CN105886431A - 一株谷氨酸棒状杆菌及其高产异亮氨酸的方法 - Google Patents

一株谷氨酸棒状杆菌及其高产异亮氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株谷氨酸棒状杆菌及其高产L‑异亮氨酸的方法，属于微生物领域、基因组学领域。所述谷氨酸棒杆菌具体为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)YI，保藏号为CGMCC No.12153。该菌株经诱变获得，在30L发酵罐发酵32‑40h，异亮氨酸产量可达28g/L，发酵时间短，且产量高，优于现有技术。此外，本发明还公布了该菌株相对于标准株的基因突变位点，为相关研究提供了新方向。

Description

一株谷氨酸棒状杆菌及其高产异亮氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域、基因组学领域，特别涉及一株谷氨酸棒状杆菌及其高产L-异亮氨酸的方法。
背景技术：
谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，是一种放线菌目的革兰氏阳性菌，细胞呈短棒状八字排列。谷氨酸棒状杆菌在氨基酸发酵领域有着举足轻重的地位，至今已经被安全应用了近60年。目前，包括L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-天门冬氨酸等大多数氨基酸都开始运用谷氨酸棒状杆菌发酵进行生产。
国内的L-异亮氨酸生产主要依靠微生物发酵法，使用的菌株以谷氨酸棒状杆菌为主，但目前对其代谢网络动态调节认识的不足限制了更深层次代谢工程应用研究的进展。异亮氨酸的生物合成途径所属的分支链氨基酸(缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸)合成途径，一直是科研人员研究的热点，大部分研究集中于该代谢网络中的关键酶的活性中心氨基酸的改变，或者关键酶的过表达，但目前为止，尚未有关于异亮氨酸生产菌的完整基因组序列的报道。
本实验室，利用传统育种手段中的化学诱变法，成功筛选到了一株高效的异亮氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌YI株，并完成了全基因组测序。在此基础上又对其进行比较基因组学分析，揭示了YI株的异亮氨酸合成途径相关基因的碱基突变。
发明内容：
本发明包括一株经过诱变筛选得到的L-异亮氨酸高效生产菌株，谷氨酸棒杆菌YI，并且对其基因组进行测序，得到了完整的基因组序列。本发明在异亮氨酸高产菌株谷氨酸棒杆菌YI的全基因组测序的基础上，分析了整个分支链氨基酸合成途径中的基因序列，报道了这些基因存在碱基突变所导致的编码产物氨基酸突变，这些突变对于异亮氨酸的合成有较明显的正向影响。
传统诱变育种得到的菌株的遗传背景往往不清晰，虽然获得了期望的表型性状，但对于其形成机理缺乏明确认识。本发明在基因组序列的基础上，通过对异亮氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌YI与谷氨酸棒杆菌标准株ATCC 13032的基因组序列相比较，发现其异亮氨酸合成相关基因序列中存在较多碱基突变，碱基突变导致各基因编码产物的氨基酸序列存在以下改变，以下采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示谷氨酸棒杆菌YI相较于标准株ATCC 13032(Genebank：NC_003450)在相同的酶上发生的氨基酸突变。由于突变前后的各基因序列所包含的碱基数均与标准株ATCC 13032一致，因此所述位置的编号以ATCC 13032的对应酶在Genebank中的氨基酸序号来表示：
乙酰羟酸合酶催化亚基：Lys30Gln、Asn156Asp、Val233Ile；核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1；
乙酰羟酸合酶调控亚基：His47Leu；核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2；
苏氨酸脱水酶：Pro363Leu；核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3；
二羟酸脱水酶：Glu461Lys；核苷酸序列如序列表SEQ ID No.4；
分支链氨基酸氨基转移酶：Phe32Tyr、Gln 253His；核苷酸序列如序列表SEQID No.5；
异丙基苹果酸合酶：Gly92Asp、Ile162Val、Pro206Ser、Val439Ile、Arg494His、Ser557Leu；核苷酸序列如序列表SEQ ID No.6；
异丙基苹果酸脱水酶大亚基：Lys 93Gln、Gly317Ser、Ser319Thr、Ser322Asn；核苷酸序列如序列表SEQ ID No.7；
异丙基苹果酸脱水酶小亚基：Tyr7His、Thr113Ala；核苷酸序列如序列表SEQID No.8；
异丙基苹果酸脱氢酶：Ile334Val、Lys336Arg；核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.9；
所述谷氨酸棒杆菌YI，具体为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)YI，该菌已于2016年3月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.12153，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101.
