CN105039454B - 一种富含果聚糖的膳食补充剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富含果聚糖的膳食补充剂及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)将柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)发酵菌种在番茄汁蔗糖培养基中发酵培养，得发酵液；(2)将所得发酵液离心取上清液，调节pH，冷冻干燥即得。其来源广、成本低，发酵菌种为首次被发现具有产果聚糖功能的柠檬明串珠菌并为单一菌种，上述组合有利于产品品质的标准化、工业大规模生产的成本控制以及食品安全性的保障。同时，采用本发明制备的富含果聚糖的膳食补充剂打破了现有市场上稀缺以果聚糖作为功能性成分的膳食补充剂的现状，因此，其应用前景十分广阔。

Description

一种富含果聚糖的膳食补充剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种富含果聚糖的膳食补充剂及其制备方法。

背景技术

膳食补充剂是一种日常营养补充剂，其可通过维生素、矿物质、氨基酸等营养成分的补充，来提高机体健康水平和降低疾病发生风险，现有的膳食补充剂基本都是通过多种营养成分的组合制备而成的，复杂的配方大大增加了膳食补充剂在制备过程中被污染的风险，进而对消费者形成了潜在的威胁。而果聚糖(果聚糖的英文名称为Levan)是一种天然的果糖聚合物，存在于多种植物和微生物发酵产物中，虽然在甘蔗汁加工业中是不受欢迎的微生物代谢产物，但在抗癌、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、降胆固醇、增强免疫、减肥等医药临床领域具有极高的应用价值，近年来受到研究者的关注。

将levan与膳食补充剂配合使用势必相得益彰，但目前富含果聚糖的膳食补充剂相对较少，并levan的使用也因其产生菌多为致病菌(芽孢杆菌等)而通常是提取后人工添加入产品中去的，因此，利用安全性更高的微生物来生产富含果聚糖的膳食补充剂将是膳食补充剂的重要研究方向之一。

发明内容

因此，本发明为了解决目前市场缺乏富含levan的膳食补充剂，现有levan产生菌多为致病菌，以及类似的膳食补充剂中多糖多为人工添加的问题，提供了一种富含果聚糖的膳食补充剂及其制备方法。本发明人发现利用保藏编号为CGMCC No.6431的柠檬明串珠菌发酵蕃茄汁蔗糖培养基后，获得的发酵液中含有大量果聚糖，利用该发酵液制备的膳食补充剂中果聚糖含量也相当丰富，从而完成了本发明。

因此，为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是：一种富含果聚糖的膳食补充剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)发酵菌种在番茄汁蔗糖培养基中发酵培养，得发酵液；

(2)将步骤(1)所得发酵液离心取上清液，调节pH，冷冻干燥即得。

其中步骤(1)为将柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)发酵菌种在番茄汁蔗糖培养基中发酵培养，得发酵液。

其中所述的柠檬明串珠菌为现有技术，其制备方法为本领域常规制备方法，或者通过购买获得。所述柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)发酵菌种较佳地为保藏号为CGMCC No.6431的柠檬明串珠菌，该菌株的命名为BD01707。该菌株已于2012年08月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。

其中所述的番茄汁蔗糖培养基的制备方法包括以下步骤：番茄榨汁，将所得榨汁过滤后煮沸，离心取上清液，与蔗糖混合后加热冷却，调节pH值，灭菌后冷却即得。其中所述过滤的方法为较佳地利用80～120目纱布过滤取汁，更佳地为100目纱布，所述煮沸的时间较佳地为1～10分钟，更佳地为3～7分钟，优选地为5分钟，所述离心的较佳地速度为4,000～12,000g，更佳地为6,000～10,000g，优选地为8,000g，离心的时间较佳地为8～12分钟，更佳地为9～11分钟，优选地为10分钟，蔗糖的加入量较佳地为5～30％，更佳地为10～20％，优选地为15％，所述灭菌的温度较佳地为95～125℃，更佳地为110～123℃，优选地为121℃，灭菌时间较佳地为10～30分钟，更佳地为15～25分钟，优选地为20分钟，pH值较佳地为4.5～7.5，更佳地为6.0～7.0，优选地为6.5。

