CN103468611B - 发酵培养基及制备方法和应用、乳酸菌葡聚糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵培养基及制备方法和应用、乳酸菌葡聚糖的制备方法。所述的发酵培养基的制备方法为：将番茄汁水溶液与蔗糖混合至溶解，用碱调节pH，灭菌，即可；所述的番茄汁蔗糖培养基的pH为5.0～10.0。所述的乳酸菌葡聚糖的制备方法为：（1）将肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）发酵菌种接种于发酵培养基中，好氧培养，得发酵液；（2）将所述的发酵液加热，冷却，稀释，离心，取上清液直接加入乙醇，静置，收集沉淀物并溶于水，直接干燥，即可。本发明提供的发酵培养基来源广泛、成本低廉、天然安全，采用该发酵培养基制备的葡聚糖产量比采用传统化学合成培养基制备的葡聚糖的产量更高。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵培养基及制备方法和应用、乳酸菌葡聚糖的制备方法。
背景技术
以微生物为来源的多糖尤其是胞外多糖，是某些特定微生物（如乳酸菌、土壤杆菌、根瘤菌等）在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一类由单一或多种单糖以糖苷键聚合而成的高分子化合物。其中，依附于微生物细胞壁外的多糖被称为荚膜多糖，而粘液多糖则以渗透于生长环境中的形式存在。
大量研究证实，乳酸菌胞外多糖不但可以赋予发酵乳制品特殊的风味、改善产品质地与稳定性，还具有一定的降血脂、调节免疫和抗肿瘤等保健功能。因此，在食品添加剂（如增稠剂、乳化剂、稳定剂等）的安全性受到广泛关注的情况下，乳酸菌胞外多糖因为其良好的安全性和卓越的生理与加工性能，在医药、日用化妆品和食品行业得到广泛的应用。
众所周知，明串珠菌是一类高产胞外多糖的乳酸菌，其中，肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）可以合成多种类型的葡聚糖（一种以葡萄糖为单糖组成单位，由α-1，3、α-1，4或α-1，6糖苷键键合而成的葡萄糖高分子聚合物），其中，右旋糖苷（一种主要由葡萄糖以α-1，6糖苷键聚合而成的高分子葡聚糖）因具有良好的膨胀性而作为代血浆在医药工业上得到广泛应用。由肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）产生的各种葡聚糖的应用相当广泛，不仅可作为食品中低热量食品添加剂来使用，而且在医药领域还具有调节免疫、抗癌等临床功效。
然而在目前由明串珠菌制备葡聚糖的工艺中，发酵基料的组成复杂、部分成分来源紧缺，导致发酵基料成本高昂；采用这些基料发酵后，在提取制备多糖的过程中，通常为了去除蛋白质等干扰物质而加入氯仿、正丁醇、三氟三氯乙烷、三氯乙酸等有机溶剂，这些因素对商业化生产的成本、多糖的品质以及多糖在食品、医疗领域应用的安全性均存在不良影响。
因此，寻找一种来源广泛、价格低廉的明串珠菌产糖介质，同时提高明串珠菌发酵产生的葡聚糖的提取效率和品质，是明串珠菌多糖制备方法的关键。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服了现有技术中的葡聚糖制备工艺的发酵培养基成本高、存在有机溶剂残留等缺陷，提供了一种生产成本低、工艺简洁、制备效率高并能广泛工业应用的发酵培养基及制备方法和应用、乳酸菌葡聚糖的制备方法。
本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题的：
本发明提供一种发酵培养基，所述的发酵培养基为番茄汁蔗糖培养基，其包括蔗糖和番茄汁水溶液。
所述的番茄汁蔗糖培养基中，所述的蔗糖与所述的番茄汁水溶液的质量体积比较佳地为1g:20mL～1g:5mL，更佳地为1g:10mL～1g:5mL，尤其更佳地为3g:20mL。所述的番茄汁水溶液中番茄汁的浓度较佳地为20%～100%，更佳地为100%，所述的百分比为体积百分比。
本发明还提供所述的番茄汁蔗糖培养基的制备方法。该制备方法包括下述步骤：将番茄汁水溶液与蔗糖混合至溶解，用碱调节pH，灭菌，即可；所述的番茄汁蔗糖培养基的pH为5.0～10.0。
所述的番茄汁蔗糖培养基的pH较佳地为6.0～10.0，更佳地为7.0。用碱调节前，番茄汁水溶液与蔗糖的混合液的pH一般为4.3～4.5。所述的溶解为本领域常规操作，较佳地为先加热后冷却。
