CN112626053B

CN112626053B - 一种酸性α淀粉酶及其制备方法与应用

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Publication number: CN112626053B
Application number: CN202011388025.5A
Authority: CN
Inventors: 张改云; 裴盛祥; 牛四文; 谢富全
Original assignee: China Ocean Mineral Resources R & D Association (china's Ocean Affairs Administration); Third Institute of Oceanography MNR
Current assignee: China Ocean Mineral Resources R & D Association (china's Ocean Affairs Administration); Third Institute of Oceanography MNR
Priority date: 2020-12-01
Filing date: 2020-12-01
Publication date: 2022-10-14
Anticipated expiration: 2040-12-01
Also published as: CN112626053A

Abstract

一种酸性α淀粉酶及其制备方法与应用，属于生物工程技术领域。所述酸性α淀粉酶的核苷酸序列如SEQ ID NO 1，氨基酸序列如SEQ ID NO 2。酸性α淀粉酶的制备方法：1)设计并合成扩增酸性α淀粉酶基因的引物；2)PCR扩增及重组质粒的构建；3)α淀粉酶的表达与纯化所述酸性α酶可在纺织、造纸、洗涤剂、发酵和食品工业中的应用。所述α淀粉酶具有较广的pH与温度适用范围，不仅能用于淀粉糖化、生产高麦芽糖浆、生产高葡萄糖浆等淀粉加工工业，同时由于其在高温酸性条件下具有较高的酶活，还可在洗涤剂工业、医疗、食品和饲料加工方面进行应用，从而拓宽α淀粉酶在工业生产中的应用范围。

Description

一种酸性α淀粉酶及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及采用基因工程手段的一种酸性α淀粉酶及其制备方法与应用。

背景技术

淀粉酶是催化淀粉和糖原水解产生多种产物的酶类总称，包括糊精、低聚糖、麦芽糖和少量葡萄糖等。基于酶促反应产生的糖的异构体类型，淀粉酶可以分为α-淀粉酶和β-淀粉酶；其中，α-淀粉酶属于内切型淀粉酶，可通过在随机位点切割α-1,4-葡萄糖苷键来分解长链碳水化合物。近年来，淀粉酶已完全取代了淀粉转化工业中用于淀粉水解的化学物质，并在酶中占有主要市场份额。具有优异性能的新型淀粉酶，特别是高温条件下具有稳定活性的酸性淀粉酶的发现，一直是科学和商业研究的重点。

酸性α-淀粉酶有别于中性α-淀粉酶，在低pH条件下仍然具有较好的酸稳定性。酸性α-淀粉酶是淀粉深加工业的福音，具有节约原材料，减少劳动力消耗和废弃物排放，简化加工工艺等优点。目前已有研究报道表示，大规模生产酸性α-淀粉酶的菌株多数均来自于微生物，曲霉和芽孢杆菌由于发酵周期相对较短，现被工业广泛使用。目前国内企业酸性α-淀粉酶的生产水平和应用性与国际领先水平仍具有很大的差距，国内一些商业化的酸性α-淀粉酶也大多数进口自国外企业。因此，产量多、活性好的酸性α-淀粉酶菌株的获得与对其酶活性质的改进，提高其耐酸性能等，对于酸性α-淀粉酶的商业化应用以及我国酶制剂的发展具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的上述不足，提供一种酸性α淀粉酶及其制备方法及产品。

所述酸性α淀粉酶的核苷酸序列如SEQ ID NO 1。

所述酸性α淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 2。

所述酸性α淀粉酶的最适温度为50℃，最适pH为5.0，最适盐度为0.5％NaCl,在酸性条件下具有较高的活性和良好的稳定性。

所述一种酸性α淀粉酶的制备方法，包括以下步骤：

1)设计并合成扩增酸性α淀粉酶基因的引物，其序列如下：

上游引物Amy2863F：

5’-GTGCCGCGCGGCAGCCATATGAGGCTCACCGACACCAGCG-3’

下游引物Amy2863R：

5’-TTGTCGACGGAGCTCGAATTCTCAGGCGATCCGCCGCTC-3’

2)PCR扩增及重组质粒的构建：

用Amy2863F和Amy2863R引物，以Microbacterium hydrothermale MCCC 1A05925的基因组DNA为模板进行扩增；PCR扩增的产物与经限制性内切酶Nde I和EcoR I酶切后pET-28a表达载体连接，将连接产物转化至大肠杆菌，PCR产物经限制性内切酶Nde I和EcoRI酶切后被连接到经同样限制性内切酶酶切的表达载体pET-28a上，将连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选含有α淀粉酶基因的重组质粒，并进行核酸电泳和测序验证。