所述发酵培养的温度较佳地为20℃～35℃，更佳地为25～32℃，优选地为30℃，所述发酵培养较佳地为震荡发酵培养，振荡的速度较佳地为100～300rpm，更佳地为150～250rpm，优选地为200rpm，发酵培养的时间较佳地为24～120小时，更佳地为72～110小时，优选地为96小时。

所述的发酵菌种的接种量较佳地为0.5％～4.0％，更佳地为1％～3％，优选地为地为2％，所述百分比为体积百分比。

其中步骤(2)为将步骤(1)所得发酵液离心取上清液，调节pH，冷冻干燥即得。

其中所述离心的速度为较佳地为4,000～12,000g，更佳地为6,000～10,000g，优选地为8,000g，离心的时间较佳地为8～12分钟，更佳地为9～11分钟，优选地为10分钟。其中所述调节pH值较佳地为5.0～9.0，更佳地6.0～8.0，优选地为7.0。其中所述调节pH值的方法为本领域常规方法，较佳地为利用食品级碱调节pH值，所述食品级碱为本领域常规，较佳地是Na₂CO₃、NaHCO₃和NaOH中的一种或多种。本发明所述的冷冻干燥为本领域常规的冻干方法，所述冷冻干燥方法较佳地为真空冷冻干燥，其中所述真空冷冻干燥条件较佳地为：板层极限温度≤-60℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度0.5～2.0mm，真空度10～30Pa。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二是：一种如本发明所述的制备方法制得的富含果聚糖的膳食补充剂。

较佳地，所述膳食补充剂中果聚糖的含量≥6％，所述百分比为质量百分比。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三是：如本发明所述的富含果聚糖的膳食补充剂在制备药品或食品中的用途。

本发明所述的用途为本领域常规用途，较佳地为将本发明所得富含果聚糖的膳食补充剂作为食品添加剂或者药品辅助剂的用途。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

1、本发明采用的菌株为一株产果聚糖的柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)，该菌株为首次发现具有产levan能力的柠檬明串珠菌。

2、本发明采用的柠檬明串珠菌是乳酸菌的一种，与其他产levan的菌株(如芽孢杆菌等)相比，其代谢产物具有更高的食品安全性。

3、本发明提供的膳食补充剂中所含有的levan是柠檬明串珠菌代谢蔗糖产生的，与市面上以人工后添加方式生产的膳食补充剂相比，本发明的制备工艺极大简化了生产步骤，节省了生产成本，同时降低了非连续性操作中带来的污染风险。

4、本发明提供的膳食补充剂，其制备所过程采用的发酵培养基来源广泛、成本低廉、天然安全，在降低物料成本的同时，提高了食品的安全性。

5、本发明利用产果聚糖的柠檬明串珠菌发酵天然发酵培养基，结合调pH、冷冻干燥的方法生产可直接食用的功能性膳食补充剂，打破现有市场上稀缺富含果聚糖的膳食补充剂的现状。

生物材料保藏信息

本发明涉及的柠檬明串珠菌的菌株，已于2012年08月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。该菌株的建议的分类命名为：柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum，该菌株的保藏编号为：CGMCC No.6431，所保藏的培养物名称为：BD01707。

附图说明

图1显示柠檬明串珠菌BD01707多糖的单糖组成色谱测定结果。

图2显示柠檬明串珠菌BD01707多糖的红外光谱测定结果。

图3显示柠檬明串珠菌BD01707多糖的核磁共振测定结果。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1富含果聚糖的膳食补充剂的制备

1、材料与方法

番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸5min，8000g离心10min取上清液，加入质量百分比含量为15％的蔗糖加热溶解后冷却至室温，以食用级碱调节pH至6.5，121℃灭菌20min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。

种子(发酵菌种)的制备：将保藏编号为CGMCC No.6431的柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)BD01707的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于蔗糖的质量百分比含量为2％的M17琼脂培养基(购买自Merck Co.德国)上，28℃好氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入20mL蔗糖的质量百分比含量为2％的M17液体培养基(购买自Merck Co.德国)，28℃180rpm摇床培养24h取出，培养物9,000rpm离心10分钟，弃去上清液，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。

