CN106282146B - 一种腺苷酸脱氨酶的固态发酵方法 - Google Patents

一种腺苷酸脱氨酶的固态发酵方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106282146B
CN106282146B CN201510307165.8A CN201510307165A CN106282146B CN 106282146 B CN106282146 B CN 106282146B CN 201510307165 A CN201510307165 A CN 201510307165A CN 106282146 B CN106282146 B CN 106282146B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solid state
state fermentation
seed
culture medium
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510307165.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106282146A (zh
Inventor
李汉文
俞学锋
李知洪
姚鹃
喻晨
吴尧
董先有
姚宏
余华顺
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Angel Yeast Co Ltd
Original Assignee
Angel Yeast Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Angel Yeast Co Ltd filed Critical Angel Yeast Co Ltd
Priority to CN201510307165.8A priority Critical patent/CN106282146B/zh
Publication of CN106282146A publication Critical patent/CN106282146A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106282146B publication Critical patent/CN106282146B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/04—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amidines (3.5.4)
    • C12Y305/04017—Adenosine-phosphate deaminase (3.5.4.17)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及微生物发酵酶制剂技术领域，具体涉及一种腺苷酸脱氨酶的固态发酵方法。该方法包括如下步骤：(1)菌种活化：取曲霉孢子悬液接入培养基培养；(2)种子制备：将孢子悬液按照1％～2.5％接种量接入种子摇瓶培养基中，得到种子菌液；(3)种子罐培养：按照0.1％～0.5％接种量，将种子菌液接入种子罐中，得到种子培养液，其中转速为50～150rpm，通风比1：0.3～1：1.2；(4)固态发酵生产：将种子培养液接入固态发酵培养基培养。利用本发酵方法，测得腺苷酸脱氨酶的活力高达1500～2100U/mL，酶活水平较高，解决了目前脱氨酶生产水平低，生产成本高的问题，具有大规模工业化的应用价值。

Description

一种腺苷酸脱氨酶的固态发酵方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵酶制剂技术领域，特别涉及一种腺苷酸脱氨酶的固态发酵方法。
背景技术
高I+G(5′-肌苷酸钠和5′-鸟核酸钠)酵母抽提物是在原酵母抽提物的基础上，强化了产品中呈味核苷酸物质含量的酵母抽提物，作为天然、营养的高端调味品可替代味精，具有增鲜、提味和降盐等作用，符合现代人的饮食消费习惯和营养需求趋势。酵母抽提物中I+G的含量直接影响着产品的风味品质和生产成本。在国内的研究中，酵母抽提物中I+G含量在10％左右，而国外有I+G 含量达到20％的酵母抽提物的专利报道。我单位通过增加对高蛋白高核酸酵母的热提取时间和pH的改进，在抽提物溶液中酵母RNA由原来的13％提高到25％以上，再通过酶解工艺改进可以直接生产出18％以上的I+G产品，再对该产品进行超滤，产品各项性能得到明显改善，产品各项指标达到欧美高端产品质量水平，属国内首创。