其中，所述的番茄汁水溶液中的番茄汁采用本领域常规制备方法制得，一般包括如下步骤：将成熟番茄洗净、去皮后，进行机械破碎，分离，取上清液，即可。
所述的分离为本领域常规分离技术，较佳地为过滤、抽滤和离心中的一种或多种；其中，所述的过滤的介质为本领域常规，较佳地为多层纱布或无纺布；所述的离心为本领域常规操作，较佳地为2000g～3000g，10min～20min离心。
所述的碱为本领域常规，较佳地为食品级碱，更佳地为Na2CO3、NaHCO3和NaOH中的一种或多种。所述的灭菌为本领域常规操作，所述的灭菌的温度较佳地为95℃～125℃；所述的灭菌的时间较佳地为5min～30min。
按照上述方法制得的番茄汁的主要理化指标为：固形物含量3.28g/100mL～4.04g/100mL，灰分0.46g/100mL～0.59g/100mL，蛋白质0.39g/100mL～0.52g/100mL，脂肪0.014g/100mL～0.020g/100mL，碳水化合物2.42g/100mL～2.88g/100mL。
本发明还提供所述的番茄汁蔗糖培养基在制备乳酸菌葡聚糖中的应用。
本发明还提供了一种乳酸菌葡聚糖的制备方法，其包括如下步骤：
（1）将肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）发酵菌种接种于前述番茄汁蔗糖培养基中，好氧培养，得发酵液；
（2）将所述的发酵液加热，冷却，稀释，离心，取上清液直接加入乙醇，静置，收集沉淀物并溶于水，直接干燥，即可。
步骤（1）中，所述的发酵菌种为常规肠膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）菌种，较佳地为肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）LM57、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）LM79、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）LD106和保藏号为CGMCC NO.6432的肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）BD1710中的一种或多种，更佳地为保藏号为CGMCC NO.6432的肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）BD1710。
步骤（1）中，在所述的接种时，所述的发酵菌种一般以种子液的形式接种，其中活菌数一般为1.0×109～3.0×109CFU/mL。
步骤（1）中，所述的接种为本领域常规操作，所述的发酵菌种的接种量较佳地为0.5%～4.0%，更佳地为2.0%～4.0%，尤其更佳地为2.0%，所述的百分比为种子液占番茄汁蔗糖培养基的体积百分比。
步骤（1）中，所述的好氧培养为本领域常规操作。所述的好氧培养的温度较佳地为25℃～34℃，更佳地为25℃～31℃，尤其更佳地为28℃。所述的好氧培养的时间较佳地为24h～54h，更佳地为30h～54h，尤其更佳地为48h。所述的好氧培养的方式较佳地为摇床培养或发酵罐通气培养。
步骤（2）中，所述的加热和冷却为本领域常规操作，所述的加热的温度较佳地为95℃～100℃；所述的加热的时间较佳地为10min～30min；所述的冷却的终温较佳地为15℃～25℃。
步骤（2）中，所述的稀释的稀释剂为本领域常规使用的稀释剂，较佳地为无菌水。所述的无菌水与所述的发酵液的体积比较佳地为3:1～5:1。所述的离心为本领域常规操作，较佳地为7000g～13000g，10min～20min离心。
步骤（2）中，所述的乙醇的浓度较佳地为80%～100%，所述的百分比为体积百分比。所述的乙醇与所述的上清液的体积比较佳地为2:1～4:1。所述的静置为本领域常规操作，所述的静置的时间较佳地为4h～24h。所述的干燥为本领域常规技术，较佳地为直接冷冻干燥、在温度不超过115℃下干燥或真空冷冻干燥。
按照本发明的制备方法制得的乳酸菌葡聚糖，其主要理化指标为：水分0.89g/100g～2.19g/100g，灰分0.19g/100g～0.26g/100g，蛋白质0.68g/100g～0.79g/100g，碳水化合物96.87g/100g～98.13g/100g。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供的番茄汁蔗糖培养基的来源广泛、成本低廉、天然安全，而且经肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）发酵菌种发酵后获得的葡聚糖产量比采用传统化学合成培养基制备的葡聚糖的产量更高。本发明的制备方法克服了传统葡聚糖制备工艺中加入三氯乙酸等有机溶剂去蛋白所导致的残留困扰，其可作为一种新型的葡聚糖制备方法应用于科研、食品、制药和相关领域中，应用前景十分广阔。