所述谷氨酸棒杆菌YI经发酵罐发酵培养后，发酵液中平均可检测到异亮氨酸28g/L，所述发酵培养具体如下：
(1)斜面培养：置于32℃培养箱，第一代活化斜面培养24h，第二代活化斜面培养12h，经过两代活化培养之后的菌种直接接种于摇瓶种子培养基培养，或置于4℃保存备用；
(2)摇瓶种子培养：容积1000mL的三角瓶，装液量为100mL，从二代斜面上接种2-4环，置于水平旋转摇床，32℃，200r/min，培养12h，培养过程使用氨水调节pH维持在6.4-7.2之间；
(3)二级种子培养：接种量为8-10％，32℃培养，溶氧维持在20-30％，培养过程使用氨水调节pH维持在6.4-7.2之间，培养至OD600＝15-20；
(4)发酵罐发酵：接种量为10-13％，32℃培养，溶氧维持在20-30％，培养过程使用氨水调节pH维持在6.4-7.2之间，发酵液葡萄糖浓度维持不低于10g/L，培养32-40h；
所述活化斜面培养基组成为(g/L)：葡萄糖10，牛肉膏10，蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5，琼脂条20，pH 6.7-7.2；
所述摇瓶种子培养基组成：葡萄糖30g，酵母粉5g，豆饼粉水解液20mL，玉米浆20g，NaCl 5g，MgSO4·7H2O 2g，KH2PO4·12H2O 2g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，亮氨酸0.1g，缬氨酸0.1g，苯酚红溶液(0.4g/L)20mL，蒸馏水1000mL,pH 6.7-7.2；
所述二级种子培养基组成为：葡萄糖30g，酵母粉5g，豆饼粉水解液20mL，玉米浆20g，NaCl 5g，MgSO4·7H2O 2g，KH2PO4·12H2O 2g，FeSO4·7H2O0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，亮氨酸0.1g，缬氨酸0.1g，蒸馏水1000mL,pH 6.7-7.2；
所述发酵培养基组成为：葡萄糖60g，豆饼粉水解液25mL，玉米浆40g，MgSO4·7H2O 2g，KH2PO4·12H2O 2g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，VB1 0.01g，蒸馏水1000mL,pH 6.7-7.2；
所述豆饼粉水解液波美度28度。
有益效果：
1、本发明所提供的菌株经摇瓶发酵培养后，发酵液中平均可检测到异亮氨酸13g/L，较原始菌株的0.2g/L，进步显著，经30L发酵罐32-40h发酵后，发酵液中平均可检测到异亮氨酸28g/L，且高于现有技术；
2、本发明所发现的与异亮氨酸合成相关酶的氨基酸突变位点为异亮氨酸合成及基因研究提供了新的方向与途径。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1谷氨酸棒杆菌的化学诱变
(1)以土壤中分离得到的谷氨酸棒杆菌作为出发菌株，首先在完全培养基斜面上活化，32℃培养12小时；
(2)从斜面接种于液体种子培养基，种子培养基为LB，32℃培养12小时；
(3)用生理盐水对培养后的细胞进行洗涤，重复一次后，用pH为7.0的磷酸缓冲液重悬菌体，制成107-108细胞/mL的菌悬液；
(4)取5-10mL菌悬液，加入到无菌试管中，再加入1％(V/V)硫酸二乙酯，试管用棉塞封口，震荡30-40min；
(5)用适量无菌水稀释，涂布于含有磺胺胍、L-异亮氨酸结构类似物的抗性筛选培养基上，32℃培养，待生长出单菌落；
(6)初筛方式：单菌落利用96孔板培养，以纸层析检测L-异亮氨酸产量；
(7)复筛方式：在摇瓶中进行发酵，产物用HPLC进行检测。
实施例2谷氨酸棒杆菌YI的基因组测序
(1)基因组的提取：使用PROMEGA公司的细菌基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Purification Kit A1120，利用核酸分析仪检测，保证基因组DNA的质量符合测序需要；
(2)利用三代测序平台PacBio RS II对基因组进行测序；
(3)利用PacBio公司提供的装软件对基因组进行组装，并使用相关软件进行常规的比较基因组分析。
实施例3基因突变前后菌株异亮氨酸合成能力比较
(1)活化斜面培养基(g/L)：葡萄糖10，牛肉膏10，蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5，琼脂条20，pH 6.7-7.2；
(2)摇瓶种子培养基：葡萄糖30g，酵母粉5g，豆饼粉水解液20mL，玉米浆20g，NaCl 5g，MgSO4·7H2O 2g，KH2PO4·12H2O 2g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，亮氨酸0.1g，缬氨酸0.1g，苯酚红溶液(0.4g/L)20mL，蒸馏水1000mL,pH 6.7-7.2；