高I+G酵母抽提物的生产过程中，首先使用5′-核苷酸的磷酸二酯酶对单链DNA和RNA进行水解，生成腺苷酸(AMP)和鸟苷酸(GMP)，再由5′- 腺苷酸脱氨酶进行作用，将腺苷酸转化为肌苷酸(IMP)。在高I+G酵母抽提物制备过程中，5′-腺苷酸脱氨酶起着至关重要的作用，5′-腺苷酸脱氨酶的酶活力及作用性能直接影响肌苷酸生成及高I+G酵母抽提物的质量。因此，获得高催化活力、高性能的5′-腺苷酸脱氨酶是解决高I+G酵母抽提物生产的关键技术之一，具有重要的研究意义和市场价值。
5′-腺苷酸脱氨酶最早由鼠骨骼肌和人红血细胞制备，现代化工业生产中使用的酶大都使用酵母、青霉、曲霉及毛霉等微生物发酵法制备，其中使用最多的菌种是米曲霉和蜂蜜曲霉，近年日本也有用基因工程链霉菌进行生产的专利报道。采用液态发酵法生产脱氨酶，酶的活性不高，稳定性差。因此脱氨酶早期采用的是固态发酵法生产，但是采用该方法得到的固体酶的酶活往往偏低。目前，国际上只有日本天野酶株式会社拥有成熟的技术和产品，国内的广西科学院也有产品在试销，但产品的稳定性和应用效果还有待进一步验证。
目前，国内有关5′-腺苷酸脱氨酶的研究报道不多，并且主要仍集中在菌种选育和发酵条件优化方面。刘昌军等通过菌种筛选和发酵工艺优化，利用米曲霉固态发酵方式获得5′-腺苷酸脱氨酶的表达量为1543.48u/g鲜曲；普为民等从多株青霉及曲霉中筛选到一株腺苷酸脱氨酶蜂蜜曲霉产生菌，经紫外线及复合诱变处理及发酵工艺优化后，使原始菌种脱氨酶表达量提高了16倍，最终得到脱氨酶的表达量达到1300u/g；段作营等通过固态发酵方式获得米曲霉脱氨酶的表达量约1560u/g，并使用盐析沉淀方法对该酶进行了纯化并对酶学性质进行了初步研究。
高I+G酵母抽提物是在原酵母抽提物的基础上，强化了产品呈味核苷酸物质的酵母抽提物。该产品具有调味、营养和辅助医疗的作用，产品质量品质更高，可以满足人们对调味原料发展的需要。5′-腺苷酸脱氨酶可以专一地将腺苷酸(AMP)转变为肌苷酸(IMP)，在高I+G酵母抽提物的工业化生产中起着重要的作用；通过曲霉发酵是获取腺苷酸脱氨酶的主要途径，由于大多数菌种产酶活力低下，专一性不强，造成市场上腺苷酸脱氨酶供应紧缺，提高菌种腺苷酸脱氨酶的产酶活力是解决高I+G酵母抽提物生产的关键技术之一，具有重要的研究意义和市场价值。目前市场上以日本天野酶制剂公司的腺苷酸脱氨酶为主要生产商，国内生产腺苷酸脱氨酶的厂家较少，该产品市场开发潜力大。
发明内容
本发明解决的技术问题是现有的大多数菌种发酵产腺苷酸脱氨酶存在的活力低下，专一性不强，生产成本高的缺陷。
具体来说，针对现有技术的不足，本发明提供了如下的技术方案：
本发明提供了一种腺苷酸脱氨酶的固态发酵方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化：取曲霉孢子悬液接入培养基中培养，洗脱得到孢子悬液；
(2)种子制备：将孢子悬液按照1％～2.5％重量比的接种量接入种子摇瓶培养基中培养，得到种子菌液；
(3)种子罐培养：按照0.1％～0.5％重量比的接种量，将种子菌液接入装有种子培养基的种子罐中培养，得到种子培养液，其中转速为50～150rpm，通风比1：0.3～1：1.2；以及
(4)固态发酵生产：将种子培养液接入到固态发酵培养基中培养。
优选的，步骤(1)中所述培养基为PDA培养基。
优选的，步骤(1)中所述菌种置于28～29℃环境中培养2～4天。
优选的，步骤(2)中所述的孢子悬液置于28～29℃培养20～24小时。
优选的，步骤(3)中所述的种子罐培养是在29～31℃温度下，培养24～ 28小时。
优选的，步骤(4)中所述的固态发酵生产温度为26～30℃，发酵时间为 50～70小时。
优选的，对步骤(4)中固态发酵生产盘间品温进行控制，包括如下步骤：最高温超过35℃，最低温低于25℃时，进行上下倒盘，品温高的盘移至散热快的风口或移至底层，品温低的移至上层或远离风口。
优选的，将步骤(4)得到的含有腺苷酸脱氨酶的发酵料进行浸提处理，得到发酵液。
优选的，将发酵料加入到相当于发酵料20～30倍体积的浸提液中，搅拌1～ 2h，待固体发酵料充分打散后，再浸泡5～6h。
优选的，调节自来水pH至5.2～7，加入0.02～0.1％(w/v)EDTA2Na和 0.1～0.5％(w/v)焦亚硫酸钠得到所述的浸提液。
优选的，对得到的发酵液采用板框过滤得到粗酶过滤液。
优选的，对所述的粗酶过滤液进行超滤浓缩，浓缩倍数为10～20倍，得到浓缩液。
优选的，对所述的浓缩液通过冻干得到固体脱氨酶。
优选的，步骤(3)中所述的种子培养基，每1000mL水包括如下组分：蔗糖10～50g，黄豆粉1～7g，酵母粉1～3g和磷酸氢二钾0.5～1.5g，pH值为6～7.5。
优选的，步骤(4)中所述的固态发酵培养基，按重量份计，包括如下组分：麸皮100份、水90～150份、蔗糖1～4份、蛋白胨1～4份、硫酸铵0.1～0.8 份、硫酸镁0.1～0.8份、柠檬酸钠0.1～0.8份、吐温-800.1～0.8份，pH值为6～ 7.5。
