CN110914420A

CN110914420A - 一种降低环糊精对普鲁兰酶抑制作用的方法

Info

Publication number: CN110914420A
Application number: CN201880007987.6A
Authority: CN
Inventors: 金征宇; 柏玉香; 李晓晓
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-03-01
Filing date: 2018-07-05
Publication date: 2020-03-24
Anticipated expiration: 2038-07-05
Also published as: US11142752B2; CN110914420B; CN108384770A; US20190270976A1; WO2019165738A1; CN108384770B

Abstract

本发明公开了一种降低环糊精对普鲁兰酶抑制作用的方法，属于基因工程、酶工程或食品科学技术领域。本发明方法通过对普鲁兰酶与环糊精相互作用的关键氨基酸进行理性突变，制得普鲁兰酶突变体，以降低环糊精对普鲁兰酶的抑制作用，从而提高普鲁兰酶水解活力。本发明基于对酶与抑制剂晶体结构解析和不同来源酶的序列比对，找出普鲁兰酶与环糊精相互作用的位点，利用定点突变得到对环糊精敏感性降低的普鲁兰酶突变体，从而提高淀粉原料利用率及环糊精产率。

Description

一种降低环糊精对普鲁兰酶抑制作用的方法

技术领域

本发明涉及一种降低环糊精对普鲁兰酶抑制作用的方法，属于基因工程、酶工程或食品科学技术领域。

背景技术

普鲁兰酶(Pullulanase，EC 3.2.1.41)专一性的水解普鲁兰、可溶性淀粉、支链淀粉和相应低聚糖中的α-1，6糖苷键，生成短直链糊精。与其他淀粉酶的复配使用，可大大提高淀粉原料利用率，因此广泛应用于淀粉工业中。

在淀粉糖工业中，普鲁兰酶具有水解α-1，6糖苷键的作用，因此具有广阔的应用前景，可用于制备直链淀粉、麦芽糖、分支环糊精，与CGTase复配生产环糊精。在环糊精的生产过程中，以α-CD的生产为例，由于α-CGTase不能水解淀粉底物中的α-1，6键，单独使用α-CGTase生产α-CD时，转化率只有40％-60％。添加普鲁兰酶可以明显提高环糊精的转化率，但是普鲁兰酶容易受到环糊精的抑制，使得脱支反应与环化反应必须分开进行，造成生产周期长、资源浪费等问题。为了缩短生产周期，提高原料淀粉利用率，增大环糊精产量，采用普鲁兰酶与环糊精葡萄糖基转移酶复配“一锅法”生产环糊精，因此降低环糊精对普鲁兰酶的抑制成为亟待解决的问题。

Marshall J J、Iwamoto H、Iwamoto H等人从酶活、反应动力学等方面研究环糊精对普鲁兰酶的抑制作用，证实环糊精是普鲁兰酶的竞争性抑制剂。于博等人对环糊精对普鲁兰酶的抑制作用作了进一步的研究，在常规酶学性质表征的基础上，研究了环糊精对普鲁兰酶内源荧光及二级结构的影响，证明环糊精疏水性空腔与普鲁兰酶芳香族氨基酸之间的包合作用是环糊精抑制普鲁兰酶活性的内在驱动力。国内外的相关研究，仅着眼于环糊精与普鲁兰酶的相互作用研究，未提出具体有效的解决手段。

发明人前期通过不同来源的普鲁兰酶序列分析比对，来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis str.168)的普鲁兰酶(NCBI登录号：AF008220.1)与环糊精结合的晶体结构(PDB：2E8Z)已经发表，因此选取来源于枯草芽孢杆菌的普鲁兰酶为模板进行实验设计。本发明在对野生型普鲁兰酶及突变体进行表征之后，发现突变体可显著降低产物环糊精对其的抑制作用。抑制作用的降低，有利于提高淀粉原料利用率，增大环糊精产量，赋予环糊精生产更大的工业应用价值。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种降低环糊精对普鲁兰酶抑制作用的方法。本发明基于对酶与抑制剂晶体结构解析和不同来源酶的序列比对，找出普鲁兰酶与环糊精相互作用的位点，利用定点突变得到对环糊精敏感性降低的普鲁兰酶突变体，从而提高淀粉原料利用率及环糊精产率。

