CN116286756A - 嗜热氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶突变体、编码基因及其应用 - Google Patents
嗜热氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶突变体、编码基因及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116286756A CN116286756A CN202310216633.5A CN202310216633A CN116286756A CN 116286756 A CN116286756 A CN 116286756A CN 202310216633 A CN202310216633 A CN 202310216633A CN 116286756 A CN116286756 A CN 116286756A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glucosamine
- phosphate
- mutant
- thermophilic
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010022717 glucosamine-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 title claims abstract description 40
- 102100041034 Glucosamine-6-phosphate isomerase 1 Human genes 0.000 title claims abstract description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 18
- GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N D-F6P Natural products OCC(=O)C(O)C(O)C(O)COP(O)(O)=O GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N beta-D-fructofuranose 6-phosphate Chemical compound OC[C@@]1(O)O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims abstract description 17
- XHMJOUIAFHJHBW-VFUOTHLCSA-N glucosamine 6-phosphate Chemical compound N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O XHMJOUIAFHJHBW-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims abstract description 16
- -1 ammonium ions Chemical class 0.000 claims abstract description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 4
- 241001148023 Pyrococcus abyssi Species 0.000 claims description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 241001478240 Coccus Species 0.000 claims description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 abstract description 21
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 21
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 abstract description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 abstract description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 abstract description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N acetylacetone Chemical compound CC(=O)CC(C)=O YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 102200115452 rs137852659 Human genes 0.000 description 3
- 108010055851 Acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 2
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102100030122 Protein O-GlcNAcase Human genes 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020000005 Sucrose phosphorylase Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003233 pyrroles Chemical class 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BGNGWHSBYQYVRX-UHFFFAOYSA-N 4-(dimethylamino)benzaldehyde Chemical compound CN(C)C1=CC=C(C=O)C=C1 BGNGWHSBYQYVRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050004944 Alpha-glucan phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 101000895977 Amycolatopsis orientalis Exo-beta-D-glucosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 102000009569 Phosphoglucomutase Human genes 0.000 description 1
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 1