附图说明
图1为28℃、180rpm的好氧条件下，不同接种量下乳酸菌葡聚糖产量的检测结果示意图。
图2为28℃、180rpm的好氧条件下，发酵液的pH不同时乳酸菌葡聚糖产量的检测结果示意图。
图3为28℃、180rpm的好氧条件下，不同番茄汁浓度下乳酸菌葡聚糖产量的检测结果示意图。
图4为28℃、180rpm的好氧条件下，不同蔗糖浓度下乳酸菌葡聚糖产量的检测结果示意图。
图5为180rpm的好氧条件下，不同发酵温度下乳酸菌葡聚糖产量的检测结果示意图。
图6为乳酸菌葡聚糖糖基组成的色谱图。
图7为最佳条件下肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）BD1710在番茄汁蔗糖培养基和化学合成培养基中的产糖能力示意图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。所述的发酵菌种为保藏号为CGMCC NO.6432的肠膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）BD1710，或丹尼克斯（中国）有限公司提供的肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）LM57、肠膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）LM79、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）LD106中的一种。
下述实施例中：
番茄汁的制备：将成熟番茄清洗、去皮后，进行机械破碎，分离，取上清液，即可。其中，实施例1中的分离为多层纱布过滤，实施例2～6中的分离为抽滤，实施例7～10中的分离为2000g，20min离心。
发酵菌种（种子液）的制备：将肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）BD1710的冻干粉以少量无菌蒸馏水溶解，用接种环挑取一环划线于M17蔗糖培养基（以5%（w/v）蔗糖取代M17培养基中0.5%（w/v）的乳糖，OXOIDLTD.，英国）上，28℃好氧培养24h后取出，用接种环挑取单菌落放入1mL M17蔗糖培养基中，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于该液体培养基内，28℃、180rpm摇床培养24h后取出，以2%（v/v）接种量接种于50mL上述M17蔗糖培养基中，再置于28℃、180rpm摇床培养24h，即可。肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）LM57、肠膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）LM79、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）LD106的种子液的制备过程同上。
化学合成培养基的制备：将蛋白胨10g、酵母抽提物5g、蔗糖150g、K2HPO420g、MgSO4·7H200.2g、MnSO40.01g、NaCl0.01g、CaCl20.02g、FeSO40.01g与1L蒸馏水均匀混合，充分溶解后，以碱调节pH至7.0，在100℃下灭菌10min，即可。
实施例1
将发酵菌种肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）BD1710分别按0.5%、1.0%、2.0%、4.0%的接种量（所述的百分比为体积百分比）接入番茄汁蔗糖培养基中，所述的蔗糖与所述的番茄汁水溶液的质量体积比为3g:20mL，所述的番茄汁水溶液中番茄汁的浓度为100%，pH为7.0，28℃、180rpm摇床培养，并在不同的好氧培养时间下，取发酵液制备葡聚糖并称重，实验结果见图1。
从图1可以看出，接种量为0.5%（v/v）的发酵液中葡聚糖含量为0.05g/L～29.84g/L，接种量为1.0%（v/v）的发酵液中葡聚糖含量为0.07g/L～30.50g/L，接种量为2.0%（v/v）的发酵液中葡聚糖含量为0.12g/L～32.15g/L，接种量为4.0%（v/v）的发酵液中葡聚糖含量为0.13g/L～31.90g/L。由此可见，接种量较佳地为2.0%（v/v）～4.0%（v/v），更佳的是2.0%（v/v）。发酵时间较佳地为30h～54h，更佳地为48h。