发酵液中多糖(果聚糖)的制备：取发酵液以4倍于发酵液体积的无菌水稀释，15,000g离心10min，取上清液，加入3倍体积于上清液体积的无水乙醇，静置过夜，15,000g离心10min，收集沉淀物并溶于水后，真空冷冻干燥即得。

膳食补充剂中多糖(果聚糖)的制备：取膳食补充剂以无菌蒸馏水溶解，并还原至冷冻干燥前的体积，缓慢加入3倍于该体积的无水乙醇，静置过夜，15,000g离心10min，收集沉淀物并溶于水后，真空冷冻干燥即得。

2、富含果聚糖的膳食补充剂的制备

(1)将所得的柠檬明串珠菌BD01707种子以接种量2％(v/v)无菌接种于含蔗糖15％(v/v)，pH为6.5的番茄汁培养基，30℃、200rpm培养96小时，发酵结束后取发酵液，经测定，该发酵液中levan含量为2.87％(w/v)。

(2)将发酵液8000g离心10min取上清液，pH调节至7.0，冷冻干燥后得本实施例的膳食补充剂A。

经检测，本实施例生产的富含果聚糖的膳食补充剂中levan含量14.87％(w/w)。

3、成分检测

(1)柠檬明串珠菌BD01707发酵液中多糖的单糖组成测定

(a)标准样品配置：

多糖水解：吸取100μL浓度为4mg/mL～5mg/mL的多糖样品溶液于5mL的具塞刻度试管中，加入100μL的4moL/LTFA，充N₂封管，110℃烘箱中水解2h；冷却后打开盖，加200μL甲醇后用N₂吹干，如此重复加甲醇并用N₂吹3次，去除TFA，将其残渣用水溶解定容至5mL，用0.45μm微孔膜过滤后供进样分析。

(b)色谱条件

色谱柱：CarboPacPA203mmi.d.×150mm；

流动相：A、H₂O；B、250mmol/L NaOH；C、1mol/L NaAc；

三元梯度洗脱：流速：0.5mL/min；积分脉冲安培检测器；

Au工作电极：Ag/AgCl参比电极；

进样体积：20μL；柱温：30℃。

(c)按前述方法制备的步骤(1)发酵液中的多糖样品，并以高效阴离子色谱法测定多糖的单糖组成。

数据结果：柠檬明串珠菌BD01707多糖样品糖基组成的色谱分析结果见图1，该多糖在14.50min有单一吸收峰，且该吸收峰的保留时间与果糖标品保留时间一致。

结论：柠檬明串珠菌BD01707多糖由果糖单一糖基组成，是一种果聚糖。

(2)柠檬明串珠菌BD01707发酵液中多糖的结构判定

(a)傅里叶红外光谱(FTIR)测定

将前述方法制备的步骤(1)发酵液中的多糖样品与溴化钾粉末充分混合后，压制成片状，应用傅里叶红外光谱仪(Nicolet 6700,Thermo Fisher公司，美国)进行傅里叶红外光谱(FTIR)测定。

结果如图2所示，3306cm^-1处的强宽峰为分子间及分子内羟基吸收峰，2930cm^-1和2884cm^-1为果糖残基中C－H键伸缩振动的吸收峰，1634cm^-1处的吸收峰是结合水所致，1412－1217cm^-1为C－H变角振动的吸收峰，1120－1008cm^-1处的吸收峰是C－O－C和C－O－H的伸缩振动的结果。923cm^-1和810cm^-1处的吸收峰与呋喃环的伸缩振动有关。

