CN112553227B - 一种耐热多功能糖苷水解酶及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐热多功能糖苷水解酶及其编码基因和应用，该基因核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。具有以下性质：多功能糖苷水解酶以羧甲基纤维素钠为底物测定纤维素酶活时，最适温度为70°C、最适pH为5；以魔芋甘露聚糖为底物测定甘露聚糖酶活时，最适温度为85°C、最适pH为6.5；多功能糖苷水解酶GH5在pH4.5‑7之间具有较好的稳定性。本发明的多功能糖苷水解酶具有多种酶活性且稳定性好，在能源、饲料和食品等行业中具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及酶基因工程及酶工程领域，具体涉及一种耐热多功能糖苷水解酶及其编码基因和应用。
背景技术
木质纤维素是自然界中最丰富的可再生生物资源，是构成植物细胞壁的主要成分，由纤维素、半纤维素和其他相互交织的多聚物组成，是自然界中最丰富的可再生生物资源。糖苷水解酶如纤维素酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶等，可以水解植物细胞壁多糖如纤维素、半纤维素等，可应用到生物燃料或生物基化学品中。植物细胞壁多糖的水解往往是多种糖苷水解酶的协同作用，多功能或双功能糖苷水解酶可以大大节约成本、简化酶的制备工艺，因此多功能酶糖苷水解酶得到了广泛研究和应用，如复旦大学专利CN101906406公开了一种具有内切葡聚糖酶/木聚糖酶活性的双功能酶及其制备方法与应用，该双功能酶在30℃-70℃下热处理1小时后以CMC为底物测定残留酶活，在低于50℃具有较好的热稳定性，温度高于50℃时酶的热稳定性随温度的升高而下降。安徽农业大学专利CN102634529B公开了一种纤维素和木聚糖双功能酶及其编码基因和应用，以CMC为底物测定残留酶活，酶的热稳定性试验表明60℃下保温60min，8min前能保持60％以上活性，以后活性下降30min后活性几乎没有。
相对于一般热稳定酶而言，极耐热酶类更有优势，它具有高温下的高酶活性，常温下的稳定性和耐贮存性，减少杂菌污染概率等优点。因此挖掘性质优良的热稳定酶，对饲料工业、能源、食品等行业有着重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种耐热多功能糖苷水解酶GH5的氨基酸序列及其编码该蛋白质的基因序列，且给出了制备耐热多功能糖苷水解酶GH5的方法以及耐热多功能糖苷水解酶GH5在各种多糖水解中的应用，通过研究发现，该酶对热有较好的稳定性，能够很好的解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种多功能糖苷水解酶GH5基因，为序列表中的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
所述多功能糖苷水解酶基因的表达方法：分析多功能糖苷水解酶氨基酸序列，去除信号肽，根据去除信号肽部分核苷酸序列设计引物，通过PCR的方法获得编码基因SEQ IDNO.1片段，多功能糖苷水解酶基因以pET-28a(+)为质粒构建重组表达质粒pET28a(+)-GH5，以大肠杆菌E.coli Rosetta-gami(DE3)为表达宿主，实现C.bescii DSM 6725多功能糖苷水解酶GH5的表达。
进一步地，为序列表中的SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
通过将重组表达质粒转化宿主细胞而获得的重组菌。
进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌。
一种多功能糖苷水解酶的制备方法，包括培养重组菌，通过诱导蛋白表达、纯化从而获得重组多功能糖苷水解酶的步骤，具体如下：
(1)C.bescii DSM 6725多功能糖苷水解酶编码基因的克隆
根据基因序列设计以下引物GHF和GHR，以C.bescii DSM 6725总DNA为模板进行PCR。
引物GHF1：AATTTACCCAAAGTTGGTGCG
引物GHR1：TCATTTTGCGGCTGGAACTG
PCR反应在50μl体系中进行，反应按如下条件进行：95℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火45s，72℃延伸4min 30s，30个循环；72℃终延伸10min。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，与pMD-19T载体连接后转入化大肠杆菌E.coli JM109，在含氨苄抗性(100mg/L)的LB平板上筛选阳性转化子。挑取阳性转化子接入LB液体培养基，37℃培养12～16h，提取质粒，该质粒命名为pMD19T-GH5，对该质粒进行序列测定。