本发明的第一个目的是提供一种受环糊精抑制作用降低的普鲁兰酶。本发明通过对普鲁兰酶与环糊精相互作用的关键氨基酸进行理性突变，制得普鲁兰酶突变体，以降低环糊精对普鲁兰酶的抑制作用，从而提高普鲁兰酶水解活力。所述关键氨基酸为苯丙氨酸。

所述普鲁兰酶，其氨基酸序列包括：在母本氨基酸序列的基础上，将母本氨基酸序列上含有的

(序列如SEQ ID NO:1所示)中最后一位F(苯丙氨酸)进行突变后得到的氨基酸；其中X可以是任意天然存在的氨基酸。

在一种实施方式中，所述母本氨基酸序列是来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、Bacillus vireti、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、莫哈韦氏杆菌(Bacillus mojavensis)、Thermotogamaritima、嗜盐短杆菌([Brevibacterium]halotolerans)、Thermus sp.IM6501、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus FRI-35)、嗜盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)、Alteromonasmediterranea、Klebsiella pneumoniae、Thermotoga maritima、Escherichia coli、Enterobacter aerogenes、Bacillus tequilensis、Bacillus intestinalis、Bacillales、Bacillus licheniformis、Bacillus halotolerans中的任意一种的普鲁兰酶的氨基酸序列。

在一种实施方式中，所述母本氨基酸序列，是NCBI上登录号为WP_003229246.1(Bacillus subtilis)、WP_024026701.1(Bacillus vireti)、WP_010789532.1(Bacillusatrophaeus)、KZE96788.1(Geobacillus stearothermophilus)、WP_032731297.1(Bacillus mojavensis)、CAA04522.1(Thermotoga maritima)、OEC77647.1(Brevibacterium]halotolerans)、AAC15073.1(Thermus sp.IM6501)、AFQ12130.1(Bacillus cereus FRI-35)、WP_106020274.1(Bacillus halotolerans)中的任意一种。

在一种实施方式中，所述普鲁兰酶的氨基酸序列包括以下任意一段氨基酸序列：

(1)将来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis str.168)的普鲁兰酶氨基酸序列的第476位的氨基酸苯丙氨酸发生突变后得到的氨基酸序列；

(2)将来源于Bacillus vireti的普鲁兰酶氨基酸序列的第476位的氨基酸苯丙氨酸发生突变后得到的氨基酸序列；

(3)将来源于萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)的普鲁兰酶氨基酸序列的第476位的氨基酸苯丙氨酸发生突变后得到的氨基酸序列；

(4)将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的普鲁兰酶氨基酸序列的第481位的氨基酸苯丙氨酸发生突变后得到的氨基酸序列；

(5)将来源于莫哈韦氏杆菌(Bacillus mojavensis)的普鲁兰酶氨基酸序列的第476位的氨基酸苯丙氨酸发生突变后得到的氨基酸序列；

(6)将来源于Thermotoga maritima的普鲁兰酶氨基酸序列的第601位的氨基酸苯丙氨酸发生突变后得到的氨基酸序列；

(7)将来源于嗜盐短杆菌([Brevibacterium]halotolerans)的普鲁兰酶氨基酸序列的第478位的氨基酸苯丙氨酸发生突变后得到的氨基酸序列；

(8)将来源于Thermus sp.IM6501的普鲁兰酶氨基酸序列的第481位的氨基酸苯丙氨酸发生突变后得到的氨基酸序列；

(9)将来源于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus FRI-35)的普鲁兰酶氨基酸序列的第613位的氨基酸苯丙氨酸发生突变后得到的氨基酸序列；

(10)将来源于嗜盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)的普鲁兰酶氨基酸序列的第476位的氨基酸苯丙氨酸发生突变后得到的氨基酸序列。

