CN112553110A - 一种菌粕液的制备方法及利用菌粕液的发酵培养基与应用 - Google Patents

一种菌粕液的制备方法及利用菌粕液的发酵培养基与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体公开了一种菌粕液的制备方法及利用菌粕液的发酵培养基与应用，本发明菌粕液的制备方法包括以下步骤：S1.高山被孢霉发酵；S2.菌粕的水解：将步骤S1制备的菌粕过筛，收集过筛颗粒，加入盐酸混合，然后沸水浴回流水解，得水解液；S3.菌粕液的制备：取出步骤S2制备的水解液迅速冷却，过滤，收集滤液加入氢氧化钠溶液混合，得菌粕液。本发明菌粕液的制备方法操作简单，用料成本低，应用于工业化生产中的可操作性强；并且本发明的菌粕液可以替代部分的氮源应用于发酵培养基中，降低了生产成本，减少了环境污染，且增强了戊糖片球菌的活菌数，此外，本发明发酵培养基还可以应用于菌种的筛选。

Description

一种菌粕液的制备方法及利用菌粕液的发酵培养基与应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种菌粕液的制备方法及利用菌粕液的发酵培养基与应用。
背景技术
花生四烯酸(ARA)的发酵主要是利用高山被孢霉进行生产，高山被孢霉发酵获得霉菌生物体，将富集的霉菌生物体滤干并干燥，浸提获得花生四烯酸(ARA)后的微生物残体，将此微生物残体称为高山被孢霉菌粕。
高山被孢霉菌粕含有较高的蛋白质，其含量可达33％，通过对高山被孢霉菌粕检测分析，该物质的含氮量高达5％以上，含氮量丰富，是优质的氮源；高山被孢霉菌粕虽然具有较高含量的蛋白质，但是其还含有很多大分子量的蛋白，这对于高山被孢霉菌粕的充分利用具有一定的阻碍。有中国专利CN101613724B公开了一种重复利用高山被孢霉菌粕制备花生四烯酸的方法，高山被孢霉菌粕在进行循环使用前采用膨化法对高山被孢霉菌粕进行膨化处理，进行粉碎后，再采用复合酶法对高山被孢霉菌粕进行水解处理。但是该方法采用酶水解具有较高的成本，且操作较繁琐。因此，从经济角度、工业生产的可操作性角度以及菌种的适用性角度，对于高山被孢霉菌粕中营养物质的释放，需要建立一种操作相对简单，成本低，且应用效果好的方法。
并且，在益生菌菌种的大量生产中，常规乳酸菌培养基MRS培养基中具有牛肉膏粉、胰蛋白胨等价格较贵的氮源的添加，造成培养菌种的成本较高，因此，还亟需一种成本低、环境污染小及活菌数高的发酵培养基。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种菌粕液的制备方法及利用菌粕液的发酵培养基与应用，本发明菌粕液的制备方法操作简单，用料成本低，应用于工业化生产中的可操作性强；并且本发明的菌粕液可以替代部分的氮源应用于发酵培养基中，降低了生产成本，减少了环境污染，且增强了戊糖片球菌的活菌数。
本发明的第一目的是提供了一种菌粕液的制备方法，为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种菌粕液的制备方法，包括以下步骤：
S1.高山被孢霉发酵：高山被孢霉发酵培养获得高山被孢霉发酵液，过滤过滤烘干，得干燥菌粕；
S2.菌粕的水解：将步骤S1制备的菌粕过筛，收集过筛颗粒，加入盐酸混合，然后沸水浴回流水解，得水解液；
S3.菌粕液的制备：取出步骤S2制备的水解液迅速冷却，过滤，收集滤液加入氢氧化钠溶液混合，得菌粕液。
在本发明的技术方案中，本发明人采用酸水解的方法将菌粕中的营养物质及氨基酸充分溶解于水中，并采用氢氧化钠进行中和，操作简单，用料成本低，应用于工业生产中的可操作性强。
作为本发明所述菌粕液的制备方法的优选实施方式，所述步骤S2中盐酸的浓度为1-3％，所述菌粕与盐酸的重量比为(1-2)：100。