其中，步骤(1)中所述菌株为米曲霉(Aspergillus oryzae)，商购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，也就是说商购自保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCAF200035的菌株。其保藏地址为武汉市珞珈山武汉大学，该菌株来源于武汉大学生科院教研室。该菌株的共享方式分为公益性共享，合作研究共享，资源交换性共享；其获取途径包括邮件，现场获取，网上订购。
其中，通风比用每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示。 (V/V.min)。
本发明的有益效果是：
本发明通过该生产方法，解决了目前脱氨酶发酵酶活低，生产成本高的问题，从而提高了产量，实现了工业化生产。
腺苷酸脱氨酶目前工业用量最大的为高I+G酵母抽提物行业，由于行业所限，使得与大宗酶(如糖化酶和淀粉酶等)相比，国内科研院所对腺苷酸脱氨酶的研究相对较少，仅有少量研究报道，致使腺苷酸脱氨酶的发展极为缓慢，尚无成熟的自主商业产品。目前国内高I+G酵母抽提物生产中使用的腺苷酸脱氨酶几乎全部为日本进口产品，这使得我国高I+G酵母抽提物生产中所使用的关键酶制剂为人所控，也使得我国高I+G酵母抽提物行业的发展为人所制。因此，从特种酶制剂和快速发展的高I+G酵母抽提物两种行业的久远发展来看，自主开发腺苷酸脱氨酶生产技术，均具有重要的现实和战略意义。
具体实施方式
本发明为了克服现有技术中采用曲霉发酵法生产脱氨酶的方法存在生产成本高、脱氨酶的酶活力低，因而产量低的缺陷，通过发酵法制备得到脱氨酶成品，可用于5′-腺苷酸水解脱氨生成次黄嘌呤核酸-5′-磷酸。
具体的，本发明提供了一种腺苷酸脱氨酶的固态发酵方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化：取曲霉孢子悬液接入培养基中培养，洗脱得到孢子悬液；
(2)种子制备：将孢子悬液按照1％～2.5％重量比的接种量接入种子摇瓶培养基中培养，得到种子菌液；
(3)种子罐培养：按照0.1％～0.5％重量比的接种量，将种子菌液接入装有种子培养基的种子罐中培养，得到种子培养液，其中转速为50～150rpm，通风比1：0.3～1：1.2；以及
(4)固态发酵生产：将种子培养液接入到固态发酵培养基中培养。
下面通过具体实施例来阐述本发明的实施过程和技术效果，本领域技术人员应当理解的是，这不应被理解为对本发明权利要求范围的限制，同时需要注意的是，本发明中提到的接种量均为重量比。
其中，实施例和对比例中所用到的菌株为米曲霉(Aspergillus oryzae)，商购于中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号为CCTCC AF200035。
其中，实施例中所用PDA培养基的配方为：每1000ml水中，含土豆(去皮) 200g，葡萄糖20g和琼脂20g，pH自然。
其中，本发明所用到的各种培养基以及各种容器均经过高压蒸汽灭菌处理。
实施例中所用的具体试剂和设备均是商购的。
其中试剂的具体来源列于下面的表1中：
表1实施例及对比例中用到的各试剂及厂商
试剂/设备 纯度 生产厂商
蔗糖 工业级 苏州华航化工科技有限公司
黄豆粉 工业级 兴化市联富食品有限公司
酵母粉 工业级 安琪酵母股份有限公司
磷酸氢二钾 工业级 苏州华航化工科技有限公司
麸皮 工业级 徐州市北斗星面业有限公司
蛋白胨 工业级 衡水中裕胶业有限公司
硫酸铵 工业级 苏州华航化工科技有限公司
硫酸镁 工业级 邹平县润梓化工有限公司
柠檬酸钠 工业级 苏州华航化工科技有限公司
吐温-80 工业级 济南腾博化工有限公司
设备生产厂商如下：
冻干设备，上海东富龙科技股份有限公司；
喷粉设备，常州市益民干燥设备有限公司；
高压蒸汽灭菌锅，重庆市科发实验仪器有限公司；
超滤浓缩设备，西安滨润环保科技有限公司；
混料机，东莞市配角机械设备有限公司。
腺苷酸脱氨酶酶活测定方法如下：
1)移取3mL腺苷酸脱氨酶底物(3.475×10-2g/L)在37℃温度下保温5min，加入稀释后的AMP脱氨酶溶液0.1mL，立刻计时反应，反应15min后加入3mL 10％的高氯酸溶液终止反应。
2)对照样品处理方法同上，反应底物保温后用冰水预冷，加入3mL10％的高氯酸溶液终止反应，再加入0.1mL的样品。反应结束后，在265nm处，用石英比色皿，以水为参比测量吸光度。
酶活定义：在上述条件下每分钟吸光值改变0.001，定义为酶的活力单位。
液体酶活(U/mL)＝(△A265×10×K)/(0.001×T)
式中：△A265为空白对照与反应液吸光度的差值；K为酶液稀释倍数；T 为酶的反应时间(min)。
实施例1
1.菌种活化：取米曲霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境下接入到100gPDA培养基中，置于28℃环境中培养4天，并用50ml 无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照1％接种量接入3L种子摇瓶培养基中，置于28℃培养24小时得到种子菌液，其中种子摇瓶培养基的配方同步骤3中种子培养基的配方。
