CN106755015A - 一种新型普鲁兰酶基因和高产菌株的获得方法及产酶工艺 - Google Patents

Abstract

本发明通过系统比对来源于不同微生物的十个以上的普鲁兰酶基因结构相似性，选择高度保守的区域进行多序列组合设计长引物，并采用短时PCR技术，以上述不同来源的微生物染色体DNA为模板，获得相应的普鲁兰酶疑似基因碎片；并将上述基因碎片克隆入高表达载体pHY‑WZX，在枯草芽胞杆菌中进行异源表达；获得的转化子点种普鲁兰多糖筛选平板，获得透明圈显著的转化子进行摇瓶发酵确认酶活力最高的菌种。并建立了基于特种淀粉水解液的普鲁兰酶高效发酵生产新工艺；分别在25 L和30 m³发酵体系实现了普鲁兰酶的高效制备，最高酶活达到880 U/mL。

Description

一种新型普鲁兰酶基因和高产菌株的获得方法及产酶工艺

技术领域

本发明提供了一种新型普鲁兰酶基因和高产菌株的获得方法及普鲁兰酶高效制备新技术，属于基因工程、发酵工程领域。

背景技术

普鲁兰酶（EC 3.2.1.41）能够专一性地催化支链淀粉型多糖α-1, 6-糖苷键的水解，使支链淀粉型多糖的分支链形成一系列链长不一的直链淀粉。该酶的水解条件是α-1,6-糖苷键的两端至少有两个α-1, 4-糖苷键相连的葡萄糖。

普鲁兰酶的水解性质决定了它在改善淀粉酶对淀粉的作用效果、提高淀粉利用率、降低粮耗、提高产品质量及开发新的产品方面有着相当巨大的价值。对于淀粉加工行业，目前酶法制糖过程一般分两步进行，即液化和糖化。液化过程采用中性α-淀粉酶在90 ^ºC -105 ^ºC高温下进行，糖化过程采用酸性糖化酶在55 ^ºC-60 ^ºC的条件下进行。目前世界上以酶法(α-淀粉酶和糖化酶)生产淀粉糖的最高转化率DE值为96%，是酶法生产工艺的一个极限数值。这是因为糖化酶对淀粉中的α-l, 6-糖苷键作用力较弱，从而影响淀粉的最终水解度。若降低淀粉浆浓度，则增加了生产负荷、提高了成本。或者增加糖化酶的剂量，但易诱发葡萄糖的聚合反应，生成异麦芽糖，影响最终收率。有研究报道一种有效的改进工艺是在糖化过程中添加普鲁兰酶，水解残余的α-l, 6糖苷键，则可使DE值提高至97%以上。但由于糖化酶作用pH较低(pH 4.5-5.0)，作用温度较高(55 ^ºC-65^ºC)，故与糖化酶配合使用的普鲁兰酶也必须具有相似的酶学性质，才能大大开拓其市场，实现工业应用。而来自长野芽胞杆菌的普鲁兰酶的最适pH为4.5-5.0，最适反应温度为55 ^ºC，与糖化酶的反应条件非常相似，因而非常适合工业应用。

1961年，首次报道了普鲁兰酶的产生菌产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)，后在多种微生物中发现有普鲁兰酶存在，多为芽胞杆菌。Manika等报道了产I型普鲁兰酶的微生物如Bacteroides thetaiotaomicron、Bacillus stearothermophilus、Bacillus flavocaldarius、Bacillus sp. S-1、Caldicellulosiruptot saccharolyicus、Clostridium thermohydrosulfuricum、Klebsiella oxytoca、Klebsiella aerogenes、Fervidobacterium pennavorans Ven5等；产II型普鲁兰酶的微生物如Bacillus sp. KSM-1378、Bacillus sp. TS-23、Bacillus sp. XAL601、Bacillus circulans F-2、Pyrococcus furiosus等。