作为本发明所述菌粕液的制备方法的优选实施方式，所述步骤S3中收集滤液加入质量分数为10-30％的氢氧化钠溶液混合，得pH值为5.8-6.2的菌粕液。
本发明限定了菌粕与盐酸的重量比，并且用氢氧化钠进行中和，使得菌粕中的营养物质及氨基酸可以充分溶解于水中，保证了菌体的增殖及减少了污染物的排放。
作为本发明所述菌粕液的制备方法的优选实施方式，所述步骤S2中菌粕过60目的筛分。
本发明将菌粕过60目的筛分，留取小颗粒菌粕，使得菌粕水解更充分。
本发明的第二目的是提供了一种利用菌粕液的发酵培养基，所述发酵培养基包括以下重量份数的组分：
胰蛋白胨2.5-10份；牛肉粉1.25-5份；酵母浸出粉3-5份；葡萄糖15-25份；K2HPO4·7H2O 1.5-2.5份；醋酸钠·3H2O 4-6份；柠檬酸三铵1.5-2.5份；Mg2+水溶性化合物0.15-0.25份；Mn2+水溶性化合物0.04-0.06份；胆固醇0.75-1.25份；吐温80 0.75-1.25份和上述制备方法获得的菌粕液，所述胰蛋白胨与牛肉粉重量之和与菌粕液重量的比例为(0.75-3)：(50-200)。
在本发明的技术方案中，本发明人尝试将水解后的菌粕液替代部分常用氮源加入至发酵培养基中，从经济角度方面来说，本发明的发酵培养基可以对昂贵氮源进行部分替代，进而降低菌种发酵培养基的成本。
并且，本发明的发酵培养基充分利用菌粕液中的营养物质及氨基酸，保证菌体增殖及减少污染物排放。本发明的发酵培养基与常规的乳酸菌培养基MRS相比，更为显著提高了菌种的活菌数，此外，本发明菌粕液的添加可以进一步减少环境的污染，达到“变废为宝”的效果。
作为本发明所述发酵培养基的优选实施方式，所述发酵培养基包括以下重量份数的组分：
胰蛋白胨2.5-10份；牛肉粉1.25-5份；酵母浸出粉3-4份；葡萄糖15-20份；K2HPO4·7H2O 1.5-2份；醋酸钠·3H2O 4-5份；柠檬酸三铵1.5-2份；Mg2+水溶性化合物0.15-0.2份；Mn2+水溶性化合物0.04-0.05份；胆固醇0.75-1份；吐温80 0.75-1份和上述制备方法获得的菌粕液，所述胰蛋白胨与牛肉粉重量之和与菌粕液重量的比例为(0.75-3)：(50-200)。
作为本发明所述发酵培养基的优选实施方式，所述发酵培养基包括以下重量份数的组分：
胰蛋白胨2.5-7.5份；牛肉粉1.25-3.75份；酵母浸出粉3-4份；葡萄糖15-20份；K2HPO4·7H2O 1.5-2份；醋酸钠·3H2O 4-5份；柠檬酸三铵1.5-2份；Mg2+水溶性化合物0.15-0.2份；Mn2+水溶性化合物0.04-0.05份；胆固醇0.75-1份；吐温80 0.75-1份和上述制备方法获得的菌粕液，所述胰蛋白胨与牛肉粉重量之和与菌粕液重量的比例为(0.15-0.45)：(10-30)。
在本发明的技术方案中，本发明人发现将水解后的菌粕液替代部分常用氮源加入至发酵培养基中，当菌粕液的替代比为质量百分比计为25％时，可以提高戊糖片球菌的活菌数，并且本发明的发酵培养基的培养成本较常规的乳酸菌培养基MRS要低，在保证发酵培养基正常的发酵性能及菌种活菌数，还可以废物利用，减少污物排放。
通过戊糖片球菌的活菌数测定实验可知，本发明发酵培养基培养出的戊糖片球菌的生长密度与常规的乳酸菌培养基MRS(对照)培养效果相当，且戊糖片球菌的活菌数略高于常规的乳酸菌培养基MRS，菌种培养后的发酵液的pH值、总酸、发酵液测定密度与活菌计数结果相符，经试验验证，菌种培养后的发酵液的pH值越低、总酸越高、发酵液菌密度越高，其菌种的活菌数越高。
作为本发明所述发酵培养基的优选实施方式，所述Mg2+水溶性化合物为MgSO4·7H2O；所述Mn2+水溶性化合物为MnSO4·4H2O。
本发明的第三目的是提供了一种发酵戊糖片球菌的方法，将戊糖片球菌接种于上述发酵培养基中培养。
本发明的第四目的是提供了上述发酵培养基在筛选菌种中的应用。
