPB pH7.0、硫安 30%〜0%の濃度勾配で溶出させた。その後、濃縮を行い、活性画分を Superose 12 column (フアルマシア製）によるゲルろ過に供し、 150mMの NaClを含む 50mM KPB PH7.0で溶出させた。活性画分 (画分 15及び 16)を集めて精製酵素とした。尚、 HiPrep™16/10 ButylFFによるクロマトグラフィーの結果を図 5(a)に示し、 Superose 12 によるクロマトグラフィーの結果を図 5(b)に示す。また、各段階における全酵素活性量 、全タンパク質量、比活性、及び収率を図 6(a)の表に示す。最終段階の比活性は粗 酵素に比較して 96倍となった。
精製酵素を SDS- PAGE (CBB染色）に供し、タンパク質の純度を確認した。
SDS-PAGEの結果を図 6(b)に示す。レーン IIがサンプルレーン（精製酵素）である。単 一なバンドを示し、精製酵素の純度が高いことがわかる。尚、レーン Iにはタンパク質 分子量マーカーのバンドが示される。高分子量側力も順にフォスフオリラーゼ b(M.W. 97,400)、牛血清アルブミン (M.W. 66,267)、アルドラーゼ (M.W. 42,400)、カルボニック アンヒドラーゼ (M.W. 30,000)、トリプシンインヒビター (M.W. 20,100)、リゾチーム (M.W. 14,400)のバンドである。
得られた精製酵素について、反応温度と活性の関係を調べた。測定結果を図 7(a) に示す。尚、図 7(a)のグラフでは、 65°Cで反応させたときの活性値を 100%とした場合 の相対活性 (%)を表した。図 7(a)のグラフから明らかなように、 40°C〜70°Cの広い範囲 で高い活性が認められる。また、反応温度を 75°Cにした場合であっても約 50%の活性 が認められる。このように、当該酵素は広範囲の温度条件下で良好に作用することが わかった。
続いて、当該酵素の熱安定性を次の手順で調べた。 2.8 g (総タンパク質量)の酵 素溶液 (0.15ml)を、 pH5.0の酢酸バッファーを用いて pH 5.6に調整した後、各温度（ 40°C、 50°C、 60°C、 65°C、 70°C、 75°C)で 30分間処理し、残存活性 (未処理の場合の 酵素活性に対する％)を測定した。測定結果を図 7(b)に示す。 65°C以下の処理条件 では約 90%以上の活性を維持している。また、 70°Cで処理した場合でも約 55%の活性 を維持している。このように、当該酵素は極めて熱安定性に優れることが判明した。 次に、当該酵素について、 pHと活性の関係を調べた。測定結果を図 8(a)に示す。 尚、図 8(a)のグラフでは、 pH5.6で反応させたときの活性値を 100%とした場合の相対 活性を表した。 pHが約 4.5〜約 8.5の範囲で比較的高い反応性が認められ、約 5.0〜 約 8.0の範囲では約 70%以上の反応性が認められる。また、 pH9.0の条件であっても約 40%の反応性が得られることがわかる。
次に、当該酵素の pH安定性を次の手順で調べた。 2.8 g (総タンパク質量)の酵素 溶液（0.15ml)を、 pH3〜8は、マッキュルバイン（Mcllvaine)緩衝液、 pH8〜10は、アト キンスーパンチン (Atkins-pantin)緩衝液で各条件の pHに調整し、 30°Cで 30分間放 置した後、残存活性 (pH7.0処理の場合の酵素活性に対する %)を測定した。測定結 果を図 8(b)に示す。 pHが約 6.0〜約 8.5の範囲で比較的高い活性を維持し、約 6.5〜 約 8.0の範囲では約 80%以上の活性を維持していることがわかる。
[0045] (6)ストレプトマイセス ·ミユリナス（Streptomyces murinus)由来 AMPデァミナ一ゼの基 質特異性
ストレプトマイセス 'ォレオファシエンス（Streptomyces aureofaciens)由来のアデノシ ンデアミナーゼは、 AMPの触媒能を有するなど幅広 、基質特性を有して!/、ると報告 されている（非特許文献 2)。このことを考慮し、上記の方法で得られたストレプトマイ セス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)由来デァミナーゼが AMPデァミナ一ゼ（ AMP- deaminase)及びアデノシンデアミナーゼ（Adenosine- deaminase)の 、ずれであ るのかを確認するため、その基質特異性を検討した。結果を図 9の表に示す。尚、 5' AMPに対する酵素活性を 100%とした場合の相対活性を表している。当該酵素は 5' AMPに対して最もよく作用した。また、 3' AMP、 5' dAMP、 ADP、 ATP、 アデノシン（ Adenosine)及び 3'5'- cyclic AMPに対しても作用したが、 2，AMP、 アデ-ン（adenine )に対しては全く作用しな力つた。特に、 5' dAMP、 ADP及び ATPに対して良好に作用 した。以上の結果から、上記の方法で得られたストレブトマイセス 'ミユリナス（ Streptomyces murinus)由来デァミナーゼが AMPデァミナーゼであることが確認され た。また、 5' dAMP、 ADP及び ATPを基質とする反応についても当該酵素を好適に利 用できることが判明した。