来源于嗜热微生物的普鲁兰酶陆续被发现，多为II型普鲁兰酶，主要分离自嗜热古菌。热稳定的I型普鲁兰酶仅来源于一些嗜热的好氧细菌B. acidopullulolyticus、B. flavocaldarius KP 1228和Pullulanibacillus naganoensis（也称Bacillus naganoensis），嗜热细菌Thermusaquaticus YT-1、Thermus caldophilus GK-24和Bacillusthermoleovorans，极端厌氧嗜热菌Caldocellulosiruptor saccharolyticus、Fervidobacteriumpennivorans和Thermotoga maritime。

普鲁兰酶高效制备技术的核心是选育优良的生产菌种并建立配套的生产工艺。本发明建立了全新的高活性普鲁兰酶的筛选方法，并建立了配套的特异性发酵生产工艺，形成了一种普鲁兰酶高效制备方法。

发明内容

为解决现有普鲁兰酶与糖化酶作用条件相差较大，不适合工业应用的不足，本发明提供了一种新型普鲁兰酶基因和高产菌株的获得方法及产酶工艺。通过系统比对来源于不同微生物的十个以上的普鲁兰酶基因结构相似性，选择高度保守的区域进行多序列组合设计长引物，并采用短时PCR技术，以上述不同普鲁兰酶基因来源的微生物染色体DNA为模板，获得相应的疑似基因碎片。并将上述基因碎片克隆入高表达载体如pBL-WZX或pHY-WZX(王正祥，牛丹丹。中国发明专利，zl200510081648；Niu & Wang. J Ind MicrobiolBiotechnol, 2007), 在芽胞杆菌中进行异源表达。获得的转化子点种普鲁兰多糖筛选平板。获得透明圈显著的转化子进行摇瓶发酵确认酶活力最高的菌种。并建立了基于特种淀粉水解液的普鲁兰酶高效发酵生产新工艺。分别在25L和30m³发酵体系实现了普鲁兰酶的高效制备，最高酶活达到880U/mL。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

（1）普鲁兰酶基因的选择：借助公开发表的文献信息和NCBI核酸数据库平台，筛选目标普鲁兰酶基因；

（2）普鲁兰酶基因片段的获得：可通过下列方式获得：

a. 采用短片段基因扩增组合技术合成普鲁兰酶基因或其经过密码子优化后的核苷酸序列；

b. 以染色体DNA、微生物细胞裂解液或细胞碎片为模板经PCR扩增获得；

（3）新型普鲁兰酶基因文库的建立：分别选取上述普鲁兰酶基因中的部分序列进行组合设计兼并型长引物，并PCR扩增获得不同碱基序列组成的新型普鲁兰酶基因；其中PCR过程采用延伸时间短至2s以内的短时PCR技术，提高新型普鲁兰酶基因碱基序列组成的差异性；

（4）新型普鲁兰酶基因的高效表达：采用pBL-WZX或pHY-WZX为高效表达载体，地衣芽胞杆菌为高效表达宿主，实现上述新型普鲁兰酶基因的克隆和高效分泌表达；

（5）新型普鲁兰酶的高通量筛选：采用平板透明圈和液体摇瓶发酵的组合筛选方式，先通过评判透明圈大小初步筛选获得目标转化子，再通过摇瓶发酵和酶活测定筛选普鲁兰酶高产菌株；

（6）新型普鲁兰酶发酵工艺的建立和高效制备：通过摇瓶试验、5L发酵罐试验和30m³发酵生产，逐级建立普鲁兰酶的发酵制备工艺，并引入液化淀粉流加策略提高新型普鲁兰酶的制备效率。

本发明的显著优点

1、本发明获得普鲁兰酶新基因的方法具有易实施、易获得、催化活性高效等特点。

2、本发明获得普鲁兰酶新基因的方法可以为筛选高活性普鲁兰酶、耐酸或耐碱普鲁兰酶、耐热或低温普鲁兰酶等提供丰富的可筛选基因文库。

3、本发明基于淀粉液化液流加诱导的新工艺有助于普鲁兰酶工业生产中的高效制备。

4、本发明的重组蛋白表达宿主细胞为地衣芽胞杆菌，为食品级安全菌株。

5、本发明的重组蛋白为工业酶制剂普鲁兰酶，进一步为大宗工业酶制剂，如淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、蛋白酶、糖苷酶、核酸酶、RNA酶等，但不局限于上述酶制剂。

