CN114277043B - 一种耐热甘露糖苷酶基因及其表达蛋白和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐热甘露糖苷酶基因及其表达蛋白和应用，通过蛋白质工程的相关技术手段，对酶进行定向改造以获得更符合要求的甘露糖苷酶。该甘露糖苷酶具有较好耐高温性能和偏酸性pH条件下高活性的特性。该甘露糖苷酶在温度为70‑75℃、pH为6‑6.5的范围内，均具有较高的酶活。该甘露糖苷酶的耐热性能极高，在70‑75℃、pH4.5‑7的环境中，孵育1h酶活性能保持80％以上。与改造前相比，该甘露糖苷酶获得了转糖苷能力，在60％甘露糖浓度、pH6、55℃、2d后，可以转化总糖约10％的甘露二糖和甘露三糖，与现有酶解法生产甘露二糖、三糖相比，产物相对单一纯净，实施简便，具有更大的优越性。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种甘露糖苷酶，特别涉及一种耐热甘露糖苷酶基因及其表达蛋白和应用。
背景技术
低聚甘露糖是由D-甘露糖通过β-1,4糖苷键链接，聚合度在2-10之间的寡糖，其作为一种益身元，能调节人肠道双歧杆菌与乳酸菌，保持肠道微生态平衡。现有的低聚甘露糖生产，主要依靠使用多种酶制剂联合水解底物如魔芋粉、酵母、椰子粕等农副产品制备，但是存在许多问题：1.魔芋粉原料昂贵，实际应用受限大。2.酵母细胞壁中甘露糖含量低。3.椰子粕农副产品结构坚硬，酶解效率低下，需要将原材料预处理，造成一定的成本问题和环保问题。
转糖苷作用是指将在酶的作用下，将糖基转给其他物质。最广泛的例子是利用β-半乳糖苷酶的转糖苷性质，通过半乳糖反向水解生成低聚半乳糖。但是，类似的方法由于甘露糖苷酶很少表现出转糖苷的特性，使其在低聚甘露糖生产上鲜见。所以需要发掘、构建耐热的重组α-甘露糖苷酶，通过以分子改造为目的的蛋白质工程技术，对酶的结构进行优化，以获得热稳定性更好的、反向水解酶活更高工业酶，扩大应用领域提高应用价值，使其可作为一种高效的工业酶制剂
发明内容
根据现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种耐热甘露糖苷酶基因及其表达蛋白和应用。本发明提供的耐热甘露糖苷酶具有一定的热稳定性与耐酸性，可解决有技术中α-甘露糖苷酶在耐热方面存在的不足以及反向水解酶活不高、低聚甘露糖生产方面实际应用受限的问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种耐热甘露糖苷酶基因，所述基因的DNA序列如SEQ NO:1所示。
进一步的，本发明提供一种上述耐热甘露糖苷酶基因表达的耐热甘露糖苷酶，所述耐热甘露糖苷酶为如下(1)或(2)的蛋白：
(1)具有如SEQ NO:2所示氨基酸序列的蛋白；
(2)如SEQ NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有甘露糖苷酶活性的衍生蛋白质。
进一步的，本发明提供一种重组载体，所述重组载体由所述的基因在空载体上克隆而成。
进一步的，所述空载体为pET-28a。
进一步的，本发明提供一种重组菌，所述重组菌包含所述的基因。
本发明的进一步改进方案为：
上述耐热甘露糖苷酶或重组甘露糖苷酶在水解对硝基苯酚-α-D-甘露糖苷中的应用。
进一步的，水解反应温度为70-75℃，pH为4.5-6。
本发明的更进一步改进方案为：
上述耐热甘露糖苷酶或重组甘露糖苷酶在反向水解生产甘露二糖、甘露三糖中的应用。
进一步的，反向水解条件为60％(w/w)甘露糖，pH为6，温度为55℃。