[0046] (7)ストレプトマイセス ·ミユリナス（Streptomyces murinus)由来 AMPデァミナ一ゼの酵 素化学的諸性質
上記の方法で得られたストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)由来 AMPデァミナ一ゼの等電点を求めるためにクロマトフォーカシングを行った。 MonoP カラム（フアルマシア製）を使用し、開始バッファー（Start Buffer)を 0.075Mトリス酢酸 バッファー（pH9.3)、溶出バッファー (Poly buffer 96)を塩酸で pH4.0に調製し、最終量 を 100mlとした。また、プレダラージェント（Pre- gradient)を 3ml、グラージェント溶出（ gradient eluent)を 30ml、溶出（eluent)を 30mlで行った。クロマトフォーカシングの結 果を図 10のグラフに示す。この結果から、アイソザィムが少なくとも 2つ (pi 8.12、 7.02) あるように思われた力 メイン画分の等電点は、 8.12であった。尚、以上の結果得られ た等電点を含め、ストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)由来 AMPデァ ミナ一ゼの諸性質を図 11の表にまとめた。この表に示されるように、ストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)由来 AMPデアミナーゼは、ゲル濾過による分子量 が約 48,000 ±2,000 (SDS-PAGEによる分子量は 60,000 ±3,000)、至適 pHが約 5.6、 至適温度が約 65°C、等電点が 8.12、 Km値が 0.95mM、 Vmax力 107
mol/min/mgであつ 7こ。
(8)ストレプトマイセス属からの AMPデアミナーゼ生産菌の探索
以上の検討から、ストレプトマイセス属に属する放線菌の一つであるストレプトマイセ ス 'ミユリナス（Streptomyces murinus)が而熱性 AMPデァミナーゼを生産することが示 されたので、ストレプトマイセス属の他の株力らも耐熱性 AMPデァミナーゼが得られる 可能性があると予想された。そこで、天野ェンザィム保存菌株中のストレブトマイセス 属において AMPデァミナーゼ生産菌のスクリーニングを行った。その結果、 AMPデァ ミナーゼを生産するものは、ストレプトマイセス.グリセウスサブエスピーグリセウス（ Streptomyces gnseus subsp. griseusノ、ストレフ。トマ でス'グリセウス (Streptomyces griseus)、及びストレプトマイセス'セルロフラバス（Streptomyces celluloflavuys)の 3株 力も見出された。これら 3株の生産する AMPデァミナーゼについて熱安定性及び基 質特異性を検討した。その結果を図 12に示す。尚、熱安定性試験では、培養によつ て得られた粗酵素溶液を使用し、処理条件を 65°C、 30分間とした。また、無処理の場 合を 100%とした残存活性を求めた。基質特異性 (アデノシンに対する特異性）に関し ては、 AMPを基質として用いた場合の活性値を 100%とした場合の相対活性とした。 図 12から明らかなように、上記 3株全てにおいて、ァスペルギルス'メレウス（ Aspergillus melleus)由来デアミナーゼよりも熱安定性が優れていた。このこと力もスト レブトマイセス属の放線菌が生産するデァミナーゼは一般に熱安定性が高 、傾向に あることが示唆された。尚、以上 3株が生産するデァミナーゼはアデノシンよりも AMP に対して良好に作用し、 AMPデアミナーゼであることが確認された。
実施例 2 [0048] ストレプトマイセス ·ミユリナス由来 AMPデァミナーゼの同定
1.アミノ酸配列解析
上記実施例の手川頁に従 、ストレプトマイセス .ミユリナス（Streptomyces murinus) IFO14802を培養し、精製酵素を得た。但し、精製は HiPrep™16/10 ButylFF (フアル マシア）を用いた Butyl Sepharoseカラムによる精製までとした。分画サンプルをゲル PAG Mini "DAIICHI" 10/20 (第一化学薬品）を用いて SDS- PAGEを行った。泳動後 のゲルを、 0.01% SDSをカ卩えた Towbin緩衝液（Tris 25mM、 glycine 192mM、メタノー ル 5%)を転写緩衝液として用い PVDF膜に転写した。転写操作はバッファータンク型 転写装置を用いて定電圧 20V、 4°C、 18時間の条件下で行った。転写後 CBB (クマシ 一ブリリアントブルー R 250) (フル力）染色を行い当該酵素にあたるバンドを切り出し N 末端アミノ酸配列解析用サンプルとした。同様に泳動後のゲルを CBB染色し当該酵 素にあたるバンドを切り出し、そのまま内部アミノ酸配列解析用サンプルとした。これ らのサンプルのアミノ酸配列を解析した結果を図 13に示す。
