CN108841884B - 一种生产l-异亮氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生产L‑异亮氨酸的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明以乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentation）作为L‑异亮氨酸的生产菌株，将乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentation）与北京棒杆菌（Corynebacterium pekinense）进行共培养，使得乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentation）的产酸能力显著提升，从13g/L提高到21g/L，已可满足工业化生产需求。

Description

一种生产L-异亮氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种高效生产L-异亮氨酸的方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
L-异亮氨酸是人体必需的八种氨基酸之一，同时又是三种支链氨基酸之一，是合成人体激素、酶类的原料，具有促进蛋白质合成和抑制其分解的效果，在人体生命活动中起着重要作用，现已被广泛运于生物医药、组织工程、光化学、电化学、食品工业、化妆品等领域。在国外，L-异亮氨酸还被其大量用于乳牛催乳、制备饲料添加剂以及生产功能饮料。
目前，常用微生物发酵法生产L-异亮氨酸，而在微生物发酵法中，菌种起着至关重要的作用。
现有的L-异亮氨酸生产菌主要有谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、大肠杆菌、乳糖发酵短杆菌、以钝齿棒杆菌以及粘滞赛氏杆菌，其中，除谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌外，其余均的产酸能力均十分低下，只有谷氨酸棒杆菌与黄色短杆菌的三分之一到二分之一。
为提高乳糖发酵短杆菌、以钝齿棒杆菌以及粘滞赛氏杆菌等的产酸水平，已经有许多学者从突变菌株、基因工程菌的角度，试图得到产酸水平提高的乳糖发酵短杆菌、以钝齿棒杆菌以及粘滞赛氏杆菌等。
但是，由于突变菌株的正向突变率极低、基因工程菌的构建也具有不确定性，因此，急需找到新的提高乳糖发酵短杆菌、以钝齿棒杆菌以及粘滞赛氏杆菌等菌产酸水平的思路。
发明内容
为解决上述问题，一种高效生产L-异亮氨酸的方法。此方法是以乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)作为L-异亮氨酸的生产菌株，将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)与北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)进行共培养，使得乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)的产酸能力显著提升。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种高效生产L-异亮氨酸的方法，所述方法为将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)进行菌种培养；将北京棒杆菌(Corynebacteriumpekinense) 进行菌种培养；将菌种培养得到的乳糖发酵短杆菌与北京棒杆菌进行共培养，即得L-异亮氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述将乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentation) 进行菌种培养的条件为温度29～33℃、时间14～20h、转速200～300rpm、通风量3～5M3/h。
在本发明的一种实施方式中，所述将乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentation) 进行菌种培养的条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm、通风量4M3/h。
在本发明的一种实施方式中，所述将乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentation) 进行菌种培养的培养基A的成分包含葡萄糖90～100g/L、硫酸铵12～20g/L、玉米浆90～100g/L、磷酸二氢钾3～4g/L以及硫酸镁1～2g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述将乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentation) 进行菌种培养的培养基A的成分包含葡萄糖96g/L、硫酸铵16g/L、玉米浆96g/L、磷酸二氢钾3.2g/L以及硫酸镁1.6g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基A的pH为6～7。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基A的pH为6.8。
在本发明的一种实施方式中，所述将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)进行菌种培养的条件为温度29～33℃、时间14～20h、转速200～300rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)进行菌种培养的条件为温度30℃、时间16h、转速250rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)进行菌种培养的培养基B的成分包含葡萄糖15～25g/L、硫酸铵3～8g/L、磷酸二氢钾0.5～1.5g/L、玉米浆25～35g/L、豆粕水解液2～4g/L、生物素95～105μg/L、硫胺素190～210μg/L。
在本发明的一种实施方式中，所述将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)进行菌种培养的培养基B的成分包含葡萄糖20g/L、硫酸铵5g/L、磷酸二氢钾1g/L、玉米浆30g/L、豆粕水解液3g/L、生物素100μg/L、硫胺素200μg/L。
在本发明的一种实施方式中，所述将培养基B的pH为7～8。
在本发明的一种实施方式中，所述将培养基B的pH为7.4。
在本发明的一种实施方式中，所述共培养中乳糖发酵短杆菌与北京棒杆菌的接种比例为 5～15:1。
在本发明的一种实施方式中，所述共培养中乳糖发酵短杆菌与北京棒杆菌的接种比例为 10:1。
在本发明的一种实施方式中，所述共培养的条件为温度27～36℃、时间60～80h、转速 100～150rpm、通风量80～260M3/h。
在本发明的一种实施方式中，所述共培养的条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm、通风量180M3/h。