3)α淀粉酶的表达与纯化

将含有α淀粉酶基因的重组质粒转化入大肠杆菌E.coli BL21，用低浓度IPTG低温诱导α淀粉酶蛋白表达，之后蛋白纯化得到α淀粉酶。纯化后的α淀粉酶比活力可达640U/mg。

在步骤2)中，所述PCR扩增的条件如下：95℃预变性3min；95℃15s，65℃15s，72℃90s，72℃5min,28个循环。

在步骤3)中，所述纯化采用Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化。

所述酸性α淀粉酶可在纺织、造纸、洗涤剂、发酵和食品工业中的应用。

所述酸性α淀粉酶可作为添加剂加入到清洗剂中，医院用的医疗器械在消毒灭菌前需要先清洗器械表面残留的有机物，如血块、粘液和蛋白等，以防残留物与微生物形成芽孢保护膜，影响消毒灭菌效果。相比于传统清洗剂，含酶清洗剂仅需较短的浸泡时间(5min)，就能快速将污物分解，脱离医疗器械表面。传统清洗剂在使用时需配合手工擦洗，不仅损伤器械，而且耗费时间，而含酶清洗剂使浸泡后的医疗器械便于清洗，减轻了劳动量。

所述酸性α淀粉酶可用于现代的洗涤行业中。早起的自动洗涤工艺较为简单粗犷，这就使得早起在瓷器和木质餐具的洗涤中容易损坏。在探索温和洗涤的工艺中发现，α-淀粉酶的加入可以使得洗涤工艺更加的温和及高效。本发明的酸性α酶可作为洗涤剂应用。

现代纺织产品的生产中为防止织物扯断必须在织物表面附着一层保护物质。由于淀粉成本较低，在大多数地区容易获得并且淀粉容易被去除，因此被广泛的应用于纺织行业中。应用本发明α-淀粉酶对纺织品退浆时，不仅纤维不会受到损害，而且淀粉被水解后的产物是水溶性的糊精和小分子糖，可以用水洗去，这使得淀粉退浆工艺简单易操作。

本发明的α淀粉酶具有较广的pH与温度适用范围，不仅能用于淀粉糖化、生产高麦芽糖浆、生产高葡萄糖浆等淀粉加工工业，同时由于其在高温酸性条件下具有较高的酶活，还可在洗涤剂工业、医疗、食品和饲料加工方面进行应用，从而拓宽α淀粉酶在工业生产中的应用范围。

附图说明

图1为表达载体的构建图谱；

图2为基因序列及蛋白序列；

图3为蛋白序列与其他同源序列的比对；

图4为基于氨基酸序列的与其他家族淀粉酶的系统发生分析；

图5为纯化后的α淀粉酶蛋白的SDS-PAGE电泳；

图6为不同温度对酶活力的影响；

图7为不同pH对酶活力的影响；

图8为不同盐度对酶活力的影响；

图9为酶在不同温度下的稳定性检测；

图10为酶在不同pH下的稳定性检测；

图11为不同金属离子和螯合剂对酶活力的影响；

图12为不同浓度变性剂对酶活力的影响；

图13为酶对不同底物水解作用的效果；

图14为酶反应时间的测定；

图15为酶的Lineweaver-Burk图；

图16为酶解产物的TLC分析结果；

图17为酶解产物的IC分析结果。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

所述酸性α淀粉酶的核苷酸序列如SEQ ID NO 1。氨基酸序列如SEQ ID NO 2。所述酸性α淀粉酶的最适温度为50℃，最适pH为5.0，最适盐度为0.5％NaCl,在酸性条件下具有较高的活性和良好的稳定性。

实施例1酸性α淀粉酶的制备：

实验材料：热液微杆菌Microbacterium hydrothermale MCCC 1A05925(由中国海洋微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为1A05925，可通过购买方式得到)，大肠杆菌E.coli DH5α和大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(购买自Takara公司)；限制性内切酶EcoR I、Nde I、表达载体pET-28a、

II、2×Phanta Max MasterMix(Vazyme公司)、LB培养基(每升含Tryptone 10g，Yeast Extract 5g,NaCl 10g)；结合缓冲液(500mM NaCl,20mM咪唑,20mM磷酸盐，pH7.4)；漂洗缓冲液(500mM NaCl,40mM咪唑,20mM磷酸盐，pH7.4)；洗脱缓冲液(500mM NaCl，500mM咪唑，20mM磷酸盐，pH7.4)；3，5-二硝基水杨酸(DNS)(购自上海生工)；卡那霉素(购自上海生工)；Ni Sepharose^TM6Fast Flow试剂盒(购自GE Healthcare公司)；0.22μm细菌过滤器(购自Merck公司)；35kDa超滤管(购自Merck公司)。本发明中使用的含卡那霉素的LB培养基，其卡那霉素浓度均为100μg/mL。