通过本发明试验例结果发现，本发明的发酵培养基对嗜酸乳杆菌适用性不强，不能增加嗜酸乳杆菌的活菌数，但是可以在一定程度上增加戊糖片球菌的活菌数，因此，本发明的发酵培养基对戊糖片球菌的增殖具有一定的针对性，对于单独开发单独筛选菌种具有一定的前景。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供了一种菌粕液的制备方法，采用酸水解的方法将菌粕中的营养物质及氨基酸充分溶解于水中，并采用氢氧化钠进行中和，操作简单，用料成本低，应用于工业生产中的可操作性强；
2.本发明提供了一种发酵培养基，组分简单，将菌粕液替代部分常用氮源加入至发酵培养基中，降低了菌种发酵培养基的成本，减少了污染物的排放，并且提高了菌体的增殖效果；通过本发明发酵培养基得到的发酵液pH值越低、总酸越高、发酵液菌密度越高，其菌种的活菌数越高。
附图说明
图1为不同质量替代比的菌粕液替代氮源的发酵培养基对戊糖片球菌增殖活菌数测定的结果示意图；
图2为不同质量替代比的菌粕液替代氮源的发酵培养基对嗜酸乳杆菌增殖活菌数测定的结果示意图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1、一种菌粕液的制备方法
一种菌粕液的制备方法，包括以下步骤：
S1.高山被孢霉发酵：高山被孢霉发酵培养获得高山被孢霉发酵液，收集菌体，洗涤，板框压滤，取滤饼，烘干，提取细胞油脂，板框压滤，得到脱油菌体，烘干，得干燥菌粕；
S2.菌粕的水解：将步骤S1制备的菌粕过60目网筛去大颗粒，收集过筛颗粒，称取15g过筛颗粒置于2L三角瓶中，加入1000mL浓度为2％的盐酸混合，轻轻摇动三角瓶至过筛颗粒湿润，瓶口装置回流冷凝器于沸水浴中回流水解3小时，得水解液；
S3.菌粕液的制备：取出步骤S2制备的水解液迅速冷却，使用8层纱布过滤渣滓，收集滤液加入质量分数为20％的氢氧化钠溶液中和，分装于250mL及500mL三角瓶中，121℃高压灭菌20min，得菌粕液，菌粕液的pH值为6.0。
实施例2、一种菌粕液的制备方法
一种菌粕液的制备方法，包括以下步骤：
S1.高山被孢霉发酵：与实施例1中的步骤S1相同；
S2.菌粕的水解：将步骤S1制备的菌粕过60目网筛去大颗粒，收集过筛颗粒，称取10g过筛颗粒置于2L三角瓶中，加入1000mL浓度为1％的盐酸混合，轻轻摇动三角瓶至过筛颗粒湿润，瓶口装置回流冷凝器于沸水浴中回流水解3小时，得水解液；
S3.菌粕液的制备：取出步骤S2制备的水解液迅速冷却，使用8层纱布过滤渣滓，收集滤液加入质量分数为10％的氢氧化钠溶液中和，分装于250mL及500mL三角瓶中，121℃高压灭菌20min，得菌粕液，菌粕液的pH值为6.2。
实施例3、一种菌粕液的制备方法
一种菌粕液的制备方法，包括以下步骤：
S1.高山被孢霉发酵：与实施例1中的步骤S1相同；
S2.菌粕的水解：将步骤S1制备的菌粕过60目网筛去大颗粒，收集过筛颗粒，称取20g过筛颗粒置于2L三角瓶中，加入1000mL浓度为3％的盐酸混合，轻轻摇动三角瓶至过筛颗粒湿润，瓶口装置回流冷凝器于沸水浴中回流水解3小时，得水解液；
S3.菌粕液的制备：取出步骤S2制备的水解液迅速冷却，使用8层纱布过滤渣滓，收集滤液加入质量分数为30％的氢氧化钠溶液中和，分装于250mL及500mL三角瓶中，121℃高压灭菌20min，得菌粕液，菌粕液的pH值为5.8。
实施例4-10、一种利用菌粕液的发酵培养基
本发明实施例4-10利用实施例1制备的菌粕液的发酵培养基的配方如下表1所示。
表1
Figure BDA0002840199110000061