3.种子罐培养：按照0.1％的接种量，将种子菌液接入到装有300L种子培养基的种子罐(储存量为0.5吨)中培养，得到种子培养液，其中培养温度 29℃，转速50rpm，通风比1：0.3，培养周期28小时。其中种子培养基中各组分浓度如下：蔗糖10g/L，黄豆粉7g/L，酵母粉1g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，pH6，其余组分为水。
4.固态发酵生产：由接种管线将种子培养液接入到1.5吨固体发酵培养基中，搅拌均匀，在26℃条件下培养70小时结束。其中固体发酵培养基中各组分的重量配比如下：麸皮100份、水90份、蔗糖1份、蛋白胨1份、硫酸铵 0.1份、硫酸镁0.1份、柠檬酸钠0.1份、吐温-800.1份，pH值为6。将固体发酵培养基按照配方配制完成后，在混料机中进行拌料，拌料完成后在121℃条件下进行高压蒸汽灭菌50min。发酵期间控制品温：当盘间品温出现温差，最高温超过35℃，最低温低于25℃时，及时进行上下倒盘，品温高的盘移至散热快的风口，品温低的远离风口。
5.浸提：用柠檬酸调节自来水pH至5.2，加入0.02％(w/v)EDTA2Na和0.1％(w/v)焦亚硫酸钠并溶解充分得到浸提液。将发酵料投入到含有20 倍浸提液的浸提罐中，搅拌1h，待固体发酵料充分打散，再浸泡5h。取含有腺苷酸脱氨酶的浸提液适量，测定酶活力。
6.板框处理：采用板框过滤除去菌体和固体发酵渣。
7.超滤浓缩：将粗酶过滤液通过超滤浓缩设备进行浓缩，浓缩倍数控制在20倍。
8.冻干处理：利用冻干设备冷冻干燥处理得到固体脱氨酶。
实验测得浸提液中腺苷酸脱氨酶的酶活水平为1582U/mL。
实施例2
1.菌种活化：取米曲霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境下接入到100gPDA培养基中，置于29℃环境中培养2天，并用50ml 无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：该孢子悬液按照2.5％接种量接入到7.5L种子摇瓶培养基中，置于29℃培养20小时得到种子菌液，其中种子摇瓶培养基的配方同步骤3中种子培养基的配方。
3.种子罐培养：按照0.5％的接种量，将种子菌液接入到装有300L种子培养基的种子罐(储存量为0.5吨)中培养得到种子培养液，培养温度31℃，转速150rpm，通风比1：1.2，培养周期24小时。其中种子培养基各组分浓度如下：蔗糖50g/L，黄豆粉1g/L，酵母粉3g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，pH7.5，其余组分为水。
4.固态发酵生产：由接种管线将种子培养液接入到1.5吨固体发酵培养基中，搅拌均匀，在30℃条件下，发酵50小时结束。其中固体发酵培养基中各组分的重量配比如下：麸皮100份、水150份、蔗糖4份、蛋白胨4份、硫酸铵0.8份、硫酸镁0.8份、柠檬酸钠0.8份、吐温-800.8份，pH值为7.5。将固体发酵培养基按照配方配制完成后，在混料机中进行拌料，拌料完成后在 121℃条件下进行高压蒸汽灭菌50min。发酵期间控制品温：当盘间品温出现温差，最高温超过35℃，最低温低于25℃时，及时进行上下倒盘，品温高的盘移至散热快的底层，品温低的移至上层。
5.浸提：用柠檬酸调节自来水pH至7，加入0.1％(w/v)EDTA2Na和 0.5％(w/v)焦亚硫酸钠并溶解充分得到浸提液。将发酵料投入到含有30倍浸提液的浸提罐中，搅拌2h，待固体发酵料充分打散，再浸泡6h。取含有腺苷酸脱氨酶的浸提液适量，测定酶活力。
6.板框处理：采用板框过滤除去菌体和固体发酵渣。
7.超滤浓缩：将粗酶过滤液通过超滤浓缩设备进行浓缩，浓缩倍数控制在10倍。
8.喷粉处理：利用喷粉设备处理得到固体脱氨酶。
实验测得浸提液中腺苷酸脱氨酶的酶活水平为1620U/mL。
实施例3
1.菌种活化：取米曲霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境下接入100gPDA培养基中，置于28℃环境中培养3天，并用50ml 的无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照2％接种量接入到6L种子摇瓶培养基中，置于28℃培养22小时得到种子菌液，其中种子摇瓶培养基的配方同步骤3中种子培养基的配方。
3.种子罐培养：按照0.3％的接种量，将种子菌液接入到装有300L种子培养基的种子罐(储存量为0.5吨)中培养得到种子培养液，培养温度30℃，转速100rpm，通风比1：1，培养周期26小时。其中种子培养基中各组分的浓度如下：蔗糖30g/L，黄豆粉4g/L，酵母粉2g/L，磷酸氢二钾1g/L，pH7，其余组分为水。