(2)重组质粒的构建
根据基因序列设计以下分别带有BamHI和XhoI酶切位点的引物GHF2和GHR2，以pMD19T-GH5为模板进行PCR。
引物GHF2：CGCGGATCCAATTTACCCAAAGTTGGTGCG
引物GHR2：CCGCTCGACTCATTTTGCGGCTGGAACTG
PCR反应在50μl体系中进行，反应按如下条件进行：95℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火45s，72℃延伸4min30s，30个循环；72℃终延伸10min。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后割胶回收。本研究所采用的表达质粒是pET-28a(+)，将质粒pET-28a(+)和GH5的PCR产物分别进行双酶切后割胶回收，用T4连接酶在16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌E.coli JM109感受态细胞，在含卡那霉素抗性(10mg/L)的LB平板培养过夜，筛选阳性转化子，进行富集培养后提取质粒，命名为pET28a(+)-GH5，对该质粒进行序列测定。
(3)重组菌的筛选
将重组质粒pET28a(+)-GH5在42℃热击90s转化宿主菌大肠杆菌E.coli Rosetta-gami(DE3)感受态细胞，在含卡那霉素(10mg/L)和氯霉素(35mg/L)抗性的LB平板培养过夜，筛选阳性转化子E.coli Rosetta-gami(DE3)/pET28a(+)-GH5，接入LB液体培养基中37℃培养过夜，转接至新鲜的LB培养基中37℃培养至OD600nm达0.6-0.8，添加终浓度0.5mM的IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)在16℃下进行产酶诱导3-6h，重组菌株表现出纤维素酶和甘露聚糖酶活性。
(4)重组多功能糖苷水解酶的分离纯化与酶学特征
将上述获得的含有多功能糖苷水解酶GH5的重组菌发酵液于4℃，8000rpm离心10min，去除上清；
离心收集的细胞悬浮于缓冲液A(50mM Tris-HCl，pH7)中，制备成菌悬液。菌悬液在冰浴中用超声破碎仪破碎，200W功率下工作300次，每个循环工作2s停9s；
细胞裂解液4℃下10,000rpm离心30min，所得上清液即为无细胞抽提液。取无细胞抽提液用0.45μm滤膜过滤制备成上样样品，将Ni-NTA琼脂糖凝胶柱用缓冲液A冲洗至平衡，冲柱流速2mL/min，而后对样品进行上柱，上柱流速1mL/min，待完全吸附后，分别用含缓冲液A～含500mM咪唑的缓冲液A梯度洗脱，洗脱流速2mL/min，分别收集各阶段洗脱峰，通过SDS-PAGE分析纯化后的多功能糖苷水解酶的分子量大小和纯度。
多功能糖苷水解酶在多糖水解中的应用：通过镍柱纯化的方法获得纯化的多功能糖苷水解酶GH5，以羧甲基纤维素钠和魔芋甘露聚糖为底物确定其反应的最适温度和pH，探索其温度稳定性和pH稳定性，并将其应用于多种多糖的水解。
(5)重组多功能糖苷水解酶的对各种多糖的水解
测定多功能酶对各种多糖的水解能力，所用底物包括木聚糖、淀粉、木葡聚糖、羧甲基纤维素钠、β-葡聚糖、β-1，4甘露聚糖、魔芋甘露聚糖、瓜尔豆胶。配置0.5％的各种底物，取50μL底物并加入90μL相应的缓冲液。底物与缓冲液的混合溶液加入10μL适当稀释的酶液，混匀并在70℃反应15min，加入150μl的DNS煮沸5min，冷却至室温后测定OD540nm值。
酶活单位(U)定义为：在一定条件下，每分钟催化底物生成1μmol还原糖所需要的酶量为一个活性单位。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
一、本发明所涉及的多功能糖苷水解酶编码基因为目前国内外多功能糖苷水解酶首次报道在E.coli Rosetta-gami(DE3)中表达并将其应用；该多功能糖苷水解酶编码基因，它具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，全长4245bp个核苷酸，编码一个含1414个氨基酸的多功能糖苷水解酶，以及一个含有42个氨基酸的信号肽；
二、以pET28a(+)为表达质粒，以大肠杆菌E.coli Rosetta-gami(DE3)为表达宿主，实现了C.bescii DSM 6725多功能糖苷水解酶GH5的表达，重组菌E.coli Rosetta-gami(DE3)-GH5表现出纤维素酶和甘露聚糖酶活性。
