CN105441415A - 一种普鲁兰酶突变体PulB-d99-D436H的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种普鲁兰酶突变体PulB-d99-D436H的制备方法及其应用，其获得方法是截取长野芽孢杆菌(Bacillus？naganoensis)普鲁兰酶的100-926氨基酸肽段，同时将其436位点的天冬氨酸Asp突变为组氨酸His，改造得到一个新的普鲁兰酶突变体。本发明优点：该突变酶相对于突变前的酶具有优良的特性，其中酶的表达量是亲本酶的3.8倍，最适温度提高2.5℃，催化活性是亲本酶的1.36倍。该突变体基因以同源重组的方式整合到枯草芽孢杆菌(Bacillus？subtilis)染色体中构建重组枯草芽孢杆菌，能稳定地发酵生产普鲁兰酶。该突变体酶能够提高淀粉和普鲁兰糖的水解效率。

Description

一种普鲁兰酶突变体PulB-d99-D436H的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和分子酶工程领域，具体是一种普鲁兰酶突变体PulB-d99-D436H的制备方法及其应用。

背景技术

淀粉是一种高分子天然化合物，是应用最为广泛的一类工业原料。天然淀粉原料是由直链淀粉与支链淀粉组成的混合物，其中主要是支链淀粉，约占80％。支链淀粉是由许多短链构成的高度分支的高分子多糖，它通常是以α-D-葡萄糖残基通过α-1,4-糖苷键连接成一直链，在直链上又可通过α-1,6-糖苷键形成侧链，在侧链上又会出现另一个分支短链而形成树枝状物，每个短链大约含20-30个α-D-葡萄糖单元，短链的还原端也由α-1,6-糖苷键连接，其分子量大约为10⁸Da。工业应用的淀粉质原料中大部分是支链淀粉，如最常用的玉米淀粉中的支链淀粉占74％，马铃薯淀粉的占76％，木薯淀粉的占83％，而糯米淀粉的支链淀粉含量最高达100％。在淀粉深加工过程中，α-淀粉酶、β-淀粉酶和糖化酶等淀粉酶对α-1,4-糖苷键比较容易分解，但对α-1,6-糖苷键的分解较为困难，因此α-1,6-糖苷键的存在防碍了淀粉的利用率和影响了产品的质量。

普鲁兰酶(Pullulanase，EC3.2.1.41)是淀粉脱支酶，因其能专一性水解普鲁兰糖(Pullulan，由麦芽三糖以α-1,6-糖苷键连接起来的聚合物)而得名，该酶也能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1,6-糖苷键，使支链淀粉型多糖的分支链脱离主链，形成一系列链长不一的直链淀粉，还可以将最小单位的支链分解，在以淀粉质为原料的工业化过程中，该酶可以显著提高淀粉原料的利用率，降低生产成本和提高产品质量，因此，普鲁兰酶在食品、医药、纺织和生物能源等领域有非常重要的应用价值和市场潜力。该酶也能水解普鲁兰糖(Pullulan)直接生产麦芽三糖，具有工艺简单，产品纯度高，得率高，成本低等优点，生产过程可实现连续化和自动化。普鲁兰酶能分解支链的特性决定了它在食品工业中的广泛应用，已成为淀粉酶类中一个很有前途的新品种。在淀粉水解生产医用葡萄糖过程中，普鲁兰酶与α-淀粉酶、糖化酶联合使用，可将淀粉彻底降解为葡萄糖，并可使葡萄糖的结晶明显加快，提高设备利用率；在高纯度麦芽糖和海藻糖的生产中将普鲁兰酶与淀粉酶合用，几乎可以将淀粉100％地转化成麦芽糖，从而得到0.8g/ml以上的超高麦芽糖浆；在啤酒生产中添加普鲁兰酶可提高糖的利用率，缩短糖化时间，提高设备利用率。