4.固态发酵生产：由接种管线将种子培养液接入到1.5吨固体发酵培养基中，搅拌均匀，在28℃条件下，发酵培养60小时结束。其中固体发酵培养基中各组分的重量配比如下：麸皮100份、水120份、蔗糖2.5份、蛋白胨2.5 份、硫酸铵0.5份、硫酸镁0.5份、柠檬酸钠0.5份、吐温-800.5份，pH值为 7。将固体发酵培养基按照配方配制完成后，在混料机中进行拌料，拌料完成后在121℃条件下进行高压蒸汽灭菌50min。发酵期间控制品温：当盘间品温出现温差，最高温超过35℃，最低温低于25℃时，及时进行上下倒盘，品温高的盘移至散热快的风口，品温低的远离风口。
5.浸提：用柠檬酸调节自来水pH至6，加入0.05％(w/v)EDTA- 2Na和 0.3％(w/v)焦亚硫酸钠并溶解充分得到浸提液。将发酵料投入到含有25倍浸提液的浸提罐中，搅拌1.5h，待固体发酵料充分打散，再浸泡5.5h。取含有腺苷酸脱氨酶的浸提液适量，测定酶活力。
6.板框处理：采用板框过滤除去菌体和固体发酵渣。
7.超滤浓缩：将粗酶过滤液通过超滤浓缩设备进行浓缩，浓缩倍数控制在15倍。
8.冻干处理：利用冻干设备进行冷冻干燥处理得到固体脱氨酶。
实验测得浸提液中腺苷酸脱氨酶的酶活水平为2021U/mL。
对比例1
1.菌种活化：取米曲霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境下接入100gPDA培养基中，置于28℃环境中培养3天，并用50ml 无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照0.5％接种量接入到1.5L种子摇瓶培养基中，置于28℃培养30小时得到种子菌液，其中种子摇瓶培养基的配方同实施例3。
3.种子罐培养：按照0.3％的接种量，将种子菌液接入到装有300L种子培养基的种子罐(储存量为0.5吨)中培养得到种子培养液，培养温度30℃，转速100rpm，通风比1：1，培养周期26小时。其中种子培养基的配方同实施例3。
4.固态发酵生产：由接种管线将种子培养液接入1.5吨固体发酵培养基中，搅拌均匀，在28℃条件下，发酵60小时结束。其中固体发酵培养基的配方和配制以及品温控制的操作和实施例3相同。
其他步骤和实施例3中的步骤5-8相同。
实验测得浸提液中腺苷酸脱氨酶的酶活水平为1300U/mL。
对比例2
1.菌种活化：取米曲霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境下接入到100gPDA培养基中，置于28℃环境中培养3天，并用50ml 无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照3％接种量接入9L种子摇瓶培养基中，置于28℃培养15小时得到种子菌液，其中种子摇瓶培养基的配方同实施例3。
3.种子罐培养：按照0.3％的接种量，将种子菌液接入到装有300L种子培养基的种子罐(储存量为0.5吨)中培养得到种子培养液，培养温度30℃，转速100rpm，通风比1：1，培养周期26小时。其中种子培养基的配方同实施例3。
4.固态发酵生产：由接种管线将种子培养液接入1.5吨固体发酵培养基中，搅拌均匀，在28℃条件下，发酵60小时结束。其中固体发酵培养基的配方和配制以及品温控制的操作和实施例3相同。
其他步骤和实施例3中的步骤5-8相同。
实验测得浸提液中腺苷酸脱氨酶的酶活水平为1329U/mL。
对比例3
1.菌种活化：取米曲霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境下接入到100gPDA培养基中，置于28℃环境中培养3天，并用50ml 无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照2％接种量接入到6L种子摇瓶培养基中，置于28℃培养22小时得到种子菌液，其中种子摇瓶培养基的配方同实施例3。
3.种子罐培养：按照0.05％的接种量，将种子菌液接入到装有300L种子培养基的种子罐(储存量为0.5吨)中培养得到种子培养液，培养温度30℃，转速25rpm，通风比1：0.2，培养周期35小时。其中种子培养基的配方同实施例3。
4.固态发酵生产：由接种管线将种子培养液接入到1.5吨固体发酵培养基中，搅拌均匀，在28℃条件下，发酵80小时结束。其中固体发酵培养基的配方和配制以及品温控制的操作和实施例3相同。
其他步骤和实施例3中的步骤5-8相同。
实验测得浸提液中腺苷酸脱氨酶(鲜曲)的酶活水平为1382U/mL。
对比例4
1.菌种活化：取米曲霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境下接入到100gPDA培养基中，置于28℃环境中培养3天，并用50ml 无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照2％接种量接入到6L种子摇瓶培养基中，置于28℃培养22小时得到种子菌液，其中种子摇瓶培养基的配方同实施例3。