[0049] 2.ストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus) IFO 14802からのゲノム DNA の抽出
上記実施例の手川頁に従 、ストレプトマイセス .ミユリナス（Streptomyces murinus) IFO14802を培養し、ブフナーろうと及びヌッチェ吸引瓶を用いて培養液をろ過して菌 体を得た。菌体 lgを 4mg/mlリゾチーム（ロッシュ 'ダイァグノスティックス）、 2mg/mlァ クロモぺプチダーゼ（和光純薬）を含む TE(10mM Tris-HCl (pH8.0)、 ImM EDTA)溶 液 10mlに懸濁して 30°C、 1時間溶菌した。 0.5mM EDTA溶液 2.½11をカ卩ぇ1(^§/½1プ ロナーゼ E (科研化学 ) 260 ^ 1を加えて更に 30°C、 5分間溶菌した。次に 10% SDS溶液 1.4mlをカ卩ぇ上下に混合して 37°C、 2時間インキュベートした。 0.1M NaClを含む TE溶 液で平衡化した 12mlのフエノールをカ卩えて 5分間攪拌後、 12mlのクロ口ホルムを加え て更に 5分間攪拌した。その後遠心分離 (l,500g、室温、 5分間)を行い上清を得た。 この操作を 2回繰り返して得られた上清に lOmg/ml RNase A (シグマアルドリッチジャ パン）72 1を加えて 37°C、 1時間インキュベートした。 5M NaClを 4.5mlカ卩えて混合後、 30%ポリエチレングリコール 6000 (和光純薬）溶液を 11.25ml加えて混合し 4°Cでー晚 放置した。析出したゲノム DNAをパスツールピペットを用いて巻き取り、 70%エタノー ルで洗浄して風乾した後 TE溶液 lmlに溶解し約 lmg/mlのゲノム DNA溶液を得た。
[0050] 3.合成プライマーの設計
上記の内部アミノ酸配列解析の結果を考慮し、下記の合成プライマー (インビトロジ ェン）を設計した。
プライマー IS- F 5，- TTC GGI GAG GTI ACI GCI CGI CAY MG -3，（配列番号： 6
)
アミノ酸配列 N末端- F G E V T A R H R G - C末端
プライマー IS- R 3，- CTY CGI CTR CTG CCI CTG CGI CTC AA -5，（配列番号： 7)
アミノ酸配列 N末端- E A D D G D A E F R - C末端
[0051] 4.サザンハイブリダィゼーシヨン、コロニーハイブリダィゼーシヨン用プローブの作製 上記で得られたストレプトマイセス 'ミユリナス（Streptomyces murinus) IFO14802由 来のゲノム DNAを铸型とした PCR反応を行った。 TaKaRa LA Taq™ with GC buffer ( 宝酒造）を用いて上記の合成プライマー IS- F、 IS-Rを 2 μ Μ、铸型としたゲノム DNA 50ngを反応系に加えた。反応は 96°C '3分間インキュベート後 96°C '45秒間、 66°C ' l 分間、 72°C ' 3分間のサイクルを 35回繰り返し、最後に 72°C ' 10分間インキュベートし た。ァガロース電気泳動後、 GENECLEAN™III (BIO101)を用いて、特異的に増幅し た約 240bpの DNA断片を抽出した。抽出した DNA断片を pGEM™-T Easy (プロメガ） にサブクローンした後、挿入 DNA断片を再び抽出し、そして DIG High Prime (ロッシュ •ダイァグノスティックス）を用いて DIG標識し、 AMPデァミナーゼ遺伝子のプローブと した。
[0052] 5.サザンハイブリダィゼーシヨン
任意の制限酵素で完全消化したゲノム DNAを 1レーンあたり 6 μ gずつアプライした ァガロース電気泳動を行った。泳動終了後 0.25N HC1溶液で 30分間処理し、電気泳 動に用いたバッファーで中和後 0.4N NaOH溶液を用いたアルカリブロッテイングによ り Zeta-Probe™メンブレン（バイオラッド）にブロッテイングした。転写は 2016 VacuGene (フアルマシア LKBバイオテクノロジー）を用いて真空度 50cm' H 0で 90分間行った。
2
ブロッテイング後 2 X SSC (NaCl 0·3Μ、クェン酸ナトリウム 33.3mM)溶液でメンブレン を洗浄し、風乾後 80°C 30分間インキュベートし DNAをメンブレンに固定ィ匕した。固定 化したメンブレンに対して上記のプローブを用いてサザンハイブリダィゼーシヨンを行 い DIG Nucleic Acid Detection Kit (ロッシュ 'ダイァグノスティックス）を用いて検出を 行った。このようにして当該酵素遺伝子の制限酵素地図を作製した (図 14)。
[0053] 6.コロニーハイブリダィゼーシヨン