(3)摇瓶发酵培养基：葡萄糖60g，豆饼粉水解液25mL，玉米浆40g，MgSO4·7H2O 2g，KH2PO4·12H2O 2g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，VB1 0.01g，苯酚红溶液(0.4g/L)20mL，蒸馏水1000mL,pH 6.7-7.2；
(2)(3)中所述豆饼粉水解液购自山东菱花味精股份有限公司，波美度28度；
(4)斜面培养：置于32℃培养箱，第一代活化斜面培养24h，第二代活化斜面培养12h，经过两代活化培养之后的菌种可直接接种于摇瓶种子培养基培养，也可置于4℃保存；
(5)摇瓶种子培养：容积500mL的三角瓶，装液量为30mL，从二代斜面上接种1-2环，置于水平旋转摇床，32℃，200r/min，培养12h，培养过程使用氨水维持发酵液的pH在6.4到7.2之间；
(6)摇瓶发酵培养：容积500mL的三角瓶，装液量为30mL，接种量为10％，置于水平旋转摇床，32℃，200r/min，培养36h，培养过程使用氨水维持发酵液的pH在6.4到7.2之间，发酵液葡萄糖浓度维持不低于10g/L；
(7)发酵结束后，用HPLC分析发酵液中异亮氨酸浓度，标准株ATCC 13032的发酵液中基本检测不到异亮氨酸，基因突变之前的菌株的发酵液中最多检测到异亮氨酸0.2g/L，突变后菌株的发酵液中平均可检测到异亮氨酸13g/L。
实施例4基因突变后菌株(YI株)的30L发酵罐分批发酵实验
(1)活化斜面培养基(g/L)：葡萄糖10，牛肉膏10，蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5，琼脂条20，pH 6.7；
(2)摇瓶种子培养基：葡萄糖30g，酵母粉5g，豆饼粉水解液20mL，玉米浆20g，NaCl 5g，MgSO4·7H2O 2g，KH2PO4·12H2O 2g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，亮氨酸0.1g，缬氨酸0.1g，苯酚红溶液(0.4g/L)20mL，蒸馏水1000mL,pH 6.7；
(3)二级种子培养基：葡萄糖30g，酵母粉5g，豆饼粉水解液20mL，玉米浆20g，NaCl 5g，MgSO4·7H2O 2g，KH2PO4·12H2O 2g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，亮氨酸0.1g，缬氨酸0.1g，蒸馏水1000mL,pH 6.7；
(4)发酵培养基：葡萄糖60g，豆饼粉水解液25mL，玉米浆40g，MgSO4·7H2O2g，KH2PO4·12H2O 2g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，VB1 0.01g，蒸馏水1000mL,pH 6.7；
(2)(3)(4)中所述豆饼粉水解液购自山东菱花味精股份有限公司，波美度28度；
(5)斜面培养：置于32℃培养箱，第一代活化斜面培养24h，第二代活化斜面培养12h；
(6)摇瓶种子培养：容积1000mL的三角瓶，装液量为100mL，从二代斜面上接种3环，置于水平旋转摇床，32℃，200r/min，培养12h，培养过程使用氨水维持发酵液pH在6.4到7.2之间；
(7)二级种子培养：采用5L发酵罐，装液量为3L，接种量为8％，32℃培养，溶氧维持在20-30％，培养过程使用氨水调节pH维持在6.4-7.2之间，培养周期在12小时，用分光光度计在波长为600纳米处检测吸光度为16；
(8)30L发酵罐分批发酵：装液量为16L，接种量为10％，32℃培养，发酵过程的溶氧控制在20％到30％之间，培养过程使用氨水维持发酵液pH在6.4到7.2之间，发酵液葡萄糖浓度维持不低于10g/L，发酵周期为32小时；
(8)发酵结束后，用HPLC分析发酵液中异亮氨酸浓度，可检测到异亮氨酸22g/L。
实施例5基因突变后菌株(YI株)的30L发酵罐分批发酵实验
(1)活化斜面培养基(g/L)：葡萄糖10，牛肉膏10，蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5，琼脂条20，pH 7.0；
(2)摇瓶种子培养基：葡萄糖30g，酵母粉5g，豆饼粉水解液20mL，玉米浆20g，NaCl 5g，MgSO4·7H2O 2g，KH2PO4·12H2O 2g，FeSO4·7H2O 0.01g，
MnSO4·H2O 0.01g，亮氨酸0.1g，缬氨酸0.1g，苯酚红溶液(0.4g/L)20mL，蒸馏水1000mL,pH7.0；
(3)二级种子培养基：葡萄糖30g，酵母粉5g，豆饼粉水解液20mL，玉米浆20g，NaCl 5g，MgSO4·7H2O 2g，KH2PO4·12H2O 2g，FeSO4·7H2O 0.01g，