在本发明的一种实施方式中，所述共培养所用的培养基C的成分包含葡萄糖243～310g/L、硫酸铵0～40g/L、玉米浆40～70g/L、磷酸二氢钾0～2g/L、硫酸镁0～1g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述共培养所用的培养基C的成分包含葡萄糖280g/L、硫酸铵35g/L、玉米浆55g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、硫酸镁0.5g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述共培养所用的培养基C的pH为6～8。
在本发明的一种实施方式中，所述共培养所用的培养基C的pH为6.7。
本发明提供了应用上述一种高效生产L-异亮氨酸的方法生产得到的L-异亮氨酸。
本发明提供了上述一种高效生产L-异亮氨酸的方法在生产L-异亮氨酸方面的应用。
有益效果：
本发明以乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)作为L-异亮氨酸的生产菌株，将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)与北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)进行共培养，使得乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentation)的产酸能力显著提升，从13g/L提高到21g/L，已可满足工业化生产需求。
具体实施方式
下面结合实施例与对比例，对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的培养基如下：
培养基A：葡萄糖96g/L、硫酸铵16g/L、玉米浆96g/L、磷酸二氢钾3.2g/L以及硫酸镁 1.6g/L，pH 6.8
培养基B：葡萄糖20g/L、硫酸铵5g/L、磷酸二氢钾1g/L、玉米浆30g/L、豆粕水解液3g/L、生物素100μg/L、硫胺素200μg/L，pH 7.4
培养基C：葡萄糖280g/L、硫酸铵35g/L、玉米浆55g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、硫酸镁0.5g/L， pH 6.7
下述实施例中涉及的检测方法如下：
L-异亮氨酸产量的检测方法如下：
纸层析法：
1、点样：用微量定样器，按纸色谱法检查，点样1ul，展开剂为正丁醇：冰醋酸：水＝5:2:1；
2、展开：展开时间≥3h，结束后晾干色谱滤纸；
3、茚三酮显色：将晾干后的色谱滤纸在盛有2％茚三酮显色剂的瓷托盘中浸润，风干后置105℃烘箱中干燥5min即呈现蓝紫色斑点，按大小一致的面积剪下显色斑点，洗脱；
4、洗脱：将剪下的色斑置于具塞试管中用洗脱剂(75％乙醇：0.2％Cu5SO4·5H2O＝39:1)，各5ml进行洗脱；
5、吸光度测定：取洗脱液在520nm处测定吸光度，根据吸光度在标准曲线上查出相应的含量；
6、标准曲线绘制：根据发酵液的实际产酸率，选取相应的5个浓度的梯度标准样，同样品液一起点样、展开、显色、洗脱，测定520nm处吸光度，以标准样为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
实施例1
将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40％的培养基A中进行菌种培养，条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm、通风量4M3/h，得到乳糖发酵短杆菌菌种；
将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40％的培养基B中进行菌种培养，条件为温度30℃、时间16h、转速250rpm，得到北京棒杆菌菌种；
将得到的两种菌种分别以0.2g/L、0.02g/L的接种量接种于装液量为40％的培养基C进行发酵培养，条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm、通风量180M3/h，得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测，L-异亮氨酸产量为21.4g/L。
实施例2
将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40％的培养基A中进行菌种培养，条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm、通风量4M3/h，得到乳糖发酵短杆菌菌种；
将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40％的培养基B中进行菌种培养，条件为温度30℃、时间16h、转速250rpm，得到北京棒杆菌菌种；
将得到的两种菌种分别以0.2g/L、0.01g/L的接种量接种于装液量为40％的培养基C进行发酵培养，条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm、通风量180M3/h，得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测，L-异亮氨酸产量为19.2g/L。
实施例3
将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40％的培养基A中进行菌种培养，条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm、通风量4M3/h，得到乳糖发酵短杆菌菌种；
将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40％的培养基B中进行菌种培养，条件为温度30℃、时间16h、转速250rpm，得到北京棒杆菌菌种；
将得到的两种菌种分别以0.2g/L、0.03g/L的接种量接种于装液量为40％的培养基C进行发酵培养，条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm、通风量180M3/h，得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测，L-异亮氨酸产量为20.1g/L。
对比例1
具体步骤如下：
将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40％的培养基A中进行菌种培养，条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm、通风量4M3/h，得到乳糖发酵短杆菌菌种；将得到的菌种以0.2g/L的接种量接种于装液量为40％的培养基C进行发酵培养，条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm、通风量180M3/h，得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测，L-异亮氨酸产量为13.9g/L。
对比例2
将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40％的培养基B中进行菌种培养，条件为温度30℃、时间16h、转速250rpm，得到北京棒杆菌菌种；将得到的菌种以0.2g/L的接种量接种于装液量为40％的培养基C进行发酵培养，条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm、通风量180M3/h，得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测，L-异亮氨酸产量为0.8g/L。