三、多功能糖苷水解酶GH5以羧甲基纤维素钠为底物测定纤维素酶酶活时，最适温度为70℃、最适pH为5；以魔芋甘露聚糖为底物测定甘露聚糖酶活时，最适温度为85℃、最适为pH为6.5；多功能酶GH5在pH4.5-7之间具有较好的稳定性；在40-70℃保温6h，多功能酶糖苷水解酶GH5甘露聚糖酶和纤维素酶酶活性仍达到100％；40℃保温48h，双功能酶GH5保留了98％的甘露聚糖酶活性和79％的纤维素酶活性，70℃保温48h，双功能酶GH5保留了的65％甘露聚糖酶活性和58％的纤维素酶活性。
四、该多功能糖苷水解酶对木聚糖、羧甲基纤维素钠、β-葡聚糖、β-1，4-甘露聚糖、魔芋甘露聚糖、瓜尔豆胶均具有水解作用，同时具有纤维素酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶四种糖苷水解酶活性，在能源、饲料和食品等行业中具有很好的应用前景。
附图说明
图1为纯化后的重组多功能糖苷水解酶GH5 SDS-PAGE图；
泳道1为标准蛋白分子量；泳道2为纯化后的多功能糖苷水解酶；
图2为重组多功能糖苷水解酶GH5的最适反应pH(以羧甲基纤维素钠和魔芋甘露聚糖为底物反应)；
图3为重组多功能糖苷水解酶GH5的pH稳定性(以羧甲基纤维素钠和魔芋甘露聚糖为底物反应)；
图4为重组多功能糖苷水解酶GH5的最适反应温度(以羧甲基纤维素钠和魔芋甘露聚糖为底物反应)；
图5为重组多功能糖苷水解酶GH5的温度稳定性(以羧甲基纤维素钠和魔芋甘露聚糖为底物反应)。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1
本实施说明C.bescii DSM 6725多功能糖苷水解酶编码基因的克隆。
根据基因序列设计以下引物GHF和GHR，以C.bescii DSM 6725总DNA为模板进行PCR。
引物GHF1：AATTTACCCAAAGTTGGTGCG
引物GHR1：TCATTTTGCGGCTGGAACTG
PCR反应在50μl体系中进行，反应按如下条件进行：95℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火45s，72℃延伸4min30 s，30个循环；72℃终延伸10min。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，与pMD-19T载体连接后转化大肠杆菌E.coli JM109，在含氨苄抗性(100mg/L)的LB平板上筛选阳性转化子。挑取阳性转化子接入LB液体培养基，37℃培养12～16h，提取质粒，该质粒命名为pMD19T-GH，对该质粒进行序列测定。
实施例2
根据基因序列设计以下分别带有BamHI和XhoI酶切位点的引物GHF2和GHR2，以pMD19T-GH为模板进行PCR。
引物GHF2：CGCGGATCCAATTTACCCAAAGTTGGTGCG
引物GHR2：CCGCTCGACTCATTTTGCGGCTGGAACTG
PCR反应在50μl体系中进行，反应按如下条件进行：95℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火45s，72℃延伸4min30s，30个循环；72℃终延伸10min。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后割胶回收。本研究所采用的表达质粒是pET-28a(+)，将质粒pET-28a(+)和GH5的PCR产物分别进行双酶切后割胶回收，用T4连接酶在16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌E.coli JM109感受态细胞，在含卡那霉素抗性(10mg/L)的LB平板培养过夜，筛选阳性转化子，进行富集培养后提取质粒，命名为pET28a(+)-GH5，对该质粒进行序列测定。
实施例3
本实施说明重组菌的筛选。
将重组质粒pET28a(+)-GH5在42℃热击90s转化宿主菌大肠杆菌E.coli Rosetta-gami(DE3)感受态细胞，在含卡那霉素(10mg/L)和氯霉素(35mg/L)抗性的LB平板培养过夜，筛选阳性转化子E.coli Rosetta-gami(DE3)/pET28a(+)-GH5，接入LB液体培养基中37℃培养过夜，转接至新鲜的LB培养基中37℃培养至OD600nm达0.6-0.8，添加终浓度0.5mM的IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)在16℃下进行产酶诱导3-6h，重组菌株表现出纤维素酶和甘露聚糖酶活性。
实施例4