在一种实施方式中，所述母本氨基酸序列是来源于Bacillus subtilis str.168的普鲁兰酶氨基酸序列，序列如SEQ ID NO:2所示。

在一种实施方式中，所述环糊精为α-CD、β-CD、γ-CD中的一种或多种。

在一种实施方式中，发生突变的所述氨基酸苯丙氨酸是突变成如下氨基酸中的任意一种：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸。

本发明的第二个目的是提供编码所述普鲁兰酶的核苷酸。

本发明的第三个目的是提供含有所述核苷酸的载体或者细胞。

在一种实施方式中，所述载体可以是PMC系列、pET系列或pGEX系列质粒中的一种。

在一种实施方式中，所述细胞可以是以革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌或真菌为宿主菌构建得到的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母菌。

本发明的第四个目的是提供一种降低环糊精对普鲁兰酶抑制作用的方法，所述方法通过对普鲁兰酶与环糊精相互作用的关键氨基酸进行理性突变，制得普鲁兰酶突变体，以降低环糊精对普鲁兰酶的抑制作用，从而提高普鲁兰酶水解活力。

所述方法是对母本普鲁兰酶进行突变；突变后的普鲁兰酶，其氨基酸序列包括：在母本氨基酸序列的基础上，将母本氨基酸序列上的FNDXXRDXXXGXXF中最后一位F(苯丙氨酸)进行突变后得到的氨基酸；其中X可以是任意天然存在的氨基酸。

在一种实施方式中，所述突变的具体过程为：

(1)以普鲁兰酶基因为模板，选用质粒，构建表达载体，制得携带普鲁兰酶基因的质粒；所述质粒为PMC系列、pET系列或pGEX系列中的一种。

(2)晶体结构解析确定普鲁兰酶与环糊精结合的关键氨基酸位点；

(3)设计关键氨基酸的突变引物，以携带普鲁兰酶基因的质粒为模板进行突变，制得突变后的质粒；

(4)将突变后的质粒转入宿主菌，选取阳性单克隆发酵培养，得到普鲁兰酶突变体粗酶，经过分离纯化，制得所述普鲁兰酶突变体纯酶。

在一种实施方式中，步骤(4)中所述分离纯化的方法为亲和层析法、疏水层析法、超滤层析法或凝胶过滤层析法。

本发明有益的技术效果在于：

本发明通过对不同来源的普鲁兰酶的序列比对，以已知晶体结构的普鲁兰酶为模板，晶体结构解析得到与抑制作用相关的氨基酸，且此关键氨基酸高度保守。基于以上，构建表达载体，设计突变引物，利用定点突变得到普鲁兰酶突变体，研究环糊精对突变体的抑制作用。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌普鲁兰酶与环糊精晶体结构局部示意图；

图2为质粒构建的过程示意图；

图3为环糊精对野生型与枯草芽孢杆菌普鲁兰酶F476G突变体抑制作用的酶活表征；

图4为环糊精对野生型与枯草芽孢杆菌普鲁兰酶F476D突变体抑制作用的酶活表征。

具体实施方案

1、镍亲和层析步骤：

①平衡：用20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH7.5的缓冲液平衡镍柱；

②上样：预处理的样品以1mL/min的流速上样；

③清洗：用20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH7.5的缓冲液清洗杂蛋白；

④洗脱：用20mM Tris-HCl，500mM NaCl，300mM咪唑，pH7.5的缓冲液洗脱目的蛋白，检测波长为280nm，收集含普鲁兰酶活性的洗脱液，即得到突变体F476G的纯化酶。

2、普鲁兰酶酶活测定：

采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS)。普鲁兰酶在一定的条件下催化水解普鲁兰多糖生成还原糖，3,5-二硝基水杨酸与还原糖在热条件下还原生成棕红色氨基络合物，在一定范围内颜色深浅与还原糖量成正比，可在540nm波长下测定，计算酶活。酶活单位定义：每分钟催化产生相当于1μmol葡萄糖还原力的还原糖的酶量定义为一个活力单位。

