CN110760549A - 一种高山被孢霉发酵生产花生四烯酸的方法 - Google Patents

一种高山被孢霉发酵生产花生四烯酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高山被孢霉发酵生产花生四烯酸的方法，其以菜籽粕或菜籽粕水解物为发酵培养基的主要成分，发酵培养高山被孢霉。本发明的发酵方法降低了花生四烯酸的生产成本，提升了花生四烯酸的产量。

Description

一种高山被孢霉发酵生产花生四烯酸的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种高山被孢霉发酵生产花生四烯酸的方法。
背景技术
我国菜籽粕的产量非常大，菜籽粕的理论应用广泛，但是目前其应用范围依然局限于饲料领域。
现有的菜籽粕应用中，都是将菜籽粕作为底物，固态发酵通过特定的细菌发酵，水解菜籽粕或者去除其中的有害物质，实现脱毒，得到能够用于饲料的产物，很少有将菜籽粕用于微生物发酵的培养成分。
菜籽粕在微生物发酵领域的应用比较有限，一是由于菜籽粕中纤维素的含量较高，影响了微生物对于蛋白质的利用；二是由于由于菜籽粕中含有约为2.2％-4.4％的植酸成分，植酸具有很强的螯合阳离子作用，能与金属离子铁、锌、钙、镁、钾等元素以及一些蛋白质形成络合物，大大降低这些元素的生物利用率和蛋白质的生物学效价；另外菜籽粕中含有的硫甙、酚类物质对于微生物的发酵有不利影响。
实际上，菜籽粕是一种廉价优良的天然植物蛋白资源，必需氨基酸含量较高，降解后产生具有生理活性肽类的可能性较大，具有成为优良发酵培养基成分的潜质。
高山被孢霉作为生产花生四烯酸(二十碳四烯酸)的菌种多年以来都是采用传统的酵母浸膏、酵母粉、葡萄糖等作为培养基成分，然而随着技术的发展、市场的竞争，制造花生四烯酸的成本需要进一步降低。
现有技术中还没有将菜籽粕应用于高山被孢霉的发酵技术中，由于微生物发酵的不确定性，对于高山被孢霉在菜籽粕培养基中是否能够正常的生长代谢处于未知状态。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明通过对菜籽粕和发酵逐步研究，提供一种高山被孢霉发酵生产花生四烯酸的方法。
具体来说，本发明提供了如下技术方案：
一种高山被孢霉发酵生产花生四烯酸的方法，其以菜籽粕或菜籽粕水解物为发酵培养基的主要成分，发酵培养高山被孢霉。
优选的，上述方法中，所述发酵培养基还包含葡萄糖和酵母浸膏，优选的，以所述发酵培养基的总质量计，包含5-8％葡萄糖、0.5-1％酵母浸膏和1-2％菜籽粕水解物。
优选的，上述方法中，以所述菜籽粕水解物干物质的重量计，所述菜籽粕水解物中小肽的含量≧10％，优选的，所述小肽的含量为10-20％。
优选的，上述方法中，所述菜籽粕水解物通过将含有菜籽粕的原料采用选自木聚糖酶、纤维素酶、植酸酶和蛋白酶中的一种或几种进行酶解得到。
优选的，上述方法中，以所述菜籽粕的质量计，所述木聚糖酶的添加量为10-450U/g，所述纤维素酶的添加量为1-300U/g，所述植酸酶的添加量为2-35U/g，所述蛋白酶的添加量为1000-4000U/g。
优选的，上述方法中，所述菜籽粕水解物由包括以下步骤的制备方法得到：
(1)将含有菜籽粕的原料采用选自木聚糖酶和纤维素酶中的一种或两种和植酸酶进行酶解；
(2)采用蛋白酶进行进一步酶解，得到菜籽粕水解物。
优选的，上述方法中，步骤(1)中，将含有菜籽粕的原料采用纤维素酶和植酸酶进行酶解，优选的，将含有菜籽粕的原料采用纤维素酶和植酸酶进行共同酶解，更优选的，以所述菜籽粕的质量计，共同酶解时所述纤维素酶的添加量为10-150U/g，所述植酸酶的添加量为5-20U/g。
优选的，上述方法中，步骤(1)中，所述酶解的温度为40-60℃，优选的，所述酶解的pH为3.5-6.0，更优选的，所述酶解的时间为1-2h。
优选的，上述方法中，所述蛋白酶选自碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶中的一种或几种，优选的，所述蛋白酶为中性蛋白酶，更优选的，所述中性蛋白酶的酶解温度为30-50℃，酶解pH为6.0-8.0，酶解时间为1-3h，添加量为1000-3000U/g。
