CN107365730B - 枯草芽孢杆菌菌株及利用该菌株生产支链淀粉酶的方法 - Google Patents

枯草芽孢杆菌菌株及利用该菌株生产支链淀粉酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产支链淀粉酶的菌株YSP6，其分类属枯草芽孢杆菌属（Bacillus subtilis），该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.14391。本发明还公开了利用所述菌株YSP6生产支链淀粉酶的方法，该支链淀粉酶生产周期较短、生产效率较高，且制备的支链淀粉酶的活力较高；在35吨发酵罐中批量生产时，发酵液平均活力在1000 U/mL以上，最高达5000 U/mL；产品活力在1000U/mL以上，最高达10000U/mL，产品综合回收率达80%以上，具有较好的生产价值。

Description

枯草芽孢杆菌菌株及利用该菌株生产支链淀粉酶的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌菌株及利用该菌株生产支链淀粉酶的方法。
背景技术
支链淀粉酶是一类淀粉脱支酶，其能专一性水解普鲁兰糖（麦芽三糖以α-1,6糖苷键连接起来的聚合物）。淀粉是由直链淀粉和支链淀粉组成的混合物，其中直链淀粉是由葡萄糖单体通过α-1,4糖苷键形成的，支链淀粉的主链是由直链淀粉组成,其分支处则由α-1,6糖苷键形成。
工业应用淀粉中支链淀粉含量高达70%～95%，其中α-1,6 键的含量是 4%～5%，然而大多数的淀粉酶对α-1,6 糖苷键均不起作用,α-淀粉酶和糖化酶联合使用时也不能达到对淀粉的完全分解，因此 α-1,6 糖苷键的水解效率直接影响到工业淀粉的利用率。
淀粉脱支酶，能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1,6-糖苷键，从而剪下整个侧支，形成直链淀粉。支链淀粉酶能将最小单位的支链分解，最大限度地利用淀粉，提高淀粉利用率，在以淀粉为原料的加工工业中具有重要用途。近年来，支链淀粉酶作为辅助酶被广泛用于淀粉糖、燃料乙醇、低热量啤酒、抗性淀粉和麦芽三糖等生产，商业价值越来越高，引起了广泛关注。
支链淀粉酶在工业上的应用非常广泛，但是大部分支链淀粉酶的酶活不高，或者不能适应酸性高温的作用环境，这些因素严重的制约了支链淀粉酶的工业应用。我国对支链淀粉酶的研究始于20世纪70年代，起步晚。但是目前国内市场对支链淀粉酶的需求量大，主要依赖进口，价格昂贵。因此，掀起了一股研究支链淀粉酶的热潮。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一株枯草芽孢杆菌菌株及利用该菌株生产支链淀粉酶的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株产支链淀粉酶的菌株YSP6，其分类属枯草芽孢杆菌属（Bacillus subtilis），该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No. 14391；保藏日期为2017年07月07日；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
一种利用所述菌株YSP6生产支链淀粉酶的方法，其包括如下步骤：
1）生产液体支链淀粉酶：菌株YSP6先在温度28－38℃、pH 自然的条件下液体培养1－2天（转速160－250转/分钟），然后在28－38℃的温度条件下按3－8%的接种量接种于发酵培养基中发酵培养18－48h（转速150－260转/分钟）；