本发明应用在甘露二糖、甘露三糖的生产中时，得益于该酶较高的耐热性能和耐酸性能，重组酶在反应时可以降低对反应环境的要求，降低对原材料的预处理；同时生成的产物只有甘露二糖、甘露三糖，产物纯净，后续分离成本降低。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种全新的甘露糖苷酶基因，该经过改造的基因编码的耐热甘露糖苷酶具有很强的耐热性能，在75℃、pH为6.0的条件下酶活性最高，比酶活达到8.2μmol/mgmin；该甘露糖苷酶在温度为70-75℃、pH为6-6.5的范围内，均具有较高的酶活。该甘露糖苷酶的耐热性能极高，在70-80℃、pH 4.5-7的环境中，孵育1h酶活性能保持80％以上。与改造前相比，该甘露糖苷酶获得了转糖苷能力，在60％(w/w)甘露糖浓度、pH为6、温度为55℃、反应2d后，可以转化总糖约10％的甘露二糖和甘露三糖，与现有酶解法生产甘露二糖、三糖相比，产物相对单一，具有更大的优越性。
附图说明
图1为本发明甘露糖苷酶的SDS-PAGE蛋白电泳图；
图2为本发明甘露糖苷酶的最适温度结果图；
图3为本发明甘露糖苷酶的最适pH结果图；
图4为本发明甘露糖苷酶的热稳定性结果图；
图5为本发明甘露糖苷酶的pH稳定性结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
以下实施例中所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1甘露糖苷酶基因的制备
以Pseudothermotoga thermarum DSM 5069甘露糖苷酶的氨基酸序列(NCBI编号：AEH51527.1)为模版，通过数据库比对得到甘露糖苷酶的非保守位点作为潜在的改造位点；通过计算机模拟饱和突变后的三维结构，使用AutoDock模拟甘露糖与蛋白质相互作用情况，选择最优的改变方案，改造的位点如表1所示。改造后的氨基酸序列按照大肠杆菌密码子偏好性，经过密码子优化，人工合成的方式制备基因，基因序列如SEQ NO:1所示。
表1氨基酸改造位点
实施例2重组克隆、表达载体pET-28a-PtMan的构建与验证
将纯化的PCR产物(实施例1制备)、pET-28a(Novagen)用分别NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，琼脂糖电泳回收酶切PCR及载体大片段。割胶回收后的目的片段与载体，加入1μL 10XLigase Buffer和1μL Ligase，于16℃连接过夜。用连接反应产物转化大肠杆菌DH5α，然后涂于含100μg/mLKana(卡那青霉素)的培养皿，37℃培养10-15h。
从转化平板上挑取多个单菌落，采用BIOMIGA的质粒小量提取试剂盒提取质粒。对获得的质粒双酶切验证并对获得的重组质粒进行测序。测序结果显示，pET-28a载体中插入了所克隆的目的片段(核苷酸长度为3033bp)，进而得到重组克隆、表达载体pET-28a-PtMan，其基因的DNA序列如SEQ NO:1所示，其表达的蛋白(耐热甘露糖苷酶)的氨基酸序列如SEQ NO:2所示。
实施例3重组甘露糖苷酶的表达与纯化
将重组克隆、表达载体pET-28a-PtMan(实施例2制备)热激转化至宿主菌E.coliBL21(DE3)(Novagen)，获得含有重组质粒的重组菌。将单菌落的重组菌接种于5mL含有100μg/mL卡那青霉素的Luria-Bertani broth(LB)培养基，在37℃温度下，200rpm震荡培养4h。将上述4mL菌液接种于含800mL培养基的2000mL摇瓶中，37℃温度下，200rpm振荡培养，当吸光度达到0.4-0.6时，加入800μL的0.1M IPTG，并在22℃温度下，150rpm诱导表达15h。用高速冷冻离心机将培养液在4℃下以6000rpm离心10min，收集菌体。用50mL超纯水洗涤并在4℃下以6000rpm离心10min，回收菌体，接着用20mLBinging Buffer重悬(0.5M NaCl，20mMTris-HCl，5mM Imidazole，pH 7.4)，在冰水浴中，用超声波破碎机破碎细菌细胞，并在4℃下以10000rpm离心50min，得到含甘露糖苷酶PtMan的粗提液。