本发明还提供一种高山被孢霉的发酵产物，其通过上述的方法制备得到。
本发明所取得的有益效果：
本发明提供一种高山被孢霉发酵生产花生四烯酸的方法，其在发酵培养基中使用了特定酶解得到的菜籽粕水解物作为部分碳源和氮源，在降低了花生四烯酸生产成本的同时，提升了花生四烯酸的产量。
菌株保藏信息
本发明所用的菌种高山被孢霉Y16(Mortierellaalpine Y16)于2015年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2015421，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
具体实施方式
本发明提供一种高山被孢霉发酵生产花生四烯酸的方法，其以菜籽粕或菜籽粕水解物为发酵培养基的主要成分，发酵培养高山被孢霉。
在一种优选的实施方式中，所述高山被孢霉为高山被孢霉Y16(Mortierellaalpine Y16),其保藏编号为CCTCC NO:M2015421。
在一种优选的实施方式中，以所述菜籽粕水解物干物质的重量计，所述菜籽粕水解物中小肽的含量≧10％，优选的，所述小肽的含量为10-20％。高山被孢霉的发酵周期较长，更适于能够缓释利用的氮源成分，其对于菜籽粕水解物中小肽的含量优选为10-20％，小肽含量太低发酵时影响生长，含量过高则可能后续氮源不足，影响其产物积累。
在一种优选的实施方式中，所述菜籽粕在加入发酵培养基或进行水解前，首先经过活性炭吸附去硫甙或醇洗沉淀除酚处理。
在一种优选的实施方式中，所述菜籽粕水解物通过将含有菜籽粕的原料采用选自木聚糖酶、纤维素酶、植酸酶和蛋白酶中的一种或几种进行酶解得到。
在一种优选的实施方式中，将含有菜籽粕的原料进行酶解前，先将含有菜籽粕的原料稀释成固液比为6-30％(w/v)的悬浮液，优选为固液比为20％的悬浮液。
在一种优选的实施方式中，不同的酶水解步骤间可根据不同酶的性质用pH调节剂如盐酸、氢氧化钠、柠檬酸等将pH调至合适条件。例如可先用盐酸将pH调至5左右进行植酸酶和纤维素酶的水解，再采用碳酸钠将pH调至7左右进行蛋白酶的水解反应。
在一种优选的实施方式中，酶解过程中可进行搅拌操作。
在一种优选的实施方式中，酶解后的菜籽粕水解物溶液可干燥后保存以待后续使用，也可以直接投入培养基中使用。
本发明还提供一种花生四烯酸的制备方法，其通过将上述方法制备得到的发酵产物进一步过滤、干燥、浸提和精炼处理后得到。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不用来限制本发明的范围。其中，实施例1-10采用的是摇瓶规模，实施例11为放大的发酵方法，验证本发明方法的稳定性。
在下面的实施例中，所用的高山被孢霉菌株为高山被孢霉Y16(Mortierellaalpine Y16),其保藏编号为CCTCC NO:M2015421；菜籽粕为普通未经过处理的市售菜籽粕，其植酸含量为3.6％，其他原料均为市售。
实施例1
本实施例提供了一种高山被孢霉发酵生产花生四烯酸的发酵方法，其发酵培养基中含有未经处理的菜籽粕，具体步骤如下：
1.原始菌株的活化：将使用安瓿管保存的高山被孢霉菌株接种到PDA斜面培养基上，在28±1℃下培养8天，选取菌丝和孢子生长旺盛的PDA培养基平板，取下培养基上所有的菌丝和孢子，用无菌水制成孢子悬液，孢子悬液浓度不少于106cfu/mL。
2.种子培养：将孢子悬液接种于摇瓶培养基中，在28±1℃下振摇培养48h，摇床振摇转速为115转/分钟，得到种子培养液，所述摇瓶培养基中主要原料组分的质量百分比为葡萄糖6％、酵母浸膏1.5％、基质蒸馏水，pH值为7.0；
3.发酵培养：将种子培养液按接种量5％接种至发酵培养基中，在28±1℃下振摇培养260h，摇床振摇转速为220转/分钟，得到发酵产物，所述发酵培养基中主要原料组分的质量百分比为葡萄糖8％、酵母浸膏0.8％、菜籽粕1.5％、基质蒸馏水，pH值为7.0；
实施例2
