CN114085824B - 一种蔗糖异构酶突变体及其构建方法与应用及一种重组表达载体和重组菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种蔗糖异构酶突变体及其构建方法与应用及一种重组表达载体和重组菌，涉及酶工程技术领域。所述蔗糖异构酶突变体PdSIase‑QAF的氨基酸如SEQ ID NO.1所示。本发明所述的蔗糖异构酶突变体PdSIase‑QAF蛋白是在PdSIase蛋白的基础上经过突变得到的。本发明得到的蔗糖异构酶突变体PdSIase‑QAF蛋白较PdSIase蛋白在作为蔗糖异构酶时的比活力提高了2.3％，催化效率提高了34.75％，具有更好的工业应用前景。

Description

一种蔗糖异构酶突变体及其构建方法与应用及一种重组表达 载体和重组菌
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及一种蔗糖异构酶突变体及其构建方法与应用及一种重组表达载体和重组菌。
背景技术
异麦芽酮糖是蔗糖优良的高附加值产品。它学名为6-O-a-D-吡喃葡糖基-D-果糖是蔗糖的1种同分异构体，其很多物理性质与蔗糖相似，具有甜度、易溶于水的特点。此外，异麦芽酮糖不易水解，被食用后，人体内葡萄糖和胰岛素浓度仍然维持在一定范围内，能够有效预防糖尿病，异麦芽酮糖具有低热量、低致龋齿性、热稳定性优越等优点。因此被看作糖尿病患者的理想食品。目前，工业上，通过蔗糖异构酶转化蔗糖生产异麦芽酮糖。此酶可以催化蔗糖异构化主要生成异麦芽酮糖和海藻酮糖，同时伴随着水解副产物葡萄糖和果糖的生成。酶法生产异麦芽酮糖已经工业化生产，不但延伸了蔗糖产业链，同样产品功能很大程度上克服蔗糖存在的缺点，是成功伸延蔗糖产业链的典范。
目前报道的蔗糖异构酶反应的主要成分一般为异麦芽酮糖，且转化率介于60.0～91％之间。其中，来源于P.dispersa UQ68J的蔗糖异构酶(PdSIase)转化率达到91.0％，为目前报道最高水平，具有巨大的工业化应用潜力。直接利用P.dispersa UQ68J培养发酵，酶活达到70～80U/mL，但由于蔗糖异构酶产量仍然较低，不利于工业化生产及应用(刘军彤.Pantoea dispersa蔗糖异构酶的重组表达及应用研究[M],江南大学.2019)。
构建重组菌株表达蔗糖异构酶，以提高蔗糖异构酶的产量。江南大学陈晟团队将蔗糖异构酶PdSIase在大肠杆菌中重组表达并优化发酵条件，胞外酶活最高达到1981U/mL，是目前文献报道关于大肠杆菌重组表达蔗糖异构酶的最高胞外酶活(邹亮.Pantoeadispersa蔗糖异构酶在芽孢杆菌中的表达及发酵优化[M],江南大学.2019)。
工业菌株P.rubrum CBS 574.77来源的蔗糖异构酶催化效率(Kcat/Km＝1301mM-1s-1)要远远高于PdSIase(Kcat/Km＝17.9mM-1s-1)。虽然目前报道PdSIase的蔗糖生成异麦芽酮糖转化率最高91％，但是它的催化效率低。通过酶的改造，可以实现酶的催化特性改变。现有技术并未发现如何改进PdSIase才能得到提高PdSIase的催化效率的手段。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的为提供一种蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF及其构建方法与应用及一种重组表达载体和重组菌。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF，所述PdSIase-QAF的氨基酸如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种编码所述蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF的核苷酸，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种所述蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF的构建方法，包括如下步骤：
(1)以蔗糖异构酶PdSIase的核苷酸序列为模板，利用突变引物对所述的核苷酸序列进行突变，得到所述的编码蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF的核苷酸；
(2)将所述的编码蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF的核苷酸进行翻译得到蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF；
所述突变的位点为编码蔗糖异构酶PdSIase第148位、第224位和第306位氨基酸的核苷酸位点。
作为优选，所述蔗糖异构酶PdSIase的氨基酸如SEQ ID NO.3所示；
编码所述蔗糖异构酶PdSIase的核苷酸如SEQ ID NO.4所示。
作为优选，编码所述蔗糖异构酶PdSIase第148位氨基酸的核苷酸的突变引物如SEQ ID NO.5～6所示；
编码所述蔗糖异构酶PdSIase第148位氨基酸的核苷酸的突变为：由编码精氨酸的核苷酸序列突变为编码谷氨酰胺的核苷酸序列。
作为优选，编码所述蔗糖异构酶PdSIase第224位氨基酸的核苷酸的突变引物如SEQ ID NO.7～8所示；
编码所述蔗糖异构酶PdSIase第224位氨基酸的核苷酸的突变为：由编码天冬氨酸的核苷酸序列突变为编码丙氨酸的核苷酸序列。
作为优选，编码所述蔗糖异构酶PdSIase第306位氨基酸的核苷酸的突变引物如SEQ ID NO.9～10所示；
编码所述蔗糖异构酶PdSIase第306位氨基酸的核苷酸的突变为：由编码酪氨酸的核苷酸序列突变为编码苯丙氨酸的核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包括初始载体和所述的编码蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF的核苷酸序列；所述核苷酸序列重组于初始载体的多克隆酶切位点；所述初始载体为pET22b、pMA5或pPIC9K。
本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌通过将所述的重组表达载体转入到宿主菌获得，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)、枯草芽孢杆菌WB600或毕赤酵母。
本发明还提供了所述的蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF、所述的重组表达载体或所述的重组菌在催化底物生产异麦芽酮糖方面的应用；