3、酶活测定步骤：

A.预热：取1mL 1％的普鲁兰多糖溶液(pH 6.0)和0.1mL pH6.0的缓冲液于离心管中，置于40℃的水浴上保温10min；

B.反应：加入0.1mL(10U)的酶液，震荡混匀，准确计时30min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水浴10min，立即冷却。

C.测量：在540nm条件下测吸光值并计算活力。

酶活表征抑制作用的降低

A.预热：取1mL 1％的普鲁兰多糖溶液(pH 6.0)和0.1mL 10mM的环糊精于离心管中，置于40℃的水浴上保温10min；

C.测量：在540nm条件下测吸光值并计算活力。

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

实施例1

一种对普鲁兰酶的关键氨基酸进行理性突变及突变效果分析，包括如下步骤：

一、找出与抑制作用相关的关键氨基酸

解析来源于枯草芽孢杆菌普鲁兰酶的晶体结构，找出与抑制作用相关的关键氨基酸F476，此氨基酸与环糊精在结构上存在包合关系；通过不同来源普鲁兰酶基因序列比对，得出此关键氨基酸在普鲁兰酶序列中高度保守。

图1为枯草芽孢杆菌普鲁兰酶与环糊精复合物晶体结构局部示意图。从图中可以看出，普鲁兰酶中476位的苯丙氨酸与环糊精空腔之间存在类似包合作用，此包合作用基于苯丙氨酸的苯环与环糊精疏水性空腔之间的疏水相互作用。

二、母本氨基酸序列/核苷酸序列的获取

(1)以已知环糊精与普鲁兰酶相互作用的晶体结构的来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis str.168)的普鲁兰酶(PDB：2E8Z)为模板，其在NCBI上的登录号为CAB14971.2，采用化学全合成的方法合成普鲁兰酶基因序列AmyX。用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET20b(+)，带有T7启动子。

(2)将pET20b(+)质粒和含有AmyX基因的质粒分别进行NcoI和BamI双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶连接，连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，37℃培养8-12h，挑取转化子至含100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中震荡培养，提取质粒，酶切验证得到AmyX/Pet20b(+)表达载体。

(3)将质粒AmyX/Pet20b(+)转化进E.coli BL21(DE3)宿主菌，涂布到含氨苄青霉素(100mg/mL)的LB平板上，37℃培养8h，命名为AmyX/Pet20b(+)/BL21(DE3)。挑取单菌落至液体LB培养基中，37℃过夜培养，用甘油保存菌种。

图2为质粒构建过程示意图。选取pET-20b(+)质粒，选取BamHI和NcoI酶切位点，将普鲁兰酶连接在质粒上，构建AmyX/pET-20b(+)表达载体。

三、普鲁兰酶突变体的构建、表达与纯化

(1)设计突变引物，将476位点的苯丙氨酸(F)突变为甘氨酸(G)，突变引物如下表1所示；

表1

注：下划线为突变碱基

利用PCR进行定点突变，PCR反应体系为：5×Primer STAR GXL Buffer，10μL；dNTPMixture(2.5mM)，4μL；正向引物F476G-For(10μM)，1.5μL；反向引物F476G-Rev(10μM)，1.5μL；模板DNA(10ng/μL)，1μL；Prime STAR GXL DNA Polymerase(1.25μ/μL)，1μL，加入双蒸水至50μL。PCR扩增条件为：98℃预变性3min，随后进行30个循环(98℃ 20s，60℃ 30s，68℃ 6min)，68℃继续延伸10min。

PCR产物经Dpn I(Thermo Fisher公司)消化，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，感受态细胞在LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)过夜培养，挑取单克隆于LB液体培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素)培养，提取质粒，测序正确的质粒转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)。

(2)挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的阳性单克隆于LB液体培养基(含100μg/mL)，37℃，200rpm培养8-12h，接种量5％，接种至TB培养基(含100μg/mL的氨苄青霉素)；37℃，200rpm培养至OD＝0.6，加入终浓度0.2mM的IPTG，25℃,160rpm诱导表达96h，将发酵液4℃，10000g离心10Min，收集上清液。