实施例4-5及实施例7-9的发酵培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)按照上述含量分别称取胰蛋白胨、牛肉粉、酵母浸出粉、葡萄糖、K2HPO4·7H2O、醋酸钠·3H2O、柠檬酸三铵、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O胆固醇、吐温80及实施例1制备的菌粕液各组分，用蒸馏水溶解，并定容至1L，调节培养基体系的pH值为6.2；
(2)将上述定容后的溶液置于121℃高压灭菌20min后，冷却后保存备用，制得发酵培养基。
实施例6的发酵培养基的制备方法与上述方法相似，区别在于，不含有菌粕液。
实施例10的发酵培养基的制备方法与上述方法相似，区别在于，不含有胰蛋白胨和牛肉粉。
实施例11、一种发酵戊糖片球菌的方法
一种发酵戊糖片球菌的方法，包括以下步骤：
S1.戊糖片球菌的活化和培养：取-80℃冻存的戊糖片球菌，接种于MRS液体培养基中，于恒温箱中37℃培养24h，用接种环蘸取少量液体，在固体MRS琼脂平板上划线培养48h，将活化好的戊糖片球菌挑选单菌接种于1mL MRS培养基，在温度为37℃条件下培养24h后，形成一级种子液，再以1％的接种量接种于MRS培养基，在温度为37℃条件下培养24h后，形成二级种子液；
S2.戊糖片球菌的发酵：将步骤S1制备的二级种子液按2％的接种量分别接种于上述实施例4-10的发酵培养基中发酵培养，接种后在温度为37℃条件下静置培养24h，形成发酵液。
试验例、测定发酵液的pH、总酸、菌密度及活菌计数
1.OD值菌液密度的测定：取上述实施例6-10的发酵培养液形成的发酵液1mL于1.5mL离心管中4500rpm 10min离心取上清，无菌水洗涤一次，弃上清，加入1mL无菌水重悬，吸取500μL加入4.5mL纯水，波长λ＝600nm测定吸光光度值。
2.pH的测定：取上述实施例6-10的发酵培养液形成的发酵液40mL于50mL离心管中4500rpm 15min离心取上清，CNaOH＝0.0981M滴定总酸及pH计测定pH值。
3.总酸的测定：分别将实施例6-10的发酵培养液形成的发酵液5mL和水10mL混匀，加入1-2滴酚酞，吸取碱液使用滴定管滴加，待液体变粉且摇晃10s不褪色则记录滴加碱液的体积，进一步计算总酸含量，。
表2
Figure BDA0002840199110000071
Figure BDA0002840199110000081
4.戊糖片球菌的活菌数测定：将上述分别由实施例4-10的发酵培养基获得的发酵液，用无菌生理盐水进行十倍梯度稀释，稀释至10-10，分别取10-1-10-10这10个梯度的稀释液，吸取50μL，滴加于MRS平板，涂布均匀，戊糖片球菌37℃厌氧培养48h后取出进行菌落计数。
从图1可知，与实施例6发酵培养基中不含有本发明制备的菌粕液(作为对照组)相比，本发明实施例7采用替代比为质量百分比计为25％的菌粕液时，可以提高戊糖片球菌的活菌数，且优于对照组培养基增殖戊糖片球菌的活菌数。
并且本发明的发酵培养基的培养成本较常规的乳酸菌培养基MRS要低，在保证发酵培养基正常的发酵性能及菌种活菌数，还可以废物利用，减少污物排放。
本发明发酵培养基培养出的戊糖片球菌的生长密度与常规的乳酸菌培养基MRS(对照)培养效果相当，且戊糖片球菌的活菌数高于常规的乳酸菌培养基MRS，菌种培养后的发酵液的pH值、总酸、发酵液测定密度与活菌计数结果相符，从表2可知，菌种培养后的发酵液的pH值越低、总酸越高、发酵液菌密度越高，其菌种的活菌数越高。
5.嗜酸乳杆菌的活菌数测定：将上述分别由实施例4-10的发酵培养基获得的发酵液，用无菌生理盐水进行十倍梯度稀释，稀释至10-10，分别取10-1-10-10这10个梯度的稀释液，吸取50μL，滴加于MRS平板，涂布均匀，嗜酸乳杆菌37℃厌氧培养48h后取出进行菌落计数。