实验步骤：

(1)设计并合成扩增酸性α淀粉酶基因的引物，其序列如下：

上游引物Amy2863F：

5’-GTGCCGCGCGGCAGCCATATGAGGCTCACCGACACCAGCG-3’

下游引物Amy2863R：

5’-TTGTCGACGGAGCTCGAATTCTCAGGCGATCCGCCGCTC-3’

(2)PCR扩增及重组质粒的构建

以热液微杆菌(Microbacterium hydrothermale MCCC 1A05925)的基因组DNA为模板，使用2863F和2863R引物进行扩增。扩增体系如下，模板DNA 2μL，PCR MasterMix 25μL，2863F 2μL，2863R 2μL，ddH₂O 14μL。扩增条件：95℃预变性3min；95℃15s，65℃15s，72℃90s，72℃5min,28个循环。用限制性内切酶EcoR I和Nde I对回收的目的基因片段和pET-28a空载体进行双酶切，再用重组克隆试剂盒将目的基因与载体连接，将连接产物与受体菌E.coli DH5α感受态混合，冰上放置30min，42℃热激45s后，加入1mL LB液体培养基，37℃、220rpm复苏30min，离心后涂布于含卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养，筛选重组质粒，并对重组质粒进行电泳和测序验证。

(3)基因的诱导表达及粗酶液的制备

将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3)中，获得含有α淀粉酶基因的重组菌株。将重组菌株接种于5mL含卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养，取2mL过夜培养物按1:100接种于200mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入IPTG使其终浓度为0.1mM进行诱导，16℃、180rpm条件下继续培养8h，8000g离心5min收集菌体。将菌体重悬于10mL结合缓冲液中，加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL，冰上裂解1h后，超声破碎至菌体完全裂解，16000g离心30min，收集上清即得到粗酶液。

(4)酶的纯化

加入适量的Ni-NTA琼脂糖树脂到离心管中。离心管在3000rpm离心2min然后小心的去除上清。加入两倍柱体积的Binding/Wash Buffer将缓冲液和树脂完全混匀。离心管在3000rpm离心2min然后小心的去除上清。将蛋白提取物与Binding/Wash Buffer 1:1混匀，使混合液总体积相当于两倍树脂体积。将上步中的混合液加入树脂中，在旋转振荡器混匀30min，使混合液与树脂混匀。离心管在3000rpm离心2min，吸出上清，将上清留存进行下游分析。用两倍树脂体积的Binding/Wash Buffer清洗。离心管在3000rpm离心2min吸出上清，将上清留存进行下游分析。重复清洗步骤，用一倍树脂体积的Elution Buffer洗脱树脂上的组氨酸标签蛋白。离心管在3000rpm离心2min然后小心的吸出并保存上清。此步骤重复3次，每次的洗脱液分别保存。对洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测其纯度。

图1为表达载体的构建图谱；图2为基因序列及蛋白序列；图3为蛋白序列与其他同源序列的比对；图4为基于氨基酸序列的与其他家族淀粉酶的系统发生分析；图5为纯化后的α淀粉酶蛋白的SDS-PAGE电泳。

实施例2α-淀粉酶的酶学性质

(1)温度对淀粉酶活性的影响

取25μg(5μL)酶液用pH5.0的缓冲液定容至100μL，再加入300μL 1％的淀粉溶液(pH5.0)混合均匀，分别置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃恒温水浴锅反应10min,10000rpm离心2min,取100μL上清与150μL DNS溶液混合，立即置于沸水浴中煮沸10min，于OD₅₂₀测定溶液的吸光值。根据酶活定义计算不同温度下的酶活，以最大酶活作为100％，再计算其余温度下的相对酶活，确定淀粉酶的最适反应温度。结果表明，在pH5.0，0％的NaCl的条件下最适反应温度为50℃，酶在40～70℃范围内有具有良好的酶活力，其酶活力均保持在50％以上。随着温度的升高，其酶活力逐渐下降，在80℃的时候，该酶活力为剩余36.6％，结果见图6。

