CN108642041A - 一种提高重组大肠杆菌发酵生产l-丙氨酸能力的方法 - Google Patents

一种提高重组大肠杆菌发酵生产l-丙氨酸能力的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高重组大肠杆菌发酵生产L‑丙氨酸能力的方法。本发明提供了一种制备产L‑丙氨酸的目的菌的方法，包括如下步骤：1)将大肠杆菌E.coli XZ‑A45经过氮离子注入诱变，得到诱变筛选目的菌株；2)再将所述诱变筛选目的菌株在含有浓度递增的葡萄糖和浓度递增的L‑丙氨酸的发酵培养基中进行连续传代培养，得到目的菌。本发明将L‑丙氨酸重组工程菌XZ‑A45先经过低能离子注入诱变，筛选获得产量高、遗传性状稳定的突变菌株，再经过进化工程育种技术驯化选育，最后获得高产L‑丙氨酸的工业微生物菌种。

Description

一种提高重组大肠杆菌发酵生产L-丙氨酸能力的方法
技术领域
本发明涉及微生物的选育方法，具体涉及一种提高重组大肠杆菌发酵生产L-丙氨酸能力的方法。
背景技术
L-丙氨酸(L-Alanine)，又名L-α-丙氨酸，是人体所需的20种氨基酸之一，在生物体内由甘氨酸的氨基转移至丙酮酸而成。丙氨酸是血中氮的优良运输工具，又是一种有效生糖氨基酸，具有重要的生理功能。L-丙氨酸是一种白色结晶粉末，有特殊甜味，易溶于水，在食品及医药工业领域具有广泛的用途。L-丙氨酸可以提高食品的营养价值，改善有机酸的酸味，用作氨基酸类营养药，同时L-丙氨酸也是制造维生素B6、合成氨基丙醇和其他有机化合物的重要原料。
近些年来，已经有多个报道称，利用基因工程手段在E.coli中实现了L-丙氨酸的合成。Smith等将来源于Bacillus sphaericus的alaD基因克隆于质粒载体上，并在E.coliALS929菌株中表达，该菌株经过48小时发酵后，能够生产88g/L的L-丙氨酸。周哲敏等将来源于Geobacillus stearothermophilus的alaD基因克隆于质粒载体上，在E.coli B100菌株中表达，在5L发酵罐中发酵26小时，可产生106g/L的L-丙氨酸。
在大规模生产过程中需要工业微生物菌种具有能抗多重压力的特性。但具有像多重压力抗性这一类复杂性状的工程菌株，很难通过以基因工程为基础的方法来直接获得，而进化工程育种技术在提高微生物的环境耐受性方面具有独到的优势。近年来，离子束作为一种新的诱变源，在微生物诱变育种方面因其独特的诱变机理和生物学效应而发展迅速。与传统诱变技术相比，低能离子注入诱变具有突变率较高，突变谱广，死亡率低，正突变率高，性状稳定等特点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备产L-丙氨酸的目的菌的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)将大肠杆菌E.coli XZ-A45经过氮离子注入诱变，得到诱变筛选目的菌株；
2)再将所述诱变筛选目的菌株在含有浓度递增的葡萄糖和浓度递增的L-丙氨酸的发酵培养基中进行连续传代培养，得到目的菌。
上述方法中，所述氮离子注入诱变包括如下步骤：
1)-1、将所述大肠杆菌E.coli XZ-A45进行氮离子注入诱变，收集诱变后菌株；
1)-2、将所述诱变后菌株进行发酵培养，检测发酵产物中L-丙氨酸含量，选取产生L-丙氨酸的量高于所述大肠杆菌E.coli XZ-A45的10％以上的菌株作为初筛后的诱变菌种；
1)-3、将所述初筛后的诱变菌种进行再次发酵培养，检测发酵产物中L-丙氨酸含量，选取所有菌种中L-丙氨酸含量从高到低前五位的菌株，作为复筛后的诱变菌种。
上述方法中，所述氮离子注入诱变的氮离子注入条件为：注入能量为10-40keV，注入剂量为10-50×1014ions/cm2；
所述发酵培养采用的培养基为将如下各个物质按照各自浓度溶解在水中得到的培养基：葡萄糖80-170g/L，L-丙氨酸10-30g/L，酵母膏5-10g/L，氯化氨2-10g/L，磷酸氢二钠6-30g/L，磷酸二氢钠2-10g/L，硫酸镁0.5-2g/L，硫酸铵5-20g/L，氯化钙0.05-0.3g/L，微量金属盐母液1-5ml/L。
上述方法中，所述连续传代培养为在含有不同浓度的葡萄糖和不同浓度的L-丙氨酸的发酵培养基中进行多阶段连续传代培养，至含量稳定不变；
