CN108796003B - 一种提高l-异亮氨酸产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高L‑异亮氨酸产量的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明以以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)作为生产菌株，在以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)的发酵培养基中添加脂肪酸和/或氯高铁血红素以提高其产酸水平，成功将以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)产L‑异亮氨酸的产量从15g/L提高到了19g/L。

Description

一种提高L-异亮氨酸产量的方法
技术领域
本发明涉及一种提高L-异亮氨酸产量的方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
L-异亮氨酸是人体必需的八种氨基酸之一，同时又是三种支链氨基酸之一，是合成人体激素、酶类的原料，具有促进蛋白质合成和抑制其分解的效果，在人体生命活动中起着重要作用，现已被广泛运于生物医药、组织工程、光化学、电化学、食品工业、化妆品等领域。在国外，L-异亮氨酸还被其大量用于乳牛催乳、制备饲料添加剂以及生产功能饮料。
目前，常用微生物发酵法生产L-异亮氨酸。而现有的L-异亮氨酸生产菌主要有谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、大肠杆菌、乳糖发酵短杆菌、以钝齿棒杆菌以及粘滞赛氏杆菌，其中，除谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌外，其余均的产酸能力均十分低下，只有谷氨酸棒杆菌与黄色短杆菌的三分之一到二分之一。
为提高乳糖发酵短杆菌、以钝齿棒杆菌以及粘滞赛氏杆菌等的产酸水平，已经有许多学者从菌株的角度，试图通过突变菌株、构建基因工程菌得到产酸水平提高的乳糖发酵短杆菌、以钝齿棒杆菌以及粘滞赛氏杆菌等。
但是，由于突变菌株的正向突变率极低、基因工程菌的构建也具有不确定性，因此，急需找到新的提高乳糖发酵短杆菌、以钝齿棒杆菌以及粘滞赛氏杆菌等菌产酸水平的思路。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种提高L-异亮氨酸产量的方法。此方法以以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)作为生产菌株，在以钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)的发酵培养基中添加脂肪酸和/或氯高铁血红素以提高其产酸水平，成功将以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)产L-异亮氨酸的产量从15g/L提高到了19g/L。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种提高L-异亮氨酸产量的方法，所述方法为将L-异亮氨酸生产菌株先接种于种子培养基中进行扩培，得到种子液，再将种子液接种于发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；所述发酵培养基中添加有脂肪酸和/或氯高铁血红素。
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酸的添加量为3～5wt％。
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酸的添加量为3wt％。
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酸包含亚麻酸、亚油酸、油酸。
在本发明的一种实施方式中，所述氯高铁血红素的添加量为2～3wt％。
在本发明的一种实施方式中，所述氯高铁血红素的添加量为2wt％。
在本发明的一种实施方式中，所述L-异亮氨酸生产菌株为以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基的成分包含葡萄糖90～100g/L、硫酸铵12～20g/L、玉米浆90～100g/L、磷酸二氢钾3～4g/L以及硫酸镁1～2g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基的成分包含葡萄糖96g/L、硫酸铵16g/L、玉米浆96g/L、磷酸二氢钾3.2g/L以及硫酸镁1.6g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基的pH为6～7。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基的pH为6.8。
在本发明的一种实施方式中，所述扩培的条件为温度29～33℃、时间14～20h、转速200～300rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述扩培的条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖2430～3100g/L、硫酸铵0～400g/L、玉米浆400～700g/L、磷酸二氢钾0～20g/L、硫酸镁0～10g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖2800g/L、硫酸铵350g/L、玉米浆550g/L、磷酸二氢钾15g/L、硫酸镁5g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的pH为6～8。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的pH为6.7。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度27～36℃、时间60～80h、转速100～150rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm。
本发明提供了应用上述一种提高L-异亮氨酸产量的方法生产得到的L-异亮氨酸。
本发明提供了上述一种提高L-异亮氨酸产量的方法在生产L-异亮氨酸方面的应用。
有益效果：
本发明以以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)作为生产菌株，在以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)的发酵培养基中添加脂肪酸和/或氯高铁血红素以提高其产酸水平，成功将以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)产L-异亮氨酸的产量从15g/L提高到了19g/L。
具体实施方式
下面结合实施例与对比例，对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的培养基如下：
种子培养基：葡萄糖96g/L、硫酸铵16g/L、玉米浆96g/L、磷酸二氢钾3.2g/L以及硫酸镁1.6g/L，pH 6.8
发酵培养基：葡萄糖2800g/L、硫酸铵350g/L、玉米浆550g/L、磷酸二氢钾15g/L、硫酸镁5g/L，pH 6.7
下述实施例中涉及的检测方法如下：
L-异亮氨酸产量的检测方法如下：
纸层析法：
1、点样：用微量定样器，按纸色谱法检查，点样1ul，展开剂为正丁醇：冰醋酸：水＝5:2:1；
2、展开：展开时间≥3h，结束后晾干色谱滤纸；
3、茚三酮显色：将晾干后的色谱滤纸在盛有2％茚三酮显色剂的瓷托盘中浸润，风干后置105℃烘箱中干燥5min即呈现蓝紫色斑点，按大小一致的面积剪下显色斑点，洗脱；
4、洗脱：将剪下的色斑置于具塞试管中用洗脱剂(75％乙醇：0.2％Cu5SO4·5H2O＝39:1)，各5ml进行洗脱；
5、吸光度测定：取洗脱液在520nm处测定吸光度，根据吸光度在标准曲线上查出相应的含量；
6、标准曲线绘制：根据发酵液的实际产酸率，选取相应的5个浓度的梯度标准样，同样品液一起点样、展开、显色、洗脱，测定520nm处吸光度，以标准样为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
实施例1
具体步骤如下：