(2)pH对淀粉酶活性的影响

取25μg(5μL)酶液用不同pH的缓冲液定容至100μL，再加入300μL含1％淀粉的不同pH值的缓冲液(pH3、4、5、6、7、8、9、10、11)混合均匀，分别置于上述所测得最适温度下反应10min,10000rpm离心2min,取100μL上清与150μL DNS溶液混合，立即置于沸水浴中煮沸10min，于OD₅₂₀测定溶液的吸光值。根据酶活定义计算不同pH下的酶活，以最大酶活作为100％，再计算其余pH下的相对酶活，确定淀粉酶的最适反应pH。结果表明,酶的最适反应pH为5.0，酶在pH3～5范围内，其酶活力呈上升趋势，超过最适反应pH5.0后，酶活力逐渐下降，直至pH11,其酶活力降至最低，仅有18％。结果见图7。

(3)盐度对淀粉酶活性的影响

取25μg(5μL)酶液用不同盐度的缓冲液定容至100μL，再加入300μL含1％淀粉(最适pH)的不同盐度的缓冲液(NaCl浓度(w/v)0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％)混合均匀，分别置于上述所测得最适温度下反应10min,10000rpm离心2min,取100μL上清与150μL DNS溶液混合，立即置于沸水浴中煮沸10min，于OD₅₂₀测定溶液的吸光值。根据酶活定义计算不同盐度下的酶活，以最大酶活作为100％，再计算其余盐度下的相对酶活，确定淀粉酶的最适反应盐度。结果表明,酶的最适盐度为0.5％NaCl，其相对酶活会随着盐度的增加逐渐下降。酶在0～3％的NaCl范围内都具有较好的相对酶活，均在85％以上。结果见图8。

(4)淀粉酶热稳定性及pH稳定性的测定

取25μg(5μL)酶液用不同盐度的缓冲液定容至100μL后分别置于50℃、60℃、70℃下保温1h、3h、6h、9h、12h、24h。再与300μL含1％淀粉(最适pH和盐度)混合均匀，置于上述所测得最适温度下反应10min,10000rpm离心2min,取100μL上清与150μL DNS溶液混合，立即置于沸水浴中煮沸10min，于OD₅₂₀测定溶液的吸光值。根据酶活定义计算不同保温温度及保温时间下的剩余酶活，以上述最适反应条件下测的酶活作为100％，再计算其余条件下的相对酶活，确定淀粉酶的温度稳定性。结果表明,该酶具有良好的热稳定性，在不同的三个温度保温6h，其相对酶活仍保持在60％以上。随着保温时间的增加，酶活性逐渐下降。在保温的24h内，最适温度的相对酶活最大，在保温12h后，其剩余酶活量为35％。由此可以看出多功能α淀粉酶具有良好的热稳定性。结果见图9。

取25μg(5μL)酶液分别置于95μL不同pH的缓冲液中(pH3、4、5、6、7、8、9、10、11)，于30℃分别保温1h、3h、6h、9h、12h、24h。再与300μL含1％淀粉(最适pH和盐度)混合均匀，置于上述所测得最适温度下反应10min,10000rpm离心2min,取100μL上清与150μL DNS溶液混合，立即置于沸水浴中煮沸10min，于OD₅₂₀测定溶液的吸光值。根据酶活定义计算不同保温pH及保温时间下的剩余酶活，以上述最适反应条件下测的酶活作为100％，再计算其余条件下的相对酶活，确定淀粉酶的pH稳定性。结果表明，该酶pH稳定性效果不好，在碱性条件pH＝9保温6h后，其酶活基本丧失。但是在酸性条件下，其酶活效果相比碱性较好，其酶活在保温9h仍剩余10％的相对酶活力。结果见图10。

(5)金属离子、螯合剂及变性剂对淀粉酶活性的影响

取25μg(5μL)酶液分别置于95μL不同pH的缓冲液中，与300μL含1％淀粉底物作为反应体系，在反应体系中分别加入终浓度为1mM的金属离子和螯合剂(Al³⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、K⁺、Ba² ⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Pb²⁺、Fe²⁺、Ni⁺、Na⁺、Co²⁺、EDTA)，置于上述所测的最适合条件下反应10min,10000rpm离心2min,取100μL上清与150μL DNS溶液混合，立即置于沸水浴中煮沸10min，于OD₅₂₀测定溶液的吸光值。根据酶活定义计算不同金属离子及螯合剂下的剩余酶活，以不加金属离子和螯合剂的一组测的酶活作为对照，再计算其余条件下的相对酶活，确定金属离子、螯合剂对淀粉酶活性的影响。结果表明，Mg²、Fe²⁺、Ni⁺、Co²⁺四种金属离子对酶活有较强的促进作用，其相对酶活分别为109.19％、110.53％、109.51％、130.31％。Zn²⁺、Ni⁺和螯合剂(EDTA)酶活有较强的抑制作用，分别损失了22.58％、10.89％和41.98％的相对酶活。结果见图11。