每一阶段连续传代培养采用的发酵培养基与上一阶段连续传代培养采用的发酵培养基相比，葡萄糖和L-丙氨酸等量增加，其余组分不变；
所述连续传代培养的条件为35-39℃，摇床转速为150-200rpm，培养时间24-48h；
每一阶段连续传代培养为传代40代；
每进行一次转接培养定义为一代；
上述方法中，所述多阶段连续传代培养依次为如下：
第一阶段在含有150g/L葡萄糖和10g/L的L-丙氨酸的发酵培养基中连续转接40代；
第二阶段在含有160g/L葡萄糖和20g/L的L-丙氨酸的发酵培养基中连续转接40代，
第三阶段在含有170g/L葡萄糖和30g/L的L-丙氨酸的发酵培养基中连续转接40代。
由上述方法制备的目的菌也是本发明保护的范围。
上述目的菌保藏号为CGMCC No.15610的大肠埃希氏菌。
上述目的菌在生产L-丙氨酸或提高L-丙氨酸产量中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供一种生产L-丙氨酸的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述目的菌，得到L-丙氨酸。
所述发酵采用的条件为转速60-100rpm，通气比0.1-1vvm，发酵体系的PH值为6.5-7.5；发酵时间为40-48h。
本发明将L-丙氨酸重组工程菌XZ-A45先经过低能离子注入诱变，筛选获得产量高、遗传性状稳定的突变菌株，再经过进化工程育种技术驯化选育，最后获得高产L-丙氨酸的工业微生物菌种。本发明利用低能离子注入诱变和进化工程育种技术相结合对L-丙氨酸重组工程菌进行选育，可选育出适应于工业化生产的发酵法L-丙氨酸高产菌株。与其他传统的育种方法相比，本发明的优点体现在如下几点：
1、由于离子束注入诱变是一种集物理和化学诱变特征于一体的综合诱变，具有对生物细胞损伤小的特点，因此采用该方法诱变的菌株正突变率高，诱变效果好，高产性状稳定，不易丢失，经过10代以上转接，产量仍能保持筛选后的水平。
2、与传统基因工程改造相比较，进化工程育种技术在提高微生物环境耐受性方面具有独到的优势，可以提高对原料和产物的耐受性。
3、采用本发明选育的发酵法L-丙氨酸高产菌株，经过100m3发酵罐放大试验，产能仍能保持较高水平，发酵40h时L-丙氨酸产量在162～166g/L，与在摇瓶中的发酵性能提高水平基本一致。
保藏说明
建议分类命名：大肠埃希氏菌
拉丁名：Escherichia coli
参据的生物材料：XZ-A45-F1
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2018年4月12日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15610
附图说明
图1为进化工程育种第一阶段菌种发酵产L-丙氨酸含量变化图。
图2为进化工程育种第二阶段菌种发酵产L-丙氨酸含量变化图。
图3为进化工程育种第三阶段菌种发酵产L-丙氨酸含量变化图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、高产L-丙氨酸的突变株的获得和保藏
本实施例中：
LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，其余为自来水，pH6.8-7.2，121℃灭菌30min。
发酵培养基配方：葡萄糖80g/L，酵母膏5g/L，氯化氨2g/L，磷酸氢二钠6g/L，磷酸二氢钠2g/L，硫酸镁1g/L，硫酸铵10g/L，氯化钙0.05g/L，微量金属盐母液1ml/L，自来水配制，121℃灭菌20min。
微量金属盐母液组成：氯化铁2.5mg/L，氯化锰0.8mg/L，氯化钴0.5mg/L，钼酸钠0.5mg/L，氯化铜0.5mg/L，氯化锌0.5mg/L，自来水配制。
重组大肠杆菌E.coli XZ-A45记载在如下授权专利中：张学礼.产L-丙氨酸且耐受自来水的菌株及构建方法[P].ZL201410140656.3；E.coli XZ-A45作为出发菌,该出发菌株可以在自来水配置的发酵培养基中高产L-丙氨酸，采用自来水配置可以节约成本。
一、重组工程菌E.coli XZ-A45作为出发菌株利用低能离子注入诱变筛选菌株
1、氮离子注入诱变