实施例2按与实施例1相同的方法发酵高山被孢霉，区别仅在于，实施例2的发酵培养基中主要原料组分的质量百分比为葡萄糖8％、酵母浸膏0.8％、菜籽粕水解物1.5％、基质蒸馏水，pH值为7.0，其中，所述菜籽粕水解物的制备方法如下：首先将菜籽粕用水稀释成固液比为20％的悬浮液，然后在40℃、pH为7的环境下加入中性蛋白酶进行水解，所述中性蛋白酶的添加量为4000U/g，水解3h，干燥后得到菜籽粕水解物。
实施例3
实施例3按与实施例1相同的方法发酵高山被孢霉，区别仅在于，实施例3的发酵培养基中主要原料组分的质量百分比为葡萄糖8％、酵母浸膏0.8％、菜籽粕水解物1.5％、基质蒸馏水，pH值为7.0，其中，所述菜籽粕水解物的制备方法如下：首先将菜籽粕用水稀释成固液比为20％的悬浮液，然后将菜籽粕用植酸酶在50℃下pH值为5的环境中进行水解2h，植酸酶的添加量为10U/g，水解结束后干燥得到所述菜籽粕水解物。
实施例4
实施例4按与实施例1相同的方法发酵高山被孢霉，区别仅在于，实施例4的发酵培养基中主要原料组分的质量百分比为葡萄糖8％、酵母浸膏0.8％、菜籽粕水解物1.5％、基质蒸馏水，pH值为7.0，其中，所述菜籽粕水解物的制备方法如下：首先将菜籽粕用水稀释成固液比为20％的悬浮液，然后将菜籽粕用植酸酶、纤维素酶在50℃下、pH值为5的环境中进行水解2h，植酸酶的添加量为10U/g，纤维素酶的添加量为50U/g，水解结束后干燥得到所述菜籽粕水解物。
实施例5
实施例5按与实施例1相同的方法发酵高山被孢霉，区别仅在于，实施例5的发酵培养基中主要原料组分的质量百分比为葡萄糖8％、酵母浸膏0.8％、菜籽粕水解物1.5％、基质蒸馏水，pH值为7.0，其中，所述菜籽粕水解物的制备方法如下：首先将菜籽粕用水稀释成固液比为20％的悬浮液，然后将菜籽粕用植酸酶在50℃下、pH值为5的环境中进行水解2h，植酸酶的添加量为5U/g，再调节pH至7，料液温度降至40℃，加入中性蛋白酶进行水解，中性蛋白酶的添加量为4000U/g，水解3h，干燥得到所述菜籽粕水解物。
实施例6
实施例6按与实施例1相同的方法发酵高山被孢霉，区别仅在于，实施例6的发酵培养基中主要原料组分的质量百分比为葡萄糖8％、酵母浸膏0.8％、菜籽粕水解物1.5％、基质蒸馏水，pH值为7.0，其中，所述菜籽粕水解物的制备方法如下：首先将菜籽粕用水稀释成固液比为20％的悬浮液，然后将菜籽粕用植酸酶、纤维素酶在50℃下pH值为5的环境中进行水解2h，植酸酶的添加量为5U/g，纤维素酶的添加量为50U/g；再调节pH至7，料液温度降至40℃，加入中性蛋白酶进行水解，中性蛋白酶的添加量为3000U/g，水解2h，干燥得到所述菜籽粕水解物。
实施例7
实施例7按与实施例1相同的方法发酵高山被孢霉，区别仅在于，实施例7的发酵培养基中主要原料组分的质量百分比为葡萄糖8％、酵母浸膏0.8％、菜籽粕水解物1.5％、基质蒸馏水，pH值为7.0，其中，所述菜籽粕水解物的制备方法如下：首先将菜籽粕用水稀释成固液比为20％的悬浮液，然后将菜籽粕用植酸酶、木聚糖酶在50℃下pH值为5的环境中进行水解2h，植酸酶的添加量为10U/g，木聚糖酶的添加量为50U/g；再调节pH至7，料液温度降至40℃，加入中性蛋白酶进行水解，中性蛋白酶的添加量为3000U/g，水解2h，干燥得到所述菜籽粕水解物。
实施例8
实施例8按与实施例1相同的方法发酵高山被孢霉，区别仅在于，实施例8的发酵培养基中主要原料组分的质量百分比为葡萄糖8％、酵母浸膏0.8％、菜籽粕水解物1.5％、基质蒸馏水，pH值为7.0，其中，所述菜籽粕水解物的制备方法如下：首先将菜籽粕用水稀释成固液比为20％的悬浮液，然后将菜籽粕用植酸酶、纤维素酶在60℃下pH值为5.5的环境中进行水解1h，植酸酶的添加量为20U/g，纤维素酶的添加量为150U/g；再调节pH至6，料液温度降至30℃，加入中性蛋白酶进行水解，中性蛋白酶的添加量为1000U/g，水解3h，干燥得到所述菜籽粕水解物。
实施例9