所述液体培养基组成为：玉米淀粉2.0－6.0%，豆粕1.0－6.0%，磷酸二氢钾0.2－0.5%，葡萄糖1.0－5.0%，硫酸铵0.2－0.7%，硫酸镁0.1－0.3%, pH自然；
所述发酵培养基组成为：玉米淀粉2.0－8.0%，豆粕1.0－8.0%，磷酸二氢钾0.2－0.5%，葡萄糖1.0－5.0%，硫酸铵0.2－0.7%，硫酸镁0.1－0.3%，pH自然；
2）发酵培养结束后添加助滤剂进行板框过滤，滤液经超滤浓缩、精滤除菌后即得。
步骤2）中助滤剂添加量为0.6－5.0%，所述助滤剂的各原料重量百分比组成为：珍珠岩35－70%，硅藻土30－65%。
进一步优选的，一种利用上述菌株YSP6生产支链淀粉酶的方法，其具体包括如下步骤：
（1）菌株复壮，具体为：
如果菌株是以冻干粉（一般在-80℃保存）形式保存，则首先应将冻干粉形式的菌株接种在斜面培养基上，28－38℃条件下培养24－72h进行复壮生长；
所述斜面培养基配方为：蛋白胨 0.4－0.8%，牛肉膏 0.2－0.3%，葡萄糖 1.0－4.0%，磷酸二氢钾0.2－0.5%，琼脂1.5－2.0%，pH=自然；
需要说明的是，如果菌株以斜面培养方式保藏，则无需进行该步骤的菌株复壮操作，直接进入下一步；
（2）制备种子液，具体为：
将步骤（1）复壮后的菌株接种于灭菌后的摇瓶培养基中，28℃－38℃、180-260转/min摇瓶培养至OD600nm在6－13时（一般需10－18h左右，可认为菌种培养成熟），即已制备好种子液；
所述摇瓶培养基配方为：蛋白胨 0.4－0.8%，牛肉膏 0.2－0.3%，葡萄糖 1.0－5.0%，磷酸二氢钾0.2－0.5%，硫酸铵0.2－0.7%，硫酸镁0.1－0.3%，pH=自然；
（3）制备一级种子罐培养液，具体为：
将一级种子罐培养基灭菌后，接种步骤（2）所制备的种子液（接种量1:5000－10000），28℃－38℃、160－250 转/min、通风量1:0.5－0.7条件下培养8－15h；
所述一级种子罐培养基配方为：玉米淀粉2.0－6.0%，豆粕1.0－6.0%，磷酸二氢钾0.2－0.5%，葡萄糖1.0－5.0%，硫酸铵0.2－0.7%，硫酸镁0.1－0.3%，pH=自然；
（4）菌株发酵，具体为：
将发酵培养基灭菌后，以3－8%的接种量接种步骤（3）所制备的一级种子罐培养液，28℃－38℃、罐压0.04～0.08Mpa、通风量1:0.3－1.2条件下，发酵至发酵活力不低于1000U/ml，且连续两小时活力不再增加时（一般需18－48h），即认为发酵结束），所得产物称为醪液；
所述发酵培养基配方为：玉米淀粉2.0－8.0%，豆粕1.0－8.0%，磷酸二氢钾0.2－0.5%，葡萄糖1.0－5.0%，硫酸铵0.2－0.7%，硫酸镁0.1－0.3%，pH=自然；
需要注意的是，发酵过程中可每2小时取样检测发酵活力，在发酵时，补加发酵培养基，补加量为初始发酵培养基体积的15－30%；
（5）支链淀粉酶提取与精制，具体为：
在步骤（4）发酵结束后所得醪液中加入助滤剂，混合均匀后采用板框压滤机进行过滤，滤液再经超滤机浓缩（超滤机浓缩时，所用超滤膜截留分子量为10000道尔顿）获得浓缩液；向浓缩液中加入防腐剂，在配方罐内混合均匀后，再经精滤板框过滤以除去菌体等其它杂质，使细菌数控制在50000cfu/g以内，所得滤液为支链淀粉酶，其活力（按GB/1886.174-2016中A.9条款测定）达1000－10000 U/mL，高于市售其它支链淀粉酶产品。
具体的，步骤（5）中，助滤剂添加量为醪液重量的0.6－5.0%，所述助滤剂的各原料重量百分比组成为：珍珠岩35－70%，硅藻土30－65%；所述防腐剂添加量为浓缩液重量的0.1－0.3%，所述防腐剂为山梨酸钾或苯甲酸钠。
与现有技术相比，本申请的主要技术优势体现在如下几个方面：