- 241000522615 Pyrococcus horikoshii Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 150000004263 amino monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011960 computer-aided design Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 1
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000008271 glucosaminides Chemical class 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005065 mining Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 235000019426 modified starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 108091000115 phosphomannomutase Proteins 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
- C12Y305/99—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in other compounds (3.5.99)
- C12Y305/99006—Glucosamine-6-phosphate deaminase (3.5.99.6)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种嗜热氨基葡萄糖‑6‑磷酸脱氨酶突变体及其编码基因、重组表达载体及工程菌，以及其在酶法催化果糖‑6‑磷酸和铵根离子可逆转化为氨基葡萄糖‑6‑磷酸中的应用。本发明通过定点饱和突变技术，获得酶活力提高的嗜热氨基葡萄糖‑6‑磷酸脱氨酶突变体，该突变体对催化果糖‑6‑磷酸和铵根离子可逆转化为氨基葡萄糖‑6‑磷酸较野生型提高2.15倍，活力达3.16U/mg。且该突变体在高温下仍可发挥催化作用，可通过热处理进行蛋白纯化，简化了纯化步骤，且在常温条件下具有良好热稳定性，利用该脱氨酶突变体，能以果糖‑6‑磷酸和铵根离子为底物，更高效的合成氨基葡萄糖‑6‑磷酸，提高了热力学驱动的氨基葡萄糖体外生物合成的效率，具有较好的应用前景。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种嗜热氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶突变体及其编码基因、重组表达载体及工程菌，以及其在酶法催化果糖-6-磷酸和铵根离子可逆转化为氨基葡萄糖-6-磷酸中的应用。
(二)背景技术
氨基葡萄糖又名葡萄糖胺(Glucosamine，GlcN)，是一种天然的氨基单糖，由葡萄糖的一个羟基被氨基所取代而形成。氨基葡萄糖通常以N-乙酰基衍生物等形式(如甲壳素、壳聚糖等)存在于微生物、动物来源的多糖和结合糖中，是人体中形成软骨细胞的重要营养素，能刺激软骨细胞生长，促进软骨组织修复，具有阻止骨关节炎病程发展的作用。近年来，随着人口老龄化的加剧，氨基葡萄糖的市场份额逐年增长，2020年我国氨糖产业市场规模已超过60亿，并且以每年20％左右的速度持续增长。
由于氨基葡萄糖广阔的市场前景，其合成方法也成为研究热点。目前工业上生产氨基葡萄糖的主要方法是酸水解法，即在高温下(约100℃)，利用高浓度的盐酸将蟹虾壳来源的甲壳素和壳聚糖水解为氨基葡萄糖，尽管该方法操作简单，但是大量酸的使用导致严重的环境问题(J.Agric.Food Chem.2007,55,2246)。因此，学者纷纷致力于开发新的氨基葡萄糖合成工艺。如利用几丁质酶、外几丁质酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和N-乙酰-氨基葡萄糖脱乙酰酶将蟹虾壳来源的甲壳素生物降解合成氨基葡萄糖；但是由于蟹虾壳来源的几丁质结构复杂，几丁质无法完全水解，导致氨基葡萄糖的产率较低(J.Agric.FoodChem.2018,66,8061)。近年来兴起的微生物发酵法受到研究者的较多关注，但其产物多为N-乙酰氨基葡萄糖，需要进一步水解去乙酰化才能合成氨基葡萄糖，存在收率低、环境负担重等问题(Bioresour.Technol.2018,250,642-649)。
游淳等报道了一种热力学驱动的氨基葡萄糖体外生物合成方法，该方法以廉价的淀粉或淀粉衍生物和无机铵盐为底物，以α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶，氨基葡萄-6-磷酸脱氨酶(GlmD)和磷酸酶五种级联酶为催化剂，通过磷酸化、异构、胺化和去磷酸化等步骤合成氨基葡萄糖(ACS Catal.2020,10,13809-13819)。由于该反应体系最后一步由磷酸酶催化不可逆去磷酸化，该方法的理论产率可达100％，是合成氨基葡萄糖的理想途径。其中，氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(EC 3.5.99.6)是一种变构酶，可催化氨基葡萄糖-6-磷酸可逆转化为果糖-6-磷酸和铵根离子，它是实现热力学驱动的氨基葡萄糖高效生物合成的关键酶之一。然而，目前报道的氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶存在活力低、稳定性差等缺陷，难以用于氨基葡萄糖的工业化合成。因此，开发一种热稳定性的能够高效催化果糖-6-磷酸和铵根离子转化为氨基葡萄糖-6-磷酸的嗜热脱氨酶具有重要意义。
(三)发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种嗜热氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶突变体、编码基因，及其在高效催化果糖-6-磷酸和铵根离子转化为氨基葡萄糖-6-磷酸中的应用。
本发明采用的技术方案是：
一种嗜热氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶突变体，由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示深海火球菌(Pyrococcus abyssi)来源的氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶经单点突变或多点突变获得，所述单点突变或多点突变的突变位点为下列之一或其中两种以上：(1)第40位半胱氨酸，(2)第88位精氨酸，(3)第92位苏氨酸。
本发明从天然酶库中筛选挖掘了深海火球菌(Pyrococcus abyssi)来源的氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶，并通过蛋白质工程技术对其进行分子改造，提高了其催化果糖-6-磷酸和铵根离子转化为氨基葡萄糖-6-磷酸的活性，从而进一步提升氨基葡萄糖体外生物合成的效率，为氨基葡萄糖的规模化制备奠定基础。
