CN105647888B

CN105647888B - 内切几丁质酶及其编码基因和在生产几丁二糖中的应用

Info

Publication number: CN105647888B
Application number: CN201410645625.3A
Authority: CN
Inventors: 闫巧娟; 付星; 杨绍青; 江正强; 郭禹; 杨鑫斌
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2014-11-14
Filing date: 2014-11-14
Publication date: 2020-02-21
Anticipated expiration: 2034-11-14
Also published as: CN105647888A

Abstract

本发明公开了一种内切几丁质酶及其编码基因和在生产几丁二糖中的应用。蛋白是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列2自N末端40至696位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)有序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将(a)或(b)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有几丁质酶活性的由序列1衍生的蛋白质。利用本发明提供的几丁质酶制备几丁二糖，转化率高，能源消耗少，无污染物产生，具有重要的经济价值。本发明蛋白在工业应用中具有较大潜力。

Description

内切几丁质酶及其编码基因和在生产几丁二糖中的应用

技术领域

本发明涉及一种几丁质酶基因。更具体地涉及一种内切几丁质酶基因及其在制备几丁二糖中的应用。属于生物工程领域。

背景技术

几丁质(Chitin)是由N-乙酰氨基葡萄糖以β-1,4-糖苷键连接而成的不溶于水的线性多聚物(Bendt et al.Cloning,expression,and characterization of a chitinasegene from the Antarctic psychrotolerant bacterium Vibrio sp.strain Fi:7.Extremophiles,2001,5:119-126)，是自然界中含量仅次于纤维素的可再生生物质，每年生物界合成的几丁质高达上百亿吨。几丁质广泛存在于虾、蟹、昆虫的甲壳以及真菌和植物的细胞壁中。几丁质及其衍生物，如几丁寡糖和壳聚糖等，由于在抗菌和抗肿瘤等方面具有较高的利用价值，近年来受到人们越来越多的重视。传统几丁质相关产品的生产主要是通过化学酸水解法来获得，生产过程对环境造成了较大的污染。酶催化水解几丁质制备几丁寡糖等产品是一种高效、环保的制备方法，该方法的关键是获得性能优良的几丁质酶。

几丁质酶(Chitinase，EC 3.2.1.14)是一类糖苷键水解酶，能够特异性地催化水解几丁质链中的β-1,4-糖苷键生成几丁寡糖或N-乙酰氨基葡萄糖(Bhattacharya etal.Bacterial chitinases:Properties and potential.Critical Reviews inBiotechnology,2007,27:21-28)。几丁质酶水解几丁质生成的几丁寡糖具有一些独特的功能特性，在食品、医药、化妆品和饲料等方面具有广泛的应用价值。如这些低聚糖具有清爽的甜味，在水中溶解度比单糖低，因此有助于调整食品中的水活性，且兼具调味和改良食品质构的功能；其次几丁寡糖还可促进肠道内益生菌的增殖，并抑制肠道病原菌的生长，是一种良好的双歧杆菌增殖因子；此外几丁寡糖的吸湿和保湿性好，可用作保湿乳液、化妆水的原材料。几丁质酶除了在几丁质生物转化中具有重要的作用，同时一些几丁质酶还具有抗菌活性，在农作物生物防治中也具有很大的应用潜力。