(3)将发酵上清液用10kDa的超滤离心管，4000g离心10Min，初步浓缩分离。将浓缩的发酵液过0.22μm滤膜，用镍亲和层析纯化，整个纯化过程在低温条件下进行。

四、普鲁兰酶突变体的性能分析

抑制作用比较，实验结果列于图3。将突变体F476G与野生型纯酶相比，可以发现：三种环糊精对突变体普鲁兰酶的抑制作用比野生型普鲁兰酶显著降低，达到了降低环糊精对普鲁兰酶抑制的效果。其中，有抑制剂α-CD时，野生型纯酶的比酶活下降率为14.3％，而突变体F476G的比酶活下降率为10.6％；有抑制剂β-CD时，野生型纯酶的比酶活下降率为42.8％，而突变体F476G的比酶活下降率为17.1％；有抑制剂γ-CD时，野生型纯酶的比酶活下降率为7.1％，而突变体F476G的比酶活下降率为17.6％。

实施例2

采用与实施例1类似的方法，重新设计突变引物，在枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis str.168)来源的普鲁兰酶的母本基础上将第476位的F氨基酸突变成其他氨基酸并进行表达与纯化。

其中，设计突变引物，将476位点的苯丙氨酸(F)突变为天冬氨酸(D)，构建新的突变体F476D，突变引物如下表2所示；

表2

注：下划线为突变碱基。

比较分析了三种环糊精对野生酶和突变体F476D的抑制作用，实验结果列于图4。将突变体与野生型纯酶相比，可以发现：三种环糊精对突变体普鲁兰酶的抑制作用比野生型普鲁兰酶显著降低，达到了降低环糊精对普鲁兰酶抑制的效果。其中，有抑制剂α-CD时，野生型纯酶的比酶活下降率为14.3％，而突变体F476D的比酶活下降率为5.6％；有抑制剂β-CD时，野生型纯酶的比酶活下降率为42.8％，而突变体F476D的比酶活下降率为11.1％；有抑制剂γ-CD时，野生型纯酶的比酶活下降率为17.1％，而突变体F476D的比酶活下降率为11.0％。

基于实施例1类似的方法，发明人以来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisstr.168)的普鲁兰酶(PDB：2E8Z)为模板，对其第476位的氨基酸进行突变，还构建得到了突变体F476I、F476M、F476V、F476C、F476A，结果如表3所示。

表3不同突变体受环糊精的抑制情况

实施例3：

发明人比较了40种不同来源的普鲁兰酶的序列，发现序列中

(序列如SEQID NO:1所示，其中X可以是任意天然存在的氨基酸)中的非X部分的氨基酸(即加粗的氨基酸)都是高度保守的，其中

中最后一位F(苯丙氨酸)对应的是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis str.168)来源的普鲁兰酶氨基酸序列的第476位的苯丙氨酸。

其中，这40种不同来源的普鲁兰酶的序列，在NCBI上的登录号分别为：WP_003229246.1(Bacillus subtilis)、WP_024026701.1(Bacillus vireti)、WP_010789532.1(Bacillus atrophaeus)、KZE96788.1(Geobacillus stearothermophilus)、WP_032731297.1(Bacillus mojavensis)、CAA04522.1(Thermotoga maritima)、OEC77647.1([Brevibacterium]halotolerans)、AAC15073.1(Thermus sp.IM6501)、AFQ12130.1(Bacillus cereus FRI-35)、WP_106020274.1(Bacillus halotolerans)、AMJ80567.1(Alteromonas mediterranea)、AFU74026.1(Klebsiella pneumoniae)、CAA04522.1(Thermotoga maritima MSB8)、OWC08995.1(Escherichia coli)、AAA25124.1(Enterobacter aerogenes)、WP_010789532.1(Bacillus atrophaeus)、WP_032731297.1(Bacillus mojavensis)、WP_095714534.1(Bacillus sp.7705b)、WP_024714639.1(Bacillus tequilensis)、WP_079288107.1(Bacillus intestinalis)、WP_014114809.1(Bacillales)、KFI03882.1(Bacillus sp.BSC154)、WP_075747083.1(Bacilluslicheniformis)、WP_069840139.1(Bacillus sp.F56)、WP_014665024.1(Bacillussp.JS)、WP_071577010.1(Bacillus sp.FMQ74)、WP_103749897.1(Bacillus sp.MBGLi97)、WP_095432444.1(Bacillus sp.X2(2017))、OTQ82147.1(Bacillus subtilissubsp.subtilis)、WP_046160744.1(Bacillus sp.CMAA 1185)、WP_103803268.1(Bacillussp.Ru63)、WP_059291821.1(Bacillus halotolerans)、WP_059335607.1(Bacillushalotolerans)、WP_069150087.1(Bacillus subtilis)、KFF55698.1(Bacillussubtilis)、PTU26911.1(Bacillus subtilis)、WP_061670344.1(Bacillus atrophaeus)、WP_106293419.1(Bacillus halotolerans)、WP_099043342.1(Bacillus halotolerans)、WP_103748328.1(Bacillus subtilis)。