随着我国淀粉深加工工业的快速发展，对相关酶制剂的种类和性能提出更高的要求。目前，普鲁兰酶的工业化生产被丹麦和美国垄断，我国普鲁兰酶的工业应用完全依赖进口，价格昂贵，极大的限制了我国相关产业的发展。我国啤酒年产量3500万吨以上，以每吨啤酒耗粮170公斤，淀粉含量70％计，共需糖化400万吨淀粉，其中一半为辅料淀粉，需外加酶糖化，按国外推荐的普鲁兰酶用量为辅料的0.04％-0.08％，需使用800-1600吨普鲁兰酶；全国60万吨高麦芽糖浆，也需使用约120-240吨普鲁兰酶；全国130万吨医用葡萄糖，需使用普鲁兰酶500-1000吨。因此，仅国内市场普鲁兰酶就有1400-2800吨，价值约4-6亿元，由此可见普鲁兰酶具有极大的应用领域和市场前景。

普鲁兰酶广阔的应用前景已引起国内外相关科研人员的关注，国内对普鲁兰酶的研究始于上世纪70年代，目前主要是集中在耐酸耐热高产菌株的筛选及其相关基因的克隆与表达。天然的普鲁兰酶分子量大，其表达水平低、活性低和稳定性差等特点而使其仅限于实验室研究，还不能满足于工业化应用。随着现代生物学的快速发展，利用分子生物学技术改良酶的特性，提高酶的品质和产量已成为可能。

目前，国内相关研究机构已对普鲁兰酶进行了一些的改良，如广西科学院申请的专利(申请号201210298493.2)公开了一种来源于长野芽孢杆菌的普鲁兰酶突变体Pul324及应用，其酶的突变体也是来源于长野芽孢杆菌，他们只是缺失了酶编码基因的前324bp核苷酸(缺失N端前108个氨基酸)，得到由818个氨酸酸组成的突变酶，没有对其它氨基酸进行突变，也没有描述突变酶比亲本酶在性能上的改善情况，只是描述其突变酶在大肠杆菌能有效地分泌表达，发酵上清液酶活力提高了24倍，其意义是有利于降低酶的生产成本，目前还没有其突变酶工业化生产和工业应用的报道。尽管他们的突变酶与本专利所述及突变酶的序列高度相似，但本专利所述的实施方法与之完全不同，突变体序列也不一样，得到的是完全不同的并且酶的性能有所改善新型普鲁兰酶突变体，因此是两种不同的普鲁兰酶突变体。

江南大学的专利(申请号201210256804.9和申请号201310471021.7)公开了一种普鲁兰酶突变体及其制备方法，他们两个专利相关的普鲁兰酶都是来源于脱支芽孢杆菌，是对亲本酶的活性氨基酸进行替换，得了性能各异并且有所改良的突变体酶，但这些普鲁兰酶基因的菌种来源与本专利所述的不同，DNA序列和氨基酸序列相差很大，酶的分子量不同，酶学特性和活力都有很大的差异，且都没有得到绝对优势的突变体，也没有其工业化生产和应用的报道，酶学特性不同，最适合的应用的领域也不同，所以与本专利所述的突变体也是完全不同的。