关于几丁质酶的研究国内已有一些专利报道，如专利申请号：201210510998.0，从柠檬酸杆菌中克隆得到了几丁质酶基因，并获得重组蛋白CHI-X；专利申请号：201110258893.6，筛选得到一株产几丁质酶的细菌Chitiniphilus haikoumangrovensis，并利用该菌所产的几丁质酶降解胶体几丁质制备几丁寡糖。国际上关于细菌几丁质酶的研究报道相对较多，尤其是类芽孢杆菌属菌株，如Paenibacillus sabina、Paenibacilluschitinolyticus、Paenibacillus sp.D1、Paenibacillus pabuli和Paenibacillussp.FPU-7等(Patel et al.Statistical optimisation of medium components forchitinase production by Paenibacillus sabina strain JD2.Annals ofMicrobiology,2007,57:589-597；Ahmadi et al.Isolation and characterization of achitionolytic enzyme producing microorganism,Paenibacillus chitinolyticusJK2from Iran.Journal of Microbiology,2008,3:395-404；SinghAK.Optimization ofculture conditions for thermostable chitinase production by Paenibacillussp.D1.African Journal of Microbiology Research,2010,4:2291-2298；Itoh etal.Cooperative degradation of chitin by extracellular and cell surface-expressed chitinases from Paenibacillus sp.strain FPU-7.Applied andEnvironmental Microbiology,2013,79:7482-7490)。国内仅见：嗜几丁质类芽孢杆菌菌株CH11几丁质酶特性研究.江苏农业科学,蒋志强等,2006,1:47-49，研究嗜几丁质类芽孢杆菌(Paenibacillus chitinolyticus)产几丁质酶的情况。目前国际上尚无巴伦葛兹类芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii)产几丁质酶的研究报道。

几丁二糖是一种中间体，在合成各种复杂的活性寡糖及多糖中具有重要作用，但是其制备非常麻烦且价格昂贵。Matsuoka et al.An improved preparation of N,N'-diacetylchitobiose by continuous enzymatic degradation of colloidal chitinusing dialysis tubing as a convenient separator.Biomacromolecules,2000,1:798-800，利用透析管作为分离装置连续酶解胶体几丁质产几丁二糖，其水解率达到36％。Cottaz et al.Genetic engineering of Escherichia coli for the production ofN^I,N^II-diacetylchitobiose(chitinbiose)and its utilization as a primer for thesynthesis of complex carbohydrates.Metabolic Engineering,2005,7:311-317，应用根瘤霉几丁质酶水解几丁质制备几丁二糖，产量达到4g/L。Ilankovan et al.Productionof N-acetyl chitobiose from various chitin substrates using commercialenzymes.Carbohydrate Polymers,2006,63:245-250，应用商业几丁质酶水解不同几丁质底物生产几丁二糖，产物中几丁二糖的含量为71.5％，另含有19％几丁单糖和9.5％几丁三糖。已有的研究报道不仅几丁二糖的产率低，而且其含量也低，为后续分离纯化带来很大难度，因此制备技术有待进一步提高。

国内关于几丁质酶的研究起步较晚，目前还没有实现产业化。能否获得产酶量高、酶学性质优异的几丁质酶，对于提高我国几丁质资源利用的效率具有重要意义。

本发明从中国南海地区采集的海水样品中，筛选得到一株耐热细菌巴伦葛兹类芽孢杆菌，从该菌株中克隆得到一个几丁质酶基因并进行了异源表达，获得重组几丁质酶并研究了该酶的酶学性质，最后应用该重组酶水解几丁质制备高纯度几丁二糖。

发明内容

本发明的目的在于提供一种内切几丁质酶，名称为PbChi70，来源于巴伦葛兹类芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii)。本发明的另一个目的是提供一种表达几丁质酶PbChi70蛋白的方法和在生产几丁二糖中的应用。

本发明提供的内切几丁质酶PbChi70蛋白质，是如下1)～3)中的一种蛋白质：

1)由序列表中序列2第40～696所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

3)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有几丁质酶活性的由1)衍生的蛋白质。

所述衍生的蛋白质是指通过物理诱变、化学诱变、基因工程等手段将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，仍具有几丁质酶活性的蛋白质。

为了使1)中的PbChi70便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的PbChi70可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的PbChi70的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第1-2091位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述2)的蛋白质具体可以是在所述1)的蛋白质的C-端带上6个His标签的蛋白质。

所述内切几丁质酶PbChi70蛋白质的编码基因，也属于本发明的保护范围。

所述内切几丁质酶PbChi70的编码基因，具体为如下1)～4)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第1～2091位；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1的自5′末端第1～1014位；

3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码如所述蛋白质的基因；

4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码如所述蛋白质的基因。

序列表中的序列1由2091个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第1-2091位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的PbChi70蛋白质。