下面列举出了其中10种不同来源的普鲁兰酶的序列对应的特定氨基酸片段

(FNDXXRDXXXGXXF)。

表4

通过比对可以看出，与本发明使用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisstr.168)的普鲁兰酶(PDB：2E8Z)的第476位的苯丙氨酸对应的位点，在不同来源的普鲁兰酶中高度保守。

在此基础上，对来自于嗜热脂肪芽孢杆菌第481位的苯丙氨酸、嗜盐短杆菌第478位苯丙氨酸、嗜盐芽孢杆菌第476位苯丙氨酸进行突变，得到的突变体及突变后的效果如下表所示，可以得出此关键氨基酸位点对不同来源的普鲁兰酶适用。

表5

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种降低环糊精对普鲁兰酶抑制作用的方法

<150> CN201810170134.6

<151> 2018-03-01

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(5)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(10)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(13)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 1

Phe Asn Asp Xaa Xaa Arg Asp Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Phe

1 5 10

<210> 2

<211> 718

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Val Ser Ile Arg Arg Ser Phe Glu Ala Tyr Val Asp Asp Met Asn

1 5 10 15

Ile Ile Thr Val Leu Ile Pro Ala Glu Gln Lys Glu Ile Met Thr Pro

20 25 30

Pro Phe Arg Leu Glu Thr Glu Ile Thr Asp Phe Pro Leu Ala Val Arg

35 40 45

Glu Glu Tyr Ser Leu Glu Ala Lys Tyr Lys Tyr Val Cys Val Ser Asp

50 55 60

His Pro Val Thr Phe Gly Lys Ile His Cys Val Arg Ala Ser Ser Gly

65 70 75 80

His Lys Thr Asp Leu Gln Ile Gly Ala Val Ile Arg Thr Ala Ala Phe

85 90 95

Asp Asp Glu Phe Tyr Tyr Asp Gly Glu Leu Gly Ala Val Tyr Thr Ala

100 105 110

Asp His Thr Val Phe Lys Val Trp Ala Pro Ala Ala Thr Ser Ala Ala

115 120 125

Val Lys Leu Ser His Pro Asn Lys Ser Gly Arg Thr Phe Gln Met Thr

130 135 140

Arg Leu Glu Lys Gly Val Tyr Ala Val Thr Val Thr Gly Asp Leu His

145 150 155 160

Gly Tyr Glu Tyr Leu Phe Cys Ile Cys Asn Asn Ser Glu Trp Met Glu

165 170 175

Thr Val Asp Gln Tyr Ala Lys Ala Val Thr Val Asn Gly Glu Lys Gly

180 185 190

Val Val Leu Arg Pro Asp Gln Met Lys Trp Thr Ala Pro Leu Lys Pro

195 200 205

Phe Ser His Pro Val Asp Ala Val Ile Tyr Glu Thr His Leu Arg Asp

210 215 220

Phe Ser Ile His Glu Asn Ser Gly Met Ile Asn Lys Gly Lys Tyr Leu

225 230 235 240

Ala Leu Thr Glu Thr Asp Thr Gln Thr Ala Asn Gly Ser Ser Ser Gly

245 250 255

Leu Ala Tyr Val Lys Glu Leu Gly Val Thr His Val Glu Leu Leu Pro

260 265 270

Val Asn Asp Phe Ala Gly Val Asp Glu Glu Lys Pro Leu Asp Ala Tyr