所述催化的温度为28～32℃；
所述催化的时间为7.5～8.5h；
所述底物与所述的蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF、所述的重组表达载体或所述的重组菌的体积比为8～10:1；
所述底物的摩尔浓度为1450～1470mM；
所述底物的pH为6.9～7.1；
所述底物包括蔗糖溶液、甘蔗汁和糖蜜中的一种或几种。
本发明提供了一种蔗糖异构酶突变体及其构建方法与应用及一种重组表达载体和重组菌。本发明的方案具有如下优点：
本发明的蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF具有蔗糖异构酶的活性，PdSIase-QAF的比活力较蔗糖异构酶PdSIase提高了2.3％。与蔗糖异构酶PdSIase相比，PdSIase-QAF作为蔗糖异构酶的催化底物生产异麦芽酮糖的效率Kcat/Km提高了34.75％，催化蔗糖生产异麦芽酮糖时，PdSIase-QAF的异麦芽酮糖产量占总产物的91％，仍然能保持PdSIase的高产物特异性。因此本发明的PdSIase-QAF较PdSIase更适用于工业生产。
附图说明
图1为蔗糖异构酶PdSIase三维同源建模结构图。
图2为PdSIase和底物蔗糖分子对接后的三维立体图。
图3为PCR扩增产物电泳图和PdSIase-QAF的SDS-PAGE电泳图(其中，左图为电泳图，右图为SDS-PAGE图)。
图4为PdSIase-QAF和PdSIase的SDS-PAGE电泳图(其中M代表蛋白分子量标准，泳道1为PdSIase，泳道2为PdSIase-QAF)。
图5为PdSIase和PdSIase-QAF生产异麦芽酮糖的转化率图。
具体实施方式
本发明提供了一种蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF，所述PdSIase-QAF的氨基酸如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种编码所述蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF的核苷酸，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种所述蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF的构建方法，包括如下步骤：
(1)以蔗糖异构酶PdSIase的核苷酸序列为模板，利用突变引物对所述的核苷酸序列进行突变，得到编码所述的蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF的核苷酸；
(2)将编码所述的蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF的核苷酸进行翻译得到蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF；
所述突变的位点为编码蔗糖异构酶PdSIase第148位、第224位和第306位氨基酸的核苷酸位点。
在本发明中所述蔗糖异构酶PdSIase的氨基酸如SEQ ID NO.3所示；
编码所述蔗糖异构酶PdSIase的核苷酸如SEQ ID NO.4所示。
在本发明中编码所述编码蔗糖异构酶PdSIase第148位氨基酸的核苷酸的突变引物如SEQ ID NO.5～6所示；
编码所述蔗糖异构酶PdSIase第148位氨基酸的核苷酸的突变为：由编码精氨酸的核苷酸序列突变为编码谷氨酰胺的核苷酸序列。
在本发明中编码所述蔗糖异构酶PdSIase第148位氨基酸的核苷酸的突变方法为：以表达载体pET22b-PdSIase为模板，引入SEQ ID NO.5～6所示的引物进行PCR扩增，得到表达载体pET22b-PdSIase-Q。
在本发明中编码所述蔗糖异构酶PdSIase第224位氨基酸的核苷酸的突变引物如SEQ ID NO.7～8所示；
编码所述蔗糖异构酶PdSIase第224位氨基酸的核苷酸的突变为：由编码天冬氨酸的核苷酸序列突变为编码丙氨酸的核苷酸序列。
在本发明中编码所述蔗糖异构酶PdSIase第224位氨基酸的核苷酸的突变方法为：以表达载体pET22b-PdSIase-Q为模板，引入SEQ ID NO.7～8所示的引物进行PCR扩增，得到表达载体pET22b-PdSIase-QA。
在本发明中编码所述蔗糖异构酶PdSIase第306位氨基酸的核苷酸的突变引物如SEQ ID NO.9～10所示；
编码所述蔗糖异构酶PdSIase第306位氨基酸的核苷酸的突变为：由编码酪氨酸的核苷酸序列突变为编码苯丙氨酸的核苷酸序列。
在本发明中编码所述蔗糖异构酶PdSIase第306位氨基酸的核苷酸的突变方法为：以表达载体pET22b-PdSIase-QA为模板，引入SEQ ID NO.9～10所示的引物进行PCR扩增，得到表达载体pET22b-PdSIase-QAF。
在本发明中所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；95℃变性30S，55℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保温60min。
在本发明中对PCR扩增产物进行检测时采用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
在本发明中对PCR扩增产物进行纯化的方法为：
(1)先将PCR扩增产物经试剂盒进行纯化，得到纯化物1；
(2)将纯化物1利用Dpn I进行消化降解模板，转入宿主细胞中，得到编码PdSIase-QAF蛋白的核苷酸序列。
在本发明中所述纯化的试剂盒购自诺唯赞FastPure Gel DNA Extraction MiniKit；
所述消化时的反应体系为：ddH2O 3μL，纯化物15μL，10×Fast Dpn IBuffer 1μL，Fast Dpn I 1μL；
所述消化的方式为水浴消化；
所述消化的温度为37℃；
所述消化的时间为5min。
在本发明中所述宿主细胞为XL-10gold。
在本发明中所述蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF的发现方法为：在SEQ ID NO.3所示的PdSIase的氨基酸序列的基础上，进行同源建模、分子对接和同源蛋白氨基酸序列比对分析潜在关键氨基酸位点，构建突变蛋白库。对突变蛋白库中的每个蛋白作为蔗糖异构酶进行酶活检测，发掘酶催化效率显著提高的突变蛋白，为PdSIase-QAF，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