具体的，所述点突变为下列之一或其中两种以上：(1)第40位半胱氨酸突变为丙氨酸，(2)第88位精氨酸突变为天冬氨酸，(3)第92位苏氨酸突变为苯丙氨酸。
优选的，所述嗜热氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3(即突变体C40A)、SEQ ID NO.5(即突变体R88N)或SEQ ID NO.7(即突变体T92F)所示。
任何对SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或者替换一个或几个氨基酸且具有催化果糖-6-磷酸和铵根离子可逆转化为氨基葡萄糖-6-磷酸活性的，仍属于本发明的保护范围。
本发明还涉及含有所述编码基因的重组表达载体。这些重组载体可以用本领域常规方法将本发明的蔗糖磷酸化酶突变体核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述载体可为本领域常规的各种载体，例如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET-28a。
优选的，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4(编码突变体C40A))、SEQ IDNO.6(编码突变体R88N)或SEQ ID NO.8(编码突变体T92F)所示。
本发明还涉及含有所述编码基因的工程菌。作为一种重组表达载体的应用，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中获得基因工程菌。宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，主要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的蔗糖磷酸化酶突变体基因可以有效表达。本发明优选大肠杆菌，更优选为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。
本发明还涉及所述嗜热氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶突变体在酶法催化果糖-6-磷酸和铵根离子可逆转化为氨基葡萄糖-6-磷酸中的应用。
本发明所述嗜热氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶突变体可以以全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，还可以是经部分纯化或完全纯化的酶蛋白形式使用。如果需要，还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明嗜热氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶突变体制成固定化酶或者固定化细胞形式进行使用。
本发明的有益效果主要体现在：本发明通过定点饱和突变技术，获得酶活力提高的嗜热氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶突变体，该突变体对催化果糖-6-磷酸和铵根离子可逆转化为氨基葡萄糖-6-磷酸较野生型提高2.15倍，活力达3.16U/mg。且该突变体在高温下仍可发挥催化作用，可通过热处理进行蛋白纯化，简化了纯化步骤，且在常温条件下具有良好热稳定性，利用该脱氨酶突变体，能以果糖-6-磷酸和铵根离子为底物，更高效的合成氨基葡萄糖-6-磷酸，提高了热力学驱动的氨基葡萄糖体外生物合成的效率，具有较好的应用前景。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶基因序列的获得和载体构建
通过NCBI等数据库挖掘获得来源于深海火球菌(Pyrococcus abyssi)的氨基酸序列(GenBank:WP_048147071.1)。在不改变该多肽氨基酸序列的前提下，将上述基因的密码子替换为大肠杆菌偏好的密码子，经密码子优化后的氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
将SEQ ID NO.2所示基因序列连接于pET-28b(+)载体，重组质粒命名为pET-28b(+)-GlmD。
实施例2：野生型氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的诱导表达与纯化
1.重组菌的构建
将实施例1中的重组质粒pET-28b(+)-GlmD转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，获得野生型重组菌。
2.重组菌的培养
将菌株从保藏的甘油管中划线培养过夜后，取单菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素10mL的LB液体培养基，37℃，180rpm过夜培养。按照2％(v/v)接种量接种到100mL的LB液体培养基中，37℃，培养至OD为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，调整培养温度16℃，诱导表达16h。离心弃上清液，获得湿菌体。
3.粗酶液的热纯化
将上述收集到的湿菌体用100mM的HEPES缓冲液(pH 7.5)重悬，将菌悬液放置冰上冰浴，超声破碎(破碎持续2秒，间歇4秒，总时长15min，功率为60W)，获得细胞破碎液，后离心8000rpm、10min，取上清液在80℃下水浴热处理20min。在8000rpm转速下离心10min，取上清液即为初步纯化的酶液。经SDS-PAGE凝胶电泳估计目标蛋白的纯度和分子量大小，并用BCA蛋白试剂盒检测其蛋白浓度。
实施例3：氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶突变体库的构建
1.脱氨酶突变位点的选取
为了提高氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶GlmD的催化活性，采用计算机辅助设计选择其定点突变位点。选择与GlmD同源度为61.92％的来源于Pyrococcus horikoshii OT3脱氨酶晶体结构(PDB ID：2DEC)和来源于Pyrococcus furiosu脱氨酶晶体结构(PDB ID：2CB0)作为模板，运用MODELLER软件进行同源建模。选择DOPE评分最高的模型，利用Procheck验证结构的可信度。结合脱氨酶的催化机理及脱氨酶(GlmD)和果糖-6-磷酸的分子对接模型，确定催化活性区域的关键氨基酸残基，进一步筛选可能影响其酶活的10个氨基酸残基：Cys40、Ser42、Ser43、Ser87、Arg88、Thr92、Val133、Met135、Glu211、Lys319。
2.定点饱和突变
根据SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，设计定点饱和突变引物，见表1所示。(注：N＝A/G/C/T，K＝G/T，M＝A/C)。
表1：定点饱和突变引物序列表