粗提液使用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化(方法见His-Band Kits，Novagen)。纯化酶纯度的鉴定和分子量的测定采用SDS-PAGE方法进行，结果见图1，1表示200mM咪唑洗脱的纯化PtMan蛋白。分子量约为110kDa，与理论值相近。
实施例4重组甘露糖苷酶的酶学性质分析
酶活定义为：1min内催化对硝基苯酚-α-D-甘露糖苷(Sigma)产生1μmol对硝基苯酚所需要的酶量。
(1)最适温度
用pH值为6.0的50mM Tris-Hcl缓冲液稀释实施例3得到的纯酶液，用稀释10倍的酶液进行酶活测定。酶活测定反应体系为200μL，由0.5％对硝基苯酚-α-D-甘露糖苷100μL，90μL、pH6.0、50Mm Tris-Hcl缓冲液和10μL稀释酶液组成；反应体系的pH为6.0。将反应体系在55-90℃(间隔梯度设置为5℃)温育10min后，加入600μL 1M Na2CO3终止反应，测定405nm的吸光值。实验设3次重复，取平均值作图，研究的结果表明在75℃时，甘露糖苷酶具有最高的酶活性，为8.2μmol/mg min；将此温度下的酶活反应体系的吸光值设为相对活性100％，其他温度下酶活反应体系的吸光值与此最高酶活性体系的吸光值作为相对活性，结果如图2所示。其中，在温度70-75℃的反应体系中酶活性较高。
(2)最适pH
用pH值为6.0的50mM Tris-Hcl缓冲液稀释实施例3得到的纯酶液，用稀释10倍的酶液进行酶活测定。酶活性测定体系为200μL，由0.5％对硝基苯酚-α-D-甘露糖苷100μL，pH5.5-7.5(间隔梯度设置为0.5)的90μL、50mM Tris-Hcl缓冲液和10μL稀释酶液组成。将反应体系在75℃温育10min后，加入600μL 1M Na2CO3终止反应，测定405nm的吸光值，实验设三次重复试验，取平均值，研究结果表明，在pH为6.0时，甘露糖苷酶具有最高的酶活性，为8.2μmol/mg min；将此pH值下的酶活反应体系作为相对活性100％，其他pH值下酶活反应体系的吸光值与此最高酶活性体系的吸光值的比值作为相对活性，结果如图3所示。在pH 6.0-6.5条件下，酶活较高。
(3)热稳定性
用pH值为6.0的Tris-Hcl缓冲液稀释实施例3得到的纯酶液，用稀释10倍的酶液进行酶活测定。酶热稳定性的反应体系为200μL，由0.5％对硝基苯酚-α-D-甘露糖苷100μL，90μL、pH 6.0、50mM Tris-Hcl缓冲液，10μL稀释酶液组成。将稀释酶液在70-80℃(间隔梯度设置为5℃)水浴0.5h、1h、1.5h、2h，测定酶的残存酶活。酶活测定体系中pH为6.0，测定温度为75℃。实验设三次重复，取平均值，以75℃保温10min,不经过酶促反应直接加入600μL 1MNa2CO3，测定405nm的吸光值为空白对照，以未经孵育处理直接75℃、pH6.0反应10min测得的酶活为100％计算相对酶活。研究结果显示，70℃处理1h未见酶活明显下降，结果如图4，可见该甘露糖苷酶在70-75℃条件下热稳定性比较好。
(4)pH稳定性
用pH值为6.0的Tris-Hcl缓冲液稀释实施例3得到的纯酶液，用稀释10倍的酶液进行酶活测定。酶活测定体系为200μL，由0.5％对硝基苯酚-α-D-甘露糖苷100μL，pH 4.0-8.5(间隔梯度设置为0.5)90μL、50mM Tris-Hcl缓冲液和10μL稀释酶液组成。将稀释酶液在70℃水浴1h，测定酶的残存酶活。酶活测定体系中温度为75℃。实验设三次重复，取平均值，以75℃保温10min,不经过酶促反应直接加入600μL 1MNa2CO3，测定405nm的吸光值为空白对照，以未经孵育处理直接75℃、pH6.0反应10min测得的酶活为100％计算相对酶活。研究结果显示，70℃水浴1h后，pH 5.0-6.5缓冲体系中的酶活未见明显下降，结果如图5，可见该甘露糖苷酶在70℃，pH 5.0-6.5条件下耐酸性非常好。