取25μg(5μL)酶液分别置于不同浓度的变性剂中，即十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、Beta-巯基乙醇(Beta-Me)、尿素(Urea)、盐酸胍(Guanidine-HCl)、乙醇(Ethanol)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X100)、苯甲基磺酰氟(PMSF),再与含1％淀粉底物混合均匀。置于上述所测的最适合条件下反应10min,10000rpm离心2min,取100μL上清与150μL DNS溶液混合，立即置于沸水浴中煮沸10min，于OD₅₂₀测定溶液的吸光值。根据酶活定义计算不同变性剂下的剩余酶活，以不加变性剂的一组测的酶活作为对照，再计算其余条件下的相对酶活，确定变性剂对淀粉酶活性的影响。结果表明,终浓度较低的变性剂效果较高(Urea除外)。其中，终浓度为0.1M的PMSF和0.2M的Urea对Amy2863降解效率分别提高至105.22％和107.05％(相对酶活)。β-ME(0.5％)、SDS(0.2％)、GuanidineHCl(0.2M)对Amy2863的降解速率有明显的抑制效果，使其相对酶活降至67.72％、49.28％和56.77％。结果见图12。

(6)作用底物种类对淀粉酶活性的影响

取25μg(5μL)酶液用pH 5.0的缓冲液定容至100μL分别与300μL含1％羧甲基纤维素钠、1％果胶、1％海藻糖、1％淀粉琼脂糖、1％植物凝胶、1％卡拉胶作为反应底物混合均与，置于上述测得的最适反应条件下反应10min,10000rpm离心2min,取100μL上清与150μLDNS溶液混合，立即置于沸水浴中煮沸10min，于OD₅₂₀测定溶液的吸光值。根据酶活定义计算不作用底物下的酶活，以最大酶活作为100％，再计算其余条件下的相对酶活，确定不同底物对淀粉酶活性的影响。结果表明，该酶不仅可以高效的降解淀粉酶，而且还具有降解其他底物的功能。其中，对果胶、植物凝胶的降解效率较高，分别为72.45％与68.81％。除此之外，其对纤维素钠、海藻糖、琼脂糖和卡拉胶的降解速率分别为20.86％、20.73％、21.5％和34.28％。说明该酶具有较为广泛的底物降解能力。结果见图13。

(7)反应时间的确定

以1％的淀粉为底物，测定淀粉酶的反应速率。分别配置6个反应体系，以统一管稀释后的酶液进行实验，严格控制反应时间，依次在酶反应0min、1min、2min、3min、4min、5min时加入DNS终止反应，并在沸水浴中加热10min显色，于OD₅₂₀测定溶液的吸光值，计算反应体系还原糖的含量。若还原糖含量与反应时间呈线性关系，则在此时间内酶促反应可视为一级反应，可以据此来作为K_m和V_max的测定时间。结果表明，在5min以内，还原糖含量随着反应时间呈线性关系。因此，后续测定K_m与V_max值时可以用相同酶量，并以5min作为反应时间进行米氏常数的测定。结果见图14。

(8)动力学参数K_m和V_max的测定

在上述所测最适反应条件下，以4min作为反应时间，加入过量的酶液，分别与300μl含0.2％淀粉、0.4％淀粉、0.6％淀粉、0.8％淀粉、1％淀粉作为底物进行反应。以底物浓度的倒数为横坐标，反应速率的倒数为纵坐标，利用Lineweaver-Burk法作图，并根据线性回归方程计算出酶的K_m和V_max值。结果表明，淀粉酶的浓度在1mg/mL以下时，酶活力随底物浓度的增加而呈线性增加。酶促反应的动力学参数是K_m，代表酶与底物的亲和力，K_m值越小代表酶与底物亲和力越大。R₂代表回归线的拟合程度，R₂越接近1表示拟合程度越好。根据线性回归线可计算出Amy2863的K_m值为0.2mg/mL，V_max为16.1μmol/L*min，K_cat＝2.19min^-1，K_cat/K_m＝0.18s^-1*ml/mg，R²＝0.9996，R²值接近1，表明该结果准确性高。结果见图15。

(9)α-淀粉酶活性测定方法

在3支5mL试管中各加入1％淀粉溶液(pH5.0)3.0mL，酶液1.0mL,于50℃水浴中糖化10min，10000rpm离心2min,取1mL上清与1.5mL 3，5-二硝基水杨酸显色液混合后，立即于沸水浴中煮沸10min。以空白管调零，在520nm处测OD值。用DNS法测得反应体系中还原糖的浓度来表示纯酶的酶活，每组实验设3个重复。1个酶活力单位(U)定义为在50℃条件下，1min内催化产生1μmol还原糖所需的酶量。