在本发明中所述PdSIase三维同源建模结构如图1所示。
本发明中所述PdSIase和底物蔗糖分子对接后的三维立体图如图2所示。
所述重组表达载体包括初始载体和所述的编码蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF的核苷酸序列；所述核苷酸序列重组于初始载体的多克隆酶切位点；所述初始载体为pET22b、pMA5或pPIC9K。
所述初始载体为pET22b的重组表达载体为pET22b-PdSIase-QAF；
所述核苷酸序列重组于pET22b的酶切位点为NcoI和XhoI酶切位点之间。
在本发明中所述pET22b载体购自Novagen公司。
所述初始载体为pMA5的重组表达载体为pMA5-PdSIase-QAF；
所述核苷酸序列重组于pMA5的酶切位点为NdeI和BamHI酶切位点之间。
在本发明中所述pMA5载体购自上海禾午生物科技有限公司。
所述初始载体为pPIC9K的重组表达载体为pPIC9K-PdSIase-QAF；
所述核苷酸序列重组于pPIC9K的酶切位点为SnaBI和AvrII酶切位点之间。
在本发明中所述pPIC9K载体购自Invitrogen公司。
本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌通过将所述的重组表达载体转入到宿主菌获得，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)、枯草芽孢杆菌WB600或毕赤酵母。
在本发明中所述大肠杆菌BL21(DE3)购自ThermoFisher公司。
枯草芽孢杆菌WB600购自上海泽叶生物科技有限公司。
毕赤酵母购自Invitrogen公司。
本发明还提供了所述的蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF、所述的重组表达载体或所述的重组菌在催化底物生产异麦芽酮糖方面的应用；所述催化的温度为28～32℃，优选为30℃；
所述催化的时间为7.5～8.5h，优选为8h；
所述底物与所述的蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF、所述的重组表达载体或所述的重组菌的体积比为8～10:1，优选为9:1；
所述底物的摩尔浓度为1450～1470mM，优选为1460mM；
所述底物的pH为6.9～7.1，优选为7.0；
所述底物包括蔗糖溶液、甘蔗汁和糖蜜中的一种或几种。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中所述的LB液体培养基以水为溶剂包括如下质量浓度的组分：5g/L酵母粉、10g/L蛋白胨、10g/LNaCl、终浓度100μg/mL氨苄青霉素。
本发明实施例中所述的溶液Ⅰ以水为溶剂包括如下摩尔或质量浓度的组分：20mM的Tris-HCl缓冲液、300mM NaCl、100μg/mL氨苄青霉素；
所述溶液Ⅰ的pH为7.5。
在本发明实施例中所述的溶液Ⅱ以水为溶剂包括如下摩尔或质量浓度的组分：20mM的Tris-HCl缓冲液、300mM NaCl、50mM咪唑；
所述溶液Ⅱ的pH为7.5。
在本发明实施例中所述的溶液Ⅲ以水为溶剂包括如下摩尔或质量浓度的组分：20mM的Tris-HCl缓冲液、300mM NaCl、500mM咪唑；
所述溶液Ⅲ的pH为7.5。
在本发明实施例中所述的异麦芽酮糖标准品购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；
在本发明实施例和对比例中所述的蔗糖、果糖和葡萄糖标准品购自默克公司。
在本发明实施例和对比例中所述的海藻酮糖标准品购自上海惠诚生物科技有限公司。
实施例1蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF的发现
在SEQ ID NO.3所示的蔗糖异构酶PdSIase的氨基酸序列的基础上，进行同源建模、分子对接和同源蛋白氨基酸序列比对分析潜在关键氨基酸位点，构建突变蛋白库。对突变蛋白库中的每个蛋白作为蔗糖异构酶进行酶活检测，发掘酶催化效率显著提高的突变蛋白，为PdSIase-QAF，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述SEQ ID NO.1中的第148位的氨基酸由以前的精氨酸突变为了谷氨酰胺；第224位的氨基酸由以前的天冬氨酸突变为了丙氨酸；第306位的氨基酸由以前的酪氨酸突变为了苯丙氨酸。
实施例2重组菌的获得
大肠杆菌PdSIase-QAF、大肠杆菌PdSIase的获得
将SEQ ID NO.4所示的序列正向插入pET22b载体的NcoI和XhoI酶切位点之间，得到表达载体pET22b-PdSIase。
以pET22b-PdSIase为模板，引入SEQ ID NO.5～6所示的突变引物进行PCR扩增，得到表达载体pET22b-PdSIase-Q；以pET22b-PdSIase-Q为模板，引入SEQ ID NO.7～8所示的突变引物进行PCR扩增，得到表达载体pET22b-PdSIase-QA；以pET22b-PdSIase-QA为模板，引入SEQ ID NO.9～10所示的突变引物进行PCR扩增，得到表达载体pET22b-PdSIase-QAF。
所述SEQ ID NO.5～6所示的突变引物为编码PdSIase第148位氨基酸的核苷酸的突变引物；所述SEQ ID NO.7～8所示的突变引物为编码PdSIase第224位氨基酸的核苷酸的突变引物；所示SEQ ID NO.9～10所示的突变引物为编码PdSIase第306位氨基酸的核苷酸的突变引物。
所述PCR扩增的程序为94℃预变性5min；95℃变性30S，55℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保温60min。
所述PCR产物的检测方法采用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳结果如图3所示。将pET22b-PdSIase-QAF编码的PdSIase-QAF蛋白经过SDS-PAGE检测，结果如图3所示。
图3显示，表达产物的大小为1800bp左右，PdSIase-QAF蛋白的大小在70kda左右。
所述PCR产物的纯化方法为：先经诺唯赞FastPure Gel DNAExtraction Mini Kit试剂盒进行纯化后得到的纯化物1进行水浴消化，得到编码PdSIase-QAF蛋白的核苷酸序列。消化时的反应体系为ddH2O 3μL，PCR产物5μL，10×Fast DpnI Buffer 1μL，Fast Dpn I1μL。消化的温度为37℃，消化时间为5min。