ゲノム DNA 12 gを制限酵素 Not 1 (宝酒造)を用いて完全消化した後、ァガロース 電気泳動により DNA鎖長 3.8kbpの DNA断片を切り出し、続いて GENECLEAN™III ( BIO 101)を用いて抽出してライブラリー作製の為のインサートとした。同時に pBluescriptll KS(+) (ストラタジーン）を Not I (宝酒造）を用いて完全消化した後
Alkaline Phosphatase (宝酒造）を用いて脱リン酸化したものをライブラリー作製の為の ベクターとした。インサートとベクターを Ligation Kit ver.2 (宝酒造）を用いてライゲー シヨンし大腸菌 DH5株コンビテントセル（東洋紡績）に Hanahanの方法（J Mol Biol. 1983 Jun 5;166(4):557-80, Hanahan D., Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids)を用いて形質転換を行った。得られたクローンを LAプレート（アン ピシリン (シグマアルドリッチジャパン) 100 μ g/ml)一枚あたり約 500のコロニーを形成 するように撒き、 37°C—晩インキュベートしてコロニーを生育させた。生育した総計約 9, 500のコロニー Nylon Membranes for Colony and Plaque Hybridization (ロッシュ · ダイァグノスティックス）にリフトし、メンブレン上に DNAを固定ィ匕した。先に示したプロ ーブを用いてコロニーハイブリダィゼーシヨンを行い DIG Nucleic Acid Detection Kit ( ロッシュ 'ダイァグノスティックス）を用いて強いシグナルを示すコロニーを検出した。 以上の操作方法は全て使用した試薬に添付されたプロトコールに従った。こうして得 られたクローンを pSADと名づけストレプトマイセス ·ミユリナス（Streptomyces murinus) IFO14802由来 AMPデアミナーゼ遺伝子を含むクローンとした。
[0054] 7. AMPデァミナーゼ遺伝子の塩基配列解析
まず始めに M13 Primer M4、 M13 Primer RV (宝酒造）を用いてインサートの外側か ら塩基配列解析を実施した。単離したクローン、及びプローブに用いた DNA断片を 塩基配列解析した結果明らかとなった当該酵素遺伝子の配列をもとに再度合成ブラ イマ一 (シグマジエノシス)を設計し塩基配列解析を行った。これらの操作を繰り返し 行うプライマーウォーキングにより全長 DNA配列を解析した。塩基配列解析は BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit及ひ dGTP BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (アプライドバイオシステムズジャパン）を用い、解析 は ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer (アプライドバイオシステムズジャパン）を使用 した。以下に塩基配列解析に用いた合成プライマーを示す。
MAD- - Fl: 5， -AAGCAACTCGCCGACCAG- -3， (配列番号: 8)
MAD- -F2: 5， -TGGTCCATGCAGGACTTC- -3， (配列番号: 9)
MAD- -F3: 5， -CTGGAGAACTACAGCCTC- -3， (配列番号: 10)
MAD- -F4: 5， -CAGATCCTCGGCGTCAAG- -3， (配列番号: 11)
MAD- -F5: 5， -CTCCAGTACGCCTTCCTG- -3， (配列番号: 12)
MAD- -F6: 5， -GTCGGGTCCTGGACACCG- -3， (配列番号: 13)
MAD- -F7: 5， -TATACCGTCCGGTAGGTC- -3， (配列番号: 14)
MAD- -F8: 5， -GGACAGGAAGACGGACAC -3， (配列番号: 15〕
MAD- -F9: 5， -GATTGGCCGAGAAGTACG- -3， (配列番号： 16)
MAD- -Rl: 5， -TGGTCGGCGAGTTGCTTG- -3， (配列番号: 17)
MAD- -R2: 5， -CAGGGACAGGACACTGAG- -3， (配列番号: 18)
MAD- -R3: 5， - GATGTCGACATGGCCCTG- -3， (配列番号: 19)
MAD- -R4: 5， -CCCAGTCGATCGCGTGAG- -3， (配列番号： 20)
MAD- -R5: 5， -TGGTCGTTCCGTGAAGGC- -3， (配列番号: 21)
MAD- -R6: 5， - CTCGAACGCCGCGAACGC -3， (配列番号： 22〕
MAD- -R7: 5， - CTGGGTGTGCGCGATGTC- -3， (配列番号： 23)
MAD- -R8: 5， -CACCATCATCGCCACCTG- -3， (配列番号： 24)