附图说明

图1：普鲁兰酶高效制备新方法的实施路线图

图2：普鲁兰酶高产重组菌携带重组质粒pHY-WZX-pulX27图谱

图3：普鲁兰酶作用温度

图4：普鲁兰酶作用pH

图5：普鲁兰多糖经本发明中普鲁兰酶成品作用后的麦芽三糖含量

具体实施方式：

为了实现上述目的，本发明采用的实验方法如下：

（1）PCR体系：按照宝生物公司DNA聚合酶对应的使用说明实施。

（2）质粒构建方法：按照宝生物公司T4连接酶对应的使用说明实施。

（3）电击转化方法：

接种地衣芽胞杆菌于2.5 mL LB培养基中，过夜培养后，转接入50 mL生长培养基（含0.5 mol/L山梨醇的LB培养基）中，于37 ℃培养至OD600为0.85-0.95。将菌体在冰水浴中放置10 min，于4 ℃、10000 r/min离心5分钟收集菌体。用预冷的EP缓冲液（0.5 mol/L 山梨醇，0.5 mol/L甘露醇和10%甘油）反复洗涤细胞4次。将细胞悬浮于约1 mL的预冷EP缓冲液中。取60 µL菌体分装于1.5 mL Eppendorf管中。取1 µL重组质粒DNA（50 ng/µL），与感受态细胞混匀，移入预冷的电转化池，电击（2000 V, 5 ms）后，加入1 mL复苏培养基（含0.5mol/L山梨醇和0.38 mol/L甘露醇的LB培养基），37 ℃、80 r/min培养3h，然后涂布含卡那霉素（5 µg/mL）或四环素（50 µg/mL）的LB平板，于37 ℃培养2~3天。转化子通过测定酶活进行确认。

（4）普鲁兰酶鉴定平板（w/v）：酵母膏1%，蛋白胨3%，普鲁兰多糖10%，碳酸钙1.4%。

（5）液体发酵培养基（w/v）：酵母膏1%，蛋白胨3%，豆饼粉3%，乳糖10%, 碳酸钙1.4%， pH 7.0。

（6）用红色普鲁兰法测酶活，测定方法如下：

普鲁兰酶酶活的测定，参考Megazyme公司Red-Pullulan使用说明书。其酶法定义为：在40℃、0.2 mol/L pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲液，每分钟分解2%普鲁兰糖生成1 mol还原糖所需要酶的量定义为一个酶活力单位，用U/mL表示。基本方法是：0.5 mL 0.5% w/v普鲁兰多糖，40℃预热6min，加入0.5 mL稀释酶液（稀释用0.2 mol/L HAc-NaAc缓冲液，pH 5.0），准确反应30 min，加入1.5 mL DNS ，隔水煮沸7 min，迅速用冰水冷却到室温，加水10.5 mL，摇匀，测定550nm下OD值，根据标准曲线计算酶活力。