所述严格条件可为用0.1×SSPE或0.1×SSC，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

扩增所述内切几丁质酶PbChi70基因全长或其任一片段的引物对，也属于本发明的保护范围。

含有所述PbChi70基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌，也属于本发明的保护范围。

所述重组载体具体可为在pET28a(+)的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点间插入所述内切几丁质酶PbChi70基因得到的重组表达载体。

所述重组菌是将所述的重组载体导入大肠杆菌得到的重组大肠杆菌。

本发明所提供表达所述内切几丁质酶PbChi70蛋白的方法，是将上述所得的重组菌发酵培养，得到蛋白。

所述发酵培养的条件是：培养温度是37℃，培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8，加入终浓度1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，30℃培养过夜。

上述方法还包括将所述内切几丁质酶进行纯化的步骤，所述纯化包括以下步骤：

1)将所述重组菌破壁；

2)取上清液用Ni-IDA或Ni-NTA亲和层析进行纯化。

3)检测各个纯化步骤中收集样品的蛋白浓度及酶的纯度。

用本发明提供的几丁质酶可以水解胶体几丁质，所述蛋白质在水解几丁质生产几丁二糖中的应用，也属于本发明的保护范围之内。

本发明从巴伦葛兹类芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii)中扩增得到几丁质酶编码基因，并转入大肠杆菌中，实验结果表明，本发明的几丁质酶最适反应温度为55℃，在温度低于55℃条件下处理30min，残余酶活力达90％以上，表现出较好的热稳定性；其最适pH为5.5；用本发明提供的几丁质酶可以水解胶体几丁质，水解产物主要为几丁二糖及少量单糖。几丁二糖采用活性炭色谱层析分离经结晶后得到晶体，产率可达61％，纯度达到99％。水解反应条件温和，对环境友好。

利用本发明提供的几丁质酶制备几丁二糖，转化率高，能源消耗少，无污染物产生，具有重要的经济价值。此外，本发明内容对促进海洋资源的利用及酶制剂工业的发展也具有重要意义。

附图说明

图1 为本发明的几丁质酶基因PbChi70保守区(A)和基因全长(B)PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。

图2 为经各步骤纯化后几丁质酶PbChi70的SDS-PAGE电泳图，泳道M为低分子量标准蛋白；泳道1为破壁后的粗酶液；泳道2为纯化后的几丁质酶。

图3 为纯化后几丁质酶的最适pH(A)及pH稳定性(B)，图中：(◇)柠檬酸盐缓冲液，(●)乙酸钠缓冲液，(□)MES缓冲液，(▲)磷酸盐缓冲液，(△)Tris盐酸缓冲液，(○)Glycine-NaOH缓冲液，(◆)Na₂HPO₄-NaOH缓冲液。

图4 为纯化后几丁质酶的最适温度(A)及温度稳定性(B)。

图5 为几丁质酶水解胶体几丁质产物的TLC分析图。M：几丁寡糖标准品；其它水解时间图上已列出。

图6 为几丁质酶水解几丁寡糖产物的TLC图。M：几丁寡糖标准品；其它水解时间图上已列出。

图7 为几丁质酶水解胶体几丁质制备几丁二糖的水解历程图。图中：(◆)N-乙酰氨基葡萄糖，(■)几丁二糖，(▲)几丁三糖。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用材料如试剂、克隆表达载体、菌株以及发酵用原材料均可从商业途径获得。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本发明所依赖的遗传资源是巴伦葛兹类芽孢杆菌(Paenibacillusbarengoltzii)CAU904，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年8月20日，保藏号为CGMCCNo.9530，分类命名：巴伦葛兹类芽孢杆菌，原始来源是2011年10月采自南海的海水水样，直接来源与原始来源相同。

实施例1几丁质酶基因的发现

一、几丁质酶基因组保守区片段PCR扩增简并引物设计

以巴伦葛兹类芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii)CAU904为基因组模板，根据GenBank数据库中报道的几丁质酶氨基酸序列，利用在线软件Block Maker (http://blocks.fhcrc.org/blocks/blockmkr/make_blocks.html)搜索保守区。根据几丁质酶的保守氨基酸序列，利用在线设计软件CODHOP(http://blocks.fhcrc.org/codehop.html),选取GenBank中已报道的类芽孢杆菌属GH 18家族几丁质酶氨基酸序列进行同源比对，选择序列保守区THINYAFA和DLDWEYPV设计表2中的简并引物Chi2DF和Chi2DR。