取37℃恒温培养24h的出发菌株E.coli XZ-A45新鲜斜面，加无菌水15ml，刮洗下菌株并转入带有玻璃珠的250ml三角瓶内，向三角瓶中加入无菌水制成菌悬液，调整细菌浓度在108个/ml。取200μL上述菌悬液均匀涂布于无菌空白LB培养皿上，无菌状态下风干，在注入能量为20keV，注入剂量为10×1014、15×1014、20×1014ions/cm2，靶室真空度为10-3pa，以5s脉冲式注入，间隔为l5s条件下对大肠杆菌进行氮离子注入，离子注入完毕后，在无菌条件下将培养皿用1ml无菌生理盐水洗脱，按照104、105、106倍进行梯度稀释，分别将稀释后的样品涂布到LB平板培养基上，于37℃下倒置培养48h，得到诱变平板。
2、高通量初筛
于无菌96微孔板各孔中加入200μLLB培养基，待凝固后，从1得到的诱变平板上挑选1000株单菌落转接于各孔中，置37℃恒温培养24h。采用12道孔的排枪将96孔板上长出的单菌落接种于装有500μL发酵培养基的96微孔板，于37℃，300rpm微孔板摇床培养24h，同时将原孔板上的菌落转接于另一微孔板，同样条件下培养后作为备份。在无菌条件下，将培养后发酵液于4800rpm离心10min，得到上清液，采用高效液相色谱法测定上清液中L-丙氨酸的含量。选择39株L-丙氨酸含量高于出发菌株10％以上的菌株作为初筛后的诱变菌种(表1)。
L-丙氨酸定量检测方法：使用安捷伦Agilent-1260高效液相色谱仪，利用安捷伦公司C18色谱柱，采用OPA柱前衍生方法检测。
表1高通量初筛L-丙氨酸产量提高10％的菌株
3、摇瓶复筛
从保藏孔板上挑取2得到的初筛后的诱变菌种单菌落接种至新鲜LB斜面上，从培养成熟的斜面上接种至种子瓶，待种子长至对数生长期时接入装有50ml发酵培养基的250ml三角瓶，接种量3％(v/v)。置于37℃，160rpm的摇床培养36h。取2ml发酵液于离心管中，10000rpm离心5min，得到上清液，利用高效液相色谱测定L-丙氨酸含量。
从中选择L-丙氨酸含量最高的前5个菌株作为复筛后的诱变菌种。
4、遗传性状稳定性验证
将5个复筛后的诱变菌种在LB平板上划线，于37℃恒温条件下培养24h，连续传代10代，然后接入装有200ml发酵培养基的1L三角瓶中培养36h，选择传代10代后产量与第一代相比没有下降的菌株，作为诱变筛选目的菌株(表2)。
表2遗传性状稳定性验证试验
从实验结果可以看出，经过10次传代，突变株A1的L-丙氨酸产量高，且具有较好的遗传稳定性，为诱变筛选目的菌株，可作为下一步选育的出发菌株。
二、低能离子注入诱变筛选目的菌株作为出发菌株，利用进化工程育种技术选育发酵法L-丙氨酸高产菌株
在培养基中提高葡萄糖浓度和添加L-丙氨酸，连续传代诱变筛选目的菌株，以提高其耐受高糖高酸的能力，具体如下：
将上述一得到的低能离子注入诱变筛选出的目的菌株A1接种于含有200ml发酵培养基的1L三角摇瓶，培养温度为37℃，摇床转速为160rpm。采用连续传代培养方式，每36h时将摇瓶中的菌液按照10％(体积百分含量)的比例转接到一个新的摇瓶中培养，利用高效液相色谱测定发酵液中L-丙氨酸含量，每进行一次转接培养即为一代驯化。
上述连续传代培养方式为在含有阶梯浓度的葡萄糖和L-丙氨酸的发酵培养基中阶梯培养，每一阶段培养采用的发酵培养基中的葡萄糖和L-丙氨酸均比上一阶段培养采用的发酵培养基中的葡萄糖和L-丙氨酸等量增加，本实施例是每一阶段葡萄糖浓度提高10g/L,L-丙氨酸提高10g/L，直至筛选的菌株的L-丙氨酸产量基本稳定不变即可，具体如下：
第一阶段在葡萄糖浓度为150g/L，添加10g/L的L-丙氨酸的发酵培养基中连续转接40代；每代菌种发酵生产L-丙氨酸含量变化趋势图如图1所示。
第二阶段将葡萄糖的浓度增加到160g/L，添加20g/L的L-丙氨酸的发酵培养基中连续转接40代，每代菌种发酵生产L-丙氨酸含量变化趋势图如图2所示；
第三阶段将葡萄糖的浓度增加到170g/L，添加30g/L的L-丙氨酸的发酵培养基中再连续转接40代，每代菌种发酵生产L-丙氨酸含量变化趋势图如图3所示，可以看出，从第三阶段的第36代开始，菌株生产L-丙氨酸基本不变，选取第三阶段的第40代菌株作为目的突变菌株，命名为XZ-A45-F1。
将目的突变菌株与2018年4月12日，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.15610。
实施例2、目的突变菌株XZ-A45-F1发酵生产L-丙氨酸
1、摇瓶发酵