式中：

X——样品的酶活力，U/g或U/mL；

A——待测酶液在550nm处的吸光度值和标准曲线计算出来的葡萄糖浓度；

1000——mg/ mL换算成μg/mL的系数；

180——葡萄糖的分子量；

30——酶反应时间，min；

n——发酵液稀释倍数。

（7）淀粉液化液的制备：25%固含量的淀粉水溶液中添加高温α-淀粉酶3~12 U/g煮沸10min制备不同DE值的淀粉液化液。

具体实施方式：

实施例1—不同来源普鲁兰酶基因的合成

按照表1中的登录号信息从NCBI数据库中下载各普鲁兰酶基因序列并合成。

表1 各普鲁兰酶基因及其登录号信息

实施例2—新型普鲁兰酶基因文库的获得

以实施例1中获得普鲁兰酶基因按照不同组合方式形成的混合液作为模板克隆普鲁兰酶基因。以上述微生物普鲁兰酶基因相对保守序列中的部分碱基串联组成长引物，如附录中的PULX1和PULX2，短时PCR条件下[95℃ 10min；30×(94℃ 30s; 56℃ 1min; 72℃ 0.1~2s）；68℃ 10min]扩增获得目的条带。将获得的条带克隆入表达载体pHY-WZX获得重组质粒pHY-WZX-pulX。获得重组质粒在大肠杆菌JM109中保存。作为新型普鲁兰酶基因文库用于后续分泌表达型重组菌的构建和普鲁兰酶高产菌株的筛选。

实施例3—新型普鲁兰酶高产菌株的筛选

将上述重组质粒采用碱裂解法提取制备闭环质粒通过电击转化的方法导入宿主菌地衣芽胞杆菌CBB302中，获得相应的重组菌；并将重组菌涂布普鲁兰酶鉴定平板初步筛选获得透明圈较大的菌株。初筛获得的重组菌接种液体普鲁兰酶筛选培养基37 ℃好氧培养120h测定产酶情况，酶活数据见表2。透明圈显著的菌株液体培养后冻藏管-70℃保藏用于后续发酵工艺建立和普鲁兰酶的高效制备。

表2 新型普鲁兰酶重组菌透明圈形成情况

注：+/-，透明圈隐约可以看到但不清晰；+，透明圈清晰但直径小于2 mm；++，透明圈清晰直径大于2 mm小于3 mm；+++，透明圈清晰直径大于3 mm小于5 mm；++++，透明圈清晰直径大于5 mm

实施例4—新型普鲁兰酶高产菌株的摇瓶发酵工艺

初筛获得透明圈显著（透明圈直径大于3 mm）的重组菌由冻藏管划线LB平板，37℃培养12 h，单菌落接种液体LB培养基。37℃好氧培养12 h，发酵实验在250 mL三角瓶中装30 mL发酵培养基（酵母膏1%，蛋白胨3%，豆饼粉3%，乳糖10%，碳酸钙1.4% ）。以5%的接种量，接种重组菌，37℃、180 r/min，培养5天。发酵过程中每24 h取样分析酶活情况。普鲁兰酶产生菌在摇瓶中产生普鲁兰酶的酶活数据见表3。

表3 透明圈较大重组菌摇瓶条件下的产酶情况

实施例5： 15 L发酵体系下pulX27菌种制备普鲁兰酶

将表3中酶活最高的重组菌pulX27接种到种子培养基（酵母膏0.5% w/v，蛋白胨1% w/v，氯化钠 1% w/v，其余为水，pH 7.0）培养到对数生长期，进一步在15 L发酵罐中进行发酵实验，发酵培养基为（w/v）：酵母膏1%，蛋白胨3%，豆饼粉3%，乳糖10%，碳酸钙1.4%，发酵过程中用硫酸或氨水控制pH为7.0。以5% vol的接种量接种，37 ℃通氧培养24 h后补加不同DE值的淀粉水解液120 mL。发酵70 h～96 h后，此菌株产生普鲁兰酶酶活水平详见表4。

表4 15L发酵体系下添加不同DE值诱导液的产酶情况

实施例6: 在30 m³体系下菌种pulX27发酵制备普鲁兰酶

将实施例5的工艺调整为30 m³发酵体系对应的比例。分别完成种子培养，1 L种子液接种15 L一级种子罐，培养12 h后移种3 m³二级种子罐，继续培养12 h后移种30 m³主发酵罐，发酵培养基初始装液量为20 m³培养菌体，经补料生长阶段后，流加发酵总体积1% vol的淀粉液化液（DE值为6~8）诱导产酶。诱导70～96 h后发酵结束酶活为880 U/mL。发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液至合适浓度，添加辅助制剂后精滤制备普鲁兰酶液体成品，或添加适量食品级淀粉后喷雾干燥制备粉末剂型普鲁兰酶酶成品，成品酶活为3000～3300U/g。

实施例7：制备获得的普鲁兰酶成品以普鲁兰多糖为底物水解获得麦芽三糖糖浆

20%的普鲁兰多糖溶液，按1~10U/g加入实施例6中的成品，65~75℃，pH4.5~5.5条件下反应12h。稀释100倍后取样经HPLC分析，数据如图5所示。麦芽三糖最高含量可达94.7%。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建福大百特生物科技有限公司

<120> 一种新型普鲁兰酶基因和高产菌株的获得方法及产酶工艺

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 88

<212> DNA

<213> PULX1

<400> 1

gatgggaatc tgggtccacg aagtatccgg cccaatcctt agcgatgcct gcatccaagg 60

ctcttcaaaa atcgtatcag aaatacag 88

<210> 2

<211> 80

<212> DNA

<213> PULX2

<400> 2

ctatttaccg ggaatctgcg atccaaatgg gttgaagcct gccagtagag acgtggttta 60

taataaattc catctagcta 80

<210> 3

<211> 2927

<212> DNA

<213> pulX27

<400> 3

atgtccgttg ttccgttaaa aagtgctgca atccccgttg aactacctgc cccctcaagt 60

gatgggaaca ccacaaacat ctggttccat cttgtaattt ttcctgtgta satatccttt 120

atttgctgta tggtaaggtt cttgataggc aaatccttga caactattgc gataccatcc 180

caagcaacaa gtaaaggaaa ttgggatgcg aaagacattg atagtgaccg ctacatcgat 240

ttaagcaaag ggcatgagat ttggctcgtc caaggaaaca gccagatttt ctatagtgaa 300

aaggatgctg aggcagccgc acaacctgct gtaagtaacg cttatttaga tgcttccaac 360

caagtgttgg tcaagcttag ccagccgttt actcttggtg aaggttcaag cggttttacg 420

gttcatgatg acacagcaaa taaggatatt ccagttacat ctgttagtga tgccaatcag 480

gtaacggctg ttttagcagg tactttccag catatttttg gggggagtga ttgggcaccg 540

gataatcaca atactttact aaaaaaggtg aatagcaatc tctatcaatt ttcaggaaat 600

cttcctgaag gaaactacca atataaagtg gctttaaatg atagctggaa taatccgagc 660

tacccatctg ataacattaa tttgacagtg ccagctggtg gtgcccatgt tacattttct 720

tatataccat ccacccatgc tgtttatgac acgattaaca atcctaatgc ggatttacaa 780

gtagatagca gcggtgttaa gacggatctc gtggcggtta ctcttggaga aaatcctgat 840

gtaagccata ccctgtccat tcaaacagag gactatcagg caggacaggt catacctcgt 900

aaggtgcttg attcatccca gtactactat tccggagatg atctcgggaa tacctataca 960

aagaatgcaa ctacctttaa ggtctgggcg cctacatcca ctcaagtact ggatagcagc 1020

ggtgttaaga cggatctcgt ggcggttact ccaatccgga cggttgggag agtgacaccc 1080

gacctcctta gctcttttaa atatcaggca ggacaggtca tacctcgtaa ggtgcttgat 1140

tcatcccagt actactattc cccttttttt tctatcccgc ttgaaacaaa gaatgcaact 1200

acctttaagg tctgggcgcc tacatccact caagtaaatg atgccgtata taatcatgtg 1260

accggctgca tctgcttcct tcttttgatt acgctttcag gccatggtgt atgggaagca 1320

acagtcaacc aaggcaccgg cgttacaggc gtcatgtatg agtacccgat ggttccttca 1380

acccgaacgg ctgttgatcc gtatgcaaca gctattgcac caaacggaac gagaggcatg 1440

