CN113583994B - 一种果聚糖蔗糖酶的制备方法及其应用 - Google Patents

一种果聚糖蔗糖酶的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种果聚糖蔗糖酶的制备方法及应用，该制备方法包括：将柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum接种于番茄汁蔗糖培养基中发酵培养，得到发酵液，将发酵液离心取上清后冻干得粗酶提取物，再将粗酶提取物分离得果聚糖蔗糖酶。柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum的保藏编号为CGMCCNO.6431。柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum的接种量为1×107～5×107CFU/mL。番茄汁蔗糖培养基的制备方法包括：番茄清洗、去皮、榨为番茄汁，将所得番茄汁过滤后煮沸，离心取上清液，加入蔗糖加热溶解后冷却，调节pH值，灭菌后冷却即得。该发明的果聚糖蔗糖酶的制备方法，制备的果聚糖蔗糖酶来源安全，而且一次可制备三种不同分子量的天然的果聚糖蔗糖酶，大大提高了果聚糖蔗糖酶的制备效率。

Description

一种果聚糖蔗糖酶的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体是一种果聚糖蔗糖酶的制备方法及其应用。
背景技术
Levan是一类来源于植物或微生物的果糖大分子聚合物，其分子中通常含有大量β-(2，6)果糖苷键组成的主链及少量含有大量β-(2，1)果糖苷键组成的支链。研究表明，微生物来源的Levan具有抗肿瘤、抗糖尿病、增强免疫、降血脂等功能，此外，Levan还可用于纳米材料及药物载体的制备。为了提高产物Levan的纯度，通常会将果聚糖蔗糖酶(levansucrase)从微生物中提取出来，再与底物反应来获得更高品质的Levan。然而，目前已知的产果聚糖蔗糖酶的微生物较少，并且少数微生物还有致病性，此外，几乎所有的果聚糖蔗糖酶产生菌只能合成一种分子量大小的果聚糖蔗糖酶，因此，寻找一种来源安全、产物(果聚糖蔗糖酶)多样化的制备方法来满足市场成为本领域急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种果聚糖蔗糖酶的制备方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种果聚糖蔗糖酶的制备方法，该制备方法包括：将柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum接种于番茄汁蔗糖培养基中发酵培养，得到发酵液，将发酵液离心取上清后冻干得粗酶提取物，再将粗酶提取物分离得果聚糖蔗糖酶。
进一步地，所述柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum的保藏编号为CGMCCNO.6431。
进一步地，所述柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum的接种量为1×107～5×107CFU/mL。
进一步地，所述番茄汁蔗糖培养基的制备方法包括：
番茄清洗、去皮、榨为番茄汁，将所得番茄汁过滤后煮沸，离心取上清液，加入蔗糖加热溶解后冷却，调节pH值，灭菌后冷却即得。
进一步地，所述过滤为采用80～120目纱布过滤番茄汁，所述煮沸的时间为1～10min，所述离心的速度为4，000～12，000g，离心的时间为8～12min，蔗糖的加入量为5～30％，所述灭菌的温度为110～135℃，灭菌时间为10～30min，调节pH值至4.5～7.5。
进一步地，所述发酵培养的温度为20℃～35℃，所述发酵培养为振荡发酵培养，震荡的速度为100～300rpm，发酵培养时间为24～120h，所述离心的速度为4，000～12，000g，离心的时间为8～12min。
进一步地，所述果聚糖蔗糖酶为130kDa、90kDa和80kDa三种不同分子量。
进一步地，所述果聚糖蔗糖酶由基因组上连续排列的两个果聚糖蔗糖酶编码基因表达而成。
本发明还提供了果聚糖蔗糖酶的制备方法在制备果聚糖方面的应用。
进一步地，该方法制备的果聚糖蔗糖酶用于合成果聚糖。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本申请首次公开了一种采用柠檬明串珠菌制备果聚糖蔗糖酶的方法，该胞外多糖不但来源安全，而且一次可制备三种不同分子量的天然的果聚糖蔗糖酶，大大提高了果聚糖蔗糖酶的制备效率，还公开了合成这些果聚糖蔗糖酶的两个基因在基因组上连续排列，且与已知同类基因的同源性低的特点，本申请的两个果聚糖蔗糖酶编码基因与已知同类基因的同源性＜30％。上述特点使本技术方案具有显著的技术优势，因而在果聚糖制备领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1为发酵液中果聚糖蔗糖酶的原位活性检测结果；