实施例9按与实施例1相同的方法发酵高山被孢霉，区别仅在于，实施例9的发酵培养基中主要原料组分的质量百分比为葡萄糖8％、酵母浸膏0.8％、菜籽粕水解物1.5％、基质蒸馏水，pH值为7.0，其中，所述菜籽粕水解物的制备方法如下：首先将菜籽粕用水稀释成固液比为20％的悬浮液，然后将菜籽粕用植酸酶、纤维素酶在50℃下pH值为5的环境中进行水解2h，植酸酶的添加量为5U/g，纤维素酶的添加量为50U/g；再调节pH至7，料液温度降至40℃，加入中性蛋白酶进行水解，中性蛋白酶的添加量为4000U/g，水解4h，干燥得到所述菜籽粕水解物。
实施例10
实施例10按与实施例1相同的方法发酵高山被孢霉，区别仅在于，实施例10的发酵培养基中主要原料组分的质量百分比为葡萄糖8％、菜籽粕水解物2.5％、基质蒸馏水，pH值为7.0，其中，所述菜籽粕水解物采用实施例6中制备得到的菜籽粕水解物。
实施例11
实施例11采用的菜籽粕水解物为实施例6中制备得到的菜籽粕水解物。
1.原始菌株的活化：将使用安倍管保存的高山被孢霉菌株接种到PDA斜面培养基上，在28±1℃下培养8天，选取菌丝和孢子生长旺盛的PDA培养基平板，取下培养基上的菌丝和孢子，用无菌水制成孢子悬液；
2.种子培养：将孢子悬液接种于摇瓶培养基中，在28±1℃下振摇培养72h，摇床振摇转速为115转/分钟，液体培养基中主要原料组分的质量百分比为葡萄糖6％、酵母浸膏1.5％、基质蒸馏水，pH值为7.0；
3.发酵培养：将种子培养液按接种量5％接种至7L玻璃罐中进行发酵培养，该玻璃罐中的发酵培养基中主要原料组分的质量百分比为葡萄糖5％、酵母浸膏0.8％、菜籽粕水解物1.5％，基质蒸馏水。温度28℃，转速500rpm，通气量1.5VVm，pH控制在7.0。当发酵液中葡萄糖含量低于1wt％，开始流加葡萄糖溶液至葡萄糖含量达到3wt％时终止。发酵时间为190h。
对比例1
对比例1按与实施例1相同的方法发酵高山被孢霉，区别仅在于，对比例1的发酵培养基中主要原料组分的质量百分比为葡萄糖8％、酵母浸膏0.8％、酵母粉1.5％、基质蒸馏水，pH值为7.0。
对上述实施例和对比例制备的菜籽粕水解物和发酵产物进行下述检测：
1、植酸降解率和小肽含量
按照GB 17406-1998分别测定实施例1中菜籽粕和实施例2-9所制菜籽粕水解物中的植酸含量，通过菜籽粕初始和水解步骤处理后植酸的含量得到植酸降解率。
小肽为分子量在10000道尔顿以下的小分子蛋白，采用三氯乙酸检测法测定实施例1中菜籽粕和实施例2-9中菜籽粕水解物的小肽含量：准确称取样品1.0g(精确至0.001g)，加入15％三氯乙酸(TCA)溶液溶解并定容至50mL，混匀并静置5min，过滤，滤液作为备用液，然后按照GB/T 22492-2008中附录B“肽含量的测定方法”进行测定，即得肽含量。
植酸降解率和小肽含量的测定结果如表1所示。
表1植酸降解率和小肽含量
植酸降解率％ 小肽％
实施例1 - 0.25
实施例2 0.27 10.00
实施例3 49.6 0.43
实施例4 80.5 0.48
实施例5 56.9 12.20
实施例6 79.5 18.56
实施例7 68.2 13.42
实施例8 89.5 15.23
实施例9 81.3 27.40
由表1可知，纤维素酶和植酸酶的共同酶解能够显著提高植酸的降解效率，并且增加菜籽粕的水溶性，提高其中小肽的含量。而木聚糖酶与植酸酶的共同酶解效果稍逊。
2、生物量、菌体总油含量、花生四烯酸的含量与产量
生物量采用将发酵液取样后烘干称重进行测定，测定结果如表2所示。
实施例和对比例所得发酵产物中菌体总油含量的测定方法为：称取湿菌体后m0，加入盐酸，消化样品。再加入石油醚混合，加入乙醚混合，静置分层。倒出上清液于称量好的平底烧瓶中m1，蒸干后，置于烘箱中干燥再次称重m2。测定结果如表2所示。
Figure BDA0002270185920000101
式中：m0—试样的质量，g
m1—烘前平底烧瓶的质量，g
m2—烘后平底烧瓶的质量，g
实施例和对比例所得发酵产物中花生四烯酸的含量的测定使用国标GB 26400-2001，测定结果如表2所示。
表2生物量、菌体总油含量、花生四烯酸的含量与产量
生物量g/L 总油％ AA含量％ AA产量g/L
实施例1 20.23 28.28 43.20 2.47
实施例2 21.25 28.53 44.64 2.71
实施例3 26.65 32.06 44.75 3.82