3.种子罐培养：按照0.7％的接种量，将种子菌液接入到装有300L种子培养基的种子罐(储存量为0.5吨)中培养得到种子培养液，培养温度30℃，转速200rpm，通风比1：1.5，培养周期18小时。其中种子培养基的配方同实施例3。
4.固态发酵生产：由接种管线将种子培养液接入1.5吨固体发酵培养基中，搅拌均匀，在28℃条件下，发酵40小时结束。其中固体发酵培养基的配方和配制以及品温控制的操作和实施例3相同。
其他步骤和实施例3中的步骤5-8相同。
实验测得浸提液中腺苷酸脱氨酶的酶活水平为1473U/mL。
对比例5
1.菌种活化：取米曲霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境下接入到100gPDA培养基中，置于25℃环境中培养4天，并用50ml 无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照2％接种量接入6L种子摇瓶培养基中，置于25℃温度下培养30小时得到种子菌液，其中种子摇瓶培养基的配方同实施例3。
3.种子罐培养：按照0.3％的接种量，将种子菌液接入到装有300L种子培养基的种子罐(储存量为0.5吨)中培养，得到种子培养液，培养温度25℃，转速100rpm，通风比1：1，培养周期35小时。其中种子培养基的配方同实施例3。
4.固态发酵生产：由接种管线将种子培养液接入1.5吨固体发酵培养基中，搅拌均匀，在25℃条件下，发酵80小时结束。其中固体发酵培养基的配方和配制以及品温控制的操作和实施例3相同。
其他步骤和实施例3中的步骤5-8相同。
实验测得浸提液中腺苷酸脱氨酶的酶活水平为1223U/mL。
各实施例与各对比例的酶活测定结果表明，该米曲霉菌株通过该生产方法，所产的腺苷酸脱氨酶的酶活水平较高，酶活力达到1500～2100U/mL，具有大规模工业化的应用价值。

Claims (18)

1.一种腺苷酸脱氨酶的固态发酵方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化：取保藏编号为CCTCCAF200035的米曲霉(Aspergillus oryzae)孢子悬液接入培养基中培养，洗脱得到孢子悬液；
(2)种子制备：将孢子悬液按照2％重量比的接种量接入种子摇瓶培养基中培养，得到种子菌液，所述的孢子悬液置于28℃培养22小时；
(3)种子罐培养：按照0.3％重量比的接种量，将种子菌液接入装有种子培养基的种子罐中培养，得到种子培养液，其中转速为100rpm，通风比1：1，所述的种子罐培养是在30℃温度下，培养26小时；以及
(4)固态发酵生产：将种子培养液接入到固态发酵培养基中培养，所述的固态发酵生产温度为28℃，发酵时间为60小时。
2.根据权利要求1所述的固态发酵方法，其特征在于，步骤(1)中所述菌种置于28～29℃环境中培养2～4天。
3.根据权利要求1-2任一所述的固态发酵方法，其特征在于，对步骤(4)中固态发酵生产盘间品温进行控制，包括如下步骤：最高温超过35℃，最低温低于25℃时，进行上下倒盘，品温高的盘移至散热快的风口或移至底层，品温低的移至上层或远离风口。
4.根据权利要求1-2任一所述的固态发酵方法，其特征在于，将步骤(4)得到的含有腺苷酸脱氨酶的发酵料进行浸提处理，得到发酵液。
5.根据权利要求3所述的固态发酵方法，其特征在于，将步骤(4)得到的含有腺苷酸脱氨酶的发酵料进行浸提处理，得到发酵液。
6.根据权利要求4所述的固态发酵方法，其特征在于，将发酵料加入到相当于发酵料20～30倍体积的浸提液中，搅拌1～2h，待固体发酵料充分打散后，再浸泡5～6h。
7.根据权利要求6所述的固态发酵方法，其特征在于，调节自来水pH至5.2～7，加入0.02～0.1％(w/v)EDTA- 2Na和0.1～0.5％(w/v)焦亚硫酸钠得到所述的浸提液。
8.根据权利要求1-2任一所述的固态发酵方法，其特征在于，步骤(3) 中所述的种子培养基，每1000mL水包括如下组分：蔗糖10～50g，黄豆粉1～7g，酵母粉1～3g和磷酸氢二钾0.5～1.5g，pH值为6～7.5。
9.根据权利要求3所述的固态发酵方法，其特征在于，步骤(3)中所述的种子培养基，每1000mL水包括如下组分：蔗糖10～50g，黄豆粉1～7g，酵母粉1～3g和磷酸氢二钾0.5～1.5g，pH值为6～7.5。
10.根据权利要求4所述的固态发酵方法，其特征在于，步骤(3)中所述的种子培养基，每1000mL水包括如下组分：蔗糖10～50g，黄豆粉1～7g，酵母粉1～3g和磷酸氢二钾0.5～1.5g，pH值为6～7.5。
11.根据权利要求6所述的固态发酵方法，其特征在于，步骤(3)中所述的种子培养基，每1000mL水包括如下组分：蔗糖10～50g，黄豆粉1～7g，酵母粉1～3g和磷酸氢二钾0.5～1.5g，pH值为6～7.5。
12.根据权利要求7所述的固态发酵方法，其特征在于，步骤(3)中所述的种子培养基，每1000mL水包括如下组分：蔗糖10～50g，黄豆粉1～7g，酵母粉1～3g和磷酸氢二钾0.5～1.5g，pH值为6～7.5。