(10)淀粉酶酶解产物的分析

1.采用薄层层析法(TLC)分析酶解产物，取5mg(1mL)淀粉酶与1mL含1％淀粉底物(pH5.0)混合，放入摇床30℃，150rpm反应，分别于0.5h、1h、2h、4h、6h、12h、24h取反应物，放入100℃沸水浴中灭活5min,离心取上清。以麦芽二糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、葡萄糖为标准品，分别取2ul标准品和七个时间点的反应物用毛细血管点在薄层层析板上，吹干后置于展层缸中(正丁醇︰乙酸︰水＝3︰1︰1)。待液面迁移至顶端1cm边缘时取出层析板，用吹风机将其吹干后，再放入展层缸中再次展开一次。展层结束后，将展层板浸泡在10％H₂SO₄溶液中约半分钟，放置于130℃烘箱内加热5min显色。显色后，对应标准品的层析结果分析不同时间点的酶解产物。

结果表明，如图16，在酶解反应的5短时间5min内，Amy2863将淀粉降解为葡萄糖。在随后的10min～12h内，酶解产物依旧为葡萄糖，没有其他产物的产生，可得Amy2863降解淀粉酶的最终产物为葡萄糖。

2.通过离子色谱法(IC)检测酶解产物，将上述不同时间点酶解得到的中产物进行乙醇沉淀，离心浓缩后，根据测得的还原糖的含量进行稀释。将标准品和反应终产物分别用超纯水稀释至20mg/mL，用0.22μm的水性滤膜针头滤器过滤后进行离子色谱检测，检测条件如下：

色谱柱：Dionex CarboPac PA-100阴离子交换柱，其中包括分析柱(4×250mm)和保护柱(4×50mm)。

流动相：NaOH(100mM)和NaAc(150mM)。

流速为0.25mL/min。

柱温：25℃。

进样体积：25μL。

检测条件：脉冲安培检测器，采用四电位脉冲安培检测法检测。

结果表明：如图17所示，通过比对葡萄糖和麦芽糖标准品(麦芽糖二糖)与酶解产物的出峰时间及峰面积，可以进一步确定Amy2863的酶解产物为葡萄糖。

本发明以热液微杆菌Microbacterium hydrothermale MCCC 1A05925的基因组DNA为模板，设计并合成扩增引物，通过PCR扩增酸性α淀粉酶基因，将该基因克隆至pET-28a表达载体上，在大肠杆菌E.coli DH5α中克隆，随后转入至E.coli BL21中进行诱导表达，采用Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化得到高纯度的重组酸性α-淀粉酶。该酸性α-淀粉酶具有宽泛的pH和温度范围，其最适pH 4.0，最适温度50℃，活性不依赖于钙离子,在酸性条件下具有良好的活性和耐热性。该酶的最适底物为淀粉，并且对不同种类的底物同时也具有水解功能，显示该酶可通过切割α-1,4-葡萄糖苷键来分解长链碳水化合物的多功能性。通过薄层层析法(TLC)和离子色谱法(IC)分析，该酶的最终水解产物为葡萄糖。该酶是对钙离子没有依赖性的耐酸性α-淀粉酶，与多数酸性α-淀粉酶相比，其在发酵周期(8h)和酶活性方面具有更大的优势，拥有良好的应用前景。