1）生产成本较低，实现了支链淀粉酶的规模化、产业化生产；本发明通过优化培养基构成，规模化生产时，以玉米淀粉、豆粕等农副产品为主要发酵原料，代替了酵母粉、蛋白胨等原料，较好降低了生产成本；同时通过高产菌株的选择，实现了支链淀粉酶规模化、产业化生产；
2）支链淀粉酶生产周期较短、生产效率较高，且制备的支链淀粉酶的活力较高；在35吨发酵罐中批量生产时，发酵液平均活力在1000 U/mL以上，最高达5000 U/mL，产品活力在1000U/mL以上，最高达10000U/mL，产品综合回收率达80%以上，具有较好的生产价值。
总体而言，本发明通过对特定发酵菌株培养基及发酵条件的优化，达到了高密度和高产量的预期效果。生产工艺简单易实现，较好缩短了支链淀粉酶的生产周期，加上生产成本较低、支链淀粉酶产量高、纯度高等优点，本发明可为支链淀粉酶的推广应用奠定一定基础。
附图说明
图1为Bacillus subtilis菌株YSP6的平板菌落照片；
图2为Bacillus subtilis菌株YSP6的显微镜放大1000倍照片；
图3为 Bacillus subtilis菌株YSP6的16S rDNA全序列测序结果；
图4为用MEGA5.0软件构建的进化树。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
（一）Bacillus subtilis菌株YSP6的筛选。
初筛：
土壤样品，取自淀粉厂周边土壤。用十倍梯度稀释法，选取10-4、10-5、10-6三个梯度涂布于筛选培养基（筛选培养基组成为：蛋白胨 0.4%，牛肉膏 0.2%，葡萄糖 1.0%，普鲁兰糖1.0%，磷酸二氢钾0.2%，琼脂2.0%，pH=自然），37℃恒温培养1-2d获得单菌落。喷洒酒精，记录有透明圈的菌株。
将初筛有透明圈且透明圈较大的菌株，选取15-30株接种到发酵培养基（每个菌株接种1个摇瓶，摇瓶培养基组成为：玉米淀粉3.0%，豆粕2.0%，磷酸二氢钾0.2%，葡萄糖1.0%，硫酸铵0.2%，硫酸镁0.1%，pH=自然），37℃，200转/min，恒温培养28h。
然后取2mL发酵液15000转/min离心5分钟，取上清液稀释后，用DNS法即按GB/1886.174-2016中A.9条款测定支链淀粉酶活力。
选取支链淀粉酶活力较高的百余菌株，于4℃条件下保存其相应斜面（斜面培养基组成为：蛋白胨 0.4%，牛肉膏 0.2%，葡萄糖 1%，磷酸二氢钾0.2%，琼脂2.0%，pH=自然）。
复筛
将初筛保留的菌株，接种于含有20mL发酵培养基的250mL三角瓶中（每株菌接种三个摇瓶，发酵培养基与初筛中的发酵培养基组成相同）。 37℃、200转/min恒温培养28h。然后取2mL发酵液15000转/min离心5分钟，取上清液稀释后，用DNS法即按GB/1886.174-2016中A.9条款测定支链淀粉酶活力。
多数菌株支链淀粉酶含量较低，仅有P6001号（公司编号为YSP6）菌株产支链淀粉酶活力最高，为352u/mL。表1中给出了产支链淀粉酶活力较高的几株菌株。
表1 部分试验菌株的产支链淀粉酶情况
Figure DEST_PATH_IMAGE001
（二）Bacillus subtilis菌株YSP6的鉴定。
筛选得到的能有效积累支链淀粉酶且效果显著的微生物菌株YSP6：该菌株菌体杆状，0.5μm×2.0～2.67μm，单个、成对或短链状排列，芽孢柱状，端生，孢囊不膨大，革兰氏阳性。菌落乳白色，不规则形，表面扁平、干燥，不透明，边缘不整齐（见图1和图2）。