将上述获得的含有多功能糖苷水解酶的重组菌发酵液于4℃，8000rpm离心10min，去除上清；离心收集的细胞悬浮于缓冲液A(50mM Tris-HCl，pH7)中，制备成菌悬液；菌悬液在冰浴中用超声破碎仪破碎，200W功率下工作300次，每个循环工作2s停9s；细胞裂解液4℃下10,000rpm离心30min，所得上清液即为无细胞抽提液；取无细胞抽提液用0.45μm滤膜过滤制备成上样样品，将Ni-NTA琼脂糖凝胶柱用缓冲液A冲洗至平衡，冲柱流速2mL/min，而后对样品进行上柱，上柱流速1mL/min，待完全吸附后，分别用含缓冲液A～含500mM咪唑的缓冲液A梯度洗脱，洗脱流速2mL/min，分别收集各阶段洗脱峰，通过SDS-PAGE分析纯化后的多功能糖苷水解酶的分子量大小和纯度。图1为纯化后的重组多功能糖苷水解酶GH5 SDS-PAGE图。
实施例5
1、多功能酶糖苷水解酶GH5的最适pH的测定方法及结果
将实施例4纯化的重组多功能糖苷水解酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH；以0.5％的羧甲基纤维素钠/甘露聚糖为底物，取50μL底物并加入90μL相应的缓冲液；缓冲溶液的缓冲梯度不同:100mM柠檬酸-Na2HPO4(pH 3.0-8.0)。底物与缓冲液的混合溶液加入10μL适当稀释的酶液，混匀并准确反应15min，加入150μl的DNS煮沸5min，冷却至室温后测定OD540nm值。结果表明(图2)，重组酶的纤维素酶反应最适pH为5，在pH4.5～6.5之间有70％以上的相对酶活性；甘露聚糖酶反应最适pH为6.5，在pH5.5～7.0之间有70％以上的相对酶活性。
2、多功能糖苷水解酶GH5的pH稳定性的测定方法及结果
将实施例4纯化的重组多功能糖苷水解酶在各种不同pH值的缓冲液中4℃处理24h，再于相应的pH 5、温度70℃条件下测定相对剩余酶活，以研究酶的pH稳定性。结果表明(图3)，在pH4～7之间，两种酶活性都很稳定，相对酶活保持75％以上。
3、多功能糖苷水解酶GH5的最适温度测定方法及结果
将实施例4纯化的重组多功能糖苷水解酶在不同温度55-95℃下进行酶促反应。以0.5％的羧甲基纤维素钠/甘露聚糖为底物，取50μL底物并加入90μL相应的缓冲液。底物与缓冲液的混合溶液加入10μL适当稀释的酶液，混匀并准确反应15min，加入150μl的DNS煮沸5min，冷却至室温后测定OD540nm值。酶反应最适温度测定结果如图4所示，重组酶的纤维素酶反应最适温度为70℃，在55～80℃之间有70％以上的相对酶活性；甘露聚糖酶最适温度为85℃，在75～90℃之间有75％以上的相对酶活性。
4、多功能糖苷水解酶GH5的热稳定性测定方法及结果
热稳定性测定为重组酶在不同温度下处理不同时间，再在相应酶的最适pH和温度下进行酶活性测定。酶的热稳定性试验表明(图5)，多功能糖苷水解酶具有良好的热稳定性，在40-70℃保温6h，多功能酶糖苷水解酶GH5甘露聚糖酶和纤维素酶酶活性仍达到100％；40℃保温48h，双功能酶GH5保留了98％的甘露聚糖酶活性和79％的纤维素酶活性，70℃保温48h，双功能酶GH5保留了的65％甘露聚糖酶活性和58％的纤维素酶活性。
5、多功能糖苷水解酶GH5对各种多糖的水解
测定多功能糖苷水解酶对各种多糖的水解能力，所用底物包括木聚糖、淀粉、木葡聚糖、羧甲基纤维素钠、β-葡聚糖、β-1，4甘露聚糖、魔芋甘露聚糖、瓜尔豆胶。配置0.5％的各种底物，取50μL底物并加入90μL相应的缓冲液。底物与缓冲液的混合溶液加入10μL适当稀释的酶液，混匀并在70℃反应15min，加入150μl的DNS煮沸5min，冷却至室温后测定OD540nm值。
酶活单位(U)定义为：在一定条件下，每分钟催化底物生成1μmol还原糖所需要的酶量为一个活性单位。
表1可以看出此多功能糖苷水解酶对木聚糖、羧甲基纤维素钠、β-葡聚糖、β-1，4-甘露聚糖、魔芋甘露聚糖、瓜尔多胶均具有水解作用，酶活见表1。结果表明，该多功能糖苷水解酶同时具有纤维素酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶四种糖苷水解酶活性，具有非常好的应用潜力。
表1多功能糖苷水解酶GH5对多糖的水解活性
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (1)
1.氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的耐热多功能糖苷水解酶GH5在同时水解木聚糖、羧甲基纤维素钠、β-葡聚糖、β-1，4-甘露聚糖、魔芋甘露聚糖、瓜尔多胶中的应用，其特征在于，水解温度为70℃。
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