为了加快我国普鲁兰酶的研究和改进其生产状况，彻底改变我国普鲁兰酶依赖进口的局面，开发具有自主知识产权新型普鲁兰酶，本研究结合现代分子生物学和生物信息学等知识和手段，对长野芽孢杆菌(Bacillusnaganoensis，ATCC53909)普鲁兰酶进行更深入的分子改良，筛选性能优良的突体体，低成本地制备优质高效的新型普鲁兰酶，将具有非常重要的理论价值和现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种普鲁兰酶突变体PulB-d99-D436H的制备方法及其应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明所述的新型菌普鲁兰酶突变体PulB-d99-D436H(SEQIDNO.2)，是通过截取长野芽孢杆菌普鲁兰酶(PID，G9JLV4)的100-926氨基酸肽段，同时将亲本酶436位点的天冬氨酸Asp突变为组氨酸His获得的，突变体酶表达量是亲本酶的3.8倍，最适反应温度提高2.5℃，催化活性是亲本酶的1.36倍，该突变体基因以同源重组的方式整合到枯草芽孢杆菌染色体中构建整合型重组枯草芽孢杆菌，能发酵生产普鲁兰酶。突变酶能够提高淀粉和普鲁兰糖的水解效率。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：本发明所述普鲁兰酶突变体基因是根据GenBank已公布的长野芽孢杆菌(Bacillusnaganoensis，ATCC53909)的普鲁兰酶基因序列(GenBankAccessionNo.JN872757.1)为依据，人工合成普鲁兰酶全基因序列；同时经过同源建模、分子剪接和定点突变，缺失亲本酶N端的前99个氨基酸，得到包含普鲁兰酶100-926的氨基酸并且436位点的天冬氨酸Asp突变为组氨酸His的肽段，最终改造得到一个新的普鲁兰酶突变体PulB-d99-D436H。该突变体的编码基因以同源重组的方式整合到枯草芽孢杆菌染色体中构建重组枯草芽孢杆菌，能发酵生产新型普鲁兰酶。

一种长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

所述的普鲁兰酶突变体基因编码的蛋白质，由827个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

本发明还涉及含有本发明普鲁兰酶突变体基因的转化和整合表达的宿主。

以上普鲁兰酶突变体PulB-d99-D436H及其重组枯草芽孢杆菌的具体制备方法：包括pulB基因的合成、普鲁兰酶截断体基因pulB-d99的获得、普鲁兰酶突变体基因pulB-d99-D436H的获得、普鲁兰酶突变体基因pulB-d99-D436H的表达和表达产物的纯化及突变体分别水解淀粉和普鲁兰糖测定步骤。普鲁兰酶突变体基因，以同源重组的方式整合到枯草芽孢杆菌染色体中构建重组枯草芽孢杆菌，能发酵生产新型普鲁兰酶。

所述的普鲁兰酶全基因序列，是根据已公布的长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因序列(GenBankAccessionNo.JN872757.1)为依据，人工合成其全序列基因pulB，该基因与表达载体pSE380构建成表达质粒pSE380-pulB，其表达产物为亲本酶，作为突变酶新型特性的参照物。

普鲁兰酶截断体基因pulB-d99的获得，是以表达质粒pSE380-pulB为模板，设计一对序列互补的引物(引物Pul1和Pul2)，通过反向PCR技术截断亲本酶基因的编码前99个氨基酸的核苷酸序列得到的突变体质粒pSE380-pulB-d99。

普鲁兰酶突变体基因pulB-d99-D436H的获得,是以表达质粒pSE380-pulB-d99为模板，设计一对序列互补的引物(引物Pul3和Pul4)，通过反向PCR技术进行定点突变(亲本酶436位点的天冬氨酸Asp突变为组氨酸His，即D436H)得到的突变体质粒pSE380-pulB-d99-D436H。

表达普鲁兰酶亲本酶和突变酶的表达质粒pSE380-pulB和pSE380-pulB-d99-D436H分别用CaCl₂转化大肠杆菌(Escherichiacoli)XL-1Blue感受态细胞，进行表达、酶纯化和酶水解淀粉和普鲁兰酶等相关的研究和比较。

该普鲁兰酶突变体基因，再以同源重组的方式整合到枯草芽孢杆菌染色体中构建整合型重组枯草芽孢杆菌，稳定发酵生产普鲁兰酶，具体是按照南宁邦尔克生物技术有限责任公司自行开发的专利技术进行(中国专利201310174694.6，一种高效表达重组普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌及其获得方法)。