根据微生物代谢类型的差异，采用生理生化分析方法，检测微生物对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴定评价待检微生物的分类学地位。参考文献（JohnG.H,NoelR.K,Peter H.A.S,et al.Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology,NinthEdition,Lippincott Williams﹠Wilkins,1994.）进行生理生化特性鉴定，鉴定结果详见表2。
根据明胶液化、淀粉水解、硝酸盐还原、溶菌酶、Nacl、pH、厌氧生长，V-P、卵黄、接触酶、吲哚反应、革兰氏染色、生长温度、利用柠檬酸盐、苯丙氨酸脱氨、酪素水解、酪氨酸水解、葡萄糖产气、产酸等种间生理生化特性鉴定，该菌株属于Bacillus subtilis，拟命名为Bacillus subtilis YSP6。
同时委托，中国工业微生物菌种保藏管理中心进行16s rDNA全序列测序（共1426bp，结果见图3），在NCBI网站上用BLAST检索GenBank 中相关菌株的16s rDNA序列分析（见表3）和构建进化树，用MEGA5.0软件构建进化树分析（见图4），基于16s rDNA分析和构建进化树分析得出YSP6与Bacillus subtilis subsp 亲缘关系最近，菌株YSP6可以确定为Bacillus subtilis。
由上述鉴定结果可知，菌株属枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No. 14391。
表2 生理生化特性鉴定结果对照表
Figure DEST_PATH_IMAGE002
表3 16S rDNA序列同源性（或相似性）分析
Figure DEST_PATH_IMAGE003
（三）利用菌株YSP6生产支链淀粉酶。
实施例1
在20吨发酵罐进行一批次发酵生产，本实施例公开了一种利用菌株YSP6生产支链淀粉酶的工艺，它的步骤如下：
（1）菌株复壮：
从-80℃冰箱取出以冻干粉形式保存的枯草芽孢杆菌菌种YSP6，以斜面培养方式复活菌种。接种于斜面培养基上，在30℃的斜面生长条件下培养36h进行复壮生长；
斜面培养基配方：蛋白胨 0.5%，牛肉膏 0.2%，葡萄糖：1.0%，磷酸二氢钾0.3%，琼脂1.8%；pH自然。
（2）摇瓶种子培养制备种子液：
按照配方配制摇瓶培养基，高温灭菌冷却后，接入步骤（1）复壮后的枯草芽孢杆菌菌种，在30℃、转速180 转/min摇瓶培养16 h，OD600nm在11，菌种培养成熟，获得种子液；
摇瓶培养基配方：蛋白胨 0.5%，牛肉膏 0.2%，葡萄糖1.0%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸铵0.2%，硫酸镁0.1%，pH自然。
（3）一级种子罐培养制备一级种子罐培养液：
按照培养基配方配制1m3一级种子罐培养基，经高温灭菌降至32℃后，接入步骤（2）所得种子液，在30℃、转速250转/min、通风量1:0.5条件下培养12h获得一级种子罐培养液（显微镜检测：菌丝粗壮、菌体正常，无杂菌）；
一级种子罐培养基配方：玉米淀粉4.0%，豆粕5.0%，磷酸二氢钾0.2%，葡萄糖1.0%，硫酸铵0.2%，硫酸镁0.1%，pH自然。
（4）枯草芽孢杆菌的发酵：
将发酵培养基装入发酵罐进行灭菌（121－123℃实消40－45分钟），然后降温到32℃。以4%的接种量，接入步骤（3）培养好的一级种子罐培养液进行发酵，温度控制在30±1℃，保证罐压0.05Mpa，通风量1:0.3－1.2，pH自然，大约发酵22h，发酵活力达到1000U/ml以上且连续两小时活力不再增加即可认为发酵结束，可进行放罐处理；所得产物称为醪液。
在发酵过程中每2小时取样检测，12-15小时后补加发酵培养基，加入量为发酵罐内发酵培养基初始体积的15-20%。
发酵培养基配方：玉米淀粉3.0%，豆粕3.0%，磷酸二氢钾0.2%，葡萄糖1.5%，硫酸铵0.2%，硫酸镁0.1%，pH自然。