275 280 285

Asn Trp Gly Tyr Asn Pro Leu His Phe Phe Ala Pro Glu Gly Ser Tyr

290 295 300

Ala Ser Asn Pro His Asp Pro Gln Thr Arg Lys Thr Glu Leu Lys Gln

305 310 315 320

Met Ile Asn Thr Leu His Gln His Gly Leu Arg Val Ile Leu Asp Val

325 330 335

Val Phe Asn His Val Tyr Lys Arg Glu Asn Ser Pro Phe Glu Lys Thr

340 345 350

Val Pro Gly Tyr Phe Phe Arg His Asp Glu Cys Gly Met Pro Ser Asn

355 360 365

Gly Thr Gly Val Gly Asn Asp Ile Ala Ser Glu Arg Arg Met Ala Arg

370 375 380

Lys Phe Ile Ala Asp Cys Val Val Tyr Trp Leu Glu Glu Tyr Asn Val

385 390 395 400

Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Leu Gly Ile Leu Asp Ile Asp Thr Val

405 410 415

Leu Tyr Met Lys Glu Lys Ala Thr Lys Ala Lys Pro Gly Ile Leu Leu

420 425 430

Phe Gly Glu Gly Trp Asp Leu Ala Thr Pro Leu Pro His Glu Gln Lys

435 440 445

Ala Ala Leu Ala Asn Ala Pro Arg Met Pro Gly Ile Gly Phe Phe Asn

450 455 460

Asp Met Phe Arg Asp Ala Val Lys Gly Asn Thr Phe His Leu Lys Ala

465 470 475 480

Thr Gly Phe Ala Leu Gly Asn Gly Glu Ser Ala Gln Ala Val Met His

485 490 495

Gly Ile Ala Gly Ser Ser Gly Trp Lys Ala Leu Ala Pro Ile Val Pro

500 505 510

Glu Pro Ser Gln Ser Ile Asn Tyr Val Glu Ser His Asp Asn His Thr

515 520 525

Phe Trp Asp Lys Met Ser Phe Ala Leu Pro Gln Glu Asn Asp Ser Arg

530 535 540

Lys Arg Ser Arg Gln Arg Leu Ala Ala Ala Ile Ile Leu Leu Ala Gln

545 550 555 560

Gly Val Pro Phe Ile His Ser Gly Gln Glu Phe Phe Arg Thr Lys Gln

565 570 575

Gly Val Glu Asn Ser Tyr Gln Ser Ser Asp Ser Ile Asn Gln Leu Asp

580 585 590

Trp Asp Arg Arg Glu Thr Phe Lys Glu Asp Val His Tyr Ile Arg Arg

595 600 605

Leu Ile Ser Leu Arg Lys Ala His Pro Ala Phe Arg Leu Arg Ser Ala

610 615 620

Ala Asp Ile Gln Arg His Leu Glu Cys Leu Thr Leu Lys Glu His Leu

625 630 635 640

Ile Ala Tyr Arg Leu Tyr Asp Leu Asp Glu Val Asp Glu Trp Lys Asp

645 650 655

Ile Ile Val Ile His His Ala Ser Pro Asp Ser Val Glu Trp Arg Leu

660 665 670

Pro Asn Asp Ile Pro Tyr Arg Leu Leu Cys Asp Pro Ser Gly Phe Gln

675 680 685

Glu Asp Pro Thr Glu Ile Lys Lys Thr Val Ala Val Asn Gly Ile Gly

690 695 700

Thr Val Ile Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Leu Lys Ser Phe Ala