图2为基因1291和1292在CGMCC NO.6431基因组上的分布图；
图3为蛋白1291和1292的SDS-PAGE胶图；
图4为基因1291和1292同源性比较图；
图5为多糖样品的核磁共振图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请提供了一种果聚糖蔗糖酶的制备方法，包括以下步骤：将柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum接种于番茄汁蔗糖培养基中发酵培养，得发酵液，将发酵液离心取上清液后冻干，得粗酶提取物，再将粗酶提取物分离，得果聚糖蔗糖酶。
具体的，柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)为保藏号CGMCC NO.6431的菌株，分类学命名为柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum，该菌种于2012年8月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
具体的，柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)接种量优选地为1×107～5×107CFU/mL；较佳地为2×107～4×107CFU/mL；更佳地为3×107CFU/mL。
具体的，所述番茄汁蔗糖培养基由以下步骤制备而成：成熟番茄清洗，去皮，榨汁，将所得榨汁过滤后煮沸，离心取上清，加入蔗糖加热溶解后冷却，调节pH值，灭菌后冷却即得。
需要说明的是，所述过滤的方法较佳地为利用80～120目纱布过滤取汁，所述煮沸的时间优选地为1～10min，较佳地为3～7分钟，更佳地为5分钟，所述离心的速度优选地为4，000～12，000g，较佳地为6，000～10，000g，更佳地为8，000g，离心的时间优选地为8～12min，较佳地为9～11min，更佳地为10min，蔗糖的加入量优选地为5～30％，较佳地10～20％，更佳地为为15％，所述灭菌的温度优选地为110～135℃，较佳地为110～123℃，更佳地为121℃，灭菌时间优选地为10～30min，较佳地为15～25min，更佳地为20min，pH值优选地为4.5～7.5，较佳地为6.0～7.0，更佳地为6.5。
发酵培养温度优选地为20℃～35℃，较佳地为25～32℃，更佳地为30℃，优选的发酵培养为振荡发酵培养，震荡的速度优选地为100～300rpm，较佳地为150～250rpm，更佳地为200rpm，发酵培养时间优选地为24～120h，较佳地为72～110小时，更佳地为96小时，所述离心的速度优选地为4，000～12，000g，较佳地为6，000～10，000g，更佳地为8，000g，离心的时间优选地为8～12min，较佳地为9～11min，更佳地为10min。
结合实施例和对比例1亦可知，在优选发酵参数的范围之外时，柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)CGMCC NO.6431在番茄汁蔗糖培养基中合成果聚糖蔗糖酶的效果明显下降。而在优选范围之内，接种量，培养基pH，培养温度，发酵时间，震荡速度以及蔗糖浓度相互影响，使得柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)CGMCC NO.6431可以发酵合成更多种不同分子量的果聚糖蔗糖酶。示例性的，在接种量过少时，菌种繁殖速度慢，使得最终参与被底物诱导、合成对应果聚糖蔗糖酶的菌体数量显著低于优选的接种量范围，从而影响酶的产量。示例性的，当培养温度低于优选范围值时，柠檬明串珠菌胞内的代谢活动大幅降低，进而钝化了底物的诱导作用，也会导致发酵液中果聚糖蔗糖酶产量的降低。
粗酶提取物的优选的分离方法是使用AKTA蛋白纯化系统进行分离。
该方法可同时制备三种不同分子量的果聚糖蔗糖酶，其分子量分别为130kDa、90kDa和80kDa。
上述的果聚糖蔗糖酶由基因组上连续排列的两个果聚糖蔗糖酶编码基因表达而成。
上述的两个果聚糖蔗糖酶编码基因与已知同类基因的同源性＜30％。
本申请还提供了果聚糖蔗糖酶的制备方法在果聚糖制备方面的应用。
该方法制备的果聚糖蔗糖酶可用于合成果聚糖。