取纯化物5μL转入宿主XL-10gold中，挑取阳性克隆送去测序，保留测序正确的突变体。
将测序正确的突变体导入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌PdSIase-QAF。
按同样的方法将表达载体pET22b-PdSIase导入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌PdSIase。
枯草芽孢杆菌PdSIase-QAF、枯草芽孢杆菌PdSIase的获得
将SEQ ID NO.2所示的序列正向插入pMA5载体的NdeI和BamHI酶切位点之间，得到表达载体pMA5-PdSIase-QAF。
将表达载体pMA5-PdSIase-QAF导入枯草芽孢杆菌WB600感受态中，用移液枪轻轻混匀；置于冰上30min，42℃热激90s，立即置于冰上2min；加入700μLLB培养基，37℃，200rpm培养1h；将培养物涂布在含卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置过夜培养，得到重组枯草芽孢杆菌PdSIase-QAF。
将SEQ ID NO.4所示的序列正向插入pMA5载体的NdeI和BamHI酶切位点之间，得到表达载体pMA5-PdSIase。
将表达载体pMA5-PdSIase导入枯草芽孢杆菌WB600感受态中，用移液枪轻轻混匀；置于冰上30min，42℃热激90s，立即置于冰上2min；加入700μl LB培养基，37℃，200rpm培养1h；将培养物涂布在含卡那霉素的LB固培养基上，37℃倒置过夜培养，得到重组枯草芽孢杆菌PdSIase。
枯草芽孢杆菌WB600感受态的制备方法如下：将WB600菌体接种于LB液体培养基中，37℃200rpm培养过夜；过夜培养物以10％的接种量接种于GM I溶液中；取1mL GM I培养物加入9mL GM I溶液中，37℃250rpm培养3.5h；取1mL上述GM I培养物加入9mL GM II中，37℃125rpm培养1.5h；5000rpm离心10min收集菌体；用1mL GM II溶液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞，可直接用于转化。
GM I溶液：1×最低盐溶液95.6mL、20％葡萄糖2.5mL、5％水解酪蛋白0.4mL、10％酵母汁1mL、10mg/mL色氨酸溶液0.5mL。
GMⅡ溶液：1×最低盐溶液96.98mL、20％葡萄糖2.5mL、5％水解酪蛋白0.08mL、10％酵母汁0.04mL、1M MgCl20.25mL、1M CaCl20.05mL、10mg/mL色氨酸溶液0.1mL。
10×最低盐溶液：K2HPO470g，KH2PO430g，(NH4)2SO410g，Na3C6H5O7·2H2O 5g，MgSO4·7H2O 1g，定容至500mL。
酵母PdSIase-QAF、酵母PdSIase的获得
将SEQ ID NO.2所示的序列正向插入pPIC9K载体的SnaBI和AvrII酶切位点之间，得到表达载体pPIC9K-PdSIase-QAF。
用限制性内切酶SacI将表达载体pPIC9K-PdSIase-QAF进行单酶切，得到线性化质粒。
将线性化质粒导入毕赤酵母，得到重组酵母PdSIase-QAF。
将SEQ ID NO.4所示的序列正向插入pPIC9K载体的SnaBI和AvrII酶切位点之间，得到表达载体pPIC9K-PdSIase。
用限制性内切酶SacI将表达载体pPIC9K-PdSIase进行单酶切，得到线性化质粒。
将线性化质粒导入毕赤酵母，得到重组酵母PdSIase。
实施例3PdSIase-QAF蛋白和PdSIase蛋白的制备以及PdSIase-QAF蛋白和PdSIase蛋白作为蔗糖异构酶的酶学性质
以大肠杆菌PdSIase-QAF和大肠杆菌PdSIase为例制备PdSIase-QAF蛋白和PdSIase蛋白的方法：
将大肠杆菌PdSIase-QAF和大肠杆菌PdSIase分别接种至10mL LB液体培养基中，37℃、250rpm震荡培养18h，得到种子液。
取1mL种子液，接种至500mL LB液体培养基中，37℃、250rpm震荡培养，当菌液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，并于16℃、250rpm继续震荡培养16h，之后，在4℃、7500rpm条件下离心15min，收集菌体。
取3g菌体用15mL溶液I重悬，并转移至玻璃杯中，超声15min，超声的条件为：超声3s，间隔6s，振幅30％，取超声后得到的超声裂解液在15000rpm，4℃条件下离心30min，得到上清液。
将上清液过镍柱，上样后，用50mL溶液II洗涤柱子，然后用5mL溶液III洗脱目的蛋白，收集用溶液III洗脱时的过柱后溶液。所述镍柱为Cytiva生产的规格为5mL的柱子。
将过柱后溶液接着过脱盐柱，收集过脱盐柱后的溶液冷冻干燥，得到相应的干粉。所述脱盐柱为Cytiva公司生产的规格为5mL的柱子。
所述利用大肠杆菌PdSIase-QAF得到的干粉为PdSIase-QAF，利用大肠杆菌PdSIase得到的干粉为PdSIase。
将PdSIase-QAF和PdSIase分别用pH7.0、100mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图4所示。
结果显示，两个蛋白的扩增得到的目标蛋白的大小相同。
PdSIase-QAF和PdSIase作为蔗糖异构酶的酶活性比较
蔗糖异构酶活性的测定方法采用3,5-二硝基水杨酸法。该方法的原理为蔗糖异构酶在一定条件下，催化蔗糖生成大量异麦芽酮糖和少量的海藻酮糖、葡萄糖和果糖。异麦芽酮糖为还原糖，3,5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原为显棕红色的氨基络合物，在一定范围内其颜色的深浅与还原糖的量成正比，故可以在540nm的波长下进行比色，计算酶活。酶活单位定义：每分钟释放1μmol异麦芽酮糖的酶量作为一个活力单位。
DNS溶液以水为溶剂包括如下质量浓度的组分：酒石酸钾钠182g/L、NaOH 10g/L、二硝基水杨酸10g/L、苯酚2g/L、硫酸钠2g/L。
用pH7.0，100mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液分别将上述PdSIase-QAF蛋白和PdSIase蛋白进行溶解，制备得到蛋白浓度为5mg/mL的待测溶液。