705 710 715

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgctgtaaaa gggaacaccg gtcaccttaa ggcaacaggg 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccctgttgcc ttaaggtgac cggtgttccc ttttacagcg 40

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccctgttgcc ttaaggtgat cggtgttccc ttttacagcg 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgctgtaaaa gggaacaccg atcaccttaa ggcaacaggg 40

<210> 7

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Phe Asn Asp Met Phe Arg Asp Ala Val Lys Gly Asn Thr Phe

1 5 10

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Phe Asn Asp Lys Phe Arg Asp Thr Ile Lys Gly Ser Thr Phe

1 5 10

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Phe Asn Asp Ser Phe Arg Asp Ala Val Lys Gly Ser Thr Phe

1 5 10

<210> 10

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Phe Asn Asp Arg Phe Arg Asp Ala Val Lys Gly Ser Thr Phe

1 5 10

<210> 11

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Phe Asn Asp Ser Phe Arg Asp Ala Val Lys Gly Asn Thr Phe

1 5 10

<210> 12

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Phe Asn Asp Glu Phe Arg Asp Ala Ile Arg Gly Ser Val Phe

1 5 10

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Phe Asn Asp Ser Phe Arg Asp Ala Val Lys Gly Asn Thr Phe

1 5 10

<210> 14

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Phe Asn Asp Arg Phe Arg Asp Ala Val Lys Gly Ser Thr Phe

1 5 10

<210> 15

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Phe Asn Asp Asn Ile Arg Asp Gly Leu Lys Gly Ser Val Phe

1 5 10

<210> 16

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 16

Phe Asn Asp Ser Phe Arg Asp Ala Val Lys Gly Asn Thr Phe

1 5 10

Claims

1.一种普鲁兰酶，其特征在于，所述普鲁兰酶的氨基酸序列包括，在母本氨基酸序列的基础上，将母本氨基酸序列上含有的FNDXXRDXXXGXXF中最后一位F(苯丙氨酸)进行突变后得到的氨基酸；其中X可以是任意天然存在的氨基酸；且环糊精对普鲁兰酶的抑制作用相对于母本显著降低。

2.根据权利要求1所述的普鲁兰酶，其特征在于，所述母本氨基酸序列是来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、Bacillus vireti、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、莫哈韦氏杆菌(Bacillusmojavensis)、Thermotoga maritima、嗜盐短杆菌([Brevibacterium]halotolerans)、Thermus sp.IM6501、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus FRI-35)、嗜盐芽孢杆菌(Bacillushalotolerans)、Alteromonas mediterranea、Klebsiella pneumoniae、Thermotogamaritima、Escherichia coli、Enterobacter aerogenes、Bacillus tequilensis、Bacillus intestinalis、Bacillales、Bacillus licheniformis、Bacillus halotolerans中的任意一种的普鲁兰酶的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的普鲁兰酶，其特征在于，所述普鲁兰酶的氨基酸序列包括以下任意一段氨基酸序列：

4.根据权利要求1所述的普鲁兰酶，其特征在于，所述母本氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.根据权利要求1～4任一所述的普鲁兰酶，其特征在于，所述环糊精为α-CD、β-CD、γ-CD中的一种或多种。

6.根据权利要求1～4任一所述的普鲁兰酶，其特征在于，所述最后一位F氨基酸苯丙氨酸是突变成如下氨基酸中的任意一种：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸。

7.编码权利要求1-6任一所述普鲁兰酶的核苷酸。

8.含有权利要求7所述核苷酸的载体或者细胞。

9.根据权利要求8所述的细胞，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母菌。

10.一种降低环糊精对普鲁兰酶抑制作用的方法，其特征在于，所述方法是对母本普鲁兰酶进行突变；其中，突变后的普鲁兰酶，其氨基酸序列包括，在母本氨基酸序列的基础上将母本氨基酸序列上含有的FNDXXRDXXXGXXF中最后一位F(苯丙氨酸)进行突变后得到的氨基酸；其中X可以是任意天然存在的氨基酸。