与现有技术相比，上述技术方案首次公开了一种果聚糖蔗糖酶的方法，该胞外多糖不但来源安全，而且一次可制备三种不同分子量的天然的果聚糖蔗糖酶，大大提高了果聚糖蔗糖酶的制备效率，还公开了合成这些果聚糖蔗糖酶的两个基因在基因组上连续排列，且与已知同类基因的同源性低的特点，上述特点使本技术方案具有显著的技术优势，因而在果聚糖制备领域具有良好的应用前景。
下面通过实施例进一步说明上述具体实施方式，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，所有原料均为市售，并均符合相关的国家标准。
实施例1果聚糖蔗糖酶的制备方法
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：将柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)CGMCCNO.6431的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于含2％(w/v)蔗糖的M17琼脂培养基(Merck Co.德国)上，28℃好氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入20mL含2％(w/v)蔗糖的M17液体培养基(Merck Co.德国)，28℃180rpm摇床培养24h取出，培养物9，000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子，经检测，种子液的菌浓度为1×109CFU/mL。
(b)番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸5min，8000g离心10min取上清，加入15％(w/v)蔗糖加热溶解后冷却至室温，以食用级碱调节pH至6.5，121℃灭菌20min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。
(c)发酵液中果聚糖蔗糖酶的原位活性检测：取发酵液50mL 15000g离心30min，取上清，缓慢加入硫酸铵直至饱和度达到60％，冷藏过夜，20000g、4℃离心30min取沉淀，溶解于少量蒸馏水中，装入截留分子量为1000Da的透析袋内，置于1‰CaCl2溶液中低温透析24h，期间换水5次，取出冻干得冻干粉。称量上述冻干样品5mg溶于0.5mL PBS中，再Nativelaoding混合，上样于4-20％SDS-PAGE梯度胶(南京金斯瑞生物科技有限公司，中国)，并在110V电压下电泳1.5h。所得的蛋白胶一半用于考马斯亮蓝染色，另外一半用NaAc溶液(20mM、pH5.5)浸洗2次后，置于含5％蔗糖、0.3‰NaN3的NaAc溶液(20mM、pH5.5)中，30℃反应48h后，于暗室观察原位反应产物的条带数量和位置，以此确认柠檬明串珠菌合成的果聚糖蔗糖酶的数量和分子量。
(d)果聚糖蔗糖酶的分离：将粗酶提取物溶解于蒸馏水中上样于AKTA蛋白纯化系统(GE公司，美国)，填料：Sephacryl S-300 High Resolution，流速：1mL/min，柱体积：120mL，检测器：UV检测器，根据UV信号收集280nm信号较高的洗脱液，冻干。各样品取5mg加入含5％蔗糖、0.3‰NaN3的NaAc溶液(20mM、pH5.5)中，30℃反应48h后，用葡萄糖检测试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，中国)测定是否有游离葡萄糖生成，若有则该样品为果聚糖蔗糖酶。
2、果聚糖蔗糖酶的制备
将柠檬明串珠菌种子以接种量3％(v/v)无菌接种于含蔗糖15％(v/v)，pH为6.5的番茄汁培养基，30℃、200rpm培养96h得发酵液。对发酵液中果聚糖蔗糖酶的原位活性进行检测，结果如图1所示，SDS PAGE原位反应发现有三个明显的多糖条带，表明发酵液内含有三种分子量不同的果聚糖蔗糖酶，其分子量分别为130kDa、90kDa和80kDa。将发酵液8000g离心10min取上清，冷冻干燥得粗酶提取物，对该提取物进行分离后即得三个果聚糖蔗糖酶样品。
实施例2果聚糖蔗糖酶的制备
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
(b)番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸10min，4000g离心12min取上清，加入30％(w/v)蔗糖加热溶解后冷却至室温，以食用级碱调节pH至7.5，135℃灭菌10min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。
(c)发酵液中果聚糖蔗糖酶的原位活性检测：同实施例1。