采用pH7.0，100mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液作为溶剂，制备摩尔浓度为1460mM的蔗糖溶液。
取试管，加入0.9mL蔗糖溶液和0.1mL待测溶液并混匀，30℃水浴反应8h，然后加入2mL DNS溶液并混匀，然后置于冰水环境中终止反应，然后置于沸水浴中10min，自然冷却后在540nm下测量吸光值。
吸光值和还原糖(异麦芽糖酮糖)浓度的标准曲线方程为Y＝0.5812X-0.056，R2＝0.9993；其中，Y为OD540nm吸光值，X为异麦芽酮糖浓度(mM)。
将测定和计算，得到PdSIase-QAF蛋白和PdSIase蛋白的比活力如表1所示。
表1显示，PdSIase-QAF蛋白的比活力为578U/mg，PdSIase蛋白的比活力为565U/mg，显然PdSIase-QAF蛋白的比活力较PdSIase蛋白的比活力提高了2.3％。
蛋白作为蔗糖异构酶的特异性
用pH7.0，100mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液分别溶解上述得到的PdSIase-QAF蛋白和PdSIase蛋白，得到蛋白浓度为5mg/mL的待测溶液。
采用pH7.0，100mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液作为溶剂，将蔗糖制备成摩尔浓度为1460mM的蔗糖溶液。
取试管，加入0.9mL的蔗糖溶液和0.1mL待测溶液并混匀，30℃水浴反应8h。反应结束后用去离子水稀释50倍，然后采用高效液相色谱法HPLC测定异麦芽酮糖在产物中的含量，结果如图5所示。
HPLC条件：戴安UltiMate 3000HPLC系统，示差折光检测器；
色谱柱：Rezex RCM-Monosaccharide Ca2+柱；柱温80℃；
流动相为纯水，流速0.6mL/min。
经检测，异麦芽糖酮糖质量的标准曲线方程为Y＝9592243000.0000X+164076.4000，R2＝0.9993；其中，Y为峰面积，X为异麦芽酮糖的质量(g)，出峰位置为9.7min。蔗糖质量的标准曲线方程为Y＝946337750.0000X+2370018.1667，R2＝1.0000；其中，Y为峰面积，X为蔗糖的质量(g)，出峰位置为9.4min。果糖质量的标准曲线方程为Y＝968650100.0000X+264589.0000，R2＝0.9989；其中，Y为峰面积，X为果糖的质量(g)，出峰位置为14.1min。葡萄糖质量的标准曲线方程为Y＝904077300.0000X+1204457.2000，R2＝0.9999；其中，Y为峰面积，X为葡萄糖的质量(g)，出峰位置为11.3min。海藻酮糖质量的标准曲线方程为Y＝941832500.00X+233270.10，R2＝1.00；其中，Y为峰面积，X为海藻酮糖的质量(g)，出峰位置为10.6min。
经检测和计算，PdSIase-QAF催化蔗糖溶液后得到的产物中的异麦芽酮糖在产物中所占的质量百分含量为91.28％，海藻酮糖在产物中所占的质量百分含量为2.14％。PdSIase催化蔗糖溶液后得到的产物中的异麦芽酮糖在产物中所占的质量百分含量为90.84，海藻酮糖在产物中所占的质量百分含量为2.53％，与PdSIase-QAF蛋白催化蔗糖溶液后得到的产物特异性不变。
PdSIase-QAF蛋白和PdSIase蛋白的动力学参数测定
以摩尔浓度为5～200mM的蔗糖溶液作为反应底物，在pH7.0，温度为30℃的条件下测定酶活力，通过GraphPad Prism version 5.0软件分别测定得到Km和Vmax，通过进一步计算获得Kcat、Kcat/Km值，动力学研究的结果如表1所示。
表1 PdSIase-QAF蛋白和PdSIase蛋白酶活力和动力学参数比较
酶 酶比活(U/mg) K<sub>m</sub>(mM) K<sub>cat</sub>(S<sup>-1</sup>) K<sub>cat</sub>/K<sub>m</sub>(S<sup>-1</sup>·mM<sup>-1</sup>)
PdSIase 565.0 21.34 724.0 33.93
PdSIase-QAF 578.0 21.22 970.2 45.72
表1显示，PdSIase-QAF的酶活力较PdSIase有所提高。与原始酶相比，PdSIase-QAF的Km值没有变化。此外，PdSIase-QAF的催化常数Kcat得到了提高，由原始酶的724.0S-1提高到PdSIase-QAF的970.2S-1。与原始酶相比，催化常数Kcat的提高，直接导致了PdSIase-QAF的催化效率Kcat/Km从33.93S-1·mM-1提高到45.72S-1·mM-1。最终结果表明，与PdSIase蛋白相比，PdSIase-QAF蛋白作为蔗糖异构酶的产物特异性保持了原始酶的优良特性并且催化效率提高了34.75％，具有更好的应用于工业生产的潜力。
由以上实施例可知，本发明提供了一种蔗糖异构酶突变体及其构建方法与应用及一种重组表达载体和重组菌。本发明的PdSIase-QAF是在PdSIase蛋白的基础上经过突变得到的。本发明得到的PdSIase-QAF蛋白较PdSIase蛋白在作为蔗糖异构酶时的比活力提高了2.3％，催化效率提高了34.75％，具有更好的工业应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广西科学院
广西中医药大学
<120> 一种蔗糖异构酶突变体及其构建方法与应用及一种重组表达载体和重组菌
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 598
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Phe Leu Asn Gly Phe Lys Thr Val Ile Ala Leu Thr Met Ala Ser
1 5 10 15
Ser Phe Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Leu Thr Lys Pro Ser Thr Pro Ile
20 25 30
Ala Ala Thr Asn Ile Gln Lys Ser Ala Asp Phe Pro Ile Trp Trp Lys
35 40 45
Gln Ala Val Phe Tyr Gln Ile Tyr Pro Arg Ser Phe Lys Asp Ser Asn
50 55 60
Gly Asp Gly Ile Gly Asp Ile Pro Gly Ile Ile Glu Lys Leu Asp Tyr
65 70 75 80