PCR反应条件：94℃预变性5min；以94℃变性30s、62～52℃退火30s、72℃延伸40s为一个循环进行20个循环；以94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸40s为一个循环进行15个循环；72℃总延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳回收，用TA克隆试剂盒连入pMD18-T载体中，转化E.coli DH5α，菌落PCR挑取阳性克隆测序，测序结果NCBI中进行BLAST比对。以基因组DNA为模板扩增到一段412bp左右的片段，参见图1，测序结果在NCBI中进行Blastx比对。

表2几丁质酶PbChi70基因克隆引物表

Primers	Sequence(5’-3’)	Size(bp)
			Chi2DF	ACACATATCAAYTAYGCNTTYGC	23
Chi2DR	AACCGGATATTCCCARTCNARRTC	24
			Chi2F	ATGCATTCGAAGAGAACCCATAG	23
Chi2R	TTATAGCGCCTGAAATAATGCG	22
			Chi2EF	CGC<u>GGATCC</u>GATCCTTACAAAATCGTTGCCT	31
Chi2ER	CCG<u>CTCGAG</u>TTATAGCGCCTGAAATAATGC	30

表2中:下划线标注为限制性酶切位点；Y＝C/T,N＝A/G/C/T,R＝A/G

二、几丁质酶基因全长PCR扩增

比对结果显示，步骤一获得的保守片段的氨基酸序列，据此序列，设计几丁质酶基因上下游引物Chi2F和Chi2R，扩增到一段2,091bp片段，如序列表1所示。测序结果显示扩增到几丁质酶PbChi70基因全长。几丁质酶PbChi70的核苷酸序列编码了696个氨基酸和一个终止密码子。SignalP 4.0预测到该蛋白N端含有一段39个氨基酸残基的信号肽。预测成熟蛋白分子量和等电点分别是70kDa和5.65。NCBI中BLAST比对分析显示，在已报道的有关性质研究的几丁质酶中，与来源于Bacillus circulans(P20533.1)的18家族几丁质酶相似性最高为72％；与来源于Paenibacillus sp.FPU-7(BAM67142.1)、Bacillus pumilus(ABI15082.1)和Bacillus sp.DAU101(ABC66095.1)的18家族几丁质酶相似性分别为67％、61％和61％。结构域分析显示，几丁质酶PbChi2含有一个18家族特征结构域、一个3型纤连蛋白结构域和一个几丁质结合相关的ChiA1-BD结构域。

实施例2内切几丁质酶基因的表达

一、构建重组表达载体

以巴伦葛兹类芽孢杆菌基因组DNA为模板，利用基因上下游引物Chi2EF和Chi2ER扩增去除信号肽的几丁质酶PbChi70基因，PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图2。回收PCR扩增产物，连接pMD18-T载体，热激法转化大肠杆菌DH5α，将阳性重组质粒命名为pMD18-T-PbChi70，送往测序。双酶切质粒pMD18-T-PbChi70，回收目的基因片段，与经同样双酶切的表达载体pET-28a(+)相连，连接产物转化大肠杆菌DH5α，提取质粒酶切鉴定阳性重组子，将构建正确的重组质粒命名为pET28a-PbChi70。

二、构建重组菌

将上步骤获得的重组质粒pET28a-PbChi70通过热激法转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组质粒pET28a-PbChi70的重组菌，将其命名为重组菌BL-pET28a-PbChi70。将pET-28a(+)载体通过热激法转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有pET-28a(+)载体的重组菌，将其命名为对照组。

实施例3内切几丁质酶的纯化及性质测定

一、几丁质酶的纯化

挑取阳性克隆子于50mL LB液体培养基中(50μg/mL)，37℃摇床培养至对数期，用作种子液。接种种子液于100mL LB液体培养基中，可用500mL三角瓶，含卡那霉素50μg/mL，37℃摇床培养至OD600达到0.6～0.8时添加终浓度为1mM的IPTG，30℃摇床培养诱导过夜。