(d)果聚糖蔗糖酶的分离：同实施例1。
2、果聚糖蔗糖酶的制备
将柠檬明串珠菌种子以接种量1％(v/v)无菌接种于含蔗糖30％(v/v)，pH为7.5的番茄汁培养基，35℃、100rpm培养120h得发酵液。对发酵液中果聚糖蔗糖酶的原位活性进行检测，结果与实施例1相同。将发酵液4000g离心12min取上清，冷冻干燥得粗酶提取物，对该提取物进行分离后即得三个果聚糖蔗糖酶样品。
实施例3果聚糖蔗糖酶的制备
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
(b)番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸1min，12000g离心8min取上清，加入5％(w/v)蔗糖加热溶解后冷却至室温，以食用级碱调节pH至5.5，110℃灭菌30min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。
(c)发酵液中果聚糖蔗糖酶的原位活性检测：同实施例1。
(d)果聚糖蔗糖酶的分离：同实施例1。
2、果聚糖蔗糖酶的制备
将柠檬明串珠菌种子以接种量5％(v/v)无菌接种于含蔗糖5％(v/v)，pH为5.5的番茄汁培养基，20℃、300rpm培养72h得发酵液。对发酵液中果聚糖蔗糖酶的原位活性进行检测，结果与实施例1相同。将发酵液12000g离心8min取上清，冷冻干燥得粗酶提取物，对该提取物进行分离后即得三个果聚糖蔗糖酶样品。
实施例4果聚糖蔗糖酶的制备
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
(b)番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸8min，10000g离心9min取上清，加入20％(w/v)蔗糖加热溶解后冷却至室温，以食用级碱调节pH至4.5，115℃灭菌25min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。
(c)发酵液中果聚糖蔗糖酶的原位活性检测：同实施例1。
(d)果聚糖蔗糖酶的分离：同实施例1。
2、果聚糖蔗糖酶的制备
将柠檬明串珠菌种子以接种量2％(v/v)无菌接种于含蔗糖20％(v/v)，pH为4.5的番茄汁培养基，25℃、150rpm培养24h得发酵液。对发酵液中果聚糖蔗糖酶的原位活性进行检测，结果与实施例1相同。将发酵液10000g离心9min取上清，冷冻干燥得粗酶提取物，对该提取物进行分离后即得三个果聚糖蔗糖酶样品。
实施例5果聚糖蔗糖酶的制备
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
(b)番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸11min，6000g离心11min取上清，加入10％(w/v)蔗糖加热溶解后冷却至室温，以食用级碱调节pH至6.5，125℃灭菌15min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。
(c)发酵液中果聚糖蔗糖酶的原位活性检测：同实施例1。
(d)果聚糖蔗糖酶的分离：同实施例1。
2、果聚糖蔗糖酶的制备
将柠檬明串珠菌种子以接种量4％(v/v)无菌接种于含蔗糖10％(v/v)，pH为6.5的番茄汁培养基，28℃、250rpm培养48h得发酵液。对发酵液中果聚糖蔗糖酶的原位活性进行检测，结果与实施例1相同。将发酵液6000g离心11min取上清，冷冻干燥得粗酶提取物，对该提取物进行分离后即得三个果聚糖蔗糖酶样品。
效果实施例1果聚糖蔗糖酶编码基因的确定
为了确定果聚糖蔗糖所对应的编码基因，对柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)CGMCC NO.6431进行了全基因组测序，从全基因组序列中发现2个连续排列的果聚糖蔗糖酶编码基因，分别命名为1291和1292(见图2)，其具体序列如下。
1291基因序列：