attgtcatac agctgcagcc tgttttcgca tttaatagtg tcaatgaaaa cgatccaact 1500

caatataatt ggggttatga ccctcgcaac tacaatgttc ctgagggaca atatgctact 1560

aatgcaaacg gaacaactcg gattaaagag tttaaggaaa tggttctttc actccatcag 1620

gaccacattg gggttaatat ggatgttgtt tataatcata cctttgccac gcaaatctct 1680

gacttcaata gtgtcaatga aaacgatcca actcaatata attggggtta tgaccctgga 1740

actggagtat caatcaatta tgtggaaata cagagggtat tcaatcacac cattaaagag 1800

tttaaggaaa tggttctttc aagagtgcta gatggattcc gttttgattt aatgggtatt 1860

tataatcata cctttgccac gcaaatctct gacttcgata agattgtgcc agaatataaa 1920

tccacatcgc agatagctgg taactacact aacggctcag gtactatgac acagctagcg 1980

gccgaaagac caatggttca aaaatttatt atcgattcac ttaagttttg ggtcggaatg 2040

aacgtcatta tggacgtggt gtacaaccac accacgttga atagtaatac ttggcgtctt 2100

gccacgcagc ttcatgccat tccaggaatt gctctctacg gtgagccatg gcagttccag 2160

aaggacgctt caagcctgga acaatcaacc catgataacc atacattatg ggatggagtg 2220

gctgtattta atgacaatct gcgaaacggt ttggatggct tccgcttcga cctgatgggc 2280

taccacccga aagcgcagat cctctgcatt cctttcatgc agggcgggga agaaatgctt 2340

cgtacgaaag gcggcaacga caatagctat aatgctggtg atgtagtgaa cgagtttgat 2400

tggagcagaa aagctcaata tccagatgtt ttcaattatt atagcgggct gattcatctt 2460

cgtcttgatc acccagcctt ccgcatgacg acagctaatg aaatcaatag ccacctccaa 2520

ttcctaaata gcccagagaa cacagtggcc tatgaattat ctgatcatgc aaataaagat 2580

acatggggta atattgtggt tatttataat ccaaataaaa cggcagaaac cattaatttg 2640

ccaagcggga aatgggaaat caatgcgacg agcggtaagg tgggagaatc cacacttggt 2700

caagcagagg gcagtgttca agttccaggc atatctatga tgattcttca tcaagaagta 2760

agcccatctg atggtaaata gacggtgatg ctcggccagg ggatcgcctt tgaccagcag 2820

ggctcagagc tgctgcgctc taaatccttt acccgcgact cgtatgattc cggcgactgg 2880

tttaaccgcg tggactactc cctgcaggac agcccatctg atggtaa 2927

Claims (8)

1.一种新型普鲁兰酶基因和高产菌的获得方法，其特征在于，所述方法具体步骤如下：

（1）普鲁兰酶基因的选择：借助公开发表的文献信息和NCBI核酸数据库平台，筛选目标普鲁兰酶基因；

（2）普鲁兰酶基因片段的获得：可通过下列方式获得：

a. 采用短片段基因扩增组合技术合成普鲁兰酶基因或其经过密码子优化后的核苷酸序列；

b. 以染色体DNA、微生物细胞裂解液或细胞碎片为模板经PCR扩增获得；

（3）新型普鲁兰酶基因文库的建立：分别选取上述普鲁兰酶基因中的部分序列进行组合设计兼并型长引物，并PCR扩增获得不同碱基序列组成的新型普鲁兰酶基因；其中PCR过程采用延伸时间短至2s以内的短时PCR技术，提高新型普鲁兰酶基因碱基序列组成的差异性；

（4）新型普鲁兰酶基因的高效表达：采用pBL-WZX或pHY-WZX为高效表达载体，地衣芽胞杆菌为高效表达宿主，实现上述新型普鲁兰酶基因的克隆和高效分泌表达；

（5）新型普鲁兰酶的高通量筛选：采用平板透明圈和液体摇瓶发酵的组合筛选方式，先通过评判透明圈大小初步筛选获得目标转化子，再通过摇瓶发酵和酶活测定筛选普鲁兰酶高产菌株；