MnSO4·H2O 0.01g，亮氨酸0.1g，缬氨酸0.1g，蒸馏水1000mL,pH 7.0；
(3)发酵培养基：葡萄糖60g，豆饼粉水解液25mL，玉米浆40g，MgSO4·7H2O2g，KH2PO4·12H2O 2g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，VB1 0.01g，蒸馏水1000mL,pH 7.0；
(2)(3)(4)中所述豆饼粉水解液购自山东菱花味精股份有限公司，波美度28度；
(4)斜面培养：置于32℃培养箱，第一代活化斜面培养24h，第二代活化斜面培养12h，经过两代活化培养之后的菌种可直接接种于摇瓶种子培养基培养，也可置于4℃保存；
(5)摇瓶种子培养：容积1000mL的三角瓶，装液量为100mL，从二代斜面上接种4环，置于水平旋转摇床，32℃，200r/min，培养12h，培养过程使用氨水维持发酵液pH在6.4到7.2之间；
(6)二级种子培养：采用5L发酵罐，装液量为3L，接种量为10％，32℃培养，溶氧维持在20-30％，培养过程使用氨水调节pH维持在6.4-7.2之间，培养周期在16小时，用分光光度计在波长为600纳米处检测吸光度到20；
(7)30L发酵罐分批发酵：装液量为16L，接种量为13％，32℃培养，发酵过程的溶氧控制在20％到30％之间，培养过程使用氨水维持发酵液pH在6.4到7.2之间，发酵液葡萄糖浓度维持不低于10g/L，发酵周期为36小时；
(8)发酵结束后，用HPLC分析发酵液中异亮氨酸浓度，可检测到异亮氨酸28g/L。

Claims (5)

1.一株谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，一株谷氨酸棒状杆菌包含SEQ ID No.1－9所示的序列。
2.如权利要求1所述的一株谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌具体为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)YI，保藏号为CGMCC No.12153。
3.权利要求1或2所述谷氨酸棒状杆菌在异亮氨酸生产中的应用。
4.如权利要求3所述的谷氨酸棒状杆菌在异亮氨酸生产中的应用，其特征在于，具体步骤如下：
(1)斜面培养：置于32℃培养箱，第一代活化斜面培养24h，第二代活化斜面培养12h，经过两代活化培养之后的菌种直接接种于摇瓶种子培养基培养，或置于4℃保存；
(2)摇瓶种子培养：容积1000mL的三角瓶，装液量为100mL，从二代斜面上接种2-4环，置于水平旋转摇床，32℃，200r/min，培养12h，培养过程使用氨水调节pH维持在6.4-7.2之间；
(3)二级种子培养：接种量为8-10％，32℃培养，溶氧维持在20-30％，培养过程使用氨水调节pH维持在6.4-7.2之间，培养至OD600＝15-20；
(4)发酵罐发酵：接种量为10-13％，32℃培养，溶氧维持在20-30％，培养过程使用氨水调节pH维持在6.4-7.2之间，发酵液葡萄糖浓度维持不低于10g/L，培养32-40h。
5.如权利要求4所述谷氨酸棒状杆菌在异亮氨酸生产中的应用，其特征在于，所述活化斜面培养基组成为：葡萄糖10g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，琼脂条20g/L，蒸馏水1000mL,pH 6.7-7.2；
所述摇瓶种子培养基组成为：葡萄糖30g，酵母粉5g，豆饼粉水解液20mL，玉米浆20g，NaCl 5g，MgSO4·7H2O 2g，KH2PO4·12H2O 2g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，亮氨酸0.1g，缬氨酸0.1g，苯酚红溶液(0.4g/L)20mL，蒸馏水1000mL,pH 6.7-7.2；
所述二级种子培养基组成为：葡萄糖30g，酵母粉5g，豆饼粉水解液20mL，玉米浆20g，NaCl 5g，MgSO4·7H2O 2g，KH2PO4·12H2O 2g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，亮氨酸0.1g，缬氨酸0.1g，蒸馏水1000mL,pH 6.7-7.2；
所述发酵培养基组成为：葡萄糖60g，豆饼粉水解液25mL，玉米浆40g，MgSO4·7H2O2g，KH2PO4·12H2O 2g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，VB1 0.01g，蒸馏水1000mL,pH6.7-7.2。
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