MNMKETTTRKKLYKSGKVWVAAATAFAVMGVSAVTTSISADTTASAVTAPTTADKAAPAVTAPTTADKAAPAVTAPTTADKAAPAVTAPTTADKAAPAVTAPTTADKATPAVAAPTTATSAQVTELTKNGLQLVSDAKIDNFDVNKLSSRQINSLNAAADKYYQNPNKTPNSNAVTYKNFDDLIKQLQEQPKNIAIPQFNSQNIKNLPAVTTESALTGKIEDLDIWDSWMVQDAQTQKVADVQGHQVMFALAGSTKEPADTHIYMLTTPYKATTINSWQMVGPVFGYNAVPWSQEWSGSATVNKDGSIQLFYTRVTWNDTIKQNMQRLSTINIVVRPTNSNGLAIENVNNDHIIFDGDGKYYQNIEQTVNSEGDNFTLRDPHVIEVDGQRYLSFETNTGTNNPEGYENVTDLSNYGGSLHYNVTKLLELVGNDAAFRTATLANGALGLLRLTQEQNNPTVTQIYDPLVTSNMVTDEIERANIVPLNGKYYLFTDTRLEKSSLGSNWNKSTASDIAMLGYVSDTLFGDYKPLNINGVVLVANKTSNDRTATYSYYAVPVDGYSDRLLITSYMSNRGMEAGNGLNATTAPSFIIQINADGTTAVEQTITTQNDWVDPYNAVDPSMYGFPGQAVNIKMAINSSFRTDGVFLNAPYGANVTNEHGLSITSEHVGNTTDYNGMSTQITRQYITSDNITWYLASLNNRSVWIDSRAFTTVPFTPRDMTSFVNFSGRKDGIFTNAPYGMDNAKYVGNINNYQGQSFVIGGQYYDRGITWNLIQVNGQSVWVDNRSFATNFTHDTDKKVFVNTTSNLDGLFLNAPYRQPGYKLAGLAKNYNNQTVTVSQQYFDDQGTVWSQVVLGGQTVWVDNHALAQMQVRDTNQQLYVNSNGRNDGLFLNAPYRGQGSQLIGMTADYNGQHVQVTKQGQDAYGAQWRLITLNNQQVWVDSRALSTTIMQAMNDDMYVNSSQRTDGLWLNAPYTMSGAKWAGDTRSANGRYVHISKAYSNEVGNTYYLTNLNGQSTWIDKRAFTTTFDQVVALNATIVARQRPDGMFKTAPYGEAGAQFVDYVTNYSQQTVPVTKQHSDAQGNQWYLATVNGTQYWIDQRSFSPVVTKVVDYQAKIVPRTTRDGVFSGAPYGEVNAKLVNMATAYQNQVVHATGEYTNASGITWSQFALSGQEDKLWIDKRALQA
1292基因序列：
MKQQESITRKKLYRSGKSWVAAATAFAVMGVSAVTTSISADTTASAVTAPTTADKAAPAVTAPTTADKAAPAVTAPATADKAAPAVTAPTTADKAAPAVTAPTTADKAAPAVTAPTTADKAAPAVTALTAPNTARLVEKDLPANNEISGLTTFGNNLVCDAGLAKSDLIKNLSKDQIDAINQAATKYYDDPAKKPFSNAITYKDFDQLINQFNESPKELSVPKFNKENIKDMPSLTTKDAESNEVSALDMWDTWSVQDAKTKTVANVNGFQMMFGLAGAPTLGDTHMYMLYAKYGATHIEDWKMAGSVFGYDAVNSNQEWSGSAALNDDGSIQLFYTRVKWNSKLEANYQELWTANIDVSVIPDNEIQIKSINNDHSLFAGDGFYYEQLDQIRGTESQHGENFALRDPNIIETDSGRYLTFEAGTGQYRPSGKQNITDLSIYGGDLSYNVKAMLNTVSNSDWKSLAGRSNAALGLLKLSGNQSDPDVEKLYTPRITSILTSDEIERANIVPLNGKYYLFAAARFDRSFLGHSPKLQPGYNVMMLGYVSDKIDGDYRPLNGNGTVLVSNIDFNDRTATYAYYPVAVDGYSDRLLVTGYMSNRGQKTNTGYNATTAPSFIIQINADGTTAVEQTITTQNDWVDPYNAVDPSMYGFPGQAVNIKMAINSSFRTDGVFLNAPYGANVTNEHGLSITSEHVGNTTDYNGMSTQITRQYITSDNITWYLASLNNRSVWIDSRAFTTVPFTPRDMTSFVNFSGRKDGIFTNAPYGMDNAKYVGNINNYQGQSFVIGGQYYDRGITWNLIQVNGQSVWVDNRSFATNFTHDTDKKVFVNTTSNLDGLFLNAPYRQPGYKLAGLAKNYNNQTVTVSQQYFDDQGTVWSQVVLGGQTVWVDNHALAQMQVRDTNQQLYVNSNGRNDGLFLNAPYRGQGSQLIGMTADYNGQHVQVTKQGQDAYGAQWRLITLNNQQVWVDSRALSTTIMQAMNDDMYVNSSQRTDGLWLNAPYTMSGAKWAGDTRSANGRYVHISKAYSNEVGNTYYLTNLNGQSTWIDKRAFTTTFDQVVALNATIVARQRPDGMFKTAPYGEAGAQFVDYVTNYSQQTVPVTKQHSDAQGNQWYLATVNGTQYWIDQRSFSPVVTKVVDYQAKIVPRTTRDGVFSGAPYGEVNAKLVNMATAYQNQVVHATGEYTNASGITWSQFALSGQEDKLWIDKRALQA