实施例2
将发酵菌种肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）BD1710以2.0%（v/v）的接种量分别接入初始pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的番茄汁蔗糖培养基中，所述的蔗糖与所述的番茄汁水溶液的质量体积比为3g:20mL，所述的番茄汁水溶液中番茄汁的浓度为100%，28℃、180rpm摇床培养48h后取发酵液，制备葡聚糖并称重，实验结果见图2。
从图2可以看出，采用初始pH为5.0的番茄汁蔗糖培养基发酵时葡聚糖含量为7.20g/L，采用初始pH为6.0的番茄汁蔗糖培养基发酵时葡聚糖含量为26.72g/L，采用初始pH为7.0的番茄汁蔗糖培养基发酵时葡聚糖含量为32.15g/L，采用初始pH为8.0的番茄汁蔗糖培养基发酵时葡聚糖含量为26.00g/L，采用初始pH为9.0的番茄汁蔗糖培养基发酵时葡聚糖含量为25.30g/L，采用初始pH为10.0的番茄汁蔗糖培养基发酵时葡聚糖含量为24.80g/L。由此可见，番茄汁蔗糖培养基的初始pH较佳地为6.0～10.0，更佳的是7.0。
实施例3
将发酵菌种肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）BD1710以2.0%（v/v）的接种量分别接入番茄汁浓度为20%、40%、60%、80%、100%（v/v），蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比为3g:20mL，初始pH为7.0的番茄汁蔗糖培养基中，28℃、180rpm摇床培养48h后取发酵液，制备葡聚糖并称重，实验结果见图3。
从图3可以看出，采用番茄汁的浓度为20%（v/v）的番茄汁蔗糖培养基时葡聚糖含量为5.00g/L，采用番茄汁的浓度为40%（v/v）的番茄汁蔗糖培养基时葡聚糖含量为10.60g/L，采用番茄汁的浓度为60%（v/v）的番茄汁蔗糖培养基时葡聚糖含量为14.40g/L，采用番茄汁的浓度为80%（v/v）的番茄汁蔗糖培养基时葡聚糖含量为18.40g/L，采用番茄汁的浓度为100%（v/v）的番茄汁蔗糖培养基时葡聚糖含量为32.15g/L。由此可见，番茄汁浓度较佳地为100%（v/v）。
实施例4
将发酵菌种肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）BD1710以2.0%（v/v）的接种量接入蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比分别为1g:20mL（以5.0%表示）、1g:10mL（以10.0%表示）、3g:20mL（以15.0%表示）、1g:5mL（以20.0%表示），番茄汁的浓度为100%，pH为7.0的番茄汁蔗糖培养基中，28℃、180rpm摇床培养，并于不同的好氧培养时间下，取发酵液，制备葡聚糖并称重，实验结果见图4。
从图4可以看出，采用蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比为1g:20mL的番茄汁蔗糖培养基时葡聚糖含量为0.02g/L～18.90g/L，采用蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比为1g:10mL的番茄汁蔗糖培养基时葡聚糖含量为0.04g/L～29.10g/L，采用蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比为3g:20mL的番茄汁蔗糖培养基时葡聚糖含量为0.03g/L～32.15g/L，采用蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比为1g:5mL的番茄汁蔗糖培养基时葡聚糖含量为0.04g/L～29.80g/L。由此可见，蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积较佳地为1g:10mL～1g:5mL，更佳地为3g:20mL。
实施例5