将实施例1得到的目的突变菌株接种于含有200ml发酵培养基的1L三角摇瓶，培养温度为37℃，摇床转速为160rpm。培养36h时利用高效液相色谱测定发酵液中L-丙氨酸含量。
2、发酵罐发酵
为了验证驯化菌株在工业化生产中是否可以保持摇瓶中发酵培养时的突出性能，进行逐级放大在100m3发酵罐中验证。
将实施例1得到的目的突变菌株转接入装有70m3发酵培养基的100m3发酵罐，在发酵培养基中发酵培养，发酵培养的转速80rpm，通气量100m3/h，发酵过程补加氨水控制发酵液pH6.5-7.5，发酵时间40h。
利用高效液相色谱检测发酵液中L-丙氨酸含量，重复三批，结果如下：L-丙氨酸含量分别为165g/L、162g/L、166g/L。
将摇瓶发酵和发酵罐发酵结果与出发菌株相比，见下表3，证明本发明方法筛选出的菌株有利于大规模工业化生产。
表3本发明选育的高产菌株与出发菌株的产量比较
使用安捷伦Agilent-1260高效液相色谱仪，采用日本SUMICHIRAL公司OA-6000色谱柱检测发酵液中L-丙氨酸光学纯度(ee值)为99.99％。
OA-6000色谱柱检测方法：流动相为2mmol/L硫酸铜水溶液，紫外检测波长为210nm，流速为1mL/min，进样体积20μL，柱温30℃。

Claims (9)

1.一种制备产L-丙氨酸的目的菌的方法，包括如下步骤：
1)将大肠杆菌E.coli XZ-A45经过氮离子注入诱变，得到诱变筛选目的菌株；
2)再将所述诱变筛选目的菌株在含有浓度递增的葡萄糖和浓度递增的L-丙氨酸的发酵培养基中进行连续传代培养，得到目的菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述氮离子注入诱变包括如下步骤：
1)-1、将所述大肠杆菌E.coli XZ-A45进行氮离子注入诱变，收集诱变后菌株；
1)-2、将所述诱变后菌株进行发酵培养，检测发酵产物中L-丙氨酸含量，选取产生L-丙氨酸的量高于所述大肠杆菌E.coli XZ-A45的10％以上的菌株作为初筛后的诱变菌种；
1)-3、将所述初筛后的诱变菌种进行再次发酵培养，检测发酵产物中L-丙氨酸含量，选取所有菌种中L-丙氨酸含量从高到低前五位的菌株，作为复筛后的诱变菌种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述氮离子注入诱变的氮离子注入条件为：注入能量为10-40keV，注入剂量为10-50×1014ions/cm2；
所述发酵培养采用的培养基为将如下各个物质按照各自浓度溶解在水中得到的培养基：葡萄糖80-170g/L，L-丙氨酸10-30g/L，酵母膏5-10g/L，氯化氨2-10g/L，磷酸氢二钠6-30g/L，磷酸二氢钠2-10g/L，硫酸镁0.5-2g/L，硫酸铵5-20g/L，氯化钙0.05-0.3g/L，微量金属盐母液1-5ml/L。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：
所述连续传代培养为在含有不同浓度的葡萄糖和不同浓度的L-丙氨酸的发酵培养基中进行多阶段连续传代培养，至含量稳定不变；
每一阶段连续传代培养采用的发酵培养基与上一阶段连续传代培养采用的发酵培养基相比，葡萄糖和L-丙氨酸等量增加，其余组分不变；
所述连续传代培养的条件为35-39℃，摇床转速为150-200rpm，培养时间24-48h；
每一阶段连续传代培养为传代40代。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述多阶段连续传代培养依次为如下：
第一阶段在含有150g/L葡萄糖和10g/L的L-丙氨酸的发酵培养基中连续转接40代；
第二阶段在含有160g/L葡萄糖和20g/L的L-丙氨酸的发酵培养基中连续转接40代，
第三阶段在含有170g/L葡萄糖和30g/L的L-丙氨酸的发酵培养基中连续转接40代。
6.由权利要求1-5任一所述方法制备的目的菌。
7.根据权利要求6所述的目的菌，其特征在于：所述目的菌为保藏号为CGMCC No.15610的大肠埃希氏菌。
8.权利要求6或7所述目的菌在生产L-丙氨酸或提高L-丙氨酸产量中的应用。
9.一种生产L-丙氨酸的方法，包括如下步骤：发酵权利要求6或7所述目的菌，得到L-丙氨酸。
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