将以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装有100mL种子培养液的250mL摇瓶中进行扩培，条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm，得到种子液；将种子液以0.2g/L的接种量接种于装有200mL添加了3wt％亚麻酸和2wt％氯高铁血红素的发酵培养基的500mL摇瓶中进行发酵培养，条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm，得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测，L-异亮氨酸产量为19.2g/L。
实施例2
具体步骤如下：
将以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装有100mL种子培养液的250mL摇瓶中进行扩培，条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm，得到种子液；将种子液以0.2g/L的接种量接种于装有200mL添加了3wt％亚麻酸的发酵培养基的500mL摇瓶中进行发酵培养，条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm，得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测，L-异亮氨酸产量为16.7g/L。
实施例3
具体步骤如下：
将以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装有100mL种子培养液的250mL摇瓶中进行扩培，条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm，得到种子液；将种子液以0.2g/L的接种量接种于装有200mL添加了2wt％氯高铁血红素的发酵培养基的500mL摇瓶中进行发酵培养，条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm，得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测，L-异亮氨酸产量为17.4g/L。
实施例4
具体步骤如下：
将以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装有100mL种子培养液的250mL摇瓶中进行扩培，条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm，得到种子液；将种子液以0.2g/L的接种量接种于装有200mL添加了3wt％亚油酸和3wt％氯高铁血红素的发酵培养基的500mL摇瓶中进行发酵培养，条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm，得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测，L-异亮氨酸产量为19.0g/L。
实施例5
具体步骤如下：
将以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装有100mL种子培养液的250mL摇瓶中进行扩培，条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm，得到种子液；将种子液以0.2g/L的接种量接种于装有200mL添加了5wt％亚油酸和2wt％氯高铁血红素的发酵培养基的500mL摇瓶中进行发酵培养，条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm，得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测，L-异亮氨酸产量为18.4/L。
实施例6
具体步骤如下：
将以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装有100mL种子培养液的250mL摇瓶中进行扩培，条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm，得到种子液；将种子液以0.2g/L的接种量接种于装有200mL添加了3wt％油酸和2wt％氯高铁血红素的发酵培养基的500mL摇瓶中进行发酵培养，条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm，得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测，L-异亮氨酸产量为18.7/L。
对比例1
具体步骤如下：
将以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装有100mL种子培养液的250mL摇瓶中进行扩培，条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm，得到种子液；将种子液以0.2g/L的接种量接种于装有200mL发酵培养基的500mL摇瓶中进行发酵培养，条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm，得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测，L-异亮氨酸产量为14.3g/L。
对比例2
具体步骤如下：
将以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装有100mL种子培养液的250mL摇瓶中进行扩培，条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm，得到种子液；将种子液以0.2g/L的接种量接种于装有200mL添加了7wt％亚麻酸和4wt％氯高铁血红素的发酵培养基的500mL摇瓶中进行发酵培养，条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm，得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测，L-异亮氨酸产量为15.6/L。
对比例3
具体步骤如下：
将以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装有100mL种子培养液的250mL摇瓶中进行扩培，条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm，得到种子液；将种子液以0.2g/L的接种量接种于装有200mL添加了1wt％亚油酸的发酵培养基的500mL摇瓶中进行发酵培养，条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm，得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测，L-异亮氨酸产量为16.1/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种提高L-异亮氨酸产量的方法，其特征在于，所述方法为将L-异亮氨酸生产菌株先接种于种子培养基中进行扩培，得到种子液，再将种子液接种于发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；所述发酵培养基中添加有脂肪酸和氯高铁血红素，所述L-异亮氨酸生产菌株为以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)，所述脂肪酸的添加量为3～5wt％；所述氯高铁血红素的添加量为2～3wt％，所述脂肪酸为油酸、亚油酸和亚麻酸中的任一种。
2.如权利要求1所述的一种提高L-异亮氨酸产量的方法，其特征在于，所述种子培养基的成分包含葡萄糖90～100g/L、硫酸铵12～20g/L、玉米浆90～100g/L、磷酸二氢钾3～4g/L以及硫酸镁1～2g/L。
3.如权利要求2所述的一种提高L-异亮氨酸产量的方法，其特征在于，所述扩培的条件为温度29～33℃、时间14～20h、转速200～300rpm。
4.如权利要求3所述的一种提高L-异亮氨酸产量的方法，其特征在于，所述发酵的条件为温度27～36℃、时间60～80h、转速100～150rpm。
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大肠杆菌5-氨基乙酰丙酸合成途径的改造及其对菌体代谢影响的初步研究;王阳;《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》;20130215;摘要 *
钝齿棒杆菌AS1542以油酸为生长促进因子变异株的选育;上海市工业微生物研究所;《遗传学报》;19790331;第6卷(第1期);第106页第1段 *

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