结论：BD01707多糖的糖环构型以呋喃环为主。

(b)核磁共振(NMR)测定

将前述方法制备的步骤(1)发酵液中的多糖样品按10mg/mL的浓度完全溶解于重水中，并应用核磁共振波谱仪(Avance III 400MHz,Bruker公司，德国)进行核磁共振(NMR)测定，结果如图3所示。图3中A为NMR-¹H谱，显示样品的七个质子的化学位移集中在3.4－4.2ppm区域，而图3中B为NMR-¹³C谱，显示样品在104.537(C-2),80.622(C-5),76.628(C-3),75.532(C-4),63.716(C-6)和60.234(C-1)ppm处有共振。

结论：FTIR与¹H、¹³C谱的数据结合分析表明，BD01707发酵产生的胞外多糖为果聚糖。

实施例2富含果聚糖的膳食补充剂的制备

1、材料与方法

番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸10min，4000g离心12min取上清液，加入质量百分比含量为30％的蔗糖加热溶解后冷却至室温，以食用级碱调节pH至7.5，135℃灭菌10min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。

种子(发酵菌种)的制备、发酵液中多糖(果聚糖)的制备、膳食补充剂中多糖(果聚糖)的制备：同实施例1。

2、富含果聚糖的膳食补充剂的制备

(1)将所得的柠檬明串珠菌BD01707种子以接种量0.5％(v/v)无菌接种于蔗糖的质量百分比含量为30％，pH为7.5的番茄汁培养基，35℃、100rpm培养120小时，发酵结束后取发酵液，经测定，该发酵液中levan的质量百分比含量为2.36％。

(2)将发酵液4000g离心12min取上清液，pH调节至8.0，冷冻干燥后得本实施例的膳食补充剂B。

经检测，本实施例生产的富含果聚糖的膳食补充剂中levan的质量百分比含量为6.88％。

实施例3富含果聚糖的膳食补充剂的制备

1、材料与方法

番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸1min，12000g离心8min取上清液，加入质量百分比含量为5％的蔗糖加热溶解后冷却至室温，以食用级碱调节pH至5.5，110℃灭菌30min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。

种子(发酵菌种)的制备、发酵液中多糖(果聚糖)的制备、膳食补充剂中多糖(果聚糖)的制备：同实施例1。

2、富含果聚糖的膳食补充剂的制备

(1)将所得的柠檬明串珠菌BD01707种子以接种量4.0％(v/v)无菌接种于蔗糖的质量百分比含量为5％，pH为5.5的番茄汁培养基，20℃、300rpm培养72小时，发酵结束后取发酵液，经测定，该发酵液中levan的质量百分比含量为1.88％。

(2)将发酵液12000g离心8min取上清液，pH调节至6.0，冷冻干燥后得本实施例的膳食补充剂C。

经检测，本实施例生产的富含果聚糖的膳食补充剂中levan的质量百分比含量为20.22％。

实施例4富含果聚糖的膳食补充剂的制备

1、材料与方法

番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，120目纱布过滤取汁，煮沸8min，10000g离心9min取上清液，加入20％(w/v)蔗糖加热溶解后冷却至室温，以食用级碱调节pH至4.5，115℃灭菌25min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。

种子(发酵菌种)的制备、发酵液中多糖(果聚糖)的制备、膳食补充剂中多糖(果聚糖)的制备：同实施例1。

2、富含果聚糖的膳食补充剂的制备

(1)将所得的柠檬明串珠菌BD01707种子以接种量1.0％(v/v)无菌接种于蔗糖的质量百分比含量为20％，pH为4.5的番茄汁培养基，25℃、150rpm培养24小时，发酵结束后取发酵液，经测定，该发酵液中levan的质量百分比含量为1.46％。

(2)将发酵液10000g离心9min取上清液，pH调节至5.0，冷冻干燥后得本实施例的膳食补充剂D。

经检测，本实施例生产的富含果聚糖的膳食补充剂中levan的质量百分比含量为6.01％。

实施例5富含果聚糖的膳食补充剂的制备

1、材料与方法

番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，80目纱布过滤取汁，煮沸11min，6000g离心11min取上清液，加入质量百分比含量为10％的蔗糖加热溶解后冷却至室温，以食用级碱调节pH至6.5，125℃灭菌15min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。