（6）新型普鲁兰酶发酵工艺的建立和高效制备：通过摇瓶试验、5L发酵罐试验和30m³发酵生产，逐级建立普鲁兰酶的发酵制备工艺，并引入液化淀粉流加策略提高新型普鲁兰酶的制备效率。

2.根据权利要求1所述的一种新型普鲁兰酶基因和高产菌的获得方法，其特征在于，步骤（1）所述普鲁兰酶基因来源于染色体上携带有普鲁兰酶基因的任何微生物，包括Bacillus cereus、Bacillus flavocaldarius、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus subtilis、Bacteroides thetaiotaomicron、Clostridium thermohydrosulfuricum、Fervidobacterium pennivorans、Klebsiella pneumoniae、Pullulanibacillus naganoensis、Spinacia oleracea、Streptococcus pyogenes、Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes、Bacillus stearothermophilus、Bacillus sp. S-1、Caldicellulosiruptot saccharolyicus、Klebsiella oxytoca、Bacillus sp.、Bacillus circulans、Pyrococcus furiosus、B.acidopullulolyticus、B.flavocaldarius、Thermusaquaticus、Thermus caldophilus、Bacillusthermoleovorans、Caldocellulosiruptor saccharolyticus、Fervidobacteriumpennivorans以及Thermotoga maritime。

3.根据权利要求1所述的一种新型普鲁兰酶基因和高产菌的获得方法，其特征在于，步骤（3）所述的兼并型长引物是以上述微生物普鲁兰酶基因相对保守序列中的部分碱基串联组成的引物。

4.根据权利要求1所述的一种新型普鲁兰酶基因和高产菌的获得方法，其特征在于，步骤（3）所述的兼并型长引物为PUL1和PUL2，其核苷酸序列为：

PULX1：

5’-GATGGGAATCTGGGTCCACGAAGTATCCGGCCCAATCCTTAGCGATGCCTGCATCCAAGGCTCTTCAAAAATCGTATCAGAAATACAG-3’；

PULX2：

5’-CTATTTACCGGGAATCTGCGATCCAAATGGGTTGAAGCCTGCCAGTAGAGACGTGGTTTATAATAAATTCCATCTAGCTA-3’；

将其用于步骤（3）所述短时PCR技术，PCR反应程序为：95℃ 5~20min；30×(94℃ 30s；50~65℃ 1min；72℃ 0.1~5s）；68℃ 10min。

5.根据权利要求1所述的一种新型普鲁兰酶基因和高产菌的获得方法，其特征在于，步骤（4）所述的蛋白高效表达载体导入宿主细胞的方式为电击转化蛋白质高效分泌表达菌株；所述表达菌株包括地衣芽胞杆菌CBBD302、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、长野芽胞杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、黑曲霉，并经平板透明圈法或摇瓶酶活测定对比法获得高产菌株。

6.利用权利要求1所述的一种新型普鲁兰酶基因和高产菌的产酶工艺，其特征在于，发酵产酶阶段采用如下方法诱导强化普鲁兰酶表达强度：添加DE值为6~12，固含量为20~25%w/v的淀粉液化液，添加量为总发酵体积的1~5%vol；若使用更高DE值的淀粉液化液，则将添加量减少为原来的10%~60%。

7. 根据权利要求6所述的一种产酶工艺，其特征在于，其所采用的发酵培养基配方为（w/v）：酵母膏1% w/v，蛋白胨3% w/v，乳糖10% w/v，碳酸钙1.4% w/v，发酵培养基初始装液量为20 m³培养菌体，经补料生长阶段后，流加发酵总体积1%vol 、DE值为6~8的淀粉液化液诱导产酶；诱导70～96 h后发酵结束，酶活为880 U/mL。

8.根据权利要求6所述的一种产酶工艺，其特征在于，该工艺发酵的普鲁兰酶最适作用条件为：温度68℃，pH为5.0。