本发明与现有技术成果相比，具有实质性特点和显著的优势：

本发明是综合运用现代生物信息学和分子生物学的理论和手段，对长野芽孢杆菌普鲁兰酶进行同源建模、结构比对分析和功能预测，并以此为依据，剪除酶分子上冗余的结构，并突变关键的氨基酸残基，最终得到分子量较小的、酶特性有所改良的突变体酶，此突变体酶表达量是亲本酶的3.8倍，最适反应温度提高2.5℃，催化活性是亲本酶的1.36倍。该普鲁兰酶突变体基因，以同源重组的方式整合到枯草芽孢杆菌染色体中构建整合型重组枯草芽孢杆菌，能持续而稳定地发酵生产普鲁兰酶，因此，本发明技术成果克服了常规蛋白表达方法的质粒不稳定性问题，也避免抗生素和诱导物(如IPTG)对环境的污染问题，产品达到食品要求，产品无抗菌活性。新型普鲁兰酶优良的特性有利于降低普鲁兰酶的生产成本和扩大其应用领域，使其更适合于工业化生产和应用。本发明是理论和实验实践相结合的成功例子，其研究策略也大大减少科研实践中的盲目性和不可遇见性，有效节约了科研资源和生产成本，体现了技术成果和实施手段的先进性。

附图说明

图1是普鲁兰酶亲本酶和突变酶蛋白表达和纯化酶的SDS-PAGE图。

图2普鲁兰酶亲本酶和突变酶水解普鲁兰糖酶活性分析图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。但需要说明的是，实施例并不构成对本发明要求保护范围的限制。

1)亲本酶的同源建模

蛋白质的空间结构是决定其功能的基础，同源建模法(Homologymodel)是目前唯一能够从蛋白质的氨基酸序列出发，建立其3D模型的计算方法，是当前对未知蛋白质空间结构进行理论预测的主要方法之一。如果两种蛋白质的序列一致性(Identity)超过30％，它们很有可能以相同的折叠方式形成它们相似的空间结构，如果一对蛋白质的序列一致性大于60％，同源建模的结果将接近实验测试的结果(即它们空间结构几乎相似)。由于到目前为止，长野芽孢杆菌普鲁兰酶的晶体结构还没有得到解析，所以本发明立足于建立该酶计算机理论模型，对目的酶进行结构分析和功能预测，并以此为依据对亲本酶进行适当的改造，期望得到性能有改良的突变体酶。

目前，互联网上有免费的服务器可用来对目的蛋白进行同源建模，最常用的基于同源建模的SwissModel服务器(http://swissmodel.expasy.org/)。本发明将长野芽孢杆菌普鲁兰酶亲本酶的蛋白质序列(PID，G9JLV4)提交到SwissModel服务器进行自动同源建模，发现它与嗜酸普鲁兰芽孢杆菌(Bacillusacidopullulyticus)普鲁兰酶(PDBID，2WAN)相似性达64％。本发明所述的长野芽孢杆菌普鲁兰酶的氨基酸序列与GenBank中已公布的该普鲁兰酶(PDBID，2WAN)的具有很高的相似性，因此，以嗜酸普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶(PDBID，2WAN)为模板，得到一个N端缺失的、比较可靠的长野芽孢杆菌普鲁兰酶理论三维结构模型。

2)基于结构的序列比对、截断位点和突变位点的确定

以嗜酸普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶(PDBID，2WAN)的晶体结构BaPull3A为对照，通过Pymol或Swiss-PdbViewer生物软件，与1)中建立所的理论结构模型进行结构比对(Superimpose)分析，预测长野芽孢杆菌普鲁兰酶的底物结合口袋、底物结合位点、功能保守区域、稳定结构和催化活性相关的氨基酸残基，确定可以缺失亲本酶N端前99个氨基酸无规卷曲的结构，这样将得到分子量变小，酶的稳定性和表达量有所提高的截断体PulB-d99。