将发酵菌种肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）BD1710以2%（v/v）的接种量接入番茄汁蔗糖培养基中，所述的番茄汁蔗糖培养基中蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比为3g:20mL，所述的番茄汁的浓度为100%，pH为7.0，分别置于25℃、28℃、31℃、34℃的好氧培养温度下、转速为180rpm的摇床培养48h发酵，取发酵液，制备葡聚糖并称重，实验结果见图5。
从图5可以看出，25℃的好氧培养条件下获得的发酵液中葡聚糖含量为29.40g/L，28℃的好氧培养条件下获得的发酵液中葡聚糖含量为32.15g/L，31℃的好氧培养条件下获得的发酵液中葡聚糖含量为28.20g/L，34℃的好氧培养条件下获得的发酵液中葡聚糖含量为16.72g/L。由此可见，好氧培养的温度较佳地为25℃～31℃，更佳的为28℃。
实施例6
将发酵菌种肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）BD1710以2%（v/v）接种量接入番茄汁蔗糖培养基中，所述的番茄汁蔗糖培养基中蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比为3g:20mL，所述的番茄汁的浓度为100%，pH为7.0，28℃，并置于120rpm、180rpm、240rpm摇床培养48h，或以发酵罐通气培养的方式控制发酵液溶氧1.0mgO2/L、3.0mgO2/L、5.0mgO2/L进行好氧培养48h，发酵结束后取发酵液按上述方法制备葡聚糖，结果分别见表1和表2。
表1摇床培养测试结果
| 转速（rpm） | 120 | 180 | 240 |
| 葡聚糖产量（g/L） | 27.43 | 32.15 | 28.16 |
表2发酵罐通气培养测试结果
| 溶氧量（mgO2/L） | 1.0 | 3.0 | 5.0 |
| 葡聚糖产量（g/L） | 29.2 | 34.7 | 33.5 |
实施例7
将发酵菌种肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）BD1710按2.0%（v/v）的接种量接入番茄汁蔗糖培养基中，所述的番茄汁蔗糖培养基中蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比为3g:20mL，所述的番茄汁的浓度为100%，pH为7.0，28℃、180rpm摇床培养48h后，将发酵液置于95℃加热30min，冷却至15℃，加入5倍无菌水稀释，7000g，20min离心，取上清液，向所述的上清液中加入4倍的浓度为80%的乙醇，静置24h，收集沉淀物并溶于水，得葡聚糖的水溶液，冷冻干燥后称重，得到的葡聚糖产量为32.10g/L。
实施例8
将发酵菌种肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）BD1710按2.0%（v/v）的接种量接入上述方法制备的番茄汁蔗糖培养基中，所述的番茄汁蔗糖培养基中蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比为3g:20mL，所述的番茄汁的浓度为100%，pH为7.0，28℃、180rpm摇床培养48h后，将发酵液置于97℃加热15min，冷却至20℃，加入4倍无菌水稀释，9000g，15min离心，取上清液，向所述的上清液中加入3倍的浓度为90%的乙醇，静置12h，收集沉淀物并溶于水，得葡聚糖的水溶液，真空冷冻干燥后称重，得到葡聚糖的产量为31.97g/L。
实施例9
将发酵菌种肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）BD1710按2.0%（v/v）的接种量接入上述方法制备的番茄汁蔗糖培养基中，所述的番茄汁蔗糖培养基中蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比为3g:20mL，所述的番茄汁的浓度为100%，pH为7.0，28℃、180rpm摇床培养48h后，将发酵液置于100℃加热10min，冷却至25℃，加入3倍无菌水稀释，13000g，10min离心，取上清液，向所述的上清液中加入2倍的浓度为100%的乙醇，静置4h，收集沉淀物于温度不超过115℃下（本实验中采用110℃）干燥至恒重后称重，得到葡聚糖的产量为32.06g/L。
实施例10