解析の結果同定された全塩基配列（配列番号： 3)を図 21〜22、及び図 25〜26に 示す。また、相同性検索及びモチーフ検索を用いたァノテーシヨンによってプロモー ター領域、コード領域 (配列番号: 4)、及びターミネータ一領域を明かにした（図 21 〜22)。プロモーター領域の配列を図 27に、コード領域の配列を図 28に、ターミネ 一ター領域の配列を図 29にそれぞれ示す。また、塩基配列から推定されたアミノ酸 配列を図 23 (シグナルペプチドを含まな!/ヽ、配列番号： 1)及び図 24 (シグナルぺプ チドを含む、配列番号: 2)に示す。
[0056] 8.放線菌用ベクター pIJ702の取得
プラスミド PIJ702を保有するストレプトマイセス ·リビダンス (Streptomyces lividans) 313KATCC 35287)を以下の培地条件で 30°C、 2日間培養した。
YEME培地 + 0.5%グリシン + 50 u g/mlチォストレプトン（和光純薬）
イースト.エキス 3g
ペプトン 5g
マルト.エキス 3g
塩化マグネシウム lg
グルコース lOg
サッカロース 340g
グリシン 5g
50mg/mlチォストレプトン溶液（ジメチルスルホキシド溶液） lmlZ L (pH7.0) [0057] 培養後の培地 200mlを遠心分離（12,000g、 4°C、 10分間）し、得られた菌体を
TE- Sucrose (50mM Tris- HCl(pH8.0)、 lOmM EDTA、 25% Sucrose) 10mlに懸濁した 。次に 30mg/mlのリゾチーム（シグマアルドリッチジャパン）を含む TE- Sucrose 2ml及 び 0.25mM EDTA溶液 4mlをカ卩え、これを 37°Cで 30分間インキュベートした。インキュ ベート後 20% SDS溶液 2mlを加え、さらに 5M NaCl溶液 5mlを加えて穏やかに攪拌し た後、 0°Cで 1晚インキュベートした。次に遠心分離（100,000g、 4°C、 40分間）により得 られた上清に 30%ポリエチレングリコール 6000 (和光純薬)溶液を終濃度 10%になる ように加え、 0°Cで 4.5時間インキュベートした。その後、遠心分離 (900g、 4°C、 5分間） し、沈殿を 50mM NaClを含む TE溶液に溶解した。そして塩ィ匕セシウム 16.8g及び lOmg/mlの濃度にェチジゥムブロマイドを TE溶液に溶カゝして調整した溶液 1.2mlを加 え、遠心分離 (l,300g、室温、 15分間）により残さを取り除いた後、再び遠心分離（ 230,000g、 20°C、 12時間）を行った。遠心後、紫外線照射下でプラスミド DNA層を得 た。次に TE溶液で飽和したブタノールによる抽出を行ってェチジゥムブロマイドを除 いた。この抽出を 3回繰り返して行った。得られたプラスミド DNA溶液は TEを透析外液 として 4°Cで 1晚の透析に供した。その後、 TE溶液飽和フエノールで 1回、クロ口ホルム 'イソアミルアルコールで 2回抽出処理を行った。次に、 1/10容量の 3M酢酸ナトリウム (PH5.2)溶液と 2倍容量のエタノールをカ卩え、 - 80°Cに 30分間静置した。その後、遠心 分離（12,000g、 4°C、 15分間）により沈殿を回収し、沈殿を 70%エタノールで洗浄し、 乾燥させた。これを TE溶液 200 1に溶かした。以上の操作によって最終的に得られ た DNA量は約 10 μ gであった。
[0058] 9.シャトルベクター pSVlの構築
まず、大腸菌用ベクター pUC19 (宝酒造)を制限酵素 Bam HIで消化した DNA断片と 、放線菌用ベクター PIJ702を Bel I (宝酒造)で消化して得られるチォストレプトン耐性 遺伝子（tsr)を含む DNA断片を用意し、これらを DNA Ligation Kit Ver.2 (宝酒造）を 用いて連結することにより pUCTSRを作製した。次に pUCTSRを Kpn I、 Cla I (宝酒造） で消化して得られる DNA断片 (長断片）と、 pIJ702を Kpn I、 Cla I (宝酒造)で消化して 得られる DNA断片（短断片）を用意し、これらを DNA Ligation Kit Ver.2 (宝酒造）を用 いて連結した後、大腸菌 DH5株 (東洋紡）に形質転換した。こうして得られた形質転 換体が持つ PUC19断片と pIJ702断片が連結したプラスミドをシャトルベクター pSVlと し、後の操作に用いた（図 15)。
[0059] 10.発現ベクター pSVSADの構築
AMPデァミナーゼ遺伝子を保持する pSADを制限酵素 Not I (宝酒造)で消化し当該 遺伝子断片を用意した。またシャトルベクター pSVlを制限酵素 Xba Iで消化しベクタ 一断片を用意した。両者を DNA Blunting Kit (宝酒造)を用いて末端を平滑ィ匕しそれ ぞれをインサート断片、ベクター断片とした。 pSVl由来ベクター断片は更に Alkaline Phosphatase (宝酒造）を用いて脱リン酸化処理を行った。インサートとベクターを DNA Ligation Kit Ver.2 (宝酒造)を用いて連結した後、大腸菌 DH5株 (東洋紡）に形質転 換した。こうして得られたプラスミドを発現ベクター pSVSADとし、形質転換に用いた（ 図 16)。