通过与Bacillusderamificans的普鲁兰酶基因(GenBankAccessionNo.CAC60157)编码的耐酸性普鲁兰酶(该酶晶体结构没有报导，也是通过相应同源建模方法得到其理论三维结构，长野芽孢杆菌普鲁兰酶氨基酸序列与它的序列相似性达90％)及其突变酶的结构、功能和酶学性质相互影响的关系进行比较分析，结合嗜酸普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶(PDBID，2WAN)的晶体结构对应的功能位点(439位点是组氨酸，即439H)，确定将长野芽孢杆菌(B.naganoensis)普鲁兰亲本酶对应436位点的天冬氨酸(Asp，D)突变为组氨酸(His，H)，最终得到突变体酶PulB-d99-D436H。

3)构建突变酶及其重组枯草芽孢杆菌具体方案如下

材料包括：大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、表达载体pSE380、基因突变试剂盒、Ni-NTA蛋白质组氨酸纯化介质、内切酶、修饰酶等。

(1)长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因pulB的获得及其重组质粒的构建

根据已公布的长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因序列(GenBankAccessionNo.JN872757.1)为依据，按照沉默突变进行适当的稀有密码子优化和除掉无用的酶切位点(其翻译的氨基酸序列没有变化)的原则，委托南京金斯瑞生物科技有限公司(www.genscript.com.cn)人工合成其全序列基因pulB，为了方便纯化，基因的上游加有6个组氨酸标签(6His,CAGATTCACCACCATCACCATCAT)，基因的上下游分别添加NcoI和HindIII酶切位点，合成的基因插入表达载体pSE380的NcoI和HindIII酶切位点处，得到表达质粒pSE380-pulB，重组子转化、质粒提取、酶切验证以及测序验证等步骤按相关常规方法进行。

(2)普鲁兰酶截断体基因pulB-d99的获得

以表达质粒pSE380-pulB(已甲基化)为模板，用引物Pul1(粗体字母为第100个氨基酸密码子，前面为组氨酸标签序列)和Pul2一步反向PCR法删除pulB基因编码N端前99个氨基酸的核苷酸序列。

引物Pul1序列：5’-CATCACCATCATGAAAAGGATGCTGAGGCAG-3’

引物Pul2序列：5’-CTGCCTCAGCATCCTTTTCATGATGGTGATG-3’

25μL的PCR反应体系：5×PSPCR缓冲液5μL，dNTP200μmol/L，引物各10pmol/L，重组质粒pSE380-pulB模板10～20ng，PrimeSTARHSDNA聚合酶0.5个单位，加超纯水至反应总体积为25.0μL。

PCR扩增程序如下：95℃3min；95℃30sec；61.5℃30sec；延伸温度和时间72℃7.0min；循环22次；72℃15min。取3μL的PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶进行电泳分析，再用DpnI酶把余下的PCR产物进行消化原始模板后，用PCR产物试剂盒进行纯化，再转化到大肠杆菌宿主菌E.coliXL-1Blue，最终得到序列正确的表达质粒pSE380-pulB-d99。

(3)普鲁兰酶突变体基因pulB-d99-D436H的获得

以表达质粒pSE380-pulB-d99(已甲基化)为模板，以引物Pul3(粗体密码子为突变子)和Pul4一步反向PCR法定法，将该基因编码的第436位点的天冬氨酸(Asp，D)突变为组氨酸(His，H)。

引物Pul3序列：5’-GTCATCTATGAAATGCATGTTCGTGACTTTTCC-3’

引物Pul4序列：5’-GGAAAAGTCACGAACATGCATTTCATAGATGAC-3’

25μL的PCR反应体系和PCR扩增程序：与上述步骤(2)相似，只是以10～20ng表达质粒pSE380-pulB-d99为模板，以引物Pul3和Pul4进行PCR，退火温度60.0℃30sec，延伸温度和时间72℃7.0min，PCR产物经过模板消化、转化、酶切验证和测序后，得到正确的突变体质粒pSE380-pulB-d99-D436H。