序列表

<110> 自然资源部第三海洋研究所；中国大洋矿产资源研究开发协会（中国大洋事务管理局）

<120> 一种酸性α淀粉酶及其制备方法与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1677

<212> DNA

<213> Microbacterium hydrothermale

<400> 1

gtgaggctca ccgacaccag cgacctgtgg tggaagaccg ccgtcttcta caacctcgac 60

gtcaagacgt acctggatgc cgacgacgac ggcgtgggcg acctgcgcgg tctcgcgcag 120

cggctcgacc acctcgcgga gctcggcgtg acgtgcctct ggctcgcccc gttctacccc 180

tcgccgcagc gcgacaacgg ctacgacatc gaggactact acggcgtcga cccccgctac 240

ggttcgctcg gcgacatggt cgaggtgctg cgcacggccc acgaccgcgg gatgcgcgtg 300

atcgtcgacc tcgtcgtgaa tcacacctcc gatcggcatc cgtggttcca gcaggcgcgg 360

cagagccccg acagccgcta ccggcacttc taccagtgga gcgacgaggt gcccgacgac 420

gccccggcga gcatgttccc cgacgtcgag aacggggtct ggttcttcga cgagaccgcg 480

gggcagtact acaagcactc cttctaccgg catcagcccg acctcgccac cgatcacccc 540

gaggtgcgcg aggagatcgc gaaggtcatc ggcttctggc tcgagctggg tgtcgacggt 600

ttccgcgtgg atgccgtgcc ccacctcatc gacgcaggcg acgggcccga gcacgacttc 660

ctccgcgcgc tgcggggata cgtctcgcgt cgcagcggtc acgccatgat gctcggcgag 720

gtcaacctgc cctacgacga gcagctgcgt ttcttcggcg acgccgacgg cgacgagctc 780

acgatgcagt tcgacttcgt cgccaatcag cggctgtacc tcgccctggc ccggcaggat 840

gccgcgcccc tgcgcgaggc gctggagtcg cggcccgcga tcgcccgcgg caaccagtgg 900

ggcaacttcg tgcgcaacca cgacgagctc acgctcgatc agttgagcgc cgaggagcgg 960

gaggaggtgt tcgcggcctt cgcccccgag gagggccagc gcatccacgg tcggggcatc 1020

acgcgccgcc tgccgtcgat gctcgagggc gaccagcgcc gcatccgcat ggtctacagc 1080

ctgacgttct ctctgcccgg ggcgccggtg ctgtactacg gcgaggagat cgggatgggc 1140

gagaatccca cgatctcggg cagtcgcgcg gccgtgcgca cgccgatgca gtggaccgcg 1200

gacgtcgatg cgggcttctc gggggcggac gagctcatcg ccgacgtcgt ccccggtgga 1260

ttcgcgcccg agcacgtcaa cgtcgcgcag cagcggcgcg accccgactc gatgctgcgg 1320

ttcacgcaga acctcgtgcg tcagtaccgg gcctctcccg agatcgggtg gggggagctc 1380

ggcatcctgg atcaacccca cgcgtgcgtg ctggcccact cggtcacgag cgagctgggc 1440

atgctcgtcg ccgcgcacaa cttcgccccc gacggccgca ccttccgcct gcggatcgag 1500

ggagcggatg cggatgcgga tgcggatgcg gatgccgaga cctggcgcct cgtcgacctt 1560

ctcgacgacg cgggcggagc gcagaccctg gacggcgacg ggttcgaggt gacgctcgac 1620

gggtacgggt accgatggtg gcgggtcatc cgtccggggg agcggcggat cgcctga 1677

<210> 2

<211> 558

<212> PRT

<213> Microbacterium hydrothermale

<400> 2

Val Arg Leu Thr Asp Thr Ser Asp Leu Trp Trp Lys Thr Ala Val Phe

1 5 10 15

Tyr Asn Leu Asp Val Lys Thr Tyr Leu Asp Ala Asp Asp Asp Gly Val

20 25 30

Gly Asp Leu Arg Gly Leu Ala Gln Arg Leu Asp His Leu Ala Glu Leu

35 40 45

Gly Val Thr Cys Leu Trp Leu Ala Pro Phe Tyr Pro Ser Pro Gln Arg

50 55 60

Asp Asn Gly Tyr Asp Ile Glu Asp Tyr Tyr Gly Val Asp Pro Arg Tyr

65 70 75 80

Gly Ser Leu Gly Asp Met Val Glu Val Leu Arg Thr Ala His Asp Arg

85 90 95

Gly Met Arg Val Ile Val Asp Leu Val Val Asn His Thr Ser Asp Arg

100 105 110

His Pro Trp Phe Gln Gln Ala Arg Gln Ser Pro Asp Ser Arg Tyr Arg

115 120 125

His Phe Tyr Gln Trp Ser Asp Glu Val Pro Asp Asp Ala Pro Ala Ser

130 135 140

Met Phe Pro Asp Val Glu Asn Gly Val Trp Phe Phe Asp Glu Thr Ala

145 150 155 160

Gly Gln Tyr Tyr Lys His Ser Phe Tyr Arg His Gln Pro Asp Leu Ala

165 170 175

Thr Asp His Pro Glu Val Arg Glu Glu Ile Ala Lys Val Ile Gly Phe

180 185 190

Trp Leu Glu Leu Gly Val Asp Gly Phe Arg Val Asp Ala Val Pro His

195 200 205

Leu Ile Asp Ala Gly Asp Gly Pro Glu His Asp Phe Leu Arg Ala Leu

210 215 220

Arg Gly Tyr Val Ser Arg Arg Ser Gly His Ala Met Met Leu Gly Glu

225 230 235 240

Val Asn Leu Pro Tyr Asp Glu Gln Leu Arg Phe Phe Gly Asp Ala Asp

245 250 255

Gly Asp Glu Leu Thr Met Gln Phe Asp Phe Val Ala Asn Gln Arg Leu

260 265 270

Tyr Leu Ala Leu Ala Arg Gln Asp Ala Ala Pro Leu Arg Glu Ala Leu

275 280 285

Glu Ser Arg Pro Ala Ile Ala Arg Gly Asn Gln Trp Gly Asn Phe Val

290 295 300

Arg Asn His Asp Glu Leu Thr Leu Asp Gln Leu Ser Ala Glu Glu Arg

305 310 315 320

Glu Glu Val Phe Ala Ala Phe Ala Pro Glu Glu Gly Gln Arg Ile His

325 330 335

Gly Arg Gly Ile Thr Arg Arg Leu Pro Ser Met Leu Glu Gly Asp Gln

340 345 350

Arg Arg Ile Arg Met Val Tyr Ser Leu Thr Phe Ser Leu Pro Gly Ala

355 360 365

Pro Val Leu Tyr Tyr Gly Glu Glu Ile Gly Met Gly Glu Asn Pro Thr

370 375 380

Ile Ser Gly Ser Arg Ala Ala Val Arg Thr Pro Met Gln Trp Thr Ala

385 390 395 400

Asp Val Asp Ala Gly Phe Ser Gly Ala Asp Glu Leu Ile Ala Asp Val

405 410 415

Val Pro Gly Gly Phe Ala Pro Glu His Val Asn Val Ala Gln Gln Arg

420 425 430

Arg Asp Pro Asp Ser Met Leu Arg Phe Thr Gln Asn Leu Val Arg Gln

435 440 445

Tyr Arg Ala Ser Pro Glu Ile Gly Trp Gly Glu Leu Gly Ile Leu Asp

450 455 460

Gln Pro His Ala Cys Val Leu Ala His Ser Val Thr Ser Glu Leu Gly

465 470 475 480

Met Leu Val Ala Ala His Asn Phe Ala Pro Asp Gly Arg Thr Phe Arg

485 490 495

Leu Arg Ile Glu Gly Ala Asp Ala Asp Ala Asp Ala Asp Ala Asp Ala

500 505 510

Glu Thr Trp Arg Leu Val Asp Leu Leu Asp Asp Ala Gly Gly Ala Gln

515 520 525

Thr Leu Asp Gly Asp Gly Phe Glu Val Thr Leu Asp Gly Tyr Gly Tyr

530 535 540

Arg Trp Trp Arg Val Ile Arg Pro Gly Glu Arg Arg Ile Ala

545 550 555

Claims

1.一种酸性α淀粉酶，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示；

所述一种酸性α淀粉酶的制备方法包括以下步骤：

1）设计并合成扩增酸性α淀粉酶基因的引物，其序列如下：

上游引物Amy2863F：

5’-GTGCCGCGCGGCAGCCATATGAGGCTCACCGACACCAGCG-3’

下游引物Amy2863R：

5’-TTGTCGACGGAGCTCGAATTCTCAGGCGATCCGCCGCTC-3’

2）PCR扩增及重组质粒的构建：

用Amy2863F和Amy2863R引物，以Microbacterium hydrothermale MCCC 1A05925的基因组DNA为模板进行扩增；PCR扩增的产物与经限制性内切酶NdeI和EcoR I酶切后pET-28a表达载体连接，将连接产物转化至大肠杆菌，PCR产物经限制性内切酶Nde I和EcoR I酶切后被连接到经同样限制性内切酶酶切的表达载体pET-28a上，将连接产物转化大肠杆菌E.coliDH5α，筛选含有α淀粉酶基因的重组质粒，并进行核酸电泳和测序验证；

所述PCR扩增的条件如下：95℃预变性3min；95℃ 15s，65℃ 15s，72℃ 90s，72℃5min, 28个循环；

3）α淀粉酶的表达与纯化

将含有α淀粉酶基因的重组质粒转化入大肠杆菌E.coli BL21，用低浓度IPTG低温诱导α淀粉酶蛋白表达，之后蛋白纯化得到酸性α淀粉酶；

所述纯化采用Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化。

2.如权利要求1所述一种酸性α淀粉酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）设计并合成扩增酸性α淀粉酶基因的引物，其序列如下：

上游引物Amy2863F：

5’-GTGCCGCGCGGCAGCCATATGAGGCTCACCGACACCAGCG-3’

下游引物Amy2863R：

5’-TTGTCGACGGAGCTCGAATTCTCAGGCGATCCGCCGCTC-3’

2）PCR扩增及重组质粒的构建：

3）α淀粉酶的表达与纯化

所述纯化采用Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化。

3.如权利要求1所述一种酸性α淀粉酶在纺织、造纸、洗涤剂、发酵和食品工业中的应用。