（5）支链淀粉酶的提取与精制：
向步骤（4）中发酵结束后所得醪液中加入占醪液重量1.75%的珍珠岩、及3.25%的硅藻土，混合均匀后采用板框压滤机进行过滤，滤液再经超滤机浓缩（超滤机浓缩时，所用超滤膜截留分子量为10000道尔顿）获得浓缩液；向浓缩液中加入占浓缩液重量0.1%的防腐剂山梨酸钾，在配方罐内混合均匀后，再经精滤板框过滤使细菌数控制在10000cfu/g以内，所得滤液为支链淀粉酶，其活力（按GB/1886.174-2016中A.9条款测定）达3000U/mL，综合回收率达87%。
实施例2
在35吨发酵罐进行一批次发酵生产，本实施例公开了一种利用菌株YSP6生产支链淀粉酶的工艺，它的步骤如下：
（1）菌株复壮：
从-80℃冰箱取出以冻干粉形式保存的枯草芽孢杆菌菌种YSP6，以斜面培养方式复活菌种。接种于斜面培养基上，在38℃的斜面生长条件下培养72h进行复壮生长；
斜面培养基配方：蛋白胨 0.7%，牛肉膏 0.2%，葡萄糖2.0%，磷酸二氢钾0.2%，琼脂2.0%；pH自然。
（2）摇瓶种子培养制备种子液：
按照配方配制摇瓶培养基，高温灭菌冷却后，接入步骤（1）复壮后的枯草芽孢杆菌菌种，在38℃、转速260 转/min摇瓶培养10 h，OD600nm为6，菌种培养成熟，获得种子液；
摇瓶培养基配方：蛋白胨 0.8%，牛肉膏 0.3%，葡萄糖2.0%，磷酸二氢钾0.5%，硫酸铵0.4%，硫酸镁0.2%，pH自然。
（3）一级种子罐培养制备一级种子罐培养液：
按照培养基配方配制1m3一级种子罐培养基，经高温灭菌降至39℃后，接入步骤（2）所得种子液，在37±1℃、转速160转/min、通风量1:0.7条件下培养12h获得一级种子罐培养液（显微镜检测：菌丝粗壮、菌体正常，无杂菌）；
一级种子罐培养基配方：玉米淀粉4.0%，豆粕6.0%，磷酸二氢钾0.3%，葡萄糖3.0%，硫酸铵0.4%，硫酸镁0.2%，pH自然。
（4）枯草芽孢杆菌的发酵：
将发酵培养基装入发酵罐进行灭菌（121－123℃实消40－45分钟），然后降温到39℃。以6%的接种量，接入步骤（3）培养好的一级种子罐培养液进行发酵，温度控制在37±1℃，保证罐压0.08Mpa，通风量按照1:0.3-1.2，pH自然，大约发酵48h，发酵活力达到5000U/ml左右且连续两小时活力不再增加即可认为发酵结束，可进行放罐处理；所得产物称为醪液。
在发酵过程中每2小时取样检测，12-36小时补加发酵培养基，加入量为发酵罐内发酵培养基初始体积的15-30%。
发酵培养基配方：玉米淀粉6.0%，豆粕4.0%，磷酸二氢钾0.5%，葡萄糖4.0%，硫酸铵0.4%，硫酸镁0.3%。
（5）支链淀粉酶的提取与精制：
向步骤（4）中发酵结束后所得醪液中加入占醪液重量3.0%的珍珠岩、及1.3%的硅藻土，混合均匀后采用板框压滤机进行过滤，滤液再经超滤机浓缩（超滤机浓缩时，所用超滤膜截留分子量为10000道尔顿）获得浓缩液；向浓缩液中加入占浓缩液重量0.3%的防腐剂苯甲酸钠，在配方罐内混合均匀后，再经精滤板框过滤使细菌数控制在6000cfu/g以内，所得滤液为支链淀粉酶，其活力（按GB/1886.174-2016中A.9条款测定）达10000U/mL，综合回收率达85%。

Claims (5)

1.一株产支链淀粉酶的菌株YSP6，其分类属枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No. 14391；
该菌株用于生产支链淀粉酶；在35吨发酵罐中批量生产时，发酵液平均活力在1000 U/mL以上，最高达5000 U/mL，产品活力在1000U/mL以上，最高达10000U/mL。