以载体pET28b为模板，进行PCR扩增整个质粒，反应体系如表2所示，反应条件如表3所示，获得突变序列。
表2：PCR反应体系
表3：PCR反应条件
实施例4：氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶定点饱和突变体库的初筛
1.脱氨酶突变体重组工程菌的构建与表达
经过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小正确的扩增条带。用限制性内切酶DpnI酶37℃消化处理PCR产物2h，消化甲基化的质粒模板。将消化后的PCR产物吸取10μL转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞，并涂布与含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，37℃下培养12h，获得单菌落培养物。
将获得的单菌落接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基的96孔板中，37℃培养12h后，获得种子液。取200μL种子液转接至新的无菌96深孔板中，且每个孔中均含有400μL的终浓度为50μg/mL的卡那霉素、0.1mM的IPTG的LB液体培养基，在28℃、180rpm条件下培养12h后，4000rpm离心20min，弃上清收集湿菌体。加入400μL的HEPES缓冲液(pH 7.5，100mM)重悬各孔中的菌体，利用反复冻融的方法进行细胞破碎(-80℃冷冻40min，37℃融解30min，反复4次)，在80℃条件下热处理20min，然后8000rpm离心20min，取上清液获得突变体酶液。
2.脱氨酶的高通量筛选
利用Elson-Morgan显色法建立GlmD的高通量筛选方法，反应原理为：在碱性条件下氨基己糖能与乙酰丙酮进行缩合反应，生成吡咯衍生物，所产生的吡咯衍生物与对二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反应，生成红色缩合物，在一定浓度范围内，该红色缩合物在530nm处的吸光值与氨基己糖浓度呈正比，从而反映脱氨酶突变体的催化活力。
活力测定步骤：在96孔板反应板中添加200μL反应液(含155μL突变体酶液，25μL(NH4)2SO4(反应液中终浓度为25mM)，20μL果糖-6-磷酸(反应液中终浓度为5mM))，于40℃反应10min，冰浴终止，并迅速吸取100μL的反应液至含有200μL乙酰丙酮试剂的96深孔板中，90℃下水浴1h；冷却至室温后，吸取30μL至96孔酶标板上，加入100μL的96％乙醇，再加入120μL的DMAB试剂，混合均匀，在37℃下反应30min，在530nm处进行比色，根据标准曲线计算反应样液中氨基葡萄糖-6-磷酸的量，从中挑取活力提高的突变体进行下一步复筛。
实施例5：氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶定点饱和突变体库的复筛
挑选实施例4中初筛提高的突变体分别接种于含50μg/mL的卡那霉素的10mL LB液体培养基中，37℃，180rpm条件下培养10h。按体积浓度2％的接种量接种至含50μg/mL的卡那霉素的100mL LB液体培养基中，37℃、180rpm培养至OD为0.6-0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，16℃诱导表达16h。上述培养液在8000rpm下离心10min，弃上清，获得的湿菌体用HEPES缓冲液(pH 7.5，100mM)重悬。菌体悬液超声破碎(60W，持续2s，间歇4s，总时长15min)，获得细胞破碎液，在8000rpm下离心10min。上清液在80℃下水浴热处理20分钟，离心后得GlmD突变体酶液，BCA蛋白含量检测试剂盒检测目标蛋白含量。
酶活测定反应体系(1mL)：100mM的HEPES(pH 7.5)缓冲液，10mM的果糖-6-磷酸，50mM的(NH4)2SO4和适量的酶液，40℃下反应10min，测得脱氨酶的催化活性。上述反应用高氯酸终止，再加入氢氧化钠中和，后12000rpm离心1min，取上清液通过HPLC检测样品中氨基葡萄糖-6-磷酸含量。酶活定义：一个酶活单位定义为40℃，100mM的HEPES缓冲液(pH 7.5)条件下，每分钟转化生产1μmol产物所需要的酶量。
HPLC检测方法为：色谱条件：流动相A：20mM的乙酸钠(pH 7.2±0.5)，流动相B：10％的20mM乙酸钠+20％乙腈+20％甲醇(pH调至7.2±0.5)；柱温为35℃；色谱柱型号：Welchrom-C18(4.6x 250mm，5μm)；流速0.8mL/min；进样量：样品5μL+0.4mol/L硼酸缓冲液(pH 9.5)6μL+OPA衍生化试剂2μL。
如表4所示，GlmD-C40A、GlmD-R80N以及GlmD-T92F活力有明显的提高。其中，Cys40位点突变效果最好，突变体C40A对催化果糖-6-磷酸和铵根离子可逆转化为氨基葡萄糖-6-磷酸的酶活为3.16U/mg，是野生型氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶酶活的2.15倍。
表4：野生型GlmD及其突变体酶活力
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种嗜热氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶突变体，由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示深海火球菌(Pyrococcus abyssi)来源的氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶经单点突变或多点突变获得，所述单点突变或多点突变的突变位点为下列之一或其中两种以上：(1)第40位半胱氨酸，(2)第88位精氨酸，(3)第92位苏氨酸。
2.如权利要求1所述的嗜热氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶突变体，其特征在于所述点突变为下列之一或其中两种以上：(1)第40位半胱氨酸突变为丙氨酸，(2)第88位精氨酸突变为天冬氨酸，(3)第92位苏氨酸突变为苯丙氨酸。
3.如权利要求1所述的嗜热氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶突变体，其特征在于所述嗜热氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.7所示。
4.权利要求1所述嗜热氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶突变体的编码基因。
5.如权利要求4所述的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列如SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示。
6.含有权利要求4所述编码基因的重组表达载体。
7.含有权利要求4所述编码基因的工程菌。