为进一步证明上述1291和1292的果聚糖蔗糖酶编码基因是否可正常表达，设计了异源表达实验：
1)大肠杆菌的蛋白表达
鉴定正确的表达质粒转化感受态E.coli BL21(DE3)或Transrosetta，挑取3个单菌落分别接种于5mL LB培养基(含相应抗生素)，37℃培养过夜，取出。将过夜培养物分别接种于800mL LB培养基(含相应抗生素)，37℃培养5h(OD600≈0.5)，转移至25℃降温0.5h，加入IPTG至终浓度0.2mM，25℃表达16h。表达完成后取出菌液于冰中冷却，4℃，5000rpm离心15min，收集菌体，用破菌缓冲液洗涤1次，倒出破菌缓冲液将菌体冻存于-80℃。
2)蛋白的分离与纯化
取出-80℃冻存的菌体，按菌体：溶液＝1：5的比例将菌体均匀重悬于破菌缓冲液中，使用超高压破菌仪(破菌压力1000bar)破碎细菌三次至半透明状，再将菌液18000rpm离心0.5h，取上清转移至烧杯中，使用蠕动泵上样至事先平衡完毕的HisTrap FF 5mL或1mL柱上，使用破菌缓冲液冲洗柱子至无蛋白洗出(最大流速为每1mL柱体积0.5mL/min)，再换用冲淋缓冲液冲洗柱子至无蛋白洗出，最后使用洗脱缓冲液洗脱出目的蛋白。将含有目的蛋白的洗脱缓冲液用脱盐柱进行脱盐，收集淋洗液，得到纯化完成的目的蛋白。
对上述目的蛋白进行SDS PAGE电泳和原位活性检测(方法同实施例1)，结果如图3所示，在SDS PAGE胶上发现有基因1291和1292表达的蛋白条带，说明这两个果聚糖蔗糖酶编码基因均可正常表达。
结论：柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)CGMCC NO.6431合成的三种不同分子量的聚糖蔗糖酶是由基因组上连续排列的两个果聚糖蔗糖酶编码基因(1291和1292)表达而成。
效果实施例2果聚糖蔗糖酶编码基因同源性比较
采用mega7软件将基因1291和1292与其他已知的同类基因(CAD48195.1、AAO14618.1、WP010237336、AAB97111.1、AC15886.1、BAA04475、AAC36458.1、CBJ48143.1、CCM43846.1、CPR14579.1、EHD23269.1、AAT81165.1、AAL09386.1，序列均来自NCBI网站)进行同源性比较，结果如图4所示，基因1291和1292与已知同类基因的同源性＜30％，表明这两个果聚糖蔗糖酶编码基因具有显著的独特性。
效果实施例3果聚糖蔗糖酶的分子量比较
通过文献检索，对本发明制备的三种果聚糖蔗糖酶的分子量与已知报道进行比较，结果如表1所示。
表1 不同来源的果聚糖蔗糖酶的分子量比较
Figure BDA0003181945870000131
数据来源：
[1]Ben Ammar Y，Matsubara T，Ito K，et al.Characterization of athermostable levansucrase from Bacillus sp.TH4-2 capable of producing highmolecular weight levan at high temperature[J].Journal of Biotechnology，2002，99(2):111-119.
[2]van,Hijum,Aft S,et al.Biochemical and molecular characterizationof a levansucrase from Lactobacillus reuteri.[J].Microbiology，2004，150:621-630.
[3]Tieking M,Ehrmann M A，Vogel R F，et al.Molecular and functionalcharacterization of a levansucrase from the sourdough isolate Lactobacillussanfranciscensis TMW 1.392.[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2005，66(6):655-663.
[4]Sangmanee S,Nakapong S，Kuttiyawong K,et al.Production andImmobilization of Levansucrase[J].Chiang Mai Journal of Science，2015，42(1):44-51.