培养结束后10,000rpm、2min离心收集菌液，菌液用20mLpH 7.4磷酸盐缓冲液悬浮，200W、超3s、间歇4s、超90次超声破碎细胞。细胞破碎后，10,000rpm，10min离心收集上清即粗酶液。用磷酸盐缓冲液重悬沉淀，保存，用作电泳分析蛋白表达情况。引物设计时保留pET-28a(+)质粒N端的组氨酸标签，利用Ni-IDA(镍离子螯合亲和层析)柱纯化蛋白。纯化方法：用20mL磷酸盐缓冲液、pH 7.4平衡缓冲液平衡Ni-IDA柱5-10个柱体积；将粗酶液以0.5mL/min流速上样；用缓冲液A即：50mM磷酸盐缓冲液、0.5M NaCl、20mM咪唑、pH 7.4，流速1mL/min洗涤柱子，至流穿液OD280小于0.05；用缓冲液B即：50mM磷酸盐缓冲液，0.5M NaCl，80mM咪唑；pH 7.4，洗涤柱子至流穿液OD280小于0.05；用缓冲液C(50mM磷酸盐缓冲液，0.5MNaCl，120mM咪唑；pH 7.4)洗脱蛋白并用离心管收集，SDS-PAGE检测蛋白纯度(Laemmli etal.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head ofbacteriophage T4.Nature,1970,227:680-685)。

二、几丁质酶的分子量及活力测定

蛋白分子量测定：(1)采用SDS-PAGE法测定，分离胶浓度为12.5％，浓缩胶浓度为4.5％。低分子量标准蛋白为：磷酸化酶b(97.2kDa)，白蛋白(66.4kDa)，卵清蛋白(44.3kDa)，碳酸酐酶(29kDa)，胰蛋白酶制剂(20.1kDa)和溶菌酶(14.3kDa)。

几丁质酶酶活力的测定：取200μL处理好的胶体几丁质(1％，w/v)于1.5mL离心管中，50℃水浴锅预热10min后加入200μL适当稀释的酶液反应30min。反应释放出的还原糖量参照Miller等的方法测定(Miller et al.Use of dinitrosalicylic acid reagent fordetermination of reducing sugar.Analytical Chemistry,1959,31:426-428.)，即在反应液中加入600μL DNS试剂终止反应，然后沸水中显色10min。显色完成后，10,000rpm离心10min，检测540nm处吸光值。几丁质酶酶活力单位(1U)定义为在上述反应条件下每分钟反应生成1μmol还原糖所需要的酶量。

蛋白含量测定：参照Lowry等的方法(Lowry et al.Protein measurement withthe folin phenol reagent.Journal of Biological Chemistry,1951,193:265-275)以牛血清蛋白作为标准蛋白。

实验设3次重复，结果取平均值。

PbChi70的纯化情况见表3。分别将粗酶液和纯酶液作为待测酶液，并以对应灭活的蛋白作为对照组，检测几丁质酶活性。粗酶液的总酶活力为642.7U，其比活力为12.9U/mg。纯酶液的总酶活力为333.8U，其比活力为30.1U/mg。

表3几丁质酶的纯化表

几丁质酶酶活力在55℃，pH 5.5的柠檬酸缓冲液中按标准方法测定。

如图2所示，重组几丁质酶经过Ni-IDA一步纯化后得到纯酶，酶活力回收率见表3为51.9％。

三、几丁质酶的酶学性质

最适pH和pH稳定性，参见图3。

最适pH：将几丁质酶加入不同pH值的6种不同缓冲液体系中，包括柠檬酸盐缓冲液pH 3.0～6.0，乙酸钠缓冲液pH 4.0～5.5，MES缓冲液pH 5.5～6.5，磷酸盐缓冲液pH 6.0～8.0，Tris盐酸缓冲液pH 7.0～9.0，Glycine-NaOH缓冲液pH 9.0～10.5和Na₂HPO₄-NaOH缓冲液pH 10.5～12.0。在55℃条件下测定酶活力，以酶活力最高点为100％作图。pH稳定性：分别用上述不同pH值的反应体系稀释纯酶液，将稀释后的酶液置于40℃水浴锅中保温30min，迅速将样品置于冰水浴中冷却30min，按照标准方法测定酶活力，以未经处理的酶液作为对照，分别计算各pH处理后的残余活力。