实施例4 27.93 32.55 49.62 4.51
实施例5 27.84 32.15 45.79 4.10
实施例6 28.49 32.92 54.73 5.13
实施例7 27.20 31.70 50.47 4.35
实施例8 28.50 32.84 54.00 5.05
实施例9 30.72 30.45 46.80 4.38
实施例10 24.40 30.55 51.82 3.86
实施例11 31.60 43.5 56.98 7.83
对比例1 28.65 33.06 47.05 4.46
由表2可知，未经处理的菜籽粕对高山被孢霉的毒性影响较大，脱去植酸的菜籽粕发酵结果已经能够使高山被孢霉的产物水平达到传统培养基水平。部分菜籽粕蛋白水解成小肽能够促进高山被孢霉的生长代谢，使其产AA的水平较之于传统培养基成分有所提高，但是能够看到小肽含量过高反而影响了高山被孢霉后期的产物积累，使得AA总产量有所减少。研究结果中还显示高山被孢霉对于氮源比较挑剔，在利用菜籽粕进行发酵培养时还需要缓冲氮源成分。另外，本方法在放大实验中表现出了良好的稳定性。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种高山被孢霉发酵生产花生四烯酸的方法，其特征在于，以菜籽粕或菜籽粕水解物为发酵培养基的主要成分，发酵培养高山被孢霉。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵培养基还包含葡萄糖和酵母浸膏，优选的，以所述发酵培养基的总质量计，包含5-8％葡萄糖、0.5-1％酵母浸膏和1-2％菜籽粕水解物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，以所述菜籽粕水解物干物质的重量计，所述菜籽粕水解物中小肽的含量≧10％，优选的，所述小肽的含量为10-20％。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中，所述菜籽粕水解物通过将含有菜籽粕的原料采用选自木聚糖酶、纤维素酶、植酸酶和蛋白酶中的一种或几种进行酶解得到。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，以所述菜籽粕的质量计，所述木聚糖酶的添加量为10-450U/g，所述纤维素酶的添加量为1-300U/g，所述植酸酶的添加量为2-35U/g，所述蛋白酶的添加量为1000-4000U/g。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中，所述菜籽粕水解物由包括以下步骤的制备方法得到：
(1)将含有菜籽粕的原料采用选自木聚糖酶和纤维素酶中的一种或两种和植酸酶进行酶解；
(2)采用蛋白酶进行进一步酶解，得到菜籽粕水解物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，步骤(1)中，将含有菜籽粕的原料采用纤维素酶和植酸酶进行酶解，优选的，将含有菜籽粕的原料采用纤维素酶和植酸酶进行共同酶解，更优选的，以所述菜籽粕的质量计，共同酶解时所述纤维素酶的添加量为10-150U/g，所述植酸酶的添加量为5-20U/g。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，步骤(1)中，所述酶解的温度为40-60℃，优选的，所述酶解的pH为3.5-6.0，更优选的，所述酶解的时间为1-2h。
9.根据权利要求4-8任一项所述的方法，其中，所述蛋白酶选自碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶中的一种或几种，优选的，所述蛋白酶为中性蛋白酶，更优选的，所述中性蛋白酶的酶解温度为30-50℃，酶解pH为6.0-8.0，酶解时间为1-3h，添加量为1000-3000U/g。
10.一种高山被孢霉的发酵产物，其特征在于，通过权利要求1-9任一项所述的方法制备得到。
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