8.权利要求1所述嗜热氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶突变体在酶法催化果糖-6-磷酸和铵根离子可逆转化为氨基葡萄糖-6-磷酸中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310216633.5A CN116286756A (zh) | 2023-03-08 | 2023-03-08 | 嗜热氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶突变体、编码基因及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310216633.5A CN116286756A (zh) | 2023-03-08 | 2023-03-08 | 嗜热氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶突变体、编码基因及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116286756A true CN116286756A (zh) | 2023-06-23 |
Family
ID=86825217
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310216633.5A Pending CN116286756A (zh) | 2023-03-08 | 2023-03-08 | 嗜热氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶突变体、编码基因及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116286756A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116376875A (zh) * | 2023-03-03 | 2023-07-04 | 云南师范大学 | 耐热性提高的n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体及其应用 |
-
2023
- 2023-03-08 CN CN202310216633.5A patent/CN116286756A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116376875A (zh) * | 2023-03-03 | 2023-07-04 | 云南师范大学 | 耐热性提高的n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体及其应用 |
| CN116376875B (zh) * | 2023-03-03 | 2024-02-23 | 云南师范大学 | 耐热性提高的n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3557289B2 (ja) | 非還元性糖質からトレハロースを遊離する組換え型耐熱性酵素 | |
| CN110452845B (zh) | 一种产蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌 | |
| CN112553227B (zh) | 一种耐热多功能糖苷水解酶及其编码基因和应用 | |
| CN116640744B (zh) | 壳聚糖酶OUC-CsnA4-S49I及其应用和制备壳寡糖的方法 | |
| CN117625581B (zh) | 一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体Ea2F及其应用 | |
| US20230272443A1 (en) | N-Acetylglucosamine-Producing Bacterial Strain As Well As Method Of Construction And Use Thereof | |
| CN116286756A (zh) | 嗜热氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶突变体、编码基因及其应用 | |
| CN105441415A (zh) | 一种普鲁兰酶突变体PulB-d99-D436H的制备方法及其应用 | |
| US20240060062A1 (en) | Agarase Mutant with Improved Thermal Stability and Application Thereof | |
| CN114480350B (zh) | 卡拉胶酶在降解κ-卡拉胶和红藻胶中的应用 | |
| EP0704531B1 (en) | Recombinant thermostable enzyme for converting maltose into trehalose | |
| CN114457057B (zh) | 一种壳聚糖酶突变体及其应用 | |
| CN117737038B (zh) | 一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De254PΔ5及其制备与应用 | |
| CN117467647B (zh) | β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A及其编码基因与应用 | |
| CN116640747B (zh) | 壳聚糖酶OUC-CsnA4-S49P及其应用 | |
| CN112553183A (zh) | 一种糖苷水解酶CmChi3及其在降解水解胶体几丁质上的应用 | |
| CN114277043B (zh) | 一种耐热甘露糖苷酶基因及其表达蛋白和应用 | |
| CN116622747A (zh) | 一种编码右旋糖酐蔗糖酶的基因及其应用 | |
| CN111411066A (zh) | 一种双途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及构建方法 | |
| CN112921025B (zh) | 一种差向异构酶的突变体，其编码基因、氨基酸序列及其应用 | |
| CN107400667B (zh) | 一种含重组耐高温葡萄糖异构酶细胞的固定化方法 | |
| CN108034649B (zh) | 一种葡萄糖异构酶突变体及其应用 | |
| CN114891772B (zh) | 一种去乙酰基酶突变体及其应用 | |
| KR100821377B1 (ko) | 내열성 아라비노오스 이성화효소 활성을 갖는 신규한지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-Al 균주, 그 효소 및타가토오스의 생산방법 | |
| CN114085824B (zh) | 一种蔗糖异构酶突变体及其构建方法与应用及一种重组表达载体和重组菌 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |