CN103039710B - 一种混合菌株发酵生产茶籽粕饲料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种混合菌株固态发酵生产茶籽粕饲料的方法，通过将面包乳杆菌和纳豆芽孢杆菌接种于茶籽粕中并进行好氧发酵与厌氧发酵，从而生产出低毒的饲料；本发明弥补了茶籽粕在饲料应用方面的不足，降解了茶皂素，降低了其溶血性；降解了茶籽粕中的纤维素，利用乳酸菌发酵产生风味物质，提高饲料的适口性；另外，由于纳豆芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种，即使在加热干燥后该菌仍将以芽孢的形式存在于发酵后的茶籽粕中，因此可发挥益生菌的作用。

Description

一种混合菌株发酵生产茶籽粕饲料的方法

技术领域:

本发明涉及一种发酵生产茶籽粕的方法，具体涉及一种利用面包乳杆菌（Lactobacillus crustorum）与纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）混合发酵生产茶籽粕饲料的方法。

背景技术:

皂苷的毒性主要表现为溶血性，一般认为，溶血性是其苷元可以与红细胞壁上胆甾醇结合生成不溶于水的复合物沉淀，破坏细胞渗透压，使红细胞发生崩解，进而导致溶血现象。皂苷有无溶血活性与皂苷元有关，活性强弱与糖分子的大小、糖分子之间的连接、糖分子上的取代基等有关，此外还与皂苷的浓度有关。

茶皂素的结构如附图1所示，属于三萜类皂苷，由糖体、配基和有机酸组成。从分子结构看，茶皂素是一种非离子表面活性剂。其亲水基团由强电负性的含氧基团组成，这些基团集中在茶皂素的糖体配体，有机酸配体及皂苷配基的连接部位，构成亲水部分。其中配基是由非极性的碳氢环链构成，在水溶液中呈现憎水的倾向，成为亲油的主体，所以茶皂素的结构分为亲水和亲油两部分。Sobolewska等在发表于2010年9月（9卷，3期）《Phytochemistry Review》（植物化学评论）425～474页的《Saponins ascytotoxic agents:a review》（综述：皂苷—细胞毒素）一文中称利用酶解法去除皂苷的糖体配体，会降低皂苷的溶血性。酶水解工业化应用成本较高，如能利用微生物发酵，以降低茶籽粕的毒性，将更有工业化应用前景。

茶籽粕的纤维素含量高，作为饲料适口性不好。纳豆芽孢杆菌可产高活性纤维素酶，降解原料中的纤维素；同时，乳酸菌可产一些风味成分，有利于提高产品的适口性。

发明内容:

本发明的目的在于提供两种发酵菌株，以及利用该菌株进行固态发酵生产茶籽粕饲料的方法，经发酵后使茶籽粕的溶血作用明显下降，降低了茶籽粕的毒性；降解了茶籽粕中的纤维素，利用面包乳杆菌发酵产生风味物质，提高饲料的适口性；利用纳豆芽孢杆菌发酵，使发酵、干燥后的茶籽粕中存在益生菌。

为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：

一种面包乳杆菌菌株，其分类命名为面包乳杆菌（Lactobacilluscrustorum），其保藏编号为CGMCC NO.6304，保藏日期为2012年6月28日,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

一种纳豆芽孢杆菌菌株，其分类命名为纳豆芽孢杆菌（Bacillusnatto），其保藏编号为CGMCC NO.2801，保藏日期为2008年12月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏单位地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。

本发明还公开了所述面包乳杆菌菌株与纳豆芽孢杆菌混合发酵茶籽粕生产茶籽粕饲料的方法，包括以下步骤：

1、种子培养：

（1）将所述面包乳杆菌菌株涂布于MRS固体培养基，然后于30～40℃厌氧培养2～3天，挑取单菌落接种到种子培养基A中，继续30～40℃厌氧培养,使菌液的OD₆₀₀值达到0.8±0.1，备用。所述种子培养基A成分为：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母抽提物5.0g，纤维二糖20.0g，吐温-801ml，柠檬酸三铵2.0g，K₂HPO₄2.0g，MgSO₄·7H₂00.2g，MnSO₄·2H₂O0.05g，蒸馏水1000ml。

（2）将上述的纳豆芽孢杆菌菌株涂布于LB固体培养基，将涂布好的平板30～40℃好氧培养1～2天，挑取单菌落接种到种子培养基B中，继续30～40℃培养12～24小时,使菌液的OD₆₀₀值达到0.8，备用。所述的种子培养基B成分为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml。

2、茶籽粕中加入适量的含一定量葡萄糖、半乳糖和硫酸铵的pH5.0的缓冲溶液，混合均匀后灭菌备用，得到茶籽粕发酵原料。

3、将步骤1中培养的面包乳杆菌与纳豆芽孢杆菌种子液分别接种于步骤2所述的茶籽粕发酵原料中，接种量均为菌液：茶籽粕等于3～10ml：100g。接种后的原料于30～40℃好氧发酵24～48小时，再于30～40℃厌氧发酵24～48小时，得发酵的茶籽粕饲料。

较佳的，步骤2中所述缓冲溶液为pH5.0磷酸盐缓冲溶液，所述磷酸盐缓冲溶液中添加了葡萄糖1.5%(w/w)、半乳糖1.5%(w/w)和硫酸铵2%(w/w)。

本发明的优点是：利用面包乳杆菌发酵的茶籽粕溶血作用明显下降，从而弥补了茶籽粕在饲料应用方面的不足，降解了茶籽粕中的纤维素，且面包乳杆菌作为一种乳酸菌，能够产生风味物质，提高饲料的适口性；枯草芽孢杆菌是目前国家批准的19种饲料添加剂益生菌之一，枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用，纳豆芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种，即使在加热干燥后纳豆芽孢杆菌仍将以芽孢的形式存在于发酵后的茶籽粕饲料中，能够发挥益生菌的作用。本发明的好氧发酵过程中，纳豆芽孢杆菌能够迅速消耗环境中的游离氧，造成低氧环境，非常有利于后续的厌氧发酵过程中面包乳杆菌的生长繁殖。

附图说明：

图1：茶皂素结构图

Ang:R₁：

或CH₃COO-，R₂：-H或-OH。

图2：发酵前后茶籽粕提取物的溶血效果

具体实施方式：

实施例1：

1、配制培养基：

MRS培养基（面包乳杆菌）：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母抽提物5.0g，纤维二糖20.0g，吐温-801ml，柠檬酸三铵2.0g，K₂HPO₄2.0g，MgSO₄·7H₂00.2g，MnSO₄·2H₂O0.05g，蒸馏水1000ml，121℃，高压灭菌15min，固体培养基是在液体培养基中再加琼脂18.0g，然后121℃高压灭菌15min。

LB培养基（纳豆芽孢杆菌）：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml。121℃，高压灭菌15min，固体培养基是在液体培养基中再加琼脂18.0g，然后121℃高压灭菌15min。

种子培养基A成分为：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母抽提物5.0g，纤维二糖20.0g，吐温-801.0ml，柠檬酸三铵2.0g，K₂HPO₄2.0g，MgSO₄·7H₂00.2g，MnSO₄·2H₂O0.05g，蒸馏水1000ml。

种子培养基B成分为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml。

2、种子培养：

从甘油保藏管中挑取少许保藏号为CGMCC No.6304的面包乳杆菌菌液，于MRS固体培养基上涂布，将涂布好的平板37℃厌氧培养三天，挑取单菌落接种到种子培养基A中，继续37℃培养24小时,使菌液的OD₆₀₀值达到0.8，备用。

从甘油保藏管中挑取少许保藏号为CGMCC NO.2801的纳豆芽孢杆菌菌液，于LB固体培养基上涂布，将涂布好的平板37℃好氧培养48小时，挑取单菌落接种到种子培养基B中，继续37℃培养12小时,使菌液的OD₆₀₀值达到0.8，备用。

3、茶籽粕固态发酵：

取部分脱去茶皂素的茶籽粕(含2.3%(w/w)茶皂素)90g，加入72ml的pH5.0磷酸盐缓冲溶液，所述磷酸盐缓冲溶液中添加了葡萄糖1.5%(w/w)、半乳糖1.5%(w/w)和硫酸铵2%(w/w)。搅拌均匀后，于121℃高压灭菌15min，得到茶籽粕发酵原料，备用。

在超净台中移取上述两种经种子培养后的菌液各4.5ml同时加入上述未发酵的含90g茶籽粕的发酵原料中，搅拌均匀，置于37℃恒温有氧发酵24小时。

将上述好氧发酵完成的固体培养基真空脱气，密封，置于37℃恒温培养36小时，得发酵的茶籽粕饲料。

4.提取茶皂素

称取发酵的茶籽粕饲料9g，加入50ml70%(v/v)乙醇，80℃振摇4小时，抽滤，溶液旋转蒸发浓缩，浓缩至干，将所得产物称重并用生理盐水配制成100μg/ml的茶皂素溶液A，备用；称取茶籽粕发酵原料9g,加入50ml70%(v/v)乙醇，80℃振摇4小时，抽滤，溶液旋转蒸发浓缩至干，将所得产物称重并用生理盐水配制成100μg/ml的茶皂素溶液B，作为对照，备用，所述茶皂素的结构如图1所示。

5.溶血实验验证发酵效果

（1）取血：将肝素钠和装有生理盐水的盛血容器置于冰箱中冷藏15min以上，用75%(v/v)酒精对动物取血部位进行消毒。用一次性注射器吸取少量的肝素钠溶液，抗凝1ml血液不少于15IU肝素钠，用注射器从动物静脉中取血后，去除针头，将血慢慢推到装有冰生理盐水的试管中。

（2）血样处理：将血样于4℃、300rmp条件下冷冻离心5min，离心后去除上清液，保留沉淀。往沉淀中加入少量4℃生理盐水，用移液枪轻吹，使血溶解，重复上述实验至血样上清无色，将血样用生理盐水稀释到2%(v/v)，得稀释后的血样。

（3）溶血实验：取48支1ml的离心管，分别加入上述稀释后的血样500μl中分别添加浓度为100μg/ml的茶皂素溶液A或B各40μl、60μl、80μl、100μl、120μl、150μl，200μl，250μl，每个样品3个平行。用生理盐水补充至总体积为1ml，于37℃溶血1小时后，10000rpm离心5min。从各管中取上清液600μl，分别于540nm测定OD₅₄₀。空白对照为500μl生理盐水和500μl所述稀释后的血样的混合液。

红细胞溶血量越高，则离心后的血样颜色越深，血样的OD₅₄₀越高，因此可以用OD₅₄₀值来反应溶血量。常用半数溶血量（HD₅₀）表示溶血效果。

半数溶血量（HD₅₀）表示为在规定时间内，通过茶皂素作用，使一定量的血红细胞半数破裂所需茶皂素的量。即当上清液的OD₅₄₀=完全溶血时OD₅₄₀×50%时所需要茶皂素的量。

实验结果如附图2所示。从图上可明显看出未发酵茶籽粕的HD₅₀为8.45μg，发酵后的茶籽粕的HD₅₀为18.23μg，发酵后茶籽粕提取液的HD₅₀值增加了115.73%，溶血效果明显降低。

5.测定纤维素含量验证发酵结果

纤维素测定方法参考GB/T5009.10-23。

纤维素测定结果：茶籽粕发酵原料中粗纤维含量为55.94%，发酵茶籽粕饲料中纤维素含量为45.33%，发酵后纤维素含量降低了10.61%。

Claims (7)

1.一种利用纳豆芽孢杆菌与面包乳杆菌混合固态发酵生产茶籽粕饲料的方法，包括以下步骤： 

（1）种子培养：将面包乳杆菌菌株和纳豆芽孢杆菌菌株分别培养，作为种子备用； 

（2）营养物配制：往茶籽粕中加入含葡萄糖、半乳糖和硫酸铵的pH5.0的缓冲溶液，混合均匀后灭菌备用，得到固体茶籽粕发酵原料； 

（3）好氧发酵：将面包乳杆菌与纳豆芽孢杆菌种子接种于（2）中所述发酵原料中，30～40℃好氧发酵24～48小时，得到经好氧发酵的茶籽粕饲料半成品； 

（4）厌氧发酵：将（3）所得的茶籽粕饲料半成品在无氧环境中于30～40℃继续发酵24～48小时，得到固态发酵的茶籽粕饲料； 

所述面包乳杆菌菌株的保藏编号为CGMCC No.6304，所述纳豆芽孢杆菌菌株的保藏编号为CGMCC NO.2801。 

2.根据权利要求1所述的方法，其中（1）中所述种子培养后菌液的OD₆₀₀值为0.8±0.1。 

3.根据权利要求1所述的方法，其中（2）中所述缓冲溶液中葡萄糖、半乳糖和硫酸铵的含量分别为1.5%w/w、1.5%w/w和2.0%w/w。 

4.根据权利要求1所述的方法，其中（3）中面包乳杆菌和纳豆芽孢杆菌的接种量均为菌液：茶籽粕为3～10ml：100g。 

5.根据权利要求1所述的方法，其中（1）中面包乳杆菌菌株的种子培养基成分为：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母抽提物5.0g，纤维二糖20.0g，吐温-801ml，柠檬酸三铵2.0g，K₂HPO₄2.0g，MgSO₄·7H₂O0.2g，MnSO₄·2H₂O0.05g，蒸馏水1000ml。 

6.根据权利要求1所述的方法，其中（1）中纳豆芽孢杆菌菌株的种子培养基成分为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml。 

7.根据权利要求3所述的方法，其中所述缓冲液为pH5.0的磷酸盐缓冲液。 

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