从图2可知，本发明发酵培养基不适合嗜酸乳杆菌的增殖，对嗜酸乳杆菌的适用性不强，对于戊糖片球菌的增加活菌数具有一定的针对性，因此，对于单独开发单独筛选菌种具有一定的前景。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种菌粕液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.高山被孢霉发酵：高山被孢霉发酵培养获得高山被孢霉发酵液，过滤烘干，得干燥菌粕；
S2.菌粕的水解：将步骤S1制备的菌粕过筛，收集过筛颗粒，加入盐酸混合，然后沸水浴回流水解，得水解液；
S3.菌粕液的制备：取出步骤S2制备的水解液迅速冷却，过滤，收集滤液加入氢氧化钠溶液混合，得菌粕液。
2.如权利要求1所述菌粕液的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中盐酸的浓度为1-3％，所述菌粕与盐酸的重量比为(1-2)：100。
3.如权利要求1所述菌粕液的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中收集滤液加入质量分数为10-30％的氢氧化钠溶液混合，得pH值为5.8-6.2的菌粕液。
4.如权利要求1所述菌粕液的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中菌粕过60目的筛分。
5.一种发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基包括以下重量份数的组分：
胰蛋白胨2.5-10份；牛肉粉1.25-5份；酵母浸出粉3-5份；葡萄糖15-25份；K2HPO4·7H2O1.5-2.5份；醋酸钠·3H2O 4-6份；柠檬酸三铵1.5-2.5份；Mg2+水溶性化合物0.15-0.25份；Mn2+水溶性化合物0.04-0.06份；胆固醇0.75-1.25份；吐温80 0.75-1.25份和如权利要求1所述的制备方法获得的菌粕液，所述胰蛋白胨与牛肉粉重量之和与菌粕液重量的比例为(0.75-3)：(50-200)。
6.如权利要求5所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基包括以下重量份数的组分：
胰蛋白胨2.5-10份；牛肉粉1.25-5份；酵母浸出粉3-4份；葡萄糖15-20份；K2HPO4·7H2O1.5-2份；醋酸钠·3H2O 4-5份；柠檬酸三铵1.5-2份；Mg2+水溶性化合物0.15-0.2份；Mn2+水溶性化合物0.04-0.05份；胆固醇0.75-1份；吐温80 0.75-1份和如权利要求1所述的制备方法获得的菌粕液，所述胰蛋白胨与牛肉粉重量之和与菌粕液重量的比例为(0.75-3)：(50-200)。
7.如权利要求6所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基包括以下重量份数的组分：
胰蛋白胨2.5-7.5份；牛肉粉1.25-3.75份；酵母浸出粉3-4份；葡萄糖15-20份；K2HPO4·7H2O 1.5-2份；醋酸钠·3H2O 4-5份；柠檬酸三铵1.5-2份；Mg2+水溶性化合物0.15-0.2份；Mn2+水溶性化合物0.04-0.05份；胆固醇0.75-1份；吐温80 0.75-1份和如权利要求1所述的制备方法获得的菌粕液，所述胰蛋白胨与牛肉粉重量之和与菌粕液重量的比例为(0.15-0.45)：(10-30)。
8.如权利要求5-7任一所述的发酵培养基，其特征在于，所述Mg2+水溶性化合物为MgSO4·7H2O；所述Mn2+水溶性化合物为MnSO4·4H2O。
9.一种发酵戊糖片球菌的方法，其特征在于，将戊糖片球菌接种于权利要求书5-7任一项的发酵培养基中培养。
10.如权利要求5-7任一所述的发酵培养基在筛选菌种中的应用。
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