柠檬酸盐缓冲液：分别配置50mM柠檬酸和柠檬酸钠溶液，将两者按照不同比例混合分别调节至pH 3.0～6.0。

乙酸钠缓冲液：配置50mM乙酸钠溶液，用乙酸分别调节至pH 4.0～5.5。

MES缓冲液：配置50mM MES溶液，用氢氧化钠分别调节至pH 5.5～6.5。

磷酸盐缓冲液：分别配置50mM磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液，将两者按照不同比例混合分别调节至pH 6.0～8.0。

Tris盐酸缓冲液：配置50mM Tris溶液，用盐酸分别调节至pH 7.0～9.0。

Glycine-NaOH缓冲液：配置50mMGlycine溶液，用氢氧化钠分别调节至pH 9.0～10.5。

Na₂HPO₄-NaOH缓冲液：配置50mM磷酸氢二钠溶液，用氢氧化钠分别调节至pH 10.5～12.0。

最适反应温度和温度稳定性，参见图4。

几丁质酶最适温度测定：将几丁质酶用最适pH值缓冲液稀释合适倍数后，于不同温度40～70℃下测定几丁质酶酶活力。以最大酶活力为100％，分别计算各温度下的相对酶活力。温度稳定性测定：将酶液用50mM的最适pH缓冲液稀释合适倍数后，置于不同温度的水浴锅中保温30min，立即冰水浴冷却30min，以标准方法测定残余酶活力，以未经处理的酶液酶活力作为对照。

几丁质酶PbChi70在pH5.5柠檬酸缓冲液中活性最高，以最高酶活力作为100％，计算其它缓冲液及pH值下的相对酶活力，结果见图3(A)。以未经处理的酶液酶活力作为100％，计算丁质酶PbChi70在各不同缓冲液及pH值下处理30min后的相对酶活力，结果见图3(B)。结果表明PbChi70在较宽的pH4.0～9.5范围内稳定，残余酶活力能保持在80％以上。

几丁质酶PbChi70在55℃反应温度下活性最高，以该酶活力作为100％，计算其它温度下的相对酶活力，结果见图4(A)。将未经处理的酶液酶活力作为100％，计算几丁质酶PbChi70在不同温度下处理30min后的相对酶活，结果见图4(B)。结果表明PbChi70具有良好的温度稳定性，在55℃下保温30min仍残余79％酶活力。

实施例4内切几丁质酶的水解特性

用50mM pH 5.5的磷酸盐缓冲液配置1％(w/v)的胶体几丁质和再生几丁质作为水解底物，加入几丁质酶PbChi70(1U/mL)，50℃水浴水解4h，定时取样，采用薄层层析(TLC，Kieselgel 60)法定性检测水解产物。TLC分析时，展层液为：正丁醇：水：乙酸＝2：1：1；显色方法参考Kopparapu等(Kopparapu et al.A novel thermostable chitinase(PJC)frompomegranate(Punica granatum)juice.Food Chemistry,127:1569-1575)的方法。显色溶液Ⅰ的配置：5mL 50％浓度的氢氧化钾与20mL无水乙醇混匀，取此溶液0.5mL与0.5mL乙酰丙酮和正丁醇的混合溶液即：乙酰丙酮0.5mL和正丁醇10mL混合而成的混合溶液，氢氧化钾和乙醇的混合溶液以及乙酰丙酮和正丁醇的混合溶液都需现配现用。溶液Ⅱ的配置：1g对甲氨基苯甲醛溶于30mL无水乙醇中，再加30mL浓盐酸。显色时，先将溶液Ⅰ均匀喷洒在TLC平板表面，105℃加热5min，然后再将溶液Ⅱ均匀喷洒在TLC平板表面，最后90℃烘烤5min显色。

图5结果表明，该酶水解胶体几丁质和再生几丁质的终产物(4h)以单糖和几丁二糖为主。而在初始阶段0～30min，主要产生几丁二糖、几丁三糖和少量的几丁四糖，随后三糖或四糖被继续降解为单糖及二糖。

图6为几丁质酶水解不同聚合度几丁寡糖的产物分析图。结果表明几丁质酶PbChi70能够水解几丁三糖、四糖和五糖，但不能水解几丁二糖。水解特性表明本发明的几丁质酶属于内切型几丁质酶。

实施例5几丁质酶在制备几丁二糖中的应用

在500mL反应体系即50mM pH 5.5柠檬酸缓冲液中，加入预先制备的终浓度3％胶体几丁质，及纯化后的终浓度5U/mL几丁质酶PbChi70，50℃下150rpm震荡水解24h。沸水浴10min将酶灭活，冷却后过滤收集滤液。采用实施例4中的TLC法及HPLC法分析测定水解液中产物的组成及几丁二糖的纯度。

HPLC测定条件为：HPLC-ELSD检测系统(Agilent 1260Series，AgilentTechnologies，USA)，Sugar-D层析柱4.61×250mm(cosmosil,Japan)，乙腈/水(75:25,v/v)作为流动相，流速为1mL/min。

进一步采用活性炭柱分离制备几丁二糖，其中

H＝50cm，用50％乙醇溶液及去离子水分别平衡层析柱4h备用，其中流速为1mL/min。将糖液真空浓缩后上样，并用总体积1.8L的0～40％乙醇溶液线性洗脱。洗脱液采用自动部分收集器收集，10mL/管。DNS法测定收集样品的还原糖含量，分别采用TLC法和HPLC法定性和定量分析收集的组分，合并同一组分的收集液，50℃下真空旋转蒸发浓缩，然后在糖液中加入适量乙醇结晶。

图7结果表明，水解液中的主要组分为几丁二糖和N-乙酰氨基葡萄糖，其中几丁二糖的含量达到80.4％，水解率达到89.5％。采用活性炭色谱层析分离水解液制备几丁二糖，结果表明能够将水解液中所产的几丁二糖与N-乙酰氨基葡萄糖完全分开，回收率为87％。几丁二糖糖液经过结晶后得到晶体，产率为61％，几丁二糖的纯度达到99％。

所述水解率为PbChi70产生的还原糖质量除以初始底物质量的百分比。

所述回收率为几丁二糖经纯化后的质量除以PbChi70水解产生二糖质量的百分比。

所述产率为几丁二糖晶体质量除以初始底物质量的百分比。

以上所述仅为本发明的较佳可行实施例，并非因此局限本发明的专利范围，故凡是运用本发明说明书及附图内容所作的等效变化，均包含于本发明的保护范围。

Claims

1.一种内切几丁质酶在水解几丁质生产几丁二糖中的应用；

所述内切几丁质酶是如下1）或2）：

1）由序列表中序列2的第40～696所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于；所述内切几丁质酶是通过下述方法制备获得的；

发酵培养重组菌，得到所述内切几丁质酶；

所述重组菌为将重组载体导入大肠杆菌得到的重组大肠杆菌；

所述重组载体是在pET28a(+) 的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点间插入所述内切几丁质酶的编码基因得到的重组表达载体；

所述编码基因为如下1) ～ 3) 中任一基因：

1) 其编码序列是序列表中序列1 的自5’末端第118 ～ 2091 位；

2) 其编码序列是序列表中序列1 ；

3) 与1) 或2) 的基因具有90％以上的同源性且编码序列表中序列2第40～696所示的氨基酸序列组成的蛋白质或序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因；

发酵培养条件是：培养温度是37℃至OD₆₀₀达到0.6 ～0.8，加入终浓度1mM 异丙基硫代-β-D- 半乳糖苷(IPTG)，30℃培养过夜；

所述方法还包括将所述内切几丁质酶进行纯化的步骤，所述纯化包括以下步骤：

1) 将所述重组菌破壁；

2) 取上清液用Ni-IDA或Ni-NTA亲和层析进行纯化；

3) 检测各个纯化步骤中收集样品的蛋白浓度及酶的纯度。