分别将肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）LM57、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）LM79、肠膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）LD106的种子液按2.0%（v/v）的接种量接入番茄汁蔗糖培养基中，所述的番茄汁蔗糖培养基中蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比为3g:20mL，所述的番茄汁的浓度为100%，pH为7.0，并在28℃、180rpm摇床培养48h后，将发酵液置于100℃加热10min，冷却至25℃，加入5倍无菌水稀释，13000g，10min离心，取上清液，向所述的上清液中加入3倍的浓度为100%的乙醇，静置24h，收集沉淀物并溶于水，得葡聚糖的水溶液，真空冷冻干燥后称重，不同菌株发酵得到葡聚糖含量如表3所示。
表3不同肠膜明串珠菌在番茄汁蔗糖培养基中的葡聚糖产量
| 肠膜明串珠菌 | LM57 | LM79 | LD106 |
| 葡聚糖产量（g/L） | 25.6 | 27.3 | 24.7 |
效果实施例1
按上述方法制备番茄汁（三个平行样，分别标注为番茄汁A、B、C）并进行理化指标测试，包括固形物含量、蛋白质、脂肪、碳水化合物、灰分的测定，其测定结果见表4。
表4番茄汁的理化指标
| 理化指标 | 番茄汁A | 番茄汁B | 番茄汁C |
| 固形物含量（g/100mL） | 3.204 | 3.696 | 4.04 |
| 灰分（g/100g） | 0.46 | 0.51 | 0.59 |
| 蛋白质（g/100g） | 0.39 | 0.48 | 0.52 |
| 脂肪（g/100g） | 0.014 | 0.016 | 0.020 |
| 碳水化合物（g/100g） | 2.42 | 2.69 | 2.88 |
可见，番茄汁所含的蛋白质含量较低，每100g番茄汁的蛋白质含量仅为0.39～0.52g，这对于后期大量代谢产物（多糖）而言其影响微乎其微。本发明的制备工艺摒弃了传统多糖提取步骤中有机溶剂（如氯仿、正丁醇、三氟三氯乙烷、三氯乙酸等）去蛋白的过程，更免去了透析等后续去除残留有机溶剂的工序，直接由发酵液醇沉收集沉淀即可获得蛋白含量极低的葡聚糖。因此，得益于该番茄汁蔗糖培养基的提取工艺既简化了多糖提取工艺，降低了生产成本，同时也解决了多糖制品在科研、食品以及医疗等领域应用时遇到的有机溶剂残留带来的安全性困扰。
效果实施例2
将发酵菌种以2%（v/v）的接种量接入上述方法制备的番茄汁蔗糖培养基中，所述的番茄汁蔗糖培养基中蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比为3g:20mL，所述的番茄汁的浓度为100%，pH为7.0，28℃、180rpm摇床培养48h，发酵结束后取发酵液按上述方法制备葡聚糖样品，并以高效阴离子色谱法测定多糖的单糖组成。
（1）多糖水解：吸取100μL浓度为4mg/mL～5mg/mL的多糖样品溶液于5mL的具塞刻度试管中，加入100μL的4moL/LTFA，充N2封管，110℃烘箱中水解2h；冷却后打开盖，加200μL甲醇后用N2吹干，如此重复加甲醇并用N2吹3次，去除TFA，将其残渣用水溶解定容至5mL，用0.45μm微孔膜过滤后供进样分析。
（2）色谱条件
色谱柱：CarboPacPA203mmi.d.×150mm；
流动相：A、H2O；B、250mmol/LNaOH；C、1mol/LNaAc；
三元梯度洗脱：流速：0.5mL/min；积分脉冲安培检测器；
Au工作电极：Ag/AgCl参比电极；
进样体积：20μL；柱温：30℃。
肠膜明串珠菌BD1710多糖样品糖基组成的色谱分析结果见图6，该多糖在10.450min有单一吸收峰，且该吸收峰的保留时间与葡萄糖标品保留时间一致。可见，肠膜明串珠菌所产多糖是由葡萄糖单一糖基组成的，即为葡聚糖。
效果实施例3
将发酵菌种以2%（v/v）接种量接入上述方法制备的番茄汁蔗糖培养基中，所述的番茄汁蔗糖培养基中蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比为3g:20mL，所述的番茄汁的浓度为100%，pH为7.0，28℃、180rpm摇床培养48h，发酵结束后取发酵液按上述方法制备葡聚糖并称重（上述实验作三个平行样，所得的葡聚糖分别标注为葡聚糖A、B、C），其产量见表5。
表5肠膜明串珠菌的葡聚糖产量