[0060] 11.ストレプトマイセス ·リビダンス (Streptomyces lividans) TK24プロトプラストの調製 ストレプトマイセス ·リビダンス (Streptomyces lividans) TK24はストレプトマイセス ·リビ ダンス（Streptomyces lividans) 66由来のストレプトマイシン而性を持つ株であり、 D. A. Hopwood (John Innes Institute^ Colney Lane、 Norwich NR4 7UH、 U. K.)力ら提 供されたものである。ストレプトマイセス 'リビダンス（Streptomyces lividans) TK24を YEME培地（0.5%グリシン）で 30°C、 2日間培養した。培養後の培地 200mlを遠心分離 (l,300g、室温、 10分間）し、得られた菌体を 0.35Mサッカロース溶液 72mlに懸濁した 。次に、この懸濁液を遠心分離（l,300g、室温、 10分間）し、菌体を lmg/mlのリゾチ一 ム（シグマアルドリッチジャパン）を含む P緩衝液 60mlに再懸濁し、これを 30°C、 2.5時 間インキュベートした。インキュベート後の懸濁液を脱脂綿でろ過して残さを取り除い た。次に得られたろ液を遠心分離（l,300g、室温、 10分間）し、沈渣を P緩衝液 25mlで 洗浄した。この洗浄を 2回繰り返した後、沈殿を P緩衝液 lmlに懸濁し、これをプロトプ ラスト懸濁液とした。
P緩衝液
TES[N-Tns(hydroxvmethl)methyl-2-aminoethane sulphonic acid] 5.73g サッカロース I03g
塩ィ匕マグネシウム 2.03g
硫酸カリウム 0.5g
塩化カルシクム 3.68g
Trace element solution 2ml/ L (pH7.4)
尚、 1%リン酸一カリウム溶液を別に調製し、これを使用直前に lOOmlP緩衝液当たり lmlカ卩えた。
irace element solution
塩化亜鉛 40mg
塩化第二鉄 200mg
塩化第二銅 10mg
塩化マンガン 10mg
四硼酸ナトリウム 10mg
モリブデン酸アンモ-ゥム lOmgZL
12.ストレプトマイセス 'リビダンス（Streptomyces lividans) TK24の开質転換
以下の各溶液を混合し、全量 121 μ 1とした。
AMPデアミナーゼ発現プラスミド pSVSAD(4 μ g)を含む ΤΕ溶液 1 μ 1 ストレプトマイセス 'リビダンス TK24プロトプラスト 100 μ 1
0.35Μサッカロース溶液 20 μ 1
次に、 20%ポリエチレングリコール 1000を含む Ρ緩衝液を 1.5ml力卩ぇピペッティングに より穏やかに混合し室温で 2分間静置した。この混合液を遠心分離（l,700g、室温、 10分間）し、沈殿^^めた。沈殿として得られたプロトプラストを P緩衝液で 2回繰り返 し洗浄した。ペレットを 0.3mlの P緩衝液に再懸濁した後に、 100 1ずつ R-2培地に滴 下した。次 、で 55°Cに保温した R-2トップァガロース培地をプレートあたり 3ml流し込 みプロトプラストをプレート全体に散布させた。プレートはトップァガロースが固化する まで 2時間クリーンベンチ内で乾燥させた。乾燥後 30°Cで 16時間培養した後、 200 g/mlチォストレプトンを含む R- 2トップァガロース培地 3mlを加え、プレートの表面を覆 い 2時間乾燥させた。更に 4日間プレートを 30°Cで培養しチォストレプトン耐性を獲得 した形質転換体 (SAD-1)を得た。
R-2培地は以下に示した R-2/A及び R-2/Bを別々に調製した後、組み合わせて作 製した。寒天を含む培地を R-2プレート、ァガロースを含む培地を R-2トツプアガロー ス培地とした。プレート培地作製時に R- 2/A、 R- 2/Bを混合し、更に 1% KH POを最
2 4 終容量 200mlあたり 1mlの割合で混合した。
R-2/A
硫酸カリウム 0.5g
塩ィ匕マグネシウム 20.2g
塩化カルシクム 5.9g
グルコース 20.0g
プロリン 6.0g
カザミノ酸 0.2g
Trace element solution 4.0ml
寒天 44.0gZLまたはァガロース 5.0gZL
R-2/B
TES 11.5g
イースト.エキス lO.Og サッカロース 203gZUpH7.4)
[0063] 13.形質転換体の培養
上記実施例の手順（<酵素液の調製方法 >の欄）に準じてソルピー NY 2%、ミース ト PIG 0.5%、 KH PO 0.1%
2 4 、 MgSO 0.05%、可溶性デンプン 3%を加えて pH5.7に調整
4
し、 121°Cで 30分間殺菌を行った。形質転換体 SAD-1と形質転換の宿主株ストレプト マイセス 'リビダンス（Streptomyces lividans) TK24を植菌し、 30°Cで前培養を 2日間、 本培養を 5日間行った。培養上清の一部を採取し、これを以下の AMPデァミナーゼ 活性測定用の試料とした。