Leu Lys Met Leu Gly Val Asp Ala Ile Trp Ile Asn Pro His Tyr Glu
85 90 95
Ser Pro Asn Thr Asp Asn Gly Tyr Asp Ile Ser Asp Tyr Arg Lys Ile
100 105 110
Met Lys Glu Tyr Gly Ser Met Ala Asp Phe Asp Arg Leu Val Ala Glu
115 120 125
Met Asn Lys Arg Gly Met Arg Leu Met Ile Asp Ile Val Ile Asn His
130 135 140
Thr Ser Asp Gln His Arg Trp Phe Val Gln Ser Arg Ser Gly Lys Asp
145 150 155 160
Asn Pro Tyr Arg Asp Tyr Tyr Phe Trp Arg Asp Gly Lys Gln Gly Gln
165 170 175
Ala Pro Asn Asn Tyr Pro Ser Phe Phe Gly Gly Ser Ala Trp Gln Leu
180 185 190
Asp Lys Gln Thr Asp Gln Tyr Tyr Leu His Tyr Phe Ala Pro Gln Gln
195 200 205
Pro Asp Leu Asn Trp Asp Asn Pro Lys Val Arg Ala Glu Leu Tyr Ala
210 215 220
Ile Leu Arg Phe Trp Leu Asp Lys Gly Val Ser Gly Leu Arg Phe Asp
225 230 235 240
Thr Val Ala Thr Phe Ser Lys Ile Pro Gly Phe Pro Asp Leu Ser Lys
245 250 255
Ala Gln Leu Lys Asn Phe Ala Glu Ala Tyr Thr Glu Gly Pro Asn Ile
260 265 270
His Lys Tyr Ile His Glu Met Asn Arg Gln Val Leu Ser Lys Tyr Asn
275 280 285
Val Ala Thr Ala Gly Glu Ile Phe Gly Val Pro Val Ser Ala Met Pro
290 295 300
Asp Phe Phe Asp Arg Arg Arg Glu Glu Leu Asn Ile Ala Phe Thr Phe
305 310 315 320
Asp Leu Ile Arg Leu Asp Arg Tyr Pro Asp Gln Arg Trp Arg Arg Lys
325 330 335
Pro Trp Thr Leu Ser Gln Phe Arg Gln Val Ile Ser Gln Thr Asp Arg
340 345 350
Ala Ala Gly Glu Phe Gly Trp Asn Ala Phe Phe Leu Asp Asn His Asp
355 360 365
Asn Pro Arg Gln Val Ser His Phe Gly Asp Asp Ser Pro Gln Trp Arg
370 375 380
Glu Arg Ser Ala Lys Ala Leu Ala Thr Leu Leu Leu Thr Gln Arg Ala
385 390 395 400
Thr Pro Phe Ile Phe Gln Gly Ala Glu Leu Gly Met Thr Asn Tyr Pro
405 410 415
Phe Lys Asn Ile Glu Glu Phe Asp Asp Ile Glu Val Lys Gly Phe Trp
420 425 430
Asn Asp Tyr Val Ala Ser Gly Lys Val Asn Ala Ala Glu Phe Leu Gln
435 440 445
Glu Val Arg Met Thr Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Met Gln Trp
450 455 460
Asn Asp Ser Val Asn Ala Gly Phe Thr Gln Gly Lys Pro Trp Phe His
465 470 475 480
Leu Asn Pro Asn Tyr Lys Gln Ile Asn Ala Ala Arg Glu Val Asn Lys
485 490 495
Pro Asp Ser Val Phe Ser Tyr Tyr Arg Gln Leu Ile Asn Leu Arg His
500 505 510
Gln Ile Pro Ala Leu Thr Ser Gly Glu Tyr Arg Asp Leu Asp Pro Gln
515 520 525
Asn Asn Gln Val Tyr Ala Tyr Thr Arg Ile Leu Asp Asn Glu Lys Tyr
530 535 540
Leu Val Val Val Asn Phe Lys Pro Glu Gln Leu His Tyr Ala Leu Pro
545 550 555 560
Asp Asn Leu Thr Ile Ala Ser Ser Leu Leu Glu Asn Val His Gln Pro
565 570 575
Ser Leu Gln Glu Asn Ala Ser Thr Leu Thr Leu Ala Pro Trp Gln Ala
580 585 590
Gly Ile Tyr Lys Leu Asn
595
<210> 2
<211> 1797
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtttctga acggcttcaa aaccgttatt gcactgacca tggcaagcag cttttatctg 60
gcagcaagtc cgctgaccaa accgagcaca ccgattgcag caaccaatat tcagaaaagc 120
gcagattttc cgatttggtg gaaacaggca gtgttctatc agatttatcc gcgtagcttt 180
aaagatagca atggtgatgg tattggtgac attccgggta ttattgagaa actggattac 240
ctgaaaatgc tgggtgttga tgccatttgg attaacccgc attatgaaag cccgaatacc 300