对比例3
将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40％的培养基A中进行菌种培养，条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm、通风量4M3/h，得到乳糖发酵短杆菌菌种；
将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40％的培养基B中进行菌种培养，条件为温度30℃、时间16h、转速250rpm，得到北京棒杆菌菌种；
将得到的两种菌种分别以0.2g/L、0.001g/L的接种量接种于装液量为40％的培养基C进行发酵培养，条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm、通风量180M3/h，得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测，L-异亮氨酸产量为14.5g/L。
对比例4
将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40％的培养基A中进行菌种培养，条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm、通风量4M3/h，得到乳糖发酵短杆菌菌种；
将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40％的培养基B中进行菌种培养，条件为温度30℃、时间16h、转速250rpm，得到北京棒杆菌菌种；
将得到的两种菌种分别以0.2g/L、0.04g/L的接种量接种于装液量为40％的培养基C进行发酵培养，条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm、通风量180M3/h，得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测，L-异亮氨酸产量为16.7g/L。
对比例5
将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40％的培养基A中进行菌种培养，条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm、通风量4M3/h，得到乳糖发酵短杆菌菌种；
将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40％的培养基B中进行菌种培养，条件为温度30℃、时间16h、转速250rpm，得到北京棒杆菌菌种；
将得到的两种菌种分别以0.2g/L、0.05g/L的接种量接种于装液量为40％的培养基C进行发酵培养，条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm、通风量180M3/h，得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测，L-异亮氨酸产量为15.9g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种生产L-异亮氨酸的方法，其特征在于，所述方法为将乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentation）进行菌种培养；将北京棒杆菌（Corynebacterium pekinense）进行菌种培养；将菌种培养得到的乳糖发酵短杆菌与北京棒杆菌进行共培养，即得L-异亮氨酸；所述共培养中乳糖发酵短杆菌与北京棒杆菌的接种比例为5~15:1。
2.如权利要求1所述的一种生产L-异亮氨酸的方法，其特征在于，所述将乳糖发酵短杆菌进行菌种培养的条件为温度29~33℃、时间14~20h、转速200~300rpm、通风量3~5M3/h。
3.如权利要求1或2所述的一种生产L-异亮氨酸的方法，其特征在于，所述将乳糖发酵短杆菌进行菌种培养的培养基A的成分包含葡萄糖90~100g/L、硫酸铵12~20g/L、玉米浆90~100g/L、磷酸二氢钾3~4g/L以及硫酸镁1~2g/L。
4.如权利要求3所述的一种生产L-异亮氨酸的方法，其特征在于，所述将北京棒杆菌进行菌种培养的条件为温度29~33℃、时间14~20h、转速200~300rpm。
5.如权利要求4所述的一种生产L-异亮氨酸的方法，其特征在于，所述将北京棒杆菌进行菌种培养的培养基B的成分包含葡萄糖15~25g/L、硫酸铵3~8g/L、磷酸二氢钾0.5~1.5g/L、玉米浆25~35g/L、豆粕水解液2~4g/L、生物素95~105μg/L、硫胺素190~210μg/L。
6.如权利要求5所述的一种生产L-异亮氨酸的方法，其特征在于，所述共培养的条件为温度27~36℃、时间60~80h、转速100~150rpm、通风量80~260M3/h。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109652475B (zh) * 2019-01-10 2020-04-14 内蒙古拜克生物有限公司 一种提高l-异亮氨酸产量的发酵方法
CN109609565B (zh) * 2019-02-24 2019-09-10 内蒙古拜克生物有限公司 一种发酵生产l-异亮氨酸的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103409476A (zh) * 2013-08-30 2013-11-27 北京明新高科技发展有限公司 一种l-异亮氨酸的发酵及分离纯化方法
CN103911419A (zh) * 2014-03-20 2014-07-09 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 一种双菌株联合发酵生产l-缬氨酸的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103409476A (zh) * 2013-08-30 2013-11-27 北京明新高科技发展有限公司 一种l-异亮氨酸的发酵及分离纯化方法
CN103911419A (zh) * 2014-03-20 2014-07-09 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 一种双菌株联合发酵生产l-缬氨酸的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《Co-expression of feedback-resistant threonine dehydratase and acetohydroxy acid synthase increase L-isoleucine production in Corynebacterium glutamicum》;Lianghong Yin;《Metabolic Engineering》;20120704;第14卷;第542-550页 *
《微生物混合培养及其应用》;冯树;《微生物学通报》;20010627;第28卷(第3期);第92-95页 *

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