CN103013956A

CN103013956A - 一种糖化酶及其重组表达菌株

Info

Publication number: CN103013956A
Application number: CN2012105005002A
Authority: CN
Inventors: 黄亦钧; 刘士成; 王华明; 张慧丹
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao KDN Biotech Co., Ltd.
Priority date: 2012-11-30
Filing date: 2012-11-30
Publication date: 2013-04-03
Also published as: CN103614354B; CN103614354A

Abstract

本发明提供了一种新型糖化酶及其重组表达工程菌，并将筛选的糖化酶基因转入里氏木霉（Trichoderma reesei）中进行表达，构建了里氏木霉工程菌株。本发明所述糖化酶在里氏木霉工程菌中得到高效表达，酶活水平达到196U/mL，能从糖链的非还原端高效分解α-1,4-糖苷键，因此，有望将其应用于全酶法生产葡萄糖的糖化过程。

Description

一种糖化酶及其重组表达菌株

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种糖化酶及用于表达该糖化酶的重组表达工程菌。

背景技术

糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶（Glucoamylase），它能把淀粉从非还原性未端水解α-1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解a-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。同时也能水解糊精，糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。糖化酶用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵；本品还大量用于生产各种规格的葡萄糖。总之，凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上，都可适用。

我国高转化率糖化酶市场发展迅速，产品产出持续扩张，国家产业政策鼓励高转化率糖化酶产业向高技术产品方向发展。2011年国内糖化酶的市场容量为5亿元人民币，而且市场以每年20%速度在增长。预计2012年市场容量不低于6亿元。糖化酶价格则自2007年起不断上涨，由2元/公斤涨到2.7元/公斤。因此，国内企业新增糖化酶投资项目也逐渐增多。

目前常用的糖化酶均是来自黑曲霉。自70年代中期开始，中科院微生物所筛选获得了高产糖化酶菌株AS.3.4309。该菌株国内许多大型抗生素制药厂、酒精厂、酿酒厂进行了生产规模试验，均获得成功。该项目的成功为我国发酵行业节约了大量的粮食，产生了巨大的经济效益和社会效益。市场越来越密切关注高转化率糖化酶，这使得克隆和表达高转化率糖化酶成为研究的热点之一。蛋白表达系统是黑曲霉，其产酶量（蛋白量）较高，但是受到糖化酶本身性质的影响，黑曲霉表达糖化酶的比活比较低，不能适应市场的需求。因此，开发性能优良、比活高的糖化酶越来越受到各方的关注。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型糖化酶及其重组表达工程菌，并将筛选的糖化酶基因转入里氏木霉（Trichoderma reesei）中进行表达，为实现糖化酶的高密度发酵生产奠定了基础。

本发明一方面提供一种新型的糖化酶，所述的糖化酶包括

1）氨基酸序列为SEQ ID NO:1的糖化酶；

2）在1）限定的氨基酸经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有糖化酶功能的，由1）衍生的蛋白质。

用于编码上述糖化酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明另一方面提供了一种表达载体，其包含上述编码糖化酶的核苷酸。

本发明另一方面提供了一种表达宿主细胞，其携带有表达上述糖化酶基因的表达载体。

上述表达宿主细胞为里氏木霉（Trichoderma reesei）。

本发明所述糖化酶在里氏木霉工程菌中得到高效表达，酶活水平达到196U/mL。所述糖化酶能从糖链的非还原端高效分解α-1,4-糖苷键，因此，能将其应用于全酶法生产葡萄糖的糖化过程。

附图说明

图1 ：构建的表达载体质粒图谱。

图2 ：里氏木霉工程菌发酵上清液的SDS-PAGE电泳分析图，其中箭头所指为重组表达的糖化酶。

具体实施方式

以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。

实施例1绳状青霉（Penicillium funiculosum）糖化酶基因的克隆

1.1总DNA的提取

将绳状青霉（购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号 3.3791）过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心5 min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液(100 mM Tris-HCl, 100 mMEDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS); 然后加100mg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65℃水浴20min后，加入200μl 10M NH₄AC，冰浴10min；13000rpm离心10min，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000 rpm离心10min，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20℃保存。

1.2基因克隆

以绳状青霉基因组为模板，采用Genome Walking方法克隆基因。Genome Walking Kit购自TaKaRa公司。本实验根据已知的部分序列设计了六条SP引物，分别扩增5'端和3'端未知序列。SP引物如下：其中5R-SP-1、5R-SP-2和5R-SP-3为扩增5'端SP引物；而3F-SP-1、3F-SP-2和3F-SP-3为扩增3'端SP引物。SP系列引物的具体序列如下表所示：

5R-SP-1	GATGGGGTAAATGGAGCGGAAG
		5R-SP-2	GCAAGGCTGGAAAGTAGAGTCATC
5R-SP-3	CAATGGTGAAGAACGACGAGCC
		3F-SP-1	CTCATCTCCAAACCGTGTCTAATCC
3F-SP-2	TACGGCTTTGATTGCCTATGGT
		3F-SP-3	CTGATTATGCTCCAGGACAACGG

第一轮反应组成：基因组DNA 0.5μl；dNTP 4μl；10×buffer 5μl；AP引物1μl；SP1引物1μl；Taq酶2μl；ddH2O 36.5μl。

第一轮反应条件为：

第二轮反应组成：第一轮反应物 1μl；dNTP 4μl；10×buffer5μl；AP引物1μl；SP2引物1μl；Taq酶2μl；ddH2O 36μl。

第二轮反应条件为：

经过两轮扩增获得5’和3’端特异条带；将获得的特异条带回收后，分别连接到pMD18 T-载体，转化DH5a；最后将阳性转化子送往北京华大基因研究中心进行测序分析。测序结果进行序列拼接获得基因全长为SEQ ID NO:2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。多个克隆的测序结果证实了序列的准确性。

经NCBI的BLAST比对发现，SEQ ID NO:1与Aspergillus awamori菌的糖化酶氨基酸序列同源性最高，同源性为71%；该蛋白属于15家族的糖水解酶，具有糖化酶保守催化和结构域。

实施例2 里氏木霉工程菌的构建

2.1表达载体构建

以基因组DNA为模板，利用引物Glu-For和Glu-Bac进行PCR扩增；

Glu-For：ACGGGTACCATGGCTCGCAGTCTTTTTC

Glu-Bac：CGCTCTAGATCAGATTGACGCTTTGGC

PCR扩增条件是：95℃ 4min；94℃ 40S；55℃ 30S，72℃ 1.5min 30个循环；72℃ 7min。扩增产物凝胶回收后，先进行Kpn I和Xba I双酶切。同样，对木霉表达质粒pKDN-EG也进行Kpn I和Xba I双酶切。用T4连接酶把双酶切产物即克隆基因和表达载体22℃连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌DH5a。相应的阳性克隆表达质粒命名为pVL-glu2，质粒图谱如图1所示。

2.2原生质体制备

接种里氏木霉菌丝于PDA平板上生长4 天；切取直径约3cm的菌落置于约60ml YEG（0.5%酵母粉、1%葡萄糖）的液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有20 ml裂解酶液(0.2g/10ml，0.7 M NaCl溶解，Sigma L1412）酶解2小时；取出酶解液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000 rpm，离心10 min；弃上清，加5 ml 溶液2悬浮，然后3000rpm，离心10 min；加适量溶液2悬浮分装（200 μl/管，10⁸个/ml）。

2.3转化与验证

取10μl pKDN-Glu DNA加入到200μl原生质体中，接着加入50μl25%PEG溶液轻轻混匀，冰浴20min；然后加入2 ml 25%PEG，轻轻混匀，室温静置5min，把原生质体加到50 ml左右熔化后冷却至45-55℃的上层半固体培养基（0.1%MgSO₄, 1%KH₂PO4, 0.6%(NH₄)₂SO₄, 1%葡萄糖, 18.3%山梨醇, 0.35%琼脂糖），轻轻混匀后倒入含100μg/ml潮霉素下层基础培养基平板（2%葡萄糖，0.5%(NH4)₂SO₄, 1.5%KH₂PO₄, 0.06%MgSO₄, 0.06%CaCl₂，1.5%琼脂），28℃黑暗培养数天至转化子长出。

按照实施例1中的方法提取转化子基因组DNA为模板，利用引物扩增目的验证转化子。利用实施例1中引物进行PCR扩增目的基因。PCR扩增条件为94℃ 3min；94℃ 30S；58℃ 30S，72℃ 90S 30个循环；72℃ 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，进行测序分析，经过PCR反应选育和验证阳性转化子。所获得阳性工程菌命名为里氏木霉VL-3（Trichoderma reesei VL-3），能表达序列为SEQ ID NO:1的酶。

实施例3 发酵和酶学性质测定

3.1木霉工程菌摇瓶发酵

将上述木霉工程菌接种于MM发酵培养基（1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5%玉米浆，0.44%(NH₄)₂SO₄，0.09%MgSO₄，2%KH₂PO₄，0.04%CaCl₂，0.018%吐温-80，0.018%微量元素，0.018%聚丙二醇-2000），28℃培养48小时，然后25℃乳糖诱导培养48小时，取发酵上清液，进行SDS-PAGE分析。结果如图2所示，其中箭头所指处为重组表达的糖化酶，说明本发明所述糖化酶基因在木霉工程菌中得到高效表达，利用考马斯亮蓝法测定显示其表达量约为6g/l。

3.2酶活测定

（1）酶活测定方法

甲、乙两支50mL比色管，分别加入25mL的2％可溶性淀粉溶液和5mL的0.1M乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH4.6)；于40±0.2℃的恒温水浴中预热5～10min。在甲管中加入酶制备液2.0mL摇匀并立即记时；反应1h后，立即在甲、乙两管各加0.2mL的 20％氢氧化钠溶液，立即摇匀并将两管取出迅速用水冷却；然后于乙管中补加酶制备液2.0mL(作为对照)。取两管中上述反应液各5mL放入碘量瓶中，准确加入0.1N碘液10mL，再加0.1N氢氧化钠溶液15mL(边加边摇晃)，放置暗处15min，加入2N硫酸2mL；最后用0.05N硫代硫酸钠溶液滴定至无色为终点。

酶活X＝(A-B)×N×90.05×n

其中:X——酶活力单位,μ/g(mL);

A——空白试验消耗硫代硫酸钠溶液的毫升数;

B——样品消耗硫代硫酸钠溶液的毫升数;

N——硫代硫酸钠溶液的当量浓度;

n——稀释倍数;

90.05——1mL1N硫代硫酸钠相当葡萄糖毫克数;

（2）酶活测定

按照上述测定方法，取1ml上述摇瓶发酵的上清液进行酶活测定。结果显示其酶活为196U/mL，说明糖化酶基因在木霉工程菌中得到高效表达。

实施例4 转糖实验

取10ml经淀粉酶液化的淀粉，加入2ml上述摇瓶发酵的上清液，即糖化酶；50℃作用30分钟后，测定反应液的DE值（还原性糖值），达到91%；然后，等比例加入适量普鲁兰酶，55℃作用1小时后，其DE值超过了93%。实验结果表明，本发明的糖化酶能从糖链的非还原端高效分解α-1,4-糖苷键，因此，能够将其应用于全酶法生产葡萄糖的糖化过程。

Claims

1.一种糖化酶，所述的糖化酶包括：

1）氨基酸序列为SEQ ID NO:1的糖化酶；

2.用于编码上述糖化酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

3.一种重组表达载体，所述的重组表达载体用于表达权利要求1所述的糖化酶。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于所述的表达载体包含有权利要求2所述的基因。

5.一种用于表达权利要求1所述的糖化酶的表达宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞携带有权利要求3所述的重组表达载体。

6.如权利要求5所述的表达宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为里氏木霉（Trichoderma reesei）。