[0064] 14. AMPデァミナーゼ活性測定
上記で得た試料の酵素活性を、実施例に示した方法（ <酵素活性測定方法 >の 欄）に従い測定した。 0.017Mの 5'AMP-2Naと 1/15Mリン酸塩緩衝液（pH5.6)を 1:2の 割合で混合した溶液 1.5mlに試料溶液 0.5mlを添加して反応液とし、 37°Cで 15分間反 応させた。 15分後に 2%過塩素酸溶液を添加して反応を停止させた後、 100 1を量りと つた。水をカ卩えて 5mlとして OD を測定した。反応時間を 0分として同様に測定したも
265
のをブランクとした。以下の条件下、 60分間に吸光度差が 0.001減少するときを 1単位 とした。測定結果を図 17に示す。尚、ストレプトマイセス 'リビダンス TK24を同様の条 件で培養した後の培養上清を対照 (コントロール)の試料とした。
図 17に示されるように、形質転換体 SAD-1の培養上清には高い AMPデアミナーゼ 活性が認められた。この結果から、 AMPデァミナーゼ遺伝子の取得に成功したことが 確認された。併せて、当該遺伝子を用いて AMPデァミナーゼ生産系を実際に構築で きることが示された。
[0065] 15.形質転換体 (SAD- 1)由来 AMPデァミナ一ゼの熱安定性
形質転換体 (SAD-1)が生産する AMPデァミナ一ゼの熱安定性を測定した。上記の 方法で調製した SAD-1の培養上清を所定の温度で処理した後、残存 AMPデァミナ ーゼ活性を測定した (pH 5.6)。尚、処理温度は、 30°C、 40°C、 50°C、 60°C、 65°C、 70 。C、及び 75°Cとした。また、処理時間は 30分間とした。
測定結果を図 18のグラフに示す。図 1に示したストレプトマイセス ·ミユリナス（ Streptomyces murinus)由来の AMPデァミナーゼと同様な熱安定性を示していること が分かる。
[0066] 16.形質転換体 (SAD- 1)由来 AMPデァミナ一ゼの基質特異性
上記の方法で得られた形質転換体 (SAD- 1)由来デァミナーゼが AMPデァミナーゼ (AMP— deaminase)及びアデノシンデアミナーゼ (Adenosine— deaminase)の 、ずれで あるのかを確認するため、その基質特異性を検討した。結果を図 19の表に示す。尚 、 5 'AMPに対する酵素活性を 100%とした場合の相対活性を表している。当該酵素は 5， AMPに対して最もよく作用した。また、 3，AMP、 5，dAMP、 ADP、 ATP、アデノシン（ Adenosine)及び 3，5 ' -cyclic AMPに対しても作用したが、 2，AMP、アデ-ン（adenine )に対しては全く作用しな力つた。特に、 5' dAMP、 ADP及び ATPに対して良好に作用 した。以上の結果から、形質転換体 (SAD-1)由来デァミナーゼがストレブトマイセス' ミユリナス（Streptomyces murinus)由来 AMPデァミナーゼと類似しており、 AMPデアミ ナーゼであることが確認された。また、 5' dAMP、 ADP及び ATPを基質とする反応につ いても当該酵素を好適に利用できることが判明した。
[0067] 17.形質転換体 (SAD-1)由来 AMPデァミナーゼの生産確認
SAD-1の培養上清を SDS-PAGE (CBB染色）に供し、当該酵素の形質転換体による 生産を確認した。 SDS-PAGEの結果を図 20に示す。レーン IIがコントロール（宿主菌 培養上清)である。レーン IIIが形質転換体 (SAD- 1)培養上清である。レーン ΙΠではレ ーン IIにないバンドが存在し、形質転換によって新規な酵素タンパクが生産されるよう になったことがわかる。レーン Iにはタンパク質分子量マーカーのバンドが示される。 高分子量側から順にフォスフオリラーゼ b(M.W. 97,000)、牛血清アルブミン (M.W. 66,000)、オボアルブミン (M.W. 45,000)、カルボニックアンヒドラーゼ (M.W. 30,000)、ト リプシンインヒビター (M.W. 20, 100)のバンドである。
[0068] 以上のように本発明者らはストレプトマイセス ·ミユリナス由来の AMPデァミナーゼを コードする遺伝子のクローユングに成功した。また、放線菌の形質転換系を用いて、 当該遺伝子が導入された形質転換体を取得することに成功し、当該遺伝子の発現を 確認した。これらの成果によって当該酵素を組換え体として生産することが可能とな つた。従って、安定供給が可能になることはもとより、遺伝子糸且換えによる当該酵素の 生産性の向上や酵素本体の改良等を行うことも可能となる。例えば、（1)高生産を示 すプロモーターの利用による生産性の向上、（2)生産性の高い菌株を宿主として利用 することによる高生産性形質転換体の作製及びそれを利用した高生産系の構築、 (3) 塩基配列 ·アミノ酸配列を改変することによる、生産性の向上、安定性の向上、及び/ 又は基質特異性の改良等を行うことができる。