通过比较后发现，本申请制备的果聚糖蔗糖酶具有如下两个优点：一是本申请的两个果聚糖蔗糖酶编码基因与已知同类基因的同源性＜30％，本申请与已知同类基因的同源性低；二是本申请提供的技术方案所制备的果聚糖蔗糖酶不但种类多，而且其中130kDa分子量的果聚糖蔗糖酶是目前已知最大的有天然活性的果聚糖蔗糖酶。
效果实施例4果聚糖蔗糖酶样品的活性验证
将实施例1制备获得的三个果聚糖蔗糖酶样品20mg分别溶解于含5％蔗糖、0.3‰NaN3的NaAc溶液(20mM、pH5.5)，30℃反应48h后，15，000g离心10min，取上清液，加入3倍体积于上清液体积的无水乙醇，静置过夜，15，000g离心10min，收集沉淀物并溶于水后，真空冷冻干燥即得三个多糖样品。将三个多糖样品按10mg/mL的浓度分别完全溶解于重水中，并应用核磁共振波谱仪(Avance III 400MHz,Bruker公司，德国)进行核磁共振(NMR)测定，结果发现，三个多糖样品的NMR图谱一致(如图5所示)，所有多糖样品的NMR-1H谱和NMR-13C谱的化学位移与果聚糖levan标准品吻合。
结论：通过本发明制备的三种不同分子量的果聚糖蔗糖酶均可用于合成果聚糖levan。
对比例1
将实施例1中的接种量，培养基pH，培养温度，发酵时间，震荡速度以及蔗糖浓度逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的发酵液，各组发酵液中果聚糖蔗糖酶的原位活性条带数量如表2所示。
表2 不同方法制备的发酵液中果聚糖蔗糖酶的原位活性条带数量
Figure BDA0003181945870000151
从表2所示的结果中可以得出，将所述发酵液的制备方法中接种量，培养基pH，培养温度，发酵时间，发酵震荡的速度以及蔗糖浓度调整到本发明之外的时候，部分组的发酵液中依然有果聚糖蔗糖酶合成，但其数量发生显著降低。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (2)

1.一种果聚糖蔗糖酶的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：将柠檬明串珠菌Leuconostoccitreum接种于番茄汁蔗糖培养基中发酵培养，得到发酵液，将发酵液离心取上清后冻干得粗酶提取物，再将粗酶提取物分离得果聚糖蔗糖酶；
所述柠檬明串珠菌Leuconostoccitreum的保藏编号为CGMCCNO.6431；
所述柠檬明串珠菌Leuconostoccitreum的接种量为3×107CFU/mL；
所述番茄汁蔗糖培养基的制备方法包括：
番茄清洗、去皮、榨为番茄汁，将所得番茄汁过滤后煮沸，离心取上清液，加入蔗糖加热溶解后冷却，调节pH值，灭菌后冷却即得；
所述过滤为采用80～120目纱布过滤番茄汁，所述煮沸的时间为1～10min，所述离心的速度为4，000～12，000g，离心的时间为8～12min，蔗糖的加入量为15％，所述灭菌的温度为110～135℃，灭菌时间为10～30min，调节pH值至6.5；
所述发酵培养的温度为30℃，所述发酵培养为震荡发酵培养，震荡的速度为200rpm，发酵培养时间为96h；所述果聚糖蔗糖酶为130kDa、90kDa和80kDa三种不同分子量。
2.根据权利要求1所述的果聚糖蔗糖酶的制备方法在制备果聚糖蔗糖酶方面的应用。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105039454A (zh) * 2015-08-27 2015-11-11 光明乳业股份有限公司 一种富含果聚糖的膳食补充剂及其制备方法
CN105054173A (zh) * 2015-08-27 2015-11-18 光明乳业股份有限公司 一种富含果聚糖的果蔬汁饮料及其制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105039454A (zh) * 2015-08-27 2015-11-11 光明乳业股份有限公司 一种富含果聚糖的膳食补充剂及其制备方法
CN105054173A (zh) * 2015-08-27 2015-11-18 光明乳业股份有限公司 一种富含果聚糖的果蔬汁饮料及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Jin Han等.Levan from Leuconostoc citreum BD1707: production optimization and changes in molecular weight distribution during cultivation.《BMC Biotechnol 》.2020,第21卷(第1期),第1-14页. *
Jin Han等.Levan-Producing Leuconostoc citreum Strain BD1707 and Its Growth in Tomato Juice Supplemented with Sucrose .《 Appl Environ Microbiol》.2015,第82卷(第5期),第1383–1390页. *

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