gataatggtt atgatattag cgactatcgc aaaatcatga aagaatatgg tagcatggcc 360
gattttgatc gtctggttgc agaaatgaat aaacgtggta tgcgtctgat gatcgatatc 420
gttattaatc ataccagcga tcaacatcgt tggtttgttc agagccgtag cggtaaagat 480
aatccgtatc gtgattatta cttttggcgt gatggtaaac agggtcaagc accgaataac 540
tatccgagct tttttggtgg tagcgcatgg cagctggata aacagaccga tcagtattat 600
ctgcattatt ttgcaccgca gcagccggat ctgaattggg ataatccgaa agttcgtgca 660
gaactgtatg caattctgcg tttttggctg gacaaaggtg ttagtggcct gcgttttgat 720
accgttgcaa cctttagcaa aattccgggt tttccggatc tgtcaaaagc acagctgaaa 780
aactttgcag aagcatatac cgaaggtccg aacatccata aatacatcca tgaaatgaat 840
cgtcaggtgc tgagcaaata caatgttgca accgcaggcg aaatttttgg tgttccggtt 900
agcgcaatgc cggatttctt cgatcgtcgt cgtgaagaac tgaacattgc atttaccttt 960
gatctgattc gtctggatcg ttatccggat cagcgttggc gtcgtaaacc gtggacactg 1020
agccagtttc gtcaggttat tagccagaca gatcgtgcag ccggtgaatt tggttggaat 1080
gcattttttc tggacaacca tgataatccg cgtcaggtga gccattttgg tgatgatagt 1140
ccgcagtggc gtgaacgtag cgcaaaagca ctggcaaccc tgctgctgac ccagcgtgca 1200
accccgttta tctttcaggg tgccgaactg ggtatgacca attatccgtt taaaaacatc 1260
gaagagttcg acgacattga agtgaaaggc ttttggaatg attatgtggc cagcggcaaa 1320
gttaatgcag cagaattcct gcaagaggtt cgtatgacca gccgtgataa tagtcgtacc 1380
ccgatgcagt ggaatgatag cgttaatgcc ggttttaccc agggcaaacc gtggtttcat 1440
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<210> 3
<211> 598
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Phe Leu Asn Gly Phe Lys Thr Val Ile Ala Leu Thr Met Ala Ser
1 5 10 15
Ser Phe Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Leu Thr Lys Pro Ser Thr Pro Ile
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Ala Ala Thr Asn Ile Gln Lys Ser Ala Asp Phe Pro Ile Trp Trp Lys
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Gln Ala Val Phe Tyr Gln Ile Tyr Pro Arg Ser Phe Lys Asp Ser Asn
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Gly Asp Gly Ile Gly Asp Ile Pro Gly Ile Ile Glu Lys Leu Asp Tyr
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Leu Lys Met Leu Gly Val Asp Ala Ile Trp Ile Asn Pro His Tyr Glu
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Ser Pro Asn Thr Asp Asn Gly Tyr Asp Ile Ser Asp Tyr Arg Lys Ile
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Met Lys Glu Tyr Gly Ser Met Ala Asp Phe Asp Arg Leu Val Ala Glu
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Met Asn Lys Arg Gly Met Arg Leu Met Ile Asp Ile Val Ile Asn His
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Ala Pro Asn Asn Tyr Pro Ser Phe Phe Gly Gly Ser Ala Trp Gln Leu
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Asp Lys Gln Thr Asp Gln Tyr Tyr Leu His Tyr Phe Ala Pro Gln Gln
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Pro Asp Leu Asn Trp Asp Asn Pro Lys Val Arg Ala Glu Leu Tyr Asp
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Ile Leu Arg Phe Trp Leu Asp Lys Gly Val Ser Gly Leu Arg Phe Asp