实施例5重组甘露糖苷酶降解对硝基苯酚-α-L-阿拉伯呋喃糖苷、对硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷、对硝基苯酚-β-D-吡喃木糖苷和对硝基苯酚-α-D-甘露糖苷的特异性研究
将重组甘露糖苷酶分别作用于对硝基苯酚-α-L-阿拉伯呋喃糖苷、对硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷、对硝基苯酚-β-D-吡喃木糖苷和对硝基苯酚-α-D-甘露糖苷，进行酶活性测定实验，结果如表2所示：
表2重组甘露糖苷酶对对硝基苯酚-α-L-阿拉伯呋喃糖苷、对硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷、对硝基苯酚-β-D-吡喃木糖苷和对硝基苯酚-α-D-甘露糖苷的降解
其中，ND为未检测出
由表2可知，该酶对对硝基苯酚-α-L-阿拉伯呋喃糖苷、对硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷和对硝基苯酚-β-D-吡喃木糖苷未见明显降解作用，可见该酶的特异性较高。
实施例6重组甘露糖苷酶反向水解生成甘露二糖、甘露三糖
配置浓度为60％(w/w)甘露糖溶液，加入5％(V/V)体积、蛋白浓度为10mg/ml的纯化酶液，在pH4-7、温度50-80℃下进行正交实验，反应2天，取样检测。结果见表3、表4：
表3 PtMan反向水解生成甘露二糖
其中，ND为未检测出
表4 PtMan反向水解生成甘露三糖
其中，ND为未检测出
由表3、表4可知，实验两天后，在pH6.0、55℃下，生成的甘露二糖和甘露三糖量最多，分别占到总糖的10％。
总结、对比本发明的甘露糖苷酶与Pseudothermotoga thermarum DSM 5069甘露糖苷酶的性能，结果如表5所示：
表5本发明的甘露糖苷酶与改造前的甘露糖苷酶相对比的结果
可见，本发明的甘露糖苷酶能够在高温下水解对硝基苯酚-α-D-甘露糖苷，同时在高浓度的甘露糖环境下反向水解生成低聚甘露糖，该酶具有一定的热稳定性与耐酸性，具有更大的优越性。
Claims (10)
1.一种耐热甘露糖苷酶基因，其特征在于，所述基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种如权利要求1所述的耐热甘露糖苷酶基因表达的耐热甘露糖苷酶。
3.根据权利要求2所述的耐热甘露糖苷酶，其特征在于，所述耐热甘露糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体由权利要求1所述的基因在空载体上克隆而成。
5.根据权利要求4所述的一种重组载体，其特征在于：所述空载体为pET-28a。
6.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌包含权利要求1所述的基因。
7.如权利要求2所述的耐热甘露糖苷酶或权利要求4所述的重组载体在水解对硝基苯酚-α-D-甘露糖苷中的应用。
8.如权利要求2所述的耐热甘露糖苷酶或权利要求4所述的重组载体在反向水解生产甘露二糖、甘露三糖中的应用。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：水解反应温度为70-75 ℃，pH 为4.5-6。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：反向水解条件为60%（w/w）甘露糖，pH为6，温度为55℃。
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