| 样品 | 葡聚糖A | 葡聚糖B | 葡聚糖C |
| 葡聚糖产量（g/L） | 31.56 | 31.92 | 32.15 |
采用本发明的制备方法从每升发酵液中得到的葡聚糖产量为31.56g～32.15g。
效果实施例4
将发酵菌种以2%（v/v）接种量接入上述方法制备的番茄汁蔗糖培养基中，所述的番茄汁蔗糖培养基中蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比为3g:20mL，所述的番茄汁的浓度为100%，pH为7.0，28℃、180rpm摇床培养48h，发酵结束后取发酵液按上述方法制备葡聚糖（上述实验作三个平行样，所得的葡聚糖分别标注为葡聚糖A、B、C），测定三个样品中的葡聚糖、水分、灰分、蛋白质及碳水化合物的含量，结果见表6。
表6葡聚糖中的主要理化指标
效果实施例5
将发酵菌种以2%（v/v）接种量分别接入上述方法制备的初始pH为7.0的番茄汁蔗糖培养基和化学合成培养基中，所述的番茄汁蔗糖培养基中蔗糖与番茄汁水溶液的质量体积比为3g:20mL，所述的番茄汁的浓度为100%，28℃、180rpm摇床培养54h，取不同培养时间的发酵液按上述方法制备葡聚糖并称重，结果见图7。
从图7可以看出，相同发酵条件下，肠膜明串珠菌在化学合成培养基中发酵，所获得的发酵液中葡聚糖含量为0.68～29.60g/L，在番茄汁蔗糖培养基中发酵所获得的发酵液中葡聚糖含量为0.74～32.15g/L。
肠膜明串珠菌于化学合成培养基发酵时，3h的发酵液中胞外粗多糖含量为0.68g/L，6h的发酵液中葡聚糖含量为1.52g/L，9h的发酵液中葡聚糖含量为7.25g/L，12h的发酵液中葡聚糖含量为12.93g/L，24h的发酵液中葡聚糖含量为27.20g/L，30h的发酵液中葡聚糖含量为28.30g/L，48h的发酵液中葡聚糖含量为29.60g/L，54h的发酵液中葡聚糖含量为29.5g/L。
肠膜明串珠菌于番茄汁蔗糖培养基发酵时，3h的发酵液中葡聚糖含量为0.74g/L，6h的发酵液中葡聚糖含量为1.84g/L，9h的发酵液中葡聚糖含量为8.84g/L，12h的发酵液中葡聚糖含量为14.86g/L，24h的发酵液中葡聚糖含量为28.40g/L，30h的发酵液中葡聚糖含量为30.36g/L，48h的发酵液中葡聚糖含量为32.15g/L，54h的发酵液中葡聚糖含量为32.00g/L。
比较肠膜明串珠菌在上述两种培养基中的产糖特性后，发现番茄汁蔗糖培养基为肠膜明串珠菌发酵产糖的优选培养基。
天然培养基打破了常规纯化学培养基发酵明串珠菌的局限性，创新性地运用番茄汁蔗糖溶液作为明串珠菌的发酵基料，在降低物料成本的同时，令发酵条件的优化过程更简单可行。与传统的纯化学培养基相比，来源广泛的番茄汁蔗糖培养基料经肠膜明串珠菌发酵获得的葡聚糖产量更高，安全性更强、价格更低廉。
本发明所述葡聚糖制备方法所采用的培养基来源广泛、价格低廉，可以低成本、高效率地植被葡聚糖；更重要的是，本发明中采用的葡聚糖的制备工艺免去了有机溶剂除蛋白的步骤，在简化获取流程，降低生产成本的同时，也极大地提高了多糖制品的食品安全性，其可作为一种新型的葡聚糖制备方法应用于科研、食品、制药和相关领域中，应用前景十分广阔。
Claims (15)
1.一种乳酸菌葡聚糖的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
（1）将肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）发酵菌种接种于发酵培养基中，好氧培养，得发酵液；所述的发酵培养基为为番茄汁蔗糖培养基，所述的番茄汁蔗糖培养基由蔗糖和番茄汁水溶液组成，所述的蔗糖与所述的番茄汁水溶液的质量体积比为1g:20mL～1g:5mL；所述的发酵菌种为肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）LM 57、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）LM 79和保藏号为CGMCC NO.6432的肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）BD 1710中的一种或多种；
（2）将所述的发酵液加热，冷却，稀释，离心，取上清液直接加入乙醇，静置，收集沉淀物并溶于水，直接干燥，即可。