13.根据权利要求1-2任一所述的固态发酵方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的固态发酵培养基，按重量份计，包括如下组分：麸皮100份、水90～150份、蔗糖1～4份、蛋白胨1～4份、硫酸铵0.1～0.8份、硫酸镁0.1～0.8份、柠檬酸钠0.1～0.8份和吐温-800.1～0.8份，pH值为6～7.5。
14.根据权利要求3所述的固态发酵方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的固态发酵培养基，按重量份计，包括如下组分：麸皮100份、水90～150份、蔗糖1～4份、蛋白胨1～4份、硫酸铵0.1～0.8份、硫酸镁0.1～0.8份、柠檬酸钠0.1～0.8份和吐温-800.1～0.8份，pH值为6～7.5。
15.根据权利要求4所述的固态发酵方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的固态发酵培养基，按重量份计，包括如下组分：麸皮100份、水90～150份、蔗糖1～4份、蛋白胨1～4份、硫酸铵0.1～0.8份、硫酸镁0.1～0.8份、柠檬酸钠0.1～0.8份和吐温-800.1～0.8份，pH值为6～7.5。
16.根据权利要求6所述的固态发酵方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的固态发酵培养基，按重量份计，包括如下组分：麸皮100份、水90～150份、蔗糖1～4份、蛋白胨1～4份、硫酸铵0.1～0.8份、硫酸镁0.1～0.8份、柠檬酸钠0.1～0.8份和吐温-800.1～0.8份，pH值为6～7.5。
17.根据权利要求7所述的固态发酵方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的固态发酵培养基，按重量份计，包括如下组分：麸皮100份、水90～150份、蔗糖1～4份、蛋白胨1～4份、硫酸铵0.1～0.8份、硫酸镁0.1～0.8份、柠檬酸钠0.1～0.8份和吐温-800.1～0.8份，pH值为6～7.5。
18.根据权利要求8所述的固态发酵方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的固态发酵培养基，按重量份计，包括如下组分：麸皮100份、水90～150份、蔗糖1～4份、蛋白胨1～4份、硫酸铵0.1～0.8份、硫酸镁0.1～0.8份、柠檬酸钠0.1～0.8份和吐温-800.1～0.8份，pH值为6～7.5。
CN201510307165.8A 2015-06-05 2015-06-05 一种腺苷酸脱氨酶的固态发酵方法 Active CN106282146B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510307165.8A CN106282146B (zh) 2015-06-05 2015-06-05 一种腺苷酸脱氨酶的固态发酵方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510307165.8A CN106282146B (zh) 2015-06-05 2015-06-05 一种腺苷酸脱氨酶的固态发酵方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106282146A CN106282146A (zh) 2017-01-04
CN106282146B true CN106282146B (zh) 2019-08-27

Family

ID=57659519

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510307165.8A Active CN106282146B (zh) 2015-06-05 2015-06-05 一种腺苷酸脱氨酶的固态发酵方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106282146B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116731874B (zh) * 2023-05-29 2023-12-05 天典(广东)生物科技有限公司 一株蜂蜜曲霉adm01及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5022115B1 (zh) * 1963-11-11 1975-07-28
US4303680A (en) * 1979-01-05 1981-12-01 Ajinomoto Company, Incorporated Production of yeast extract containing flavoring