(4)大肠杆菌基因工程菌的构建和酶的表达和纯化

表达普鲁兰酶亲本酶和突变酶的表达质粒pSE380-pulB和pSE380-pulB-d99-D436H分别用CaCl₂转化大肠杆菌(Escherichiacoli)XL-1Blue感觉态细胞中，用LB平板(含100μg/mL氨苄青霉素，Amp)培养至长出清晰的菌落，用无菌牙签挑取单菌落接种于10mLLB(含100μg/mLAmp)液体培养基中，培养过夜，再以2％的接种量接种到装有200mLLB(含100μg/mLAmp)液体培养基的500mL摇瓶中，当在37℃和220rpm培养菌体浓度至OD₆₀₀为0.5～0.7时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，在37℃和200rpm继续培养16～20h，再8000g离心收集菌体，后用50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH6.0)洗涤菌体后再离心回收菌体，再按每克菌体加5mL的破胞缓冲液(50mmol/L磷酸钠缓冲液，pH6.0，0.25％BRIJ35，V/V)重悬菌体后在冰浴条件下用超声波进行破胞，破胞至菌液澄清，11000g离心15分钟离心收集上清，所收集的上清为粗酶液，再经过镍亲和层析纯化，粗酶和纯酶都进行SDS-PAGE电泳检测，如图1所示，突变酶(Lane2)的分子量较小，其表达量明显高于亲本酶(Lane1)的表达量，其表达量是亲本酶的3.8倍，纯化酶(Lane3为突变酶，分子量为90kDa；Lane4为亲本酶，分子量为101kDa)都得到明显的单一条带，说明酶纯化效果较好，可用于酶学性质分析的实验。

(5)普鲁兰酶亲本酶和突变酶的酶学性质研究

普鲁兰酶酶活的测定采用DNS法：取200μL含1％(W/V)普鲁兰糖或可溶性淀粉缓冲溶液(50mmol/L磷酸钠缓冲液，pH5.5)于冰上浴预冷5min后，用排枪分装入96孔反应板，加入20μL适当倍数稀释酶液，在最适温度下准确反应10min(以沸水灭活的酶10min为空白对照)，加入200μLDNS终止反应，然后沸水浴5min使充分显色，再置冷水中冷却，经过适当的稀释，用酶标仪检测其OD₅₂₀值，计算酶的活力。

酶活力单位定义：在最适反应温度及最适pH条件下，每min生成1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位(1U)。

以普鲁兰糖为底物，配制含有同一底物浓度的不同pH值的缓冲液在(pH值3.0～10.0之间，pH3.0～6.0为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH6.0～8.0为磷酸盐缓冲液，pH8.5～9.0为Tris-盐酸缓冲液，pH9.5～10.0为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)，按前述的方法测定不同pH对普鲁兰酶的活力的影响，相对活力最高的pH即为该酶的最适pH。

在最适pH条件下，以普鲁兰糖为底物，用薄壁96孔反应板分装100μL的反应液，采用梯度PCR仪将酶反应的温度控制在50℃～75℃之间，在不同的温度条件下，用DNS法测定产物的生成量，以确定酶的最适反应温度。如图2所示，突变酶最适温度是62.5℃，比亲本酶的提高2.5℃。

(6)普鲁兰酶突变体对水解普鲁兰糖的影响

将5.0mL含4％(W/V)普鲁兰糖的缓冲溶液(50mmol/L磷酸钠缓冲液，pH5.5)分装于10.0mL玻璃试管，分别加入等摩尔量的纯酶(亲本酶或突变体酶)，在60.0℃最适温度下水浴反应60min(以沸水灭活的酶10min为空白对照)，在不同时间分别取200μL的反应混合液，加入200μLDNS终止反应，按DNS法分别检测亲本酶和突变体酶水解普鲁兰糖生成麦芽三糖的效率，并计算其相对活力。

如图2所示，突变普鲁兰酶对普鲁兰糖对普鲁兰糖的水解效率明显高于亲本酶，突变普鲁兰酶的酶活性是其亲本酶的1.36倍，可见突变体酶水解普鲁兰糖生产麦芽三糖，具有生产率更高，成本更低等优点，生产过程可实现连续化和自动化。

(7)普鲁兰酶突变体水解淀粉的研究

天然淀粉是直链淀粉与支链淀粉组成的混合物。支链淀粉通常是以α-1,4-糖苷键连接成一直链，直链上又可通过α-1,6-糖苷键形成侧链，由许多短链构成的高度分支树状形的高分子多糖。普鲁兰酶能专一切开支链淀粉侧链的α-1,6-糖苷键，形成一系列链长不一的直链淀粉，还可以将最小单位的支链分解，生成的直链淀粉更有利于糖化酶的水解，从面显著提高淀粉原料的利用率。在60℃淀粉水解过程中，当单一的添加适量的糖化酶DextrozymeDX反应20、40、60、80和100min时，分别有0.458、0.924、1.402、1.732和2.091g/L还原糖生成；在相同反应条件下，添加适量的普鲁兰酶亲本酶，分别有0.568、1.125、1.813、2.112和2.623g/L还原糖生成，水解效率均提高达25％；相同条件下，当添加等摩尔量的普鲁兰酶突变酶时，则分别有0.668、1.389、1.402、2.361和2.914g/L还原糖生成，水解效率均提高达40％，可见普鲁兰酶突变体比其亲本酶对淀粉有更好的水解效率。

(8)重组枯芽孢杆菌的构建和普鲁兰酶的生产

将该普鲁兰酶突变体基因，以同源重组的方式整合到枯草芽孢杆菌WB600或WB800染色体中构建整合型重组枯草芽孢杆菌，在基本培养基中稳定地发酵生产普鲁兰酶，具体步骤是按照本公司即南宁邦尔克生物技术有限责任公司开发的专利技术进行(中国专利，201310174694.6，一种高效表达重组普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌及其获得方法)。

本发明是运用生物信息学和分子生物学的理论和手段，改良的长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体表达量是其亲本酶表达量的3.8倍，最适温度提高2.5℃，催化活性是亲本酶的1.36倍，该普鲁兰酶突变体基因构建的整合型重组枯草芽孢杆菌，在基本培养基中稳定地发酵生产普鲁兰酶，其技术成果有利于降低普鲁兰酶的生产成本和扩大其应用领域，使其更适合于工业化生产和应用，因此具有重要的经济价值和科研参考意义。

应该理解的是，对本领域的研究人员来说，根据上述说明加以改进或变换，例如，所述的野生型普鲁兰酶除了来源于长野芽孢杆菌之外，还可以来源于产气气杆菌、芽孢杆菌属、放线菌、酸假孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、克雷伯氏菌、Bacillusacidopullulyticus、Thermusthermophilus和Bacillusderamificans等菌株。所述的载体适于在地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母等宿主中表达，也可通过电转化法、原生质体转化法和同源整合等方法将本发明的普鲁兰酶突变体基因转入原核或者真核宿主中，以实现普鲁兰酶突变体的表达。或者通过酶工程技术对同一位点的氨基酸残基进行替换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (6)

1.一种长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体基因pulB-d99-D436H，其特征在于,其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的普鲁兰酶突变体基因pulB-d99-D436H编码的蛋白质，其特征在于,由827个氨基酸组成，分子量为90kDa，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

3.一种宿主细胞，其特征在于,其用途是普鲁兰酶突变体基因的转化和整合表达的原核细胞或真核细胞。

4.根据权利要求3所述的宿主细胞,其特征在于,所述的原核细胞为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB600或WB800。

5.一种重组普鲁兰酶的生产方法，其特征在于，利用权利要求4所述的宿主细胞进行常规发酵生产普鲁兰酶。

6.根据权利要求2所述的普鲁兰酶突变体基因pulB-d99-D436H编码的蛋白质，在淀粉水解过程和含有淀粉材料处理过程中的应用，以及在普鲁兰糖水解生产麦芽三糖中的应用。