2.如权利要求1所述的乳酸菌葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述的发酵菌种以种子液的形式接种，其中活菌数为1.0×109～3.0×109 CFU/mL；所述的发酵菌种的接种量为0.5%～4.0%，所述的百分比为种子液占发酵培养基的体积百分比。
3.如权利要求2所述的乳酸菌葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述的发酵菌种的接种量为2.0%～4.0%，所述的百分比为种子液占发酵培养基的体积百分比。
4.如权利要求3所述的乳酸菌葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述的发酵菌种的接种量为2.0%，所述的百分比为种子液占发酵培养基的体积百分比。
5.如权利要求1-4任一项所述的乳酸菌葡聚糖的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的好氧培养的温度为25℃～34℃；所述的好氧培养的时间为24h～54h；所述的好氧培养的方式为摇床培养或发酵罐通气培养；
步骤（2）中，所述的加热的温度为95℃～100℃；所述的加热的时间为10min～30min；所述的冷却的终温为15℃~25℃；所述的稀释的稀释剂为无菌水；所述的无菌水与所述的发酵液的体积比为3:1~5:1；所述的离心为7000g~13000g，10min~20min离心；所述的乙醇的浓度为80%～100%，所述的百分比为体积百分比；所述的乙醇与所述的上清液的体积比为2:1~4:1；所述的静置的时间为4h～24h；所述的干燥为直接冷冻干燥、在温度不超过115℃下加热干燥或真空冷冻干燥。
6.如权利要求5所述的乳酸菌葡聚糖的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的好氧培养的温度为25℃～31℃；所述的好氧培养的时间为30h~54h。
7.如权利要求6所述的乳酸菌葡聚糖的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的好氧培养的温度为28℃；所述的好氧培养的时间为48h。
8.如权利要求1所述的乳酸菌葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述的蔗糖与所述的番茄汁水溶液的质量体积比为1g:10mL～1g:5mL；所述的番茄汁水溶液中番茄汁的浓度为20%～100%，所述的百分比为体积百分比。
9.如权利要求8所述的乳酸菌葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述的蔗糖与所述的番茄汁水溶液的质量体积比为3g:20mL；所述的番茄汁水溶液中番茄汁的浓度为100%，所述的百分比为体积百分比。
10.如权利要求1所述的乳酸菌葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养基的制备方法包括下述步骤：将番茄汁水溶液与蔗糖混合至溶解，用碱调节pH，灭菌，即可；所述的番茄汁蔗糖培养基的pH为5.0～10.0。
11.如权利要求10所述的乳酸菌葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述的番茄汁蔗糖培养基的pH为6.0~10.0。
12.如权利要求11所述的乳酸菌葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述的番茄汁蔗糖培养基的pH为7.0。
13.如权利要求10所述的乳酸菌葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述的番茄汁水溶液中的番茄汁由下述方法制得：将成熟番茄洗净、去皮后，进行机械破碎，分离，取上清液，即可；所述的分离为过滤、抽滤和离心中的一种或多种；其中，所述的过滤的介质为多层纱布或无纺布；所述的离心为2000g～3000g，10min~20min离心。
14.如权利要求10所述的乳酸菌葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述的碱为食品级碱；所述的灭菌的温度为95℃～125℃；所述的灭菌的时间为5min～30min。
15.如权利要求14所述的乳酸菌葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述的碱为Na2CO3、NaHCO3和NaOH中的一种或多种。
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