2.利用权利要求1所述菌株YSP6生产支链淀粉酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）生产液体支链淀粉酶：菌株YSP6先在温度28-38℃、pH 自然的条件下液体培养1-2天，然后在28-38℃的温度条件下按3-8%的接种量接种于发酵培养基中发酵培养18-48h；
液体培养所用液体培养基组成为：玉米淀粉2.0-6.0%，豆粕1.0-6.0%，磷酸二氢钾0.2-0.5%，葡萄糖1.0-5.0%，硫酸铵0.2-0.7%，硫酸镁0.1-0.3%；
所述发酵培养基组成为：玉米淀粉2.0-8.0%，豆粕1.0-8.0%，磷酸二氢钾0.2-0.5%，葡萄糖1.0-5.0%，硫酸铵0.2-0.7%，硫酸镁0.1-0.3%，pH自然；
2）发酵培养结束后添加助滤剂进行板框过滤，滤液经超滤浓缩、精滤除菌后即得。
3.利用权利要求1所述菌株YSP6生产支链淀粉酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）菌株复壮，具体为：
如果菌株是以冻干粉形式保存，则首先应将冻干粉形式的菌株接种在斜面培养基上，28-38℃条件下培养24-72h进行复壮生长；
如果菌株以斜面培养方式保存，则无需进行该步骤的菌株复壮操作，直接进入下一步；
（2）制备种子液，具体为：
将步骤（1）复壮后的菌株接种于灭菌后的摇瓶培养基中，28℃-38℃摇瓶培养至OD600nm在6-13时，即已制备好种子液；
（3）制备一级种子罐培养液，具体为：
将一级种子罐培养基灭菌后，接种步骤（2）所制备的种子液，28℃-38℃、160-250 转/min、通风量1:0.5-0.7条件下培养8-15h；
（4）菌株发酵，具体为：
将发酵培养基灭菌后，以3-8%的接种量接种步骤（3）所制备的一级种子罐培养液，28℃-38℃、罐压0.04-0.08Mpa、通风量1:0.3-1.2条件下，发酵至发酵活力不低于1000U/ml，且连续两小时活力不再增加时，即认为发酵结束，所得产物称为醪液；
（5）支链淀粉酶提取与精制，具体为：
在步骤（4）发酵结束后所得醪液中加入助滤剂，混合均匀后采用板框压滤机进行过滤，滤液再经超滤机浓缩获得浓缩液；向浓缩液中加入防腐剂，在配方罐内混合均匀后，再经精滤板框过滤使细菌数控制在50000cfu/g以内即得；
超滤机浓缩时，所用超滤膜截留分子量为10000道尔顿。
4.如权利要求3所述利用菌株YSP6生产支链淀粉酶的方法，其特征在于，所述斜面培养基组成为：蛋白胨 0.4-0.8%，牛肉膏 0.2-0.3%，葡萄糖 1.0-4.0%，磷酸二氢钾0.2-0.5%，琼脂1.5-2.0%，pH自然；
所述摇瓶培养基组成为：蛋白胨 0.4-0.8%，牛肉膏 0.2-0.3%，葡萄糖 1.0-5.0%，磷酸二氢钾0.2-0.5%，硫酸铵0.2-0.7%，硫酸镁0.1-0.3%，pH自然；
所述一级种子罐培养基组成为：玉米淀粉2.0-6.0%，豆粕1.0-6.0%，磷酸二氢钾0.2-0.5%，葡萄糖1.0-5.0%，硫酸铵0.2-0.7%，硫酸镁0.1-0.3%，pH自然；
所述发酵培养基组成为：玉米淀粉2.0-8.0%，豆粕1.0-8.0%，磷酸二氢钾0.2-0.5%，葡萄糖1.0-5.0%，硫酸铵0.2-0.7%，硫酸镁0.1-0.3%，pH自然。
5.如权利要求3所述利用菌株YSP6生产支链淀粉酶的方法，其特征在于，步骤（5）中，助滤剂添加量为醪液重量的0.6-5.0%，所述助滤剂的各原料重量百分比组成为：珍珠岩35-70%，硅藻土30-65%；所述防腐剂添加量为浓缩液重量的0.1-0.3%，所述防腐剂为山梨酸钾或苯甲酸钠。
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