种子(发酵菌种)的制备、发酵液中多糖(果聚糖)的制备、膳食补充剂中多糖(果聚糖)的制备：同实施例1。

2、富含果聚糖的膳食补充剂的制备

(1)将所得的柠檬明串珠菌BD01707种子以接种量3.0％(v/v)无菌接种于蔗糖的质量百分比含量为10％的番茄汁培养基，28℃、250rpm培养48小时，发酵结束后取发酵液，经测定，该发酵液中levan的质量百分比含量为2.05％。

(2)将发酵液6000g离心11min取上清液，pH调节至9.0，冷冻干燥后得本实施例的膳食补充剂E。

经检测，本实施例生产的富含果聚糖的膳食补充剂中levan的质量百分比含量为14.33％。

对比例1

将实施例1中的接种量，培养基pH，培养温度，发酵时间，发酵震荡的速度以及蔗糖浓度逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的发酵液,各组中的levan含量如表1所示。

表1不同方法制备所得levan产量

从表1所示的结果中可以得出，将所述发酵液的制备方法中接种量，培养基pH，培养温度，发酵时间，发酵震荡的速度以及蔗糖浓度调整到本发明之外的时候，所得果聚糖的产量显著降低。

效果实施例1产品口味与喜好程度测试

以实施例1-5制备的膳食补充剂A、B、C、D和E为实验对象，进行产品的口味测试。测试人数50人。品尝方式：采用不记名打分的方式进行品尝；分别对上述膳食补充剂A、B、C、D和E的色泽、酸甜比、风味、口感、营养项进行单独打分，每一项满分是20分，计算平均分及其总分，统计结果记录于表2。同时，根据对产品的整体喜好程度给出的意见，统计对每个单品的喜好人数，统计结果记录于表3。

表2产品口味测试结果数据统计表

表3产品喜好程度测试结果数据统计表

从产品口味测试和喜好程度统计结果可以看出，总体而言，本发明的富含果聚糖的膳食补充剂在产品风味、口感、营养方面可被大部分消费者所接受。

效果实施例2膳食补充剂中levan的稳定性

将实施例1-5制备的膳食补充剂A、B、C、D和E，分装入无菌的铝箔袋，常温(25℃)保存6个月、9个月和12个月后取出，结果如表4所示。

表4膳食补充剂中levan在常温保存条件下的稳定性

由表4可知，所有测试的膳食补充剂在常温保存12个月后，其中levan含量未发生降解，保持稳定不变。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种富含果聚糖的膳食补充剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)发酵菌种在番茄汁蔗糖培养基中发酵培养，得发酵液，所述的番茄汁蔗糖培养基由包括以下步骤的方法制备：番茄榨汁，将所得榨汁过滤后煮沸，离心取上清液，与蔗糖混合后加热冷却，调节pH值，灭菌后冷却即得，其中所述过滤的方法为利用80～120目纱布过滤取汁，所述煮沸的时间为1～10分钟，所述离心的速度为4,000～12,000g，离心的时间为8～12分钟，蔗糖的加入量为5～30％，所述灭菌的温度为110～135℃，灭菌时间为10～30分钟，pH值为4.5～7.5，所述百分比为质量百分比；所述柠檬明串珠菌为保藏号为CGMCC No.6431的柠檬明串珠菌的菌株BD01707；

(2)将步骤(1)所得发酵液离心取上清液，调节pH，冷冻干燥即得。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的发酵菌种的接种量为0.5％～4.0％，所述百分比为体积百分比。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的发酵培养的温度为20℃～35℃，所述发酵培养为振荡发酵培养，震荡的速度为100～300rpm，发酵培养的时间为24～120小时。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的发酵培养的温度为25～32℃，所述发酵培养为振荡发酵培养，震荡的速度为150～250rpm，发酵培养的时间为72～110小时。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的离心的速度为4,000～12,000g，离心的时间为8～12分钟。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的调节pH值为5.0～9.0。

7.一种如权利要求1～6任一项所述的制备方法制得的富含果聚糖的膳食补充剂。

8.如权利要求7所述的富含果聚糖的膳食补充剂在制备药品或食品中的用途。