JP2006025688A (ja) * 2004-07-15 2006-02-02 Amano Enzyme Inc 新規な耐熱性ａｍｐデアミナーゼ及びその製造法
CN1950501A (zh) * 2004-04-28 2007-04-18 天野酶株式会社 放线菌来源的amp脱氨酶及其应用
CN101289646A (zh) * 2007-04-19 2008-10-22 北京迈迪卡科技有限公司 嘌呤核苷磷酸化酶、腺苷脱氨酶、5’核苷酸酶的联合生产工艺
CN101557724A (zh) * 2006-09-12 2009-10-14 乐斯福公司 由植物制备新型磷酸二酯酶

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5022115B1 (zh) * 1963-11-11 1975-07-28
US4303680A (en) * 1979-01-05 1981-12-01 Ajinomoto Company, Incorporated Production of yeast extract containing flavoring
CN1950501A (zh) * 2004-04-28 2007-04-18 天野酶株式会社 放线菌来源的amp脱氨酶及其应用
JP2006025688A (ja) * 2004-07-15 2006-02-02 Amano Enzyme Inc 新規な耐熱性ａｍｐデアミナーゼ及びその製造法
CN101557724A (zh) * 2006-09-12 2009-10-14 乐斯福公司 由植物制备新型磷酸二酯酶
CN101289646A (zh) * 2007-04-19 2008-10-22 北京迈迪卡科技有限公司 嘌呤核苷磷酸化酶、腺苷脱氨酶、5’核苷酸酶的联合生产工艺

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《响应面法优化米曲霉产AMP脱氨酶的培养基》;叶炜等;《食品科技》;20121231;参见公知证据1第104-105页 *
《固态发酵生产腺苷酸脱氨酶》;刘军昌等;《工业微生物》;20020331;参见对比文件1摘要、第36页右栏 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106282146A (zh) 2017-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103911322B (zh) 环状芽孢杆菌及其在共生发酵技术制低聚半乳糖中的应用
CN106754411B (zh) 一株高产β-D-呋喃果糖苷酶的黑曲霉菌株及其液态发酵产酶方法
CN107488640A (zh) 一种耐氧化低温葡萄糖氧化酶及其生产方法与应用
CN100532536C (zh) 一株高产核酸酶p1的桔青霉菌及其选育方法
CN107488600A (zh) 一株高产耐氧化低温葡萄糖氧化酶的黑曲霉
CN106282145B (zh) 一种腺苷酸脱氨酶的液态发酵方法
CN103937691B (zh) 一株产β‑果糖苷酶的米曲霉菌株及其培养方法与应用
CN102766663B (zh) 桑黄活性多糖的制备方法
CN102399702B (zh) 一种黑曲霉及其应用及发酵制备柠檬酸的方法
CN104059857B (zh) 一株曲霉及其在制备果糖基转移酶中的应用
CN102127515B (zh) 一株高产l-脯氨酸短波单胞杆菌(jnpp-1)的筛选及应用
CN110218713A (zh) 一种提高桔青霉产核酸酶p1酶活的方法
CN105349461A (zh) 一株产琼胶酶溶藻弧菌及应用
CN106282146B (zh) 一种腺苷酸脱氨酶的固态发酵方法
CN108642041A (zh) 一种提高重组大肠杆菌发酵生产l-丙氨酸能力的方法
CN105483171B (zh) 一种提高辅酶q10工业产量的生产方法
CN104277989A (zh) 一株面包酵母及其在发酵生产辅酶i中的应用
CN107488591A (zh) 一种高酶活、高耐盐的酱油菌株的选育方法及其应用方法
CN113604390B (zh) 一株谷氨酸棒杆菌及其在发酵生产l-鸟氨酸中的应用
CN104774794A (zh) 一株产d-甘露糖异构酶的菌株及用其生产d-甘露糖的方法
CN105695349B (zh) 一种磷饥饿培养提高酵母细胞胞内海藻糖的方法
CN106754829A (zh) 一种利用芽孢杆菌hs17发酵生产壳聚糖酶的方法及其应用
CN105154360B (zh) 一种睾丸酮丛毛单胞菌hy-08d的培养方法
CN108658698A (zh) 一种新型微生物复合肥的制备方法
CN107988085B (zh) 一种高产酸性果胶酶的棘孢曲霉菌株及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant