CN102226166A

CN102226166A - 高效表达普鲁兰酶的基因工程菌株及其构建方法

Info

Publication number: CN102226166A
Application number: CN 201110141622
Authority: CN
Inventors: 路福平; 刘逸寒; 张艳; 王春霞; 王建玲
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2011-05-30
Filing date: 2011-05-30
Publication date: 2011-10-26

Abstract

本发明涉及一种高效表达普鲁兰酶的基因工程菌株及其构建方法，主要内容是从长野芽孢杆菌中提取染色体DNA、设计引物并PCR获得目的基因、构建重组质粒、利用大肠杆菌表达系统BL21(DE3)/pET-22b(+)使得目的基因的拷贝数增加，普鲁兰酶的表达量明显提高，粗酶液酶活力达10.94U/mg，比出发菌株酶活力提高了37倍，为其工业化生产奠定基础。另外其在提高淀粉利用率、降低粮耗、提高产品质量及开发新产品方面有广阔的开发前景，本发明不仅具有较强的基础理论研究价值，而且具有较大的经济效益和社会效益。

Description

高效表达普鲁兰酶的基因工程菌株及其构建方法

技术领域

本发明是利用基因工程技术构建基因工程菌株，尤其是一种高效表达普鲁兰酶的基因工程菌株及其构建方法。

背景技术

普鲁兰酶(Pullulanase，EC 3.2.1.41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1，6-糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉的解支酶，在改善淀粉酶对淀粉的作用效果、提高淀粉利用率、降低粮耗、提高产品质量及开发新产品方面有相当巨大的价值，在淀粉加工工业中有着重要的用途及良好的市场前景，目前已经被成熟的应用于高麦芽糖浆、高葡萄糖浆及干啤酒的生产中。

目前，普鲁兰酶的产量很低，只有丹麦诺维信及美国杰能科工业化生产并销售此酶，国内企业均依赖进口，价格昂贵。普鲁兰酶工业化生产菌株较少，我国关于普鲁兰酶的研究主要集中在产普鲁兰酶菌株的筛选、诱变及优化等方面，效果均不太理想，而随着基因工程技术的发展，利用基因工程技术改造菌种，进一步提高酶的产量及活性，降低生产成本成为可能，并在世界范围内得到越来越广泛的重视及应用。近几年，我国学者特别是江南大学学者利用基因工程技术构建基因工程菌株取得了一定的效果：2006年，夏子芳利用大肠杆菌表达系统表达海栖热袍菌普鲁兰酶基因，并得到少量酶活；2008年，张明焱将来源于Bacillus licheniformis的普鲁兰酶编码基因利用大肠杆菌表达系统表达，酶活力达5.6U/ml；2010年，王淑军等人利用深海古菌Thermococcus siculi HJ21 PCR扩增出一新的普鲁兰酶编码基因，并在大肠杆菌中得到表达，但表达量较低。

我国关于普鲁兰酶的研究起步较晚，为了改变对进口产品的依赖，寻求一条国产化的道路，本发明利用基因工程技术构建基因工程菌株，进一步提高酶的产量及活性，为其工业化生产奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效表达普鲁兰酶的基因工程菌株及其构建方法，通过重新构建后获得基因工程菌的普鲁兰酶的表达量明显提高，为其工业化生产奠定基础。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种高效表达普鲁兰酶的基因工程菌株，所述基因工程菌株含有普鲁兰酶基因，普鲁兰酶基因基因的来源是Bacillus naganoensis(ATCC53909)。

而且，所述基因工程菌株的宿主菌是大肠杆菌BL21(DE3)。

而且，所述基因工程菌株的普鲁兰酶基因由Bacillus naganoensis(ATCC53909)染色体DNA扩增得到的。

一种高效表达普鲁兰酶的基因工程菌株的构建方法，方法的步骤如下：

(1)基因克隆：根据NCBI上报道的基因序列设计引物，以Bacillus naganoensis(ATCC53909)菌株的染色体DNA为模板克隆得到普鲁兰酶基因；

(2)基因工程菌株的构建：将所获得的普鲁兰酶基因与载体pEY-22b(+)连接，酶切验证；

(3)将酶切验证正确的载体转化到宿主E.coli BL21(DE3)内，之后进行酶切，测序验证，确定构建含有普鲁兰酶基因的基因工程菌株BL21(DE3)/pET22b-pul。

而且，基因工程菌株BL21(DE3)/pET22b-pul经发酵所测粗酶液酶活力为10.94U/mg，比出发菌株Bacillus naganoensis(ATCC53909)酶活力提高了37倍。

本发明的优点和积极效果如下：

本发明首次利用基因工程技术构建了含有普鲁兰酶基因的工程菌株，本菌株经诱导后获得的粗酶液的酶活力达10.94U/mg，比出发菌株酶活力提高了37倍，实现普鲁兰酶的高效表达，为普鲁兰酶在食品工业中的应用及工业化生产奠定基础。

附图说明

图1为本发明的PCR扩增图，其中：1为PCR产物；2为1kb DNA marker；

图2为本发明重组质粒的构建流程；

图3为本发明酶切验证凝胶图，其中：1为1kb DNA marker；2为经BamH I和Sal I双酶切；3为经BamH I单酶切；4为经BamH I单酶切的pET-22b(+)；

图4为本发明蛋白电泳图，其中1为BL21(DE3)/pET22b-pul诱导前的全细胞；2为BL21(DE3)/pET22b-pul诱导后的全细胞；3为BL21(DE3)诱导前的全细胞；4为BL21(DE3)诱导后的全细胞；5为BL21(DE3)/pET-22b(+)诱导前的全细胞；6为BL21(DE3)/pET-22b(+)诱导后的全细胞；M为蛋白marker。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

一种高效表达普鲁兰酶的基因工程菌株，利用大肠杆菌表达系统，构建基因工程菌株BL21(DE3)/pET22b-pul，实现普鲁兰酶的高效表达，本发明目的基因的来源是Bacillus naganoensis(ATCC53909)，基因工程宿主菌是大肠杆菌BL21(DE3)，所构建的重组表达载体不仅包括编码目的基因的DNA序列，还包括表达该基因所需的控制元件。

一种高效表达普鲁兰酶的基因工程菌株的构建方法，步骤是：

1、普鲁兰酶基因的克隆

根据NCBI上报道的基因序列设计引物，引物如下：

上游引物F1：CGCGGATCCAGATGGGAACACCACAAACATC 酶切位点为BamH I

下游引物R2：ACGCGTCGACTAAGTTCATTTAGGTCGATG 酶切位点为Sal I

1.1 PCR扩增体系：

1.2 用于扩增目的基因的PCR条件：

将PCR所得产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，可以看到在2500bp-3000bp之间有一条特异性条带，其大小与报道的基因大小相似，序列见序列3。

2、基因工程菌株的构建

2.1 pET-22b(+)质粒的提取

在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基中接种携带质粒pET-22b(+)的大肠杆菌JM109菌株(购自宝生物公司)，于37℃振荡培养过夜，具体步骤如下：

(1)取1ml过夜培养菌液于1.5ml离心管中，12000r/min离心1min收集菌体彻底弃去上清；

(2)加100μl预冷溶液I(50mmol/l蔗糖，25mmol/lTris，10mmol/l EDTA，pH8.0)，重悬沉淀；

(3)加200μl新配置的溶液II(0.2mol/l NaOH，1％SDS)，柔和颠倒离心管4-6次，冰浴3～5min；

(4)加150μl溶液III(3mol/l乙酸钾，5mol/l乙酸，pH4.8)，温和颠倒4-6s，冰浴10min；

(5)12000r/min离心10min，将上清移入另一离心管中；

(6)加入等体积的饱和苯酚∶氯仿＝1∶1，振荡混匀，12000r/min离心10min，将上清移入另一离心管中；

(7)反复抽提两次，最后加等体积的氯仿进行抽提，12000r/min离心10min，将上清移入另一离心管中；

(8)加入2倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-70℃，沉淀30min；

(9)12000r/min，离心10min，用1ml 70％乙醇洗涤2次，12000r/min，离心10min，将乙醇倒出，室温静置干燥30min；

(10)溶于40μl无菌水中，-20℃保存。

以上所获得的pET-22b(+)即可用作连接目的基因的载体。

2.2 重组载体pET22b-pul的构建

(1)将以上PCR产物及提取的pET-22b(+)质粒同时双酶切，体系如下：

酶切于37℃，反应4-6h，即可。

用DNA纯化试剂盒(TaKaRa公司)对上述酶切后的片段进行纯化回收。

(2)pET-22b(+)与目的基因的连接

将以上纯化回收后的载体和目的基因进行连接，连接体系如下：

2.3 转化宿主菌株BL21(DE3)

2.3.1 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备。

(1)挑去新鲜活化的BL21(DE3)单一菌落，接种于5ml LB培养基的试管中，37℃，180r/min培养过夜。

(2)将培养菌液以1％接种量接种于另一装有40ml LB培养基的250ml三角瓶中，37℃，180r/min培养2-3h，使细胞生长达到对数生长初期(OD₆₀₀＝0.4-0.5)。

(3)置于冰上冷却10min后，将培养液装入预冷的离心管中，于4℃离心(4000r/min，10min)。

(4)去除上清，用预冷的0.1mol/lCaCl210ml重悬细胞，并冰浴30min。

(5)4℃离心(4000r/min，10min)，去除上清。

(6)用预冷的0.1mol/lCaCl2(含有15％甘油的0.1mol/l CaCl2混合物)1ml重悬细胞，

(7)以50μl/管分装到已预冷的1.5ml离心管中，-80℃冻存备用。

2.3.2 转化

(1)从-80℃冰箱取出一管感受态细胞，冰浴融化。

(2)加入上述连接产物10μl，轻轻混匀，冰浴30min。

(3)于42℃热激90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2min。

(4)加入SOC培养基1ml，37℃缓摇孵育45min。

(5)取200μl培养液涂布于含氨苄青霉素的LA平板上，37℃倒置培养(12-16h)。

(6)挑取转化子，提取质粒，进行酶切验证。

重组质粒的构建流程及酶切验证分别见图2及图3

3、普鲁兰酶的高效表达

3.1 基因工程菌株BL21(DE3)/pET22b-pul的诱导表达

(1)将步骤2中构建成功的基因工程菌株接种于含氨苄青霉素(50μg/ml)液体LB培养基中，于37℃培养10h。

(2)将菌液按2％的接种量转接于40ml(250ml三角瓶)含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中。

(3)37℃，180r/min振荡培养，当OD600＝0.6-0.8时加入IPTG，终浓度至0.8mM。

(4)转至20℃，150r/min培养诱导10h收获。

3.2 SDS-PAGE表达分析

3.2.1 凝胶制备

3.2.2 样品处理

(1)取上述诱导收获的发酵液200μl，12000r/min离心3min。

(2)去除上清，将菌体重悬于40μl 1×SDS-PAGE电泳上样缓冲液，并进行充分混合。

(3)煮沸5min，离心取上清，进行蛋白电泳分析，电泳结果见图4。

3.3 酶活力测定

本发明采用DNS试剂显色法测定普鲁兰酶活力。其原理为普鲁兰酶在一定的温度与pH条件下，水解普鲁兰糖底物3，5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原为显棕红色的氨基络合物，在-定范围内其颜色的深浅与还原糖的量成正比，用分光光度法测定，计算其酶活力，经LB培养基发酵，诱导10h后粗酶液的酶活力达10.94U/mg，比出发菌株酶活力提高了37倍。

序列表

Claims

1.一种高效表达普鲁兰酶的基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株含有普鲁兰酶基因，普鲁兰酶基因基因的来源是Bacillus naganoensisATCC53909。

2.根据权利要求1所述的高效表达普鲁兰酶的基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株的宿主菌是大肠杆菌BL21(DE3)。

3.根据权利要求1所述的高效表达普鲁兰酶的基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株的普鲁兰酶基因由Bacillus naganoensis ATCC53909染色体DNA扩增得到的。

4.一种高效表达普鲁兰酶的基因工程菌株的构建方法，其特征在于：方法的步骤如下：

(2)基因工程菌株的构建：将所获得的普鲁兰酶基因与载体pET-22b(+)连接，酶切验证；

5.根据权利要求4所述的高效表达普鲁兰酶的基因工程菌株的构建方法，其特征在于：基因工程菌株BL21(DE3)/pET22b-pul经发酵所测粗酶液酶活力为10.94U/mg，比出发菌株Bacillus naganoensis ATCC53909酶活力提高了37倍。