産業上の利用可能性
[0069] 本発明の AMPデァミナ一ゼは熱安定性に優れる。従って、高温下での反応が望ま れる用途において好適に利用される。例えば、酵母エキスの製造における旨味増強 用の酵素として、或いは調味料の 5'—イノシン酸製造用の酵素として本発明の AMP デァミナーゼを利用することができる。
一方、 AMP以外の基質にも作用するという特性を活力ゝして、これら ADP, ΑΤΡ、 5' dAMP等の基質を出発材料とする各種の反応において、本発明の AMPデァミナ一 ゼを利用することも可能である。
[0070] この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものでは ない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々 の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その 全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims

請求の範囲 [1] 以下の性質を備える AMPデァミナーゼ： (1) 5'-アデニル酸 + H 0 → 5しイノシン酸 + NHの反応を触媒する； 2 3 (2) 65°C以下の温度で安定である（酢酸緩衝液 (pH5.6)中）； (3)分子量が 48,000 ±2,000(ゲルろ過による)、 60,000 ±3,000 (SDS-PAGEによる）で ある； (4)至適 pHが 5.6付近にある（マッキュルバイン（Mcllvaine)緩衝液中）； [2] 以下の性質を備える放線菌由来の AMPデァミナーゼ：
(1) 5'-アデニル酸 + H 0 → 5しイノシン酸 + NHの反応を触媒する；
2 3
(2) 65°C以下の温度で安定である（酢酸緩衝液 (pH5.6)中）。
[3] 前記放線菌が、ストレブトマイセス属に属する放線菌である、請求項 2に記載の AMPデァミナーゼ。
[4] 前記放線菌が、ストレプトマイセス ·ミユリナス（Streptomyces murinus)、ストレプトマ イセス 'セルロフラバス（Streptmyces celluloflavus)、及びストレプトマイセス'グリセウス (Streptmyces griseus)力 なる群より選択される放線菌である、請求項 2に記載の AMPデァミナーゼ。
[5] 請求項 1〜4のいずれかに記載の AMPデァミナーゼを作用させるステップ、を含ん でなる、酵母エキスの製造方法。
[6] 5 '—ヌクレオチドに請求項 1〜4のいずれかに記載の AMPデァミナーゼを作用させ
、該 5'—ヌクレオチドを脱アミド化してなる呈味物質の製造方法。
[7] ストレブトマイセス属に属する放線菌を栄養培地で培養し、培養液中に請求項 1記 載の AMPデァミナーゼを生成せしめ、これを採取することを特徴とする AMPデァミナ ーゼの製造方法。
[8] 前記放線菌が、ストレプトマイセス ·ミユリナス（Streptomyces murinus)、ストレプトマ イセス 'セルロフラバス（Streptmyces celluloflavus)、及びストレプトマイセス'グリセウス (Streptmyces griseus)からなる群より選択される放線菌である、請求項 7に記載の製 造方法。
[9] 以下の (a)又は (b)力 なる単離された AMPデァミナーゼ： (a)配列番号： 1のアミノ酸配列を有するタンパク質；
(b)配列番号： 1のアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列を有し、 AMPデァミナ ーゼとして機能するタンパク質。
[10] 請求項 9に記載の AMPデァミナーゼをコードする単離された核酸分子。
[11] 以下の (a)〜(c)のいずれかの塩基配列を有する、請求項 10に記載の単離された核 酸分子：
(a)配列番号： 3〜5の!、ずれかの塩基配列；
(b) (a)の塩基配列の一部が改変されてなる塩基配列であって、 AMPデァミナーゼと して機能するタンパク質をコードする塩基配列；
(c) (a)又は (b)の塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジ ントな条件下でノ、 イブリダィズする塩基配列であって、 AMPデァミナーゼとして機能するタンパク質をコ ードする塩基配列。
[12] 請求項 9〜： L 1のいずれかに記載の核酸分子を保持するベクター。
[13] 請求項 9〜11のいずれかに記載の核酸分子が導入されている形質転換体。
[14] 以下の (1)及び (2)のステップを含む、 AMPデァミナーゼの生産方法：
(1)請求項 13に記載の形質転換体を、前記核酸分子のコードするタンパク質を産生 可能な条件で培養するステップ；及び
(2)産生されたタンパク質を回収するステップ。
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