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<400> 4
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ccgatgcagt ggaatgatag cgttaatgcc ggttttaccc agggcaaacc gtggtttcat 1440
ctgaatccga attacaagca gattaatgcc gcacgcgaag ttaataaacc ggatagcgtt 1500
tttagctatt atcgccagct gattaacctg cgtcatcaga ttccggcact gacctcaggt 1560
gaatatcgtg atctggatcc gcagaataat caggtttatg catatacccg cattctggat 1620
aacgagaaat atctggttgt ggtgaacttt aaacctgagc agctgcatta tgcactgccg 1680
gataatctga ccattgcatc aagcctgctg gaaaatgttc atcagccgag cctgcaagaa 1740
aatgcaagca ccctgacact ggcaccgtgg caggcaggta tctataaact gaattaa 1797
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagcgatcag catcgttggt ttgttcagag cc 32
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aacgatgctg atcgctggta tgattaataa cgatatc 37
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgtatgcaa ttctgcgttt ttggctggac aa 32
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgcagaattg catacagttc tgcacgaact ttcgg 35
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgccggatt tcttcgatcg tcgt 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acgatcgaag aaatccggca ttgc 24

Claims (10)

1.一种蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF，其特征在于，所述PdSIase-QAF的氨基酸如SEQID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种权利要求1所述蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以蔗糖异构酶PdSIase的核苷酸序列为模板，利用突变引物对所述的核苷酸序列进行突变，得到权利要求2所述的编码蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF的核苷酸；
(2)将权利要求2所述的编码蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF的核苷酸进行翻译得到蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF；
所述突变的位点为编码蔗糖异构酶PdSIase第148位、第224位和第306位氨基酸的核苷酸位点。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述蔗糖异构酶PdSIase的氨基酸如SEQ ID NO.3所示；
编码所述蔗糖异构酶PdSIase的核苷酸如SEQ ID NO.4所示。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，编码所述蔗糖异构酶PdSIase第148位氨基酸的核苷酸的突变引物如SEQ ID NO.5～6所示；
编码所述蔗糖异构酶PdSIase第148位氨基酸的核苷酸的突变为：由编码精氨酸的核苷酸序列突变为编码谷氨酰胺的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，编码所述蔗糖异构酶PdSIase第224位氨基酸的核苷酸的突变引物如SEQ ID NO.7～8所示；
编码所述蔗糖异构酶PdSIase第224位氨基酸的核苷酸的突变为：由编码天冬氨酸的核苷酸序列突变为编码丙氨酸的核苷酸序列。
7.根据权利要求3～6任意一项所述的构建方法，其特征在于，编码所述蔗糖异构酶PdSIase第306位氨基酸的核苷酸的突变引物如SEQ IDNO.9～10所示；
编码所述蔗糖异构酶PdSIase第306位氨基酸的核苷酸的突变为：由编码酪氨酸的核苷酸序列突变为编码苯丙氨酸的核苷酸序列。
8.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括初始载体和权利要求2所述的编码蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF的核苷酸序列；所述核苷酸序列重组于初始载体的多克隆酶切位点；所述初始载体为pET22b、pMA5或pPIC9K。
9.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌通过将权利要求8所述的重组表达载体转入到宿主菌获得，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)、枯草芽孢杆菌WB600或毕赤酵母。
10.权利要求1所述的蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF、权利要求8所述的重组表达载体或权利要求9所述的重组菌在催化底物生产异麦芽酮糖方面的应用；
所述催化的温度为28～32℃；
所述催化的时间为7.5～8.5h；
所述底物与所述的蔗糖异构酶突变体PdSIase-QAF、所述的重组表达载体或所述的重组菌的体积比为8～10:1；
所述底物的摩尔浓度为1450～1470mM；
所述底物的pH为6.9～7.1；
所述底物包括蔗糖溶液、甘蔗汁和糖蜜中的一种或几种。
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