CN103614354B - 一种糖化酶及其重组表达菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新型糖化酶及其重组表达工程菌,并将筛选的糖化酶基因转入里氏木霉(Trichoderma reesei)中进行表达,构建了里氏木霉工程菌株。本发明所述糖化酶在里氏木霉工程菌中得到高效表达,酶活水平达到196U/mL,能从糖链的非还原端高效分解α‑1,4‑糖苷键,因此,有望将其应用于全酶法生产葡萄糖的糖化过程。
Description
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域,具体涉及一种糖化酶及用于表达该糖化酶的重组表达工程菌。
背景技术
糖化酶,又称葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase),它能把淀粉从非还原性未端水解α-1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖,也能缓慢水解a-1.6葡萄糖苷键,转化为葡萄糖。同时也能水解糊精,糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。糖化酶用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵;本品还大量用于生产各种规格的葡萄糖。总之,凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上,都可适用。
我国高转化率糖化酶市场发展迅速,产品产出持续扩张,国家产业政策鼓励高转化率糖化酶产业向高技术产品方向发展。2011年国内糖化酶的市场容量为5亿元人民币,而且市场以每年20%速度在增长。预计2012年市场容量不低于6亿元。糖化酶价格则自2007年起不断上涨,由2元/公斤涨到2.7元/公斤。因此,国内企业新增糖化酶投资项目也逐渐增多。
目前常用的糖化酶均是来自黑曲霉。自70年代中期开始,中科院微生物所筛选获得了高产糖化酶菌株AS.3.4309。该菌株国内许多大型抗生素制药厂、酒精厂、酿酒厂进行了生产规模试验,均获得成功。该项目的成功为我国发酵行业节约了大量的粮食,产生了巨大的经济效益和社会效益。市场越来越密切关注高转化率糖化酶,这使得克隆和表达高转化率糖化酶成为研究的热点之一。蛋白表达系统是黑曲霉,其产酶量(蛋白量)较高,但是受到糖化酶本身性质的影响,黑曲霉表达糖化酶的比活比较低,不能适应市场的需求。因此,开发性能优良、比活高的糖化酶越来越受到各方的关注。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型糖化酶及其重组表达工程菌,并将筛选的糖化酶基因转入里氏木霉(Trichoderma reesei)中进行表达,为实现糖化酶的高密度发酵生产奠定了基础。
本发明一方面提供一种新型的糖化酶,所述的糖化酶包括
1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的糖化酶;
2)在1)限定的氨基酸经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有糖化酶功能的,由1)衍生的蛋白质。
用于编码上述糖化酶的基因,其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
本发明另一方面提供了一种表达载体,其包含上述编码糖化酶的核苷酸。
本发明另一方面提供了一种表达宿主细胞,其携带有表达上述糖化酶基因的表达载体。
上述表达宿主细胞为里氏木霉(Trichoderma reesei)。
本发明所述糖化酶在里氏木霉工程菌中得到高效表达,酶活水平达到196U/mL。所述糖化酶能从糖链的非还原端高效分解α-1,4-糖苷键,因此,能将其应用于全酶法生产葡萄糖的糖化过程。
附图说明
图1:构建的表达载体质粒图谱。
图2:里氏木霉工程菌发酵上清液的SDS-PAGE电泳分析图,其中箭头所指
为重组表达的糖化酶。
具体实施方式
以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容,本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是,本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。
实施例1绳状青霉(Penicillium funiculosum)糖化酶基因的克隆
1.1总DNA的提取
将绳状青霉(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心,菌株编号3.3791)过夜培养,取适量菌体置于离心管中,13000rpm离心5min,弃上清;加入400μl抽提缓冲液(100mMTris-HCl,100mM EDTA,250mM NaCl,1%SDS);然后加100mg石英砂或玻璃珠,在珠打仪剧烈振荡2min左右;65℃水浴20min后,加入200μl10M NH4AC,冰浴10min;13000rpm离心10min,取上清;加入2倍体积的无水乙醇,-20℃放置30min;13000rpm离心10min,弃上清;用70%乙醇洗涤2次;晾干,加入水溶解,于-20℃保存。
1.2基因克隆
以绳状青霉基因组为模板,采用Genome Walking方法克隆基因。Genome WalkingKit购自TaKaRa公司。本实验根据已知的部分序列设计了六条SP引物,分别扩增5'端和3'端未知序列。SP引物如下:其中5R-SP-1、5R-SP-2和5R-SP-3为扩增5'端SP引物;而3F-SP-1、3F-SP-2和3F-SP-3为扩增3'端SP引物。SP系列引物的具体序列如下表所示:
5R-SP-1 | GATGGGGTAAATGGAGCGGAAG |
5R-SP-2 | GCAAGGCTGGAAAGTAGAGTCATC |
5R-SP-3 | CAATGGTGAAGAACGACGAGCC |
3F-SP-1 | CTCATCTCCAAACCGTGTCTAATCC |
3F-SP-2 | TACGGCTTTGATTGCCTATGGT |
3F-SP-3 | CTGATTATGCTCCAGGACAACGG |
第一轮反应组成:基因组DNA0.5μl;dNTP4μl;10×buffer5μl;AP引物1μl;SP1引物1μl;Taq酶2μl;ddH2O36.5μl。
第一轮反应条件为:
第二轮反应组成:第一轮反应物1μl;dNTP4μl;10×buffer5μl;AP引物1μl;SP2引物1μl;Taq酶2μl;ddH2O36μl。
第二轮反应条件为:
经过两轮扩增获得5’和3’端特异条带;将获得的特异条带回收后,分别连接到pMD18T-载体,转化DH5a;最后将阳性转化子送往北京华大基因研究中心进行测序分析。测序结果显示其中一个扩增产物的基因序列为SEQ ID NO:2,其编码的氨基酸序列为SEQ IDNO:1。
经NCBI的BLAST比对发现,SEQ ID NO:1与Aspergillus awamori菌的糖化酶氨基酸序列同源性最高,同源性为71%;该蛋白属于15家族的糖水解酶,具有糖化酶保守催化和结构域。
实施例2里氏木霉工程菌的构建
2.1表达载体构建
以基因组DNA为模板,利用引物Glu-For和Glu-Bac进行PCR扩增;
Glu-For:ACGGGTACCATGGCTCGCAGTCTTTTTC
Glu-Bac:CGCTCTAGATCAGATTGACGCTTTGGC
PCR扩增条件是:95℃4min;94℃40S;55℃30S,72℃1.5min30个循环;72℃7min。扩增产物凝胶回收后,先进行Kpn I和Xba I双酶切。同样,对木霉表达质粒pKDN-EG也进行KpnI和Xba I双酶切。用T4连接酶把双酶切产物即克隆基因和表达载体22℃连接过夜。最后,把连接产物导入大肠杆菌DH5a。相应的阳性克隆表达质粒命名为pVL-glu2,质粒图谱如图1所示。
2.2原生质体制备
接种里氏木霉菌丝于PDA平板上生长4天;切取直径约3cm的菌落置于约60ml YEG(0.5%酵母粉、1%葡萄糖)的液体培养基中,30℃,200rpm振荡培养过夜;多层纱布过滤收集菌丝;将菌丝置于盛有20ml裂解酶液(0.2g/10ml,0.7M NaCl溶解,Sigma L1412)酶解2小时;取出酶解液,轻轻摇晃,倒于三层灭菌擦镜纸过滤,收集滤液,3000rpm,离心10min;弃上清,加5ml溶液2悬浮,然后3000rpm,离心10min;加适量溶液2悬浮分装(200μl/管,108个/ml)。
2.3转化与验证
取10ul pKDN-Glu DNA加入到200μl原生质体中,接着加入50μl25%PEG溶液轻轻混匀,冰浴20min;然后加入2ml25%PEG,轻轻混匀,室温静置5min,把原生质体加到50ml左右熔化后冷却至45-55℃的上层半固体培养基(0.1%MgSO4,1%KH2PO4,0.6%(NH4)2SO4,1%葡萄糖,18.3%山梨醇,0.35%琼脂糖),轻轻混匀后倒入含100μg/ml潮霉素下层基础培养基平板(2%葡萄糖,0.5%(NH4)2SO4,1.5%KH2PO4,0.06%MgSO4,0.06%CaCl2,1.5%琼脂),28℃黑暗培养数天至转化子长出。
按照实施例1中的方法提取转化子基因组DNA为模板,利用引物扩增目的验证转化子。利用实施例1中引物进行PCR扩增目的基因。PCR扩增条件为94℃3min;94℃30S;58℃30S,72℃90S30个循环;72℃7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物,进行测序分析,经过PCR反应选育和验证阳性转化子。所获得阳性工程菌命名为里氏木霉VL-3(Trichoderma reesei VL-3)。
实施例3发酵和酶学性质测定
3.1木霉工程菌摇瓶发酵
将上述木霉工程菌接种于MM发酵培养基(1.5%葡萄糖,1.7%乳糖,2.5%玉米浆,0.44%(NH4)2SO4,0.09%MgSO4,2%KH2PO4,0.04%CaCl2,0.018%吐温-80,0.018%微量元素,0.018%聚丙二醇-2000),28℃培养48小时,然后25℃乳糖诱导培养48小时,取发酵上清液,进行SDS-PAGE分析。结果如图2所示,其中箭头所指处为重组表达的糖化酶,说明本发明所述糖化酶基因在木霉工程菌中得到高效表达,利用考马斯亮蓝法测定显示其表达量约为6g/l。
3.2酶活测定
(1)酶活测定方法
甲、乙两支50mL比色管,分别加入25mL的2%可溶性淀粉溶液和5mL的0.1M乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH4.6);于40±0.2℃的恒温水浴中预热5~10min。在甲管中加入酶制备液2.0mL摇匀并立即记时;反应1h后,立即在甲、乙两管各加0.2mL的20%氢氧化钠溶液,立即摇匀并将两管取出迅速用水冷却;然后于乙管中补加酶制备液2.0mL(作为对照)。取两管中上述反应液各5mL放入碘量瓶中,准确加入0.1N碘液10mL,再加0.1N氢氧化钠溶液15mL(边加边摇晃),放置暗处15min,加入2N硫酸2mL;最后用0.05N硫代硫酸钠溶液滴定至无色为终点。
酶活X=(A-B)×N×90.05×n
其中:X——酶活力单位,μ/g(mL);
A——空白试验消耗硫代硫酸钠溶液的毫升数;
B——样品消耗硫代硫酸钠溶液的毫升数;
N——硫代硫酸钠溶液的当量浓度;
n——稀释倍数;
90.05——1mL1N硫代硫酸钠相当葡萄糖毫克数;
(2)酶活测定
按照上述测定方法,取1ml上述摇瓶发酵的上清液进行酶活测定。结果显示其酶活为196U/mL,说明糖化酶基因在木霉工程菌中得到高效表达。
实施例4转糖实验
取10ml经淀粉酶液化的淀粉,加入2ml上述摇瓶发酵的上清液,即糖化酶;50℃作用30分钟后,测定反应液的DE值(还原性糖值),达到91%;然后,等比例加入适量普鲁兰酶,55℃作用1小时后,其DE值超过了93%。实验结果表明,本发明的糖化酶能从糖链的非还原端高效分解α-1,4-糖苷键,因此,能够将其应用于全酶法生产葡萄糖的糖化过程。
Claims (4)
1.一种糖化酶,所述的糖化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.一种重组表达载体,其特征在于所述的重组表达载体携带有编码权利要求1所述的糖化酶的基因,所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
3.一种用于表达权利要求1所述的糖化酶的重组细胞,其特征在于,所述的重组细胞为携带有权利要求2所述的重组表达载体的宿主细胞。
4.如权利要求3所述的重组细胞,其特征在于,所述的宿主细胞为里氏木霉(Trichoderma reesei)。
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