CN112063666B

CN112063666B - 一种重组蔗糖异构酶在转化蔗糖制备异麦芽酮糖中的应用

Info

Publication number: CN112063666B
Application number: CN202010775574.1A
Authority: CN
Inventors: 柳志强; 张烽; 蔡雪; 贾东旭; 金利群; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2020-08-05
Filing date: 2020-08-05
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2040-08-05
Also published as: CN112063666A

Abstract

本发明提供一种重组蔗糖异构酶在转化蔗糖制备异麦芽酮糖中的应用，所述应用的方法为：以含有重组蔗糖异构酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体、湿菌体提取的纯酶或湿菌体的冻干菌体为催化剂，以蔗糖为底物，以pH 4.6‑10.0的缓冲液为反应介质，在20‑55℃、180rpm进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得异麦芽酮糖；所述重组蔗糖异构酶基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。利用重组大肠杆菌或重组蔗糖异构酶为生物催化剂转化蔗糖，可以生成异麦芽酮糖，转化率达82％以上，无副产物。

Description

一种重组蔗糖异构酶在转化蔗糖制备异麦芽酮糖中的应用

(一)技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体利用生物催化法生产异麦芽酮糖，并涉及一种蔗糖异构酶及其编码基因，含有该编码基因的载体、工程菌及其应用。

(二)背景技术

异麦芽酮糖于1957年由德国南德制糖公司首次制得其结晶体，又称为帕拉金糖(Palatinose)。天然蜂蜜中含有异麦芽酮糖，不过含量极少，难以提取。异麦芽酮糖为还原型的双糖，其结构如图1所示，是由葡萄糖与果糖以α-1,6糖苷键结合形成。异麦芽酮糖是蔗糖的同分异构体，它们的相对分子量相同但是葡萄糖和果糖所连接的位置不同。

据研究表明，大多数的细菌、霉菌等微生物都不能代谢异麦芽酮糖，由此可知异麦芽酮糖具有防龋齿性。此外，异麦芽酮糖具有低吸湿性，即使在溶液中添加有机酸也不会改变异麦芽酮糖的吸湿性。而且在酸性环境中其晶体结构也能保持稳定，因此，添加异麦芽酮糖的产品相比于添加蔗糖的产品，其保质期更长。由于异麦芽酮糖的低热量、防龋齿性、低吸湿性、极耐酸解性等特质，以及近年来人们对自身健康的重视程度的不断增加，异麦芽酮糖受到了越来越广泛的关注。

本发明涉及生物催化合成异麦芽酮糖的方法，即通过蔗糖异构酶(Sucroseisomaerase，SI)的作用将蔗糖异构化得到异麦芽酮糖。所使用的催化剂既可以是含酶的微生物，也可以是游离的酶。

1.微生物转化法

许多野生来源的微生物已经被发现具备蔗糖异构酶的活力，比如克莱伯氏杆菌属、泛生菌属、红色精朊杆菌属、肠杆菌属、欧文氏杆菌属以及沙雷氏杆菌属等，其产物转化率通常在65％左右。这种方法存在较大的缺陷，由于蔗糖异构酶处在细胞的壁膜空间且野生菌蔗糖异构酶的活力不高，从而催化转化过程需要菌体的量十分巨大，后续分离纯化难度较大，所以难以应用于工业的大规模生产。

2.酶转化法

酶转化法能够解决微生物转化法所存在的需要大量菌体以及难以高强度生产等缺点。其具体方式为事先通过分离纯化的方法从产蔗糖异构酶的微生物中得到游离酶，再利用固定化细胞技术来实现工业化的生物催化工艺以生产异芽酮糖。由于固定化酶具备许多优势，故一般采用从菌体中提取纯化酶后，再通过固定化技术得到固定化酶，利用固定化酶进行异麦芽酮糖的生产。但是，已报道的蔗糖异构酶在催化反应过程中还会产生海藻酮糖、葡萄糖以及果糖等副产物，严重影响异麦芽酮糖产品质量。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种重组蔗糖异构酶在转化蔗糖制备异麦芽酮糖中的应用，利用含重组蔗糖异构酶基因的工程菌生物法转化蔗糖得到异麦芽酮糖，提高了转化率，且没有副产物，解决了高效生产异麦芽酮糖的技术难题。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种重组蔗糖异构酶在转化蔗糖制备异麦芽酮糖中的应用，所述重组蔗糖异构酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；具体所述应用的方法为：以含有重组蔗糖异构酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体、湿菌体提取的纯酶或湿菌体的冻干菌体为催化剂，以蔗糖为底物，以pH 4.6-10.0的缓冲液为反应介质，在20-55℃(优选40℃)、180rpm进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得异麦芽酮糖；所述重组蔗糖异构酶基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

进一步，所述湿菌体用量以缓冲液体积计为5～20g/L(优选10～15g/L)，所述纯酶用量以缓冲液体积计为0.01-0.5g/L(优选0.02-0.1g/L)，所述冻干菌体用量以缓冲液体积计为1-5g/L(优选1-2g/L)，所述底物用量以缓冲液体积计为10-600g/L(优选50～200g/L)。

进一步，所述缓冲液为50mM，pH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。

进一步，所述反应液分离纯化方法为：反应结束后，反应液在沸水浴中加热灭活10min，离心后取上清液，通过旋转蒸发进行浓缩至1/10倍体积后，获得浓缩液，室温(25-30℃)冷却并加入干的异麦芽酮糖作为晶种，得到小的白色晶体，通过离心收集晶体，干燥后得到异麦芽酮糖；所述晶种加入量以浓缩液重量计为0.01g/g。

本发明所述湿菌体按如下方法制备：将含重组蔗糖异构酶编码基因的工程菌接种至含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，在37℃下培养12-16h，获得种子液；再以体积浓度1-2％的接种量将种子液接种到新鲜的含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下培养至菌体浓度OD₆₀₀为0.4-0.8(优选0.6)，再加入终浓度为0.1mM的IPTG，25℃下诱导培养10-12h，然后在4℃下8000rpm离心10min，收集湿菌体。

本发明纯酶按如下方法制备：将含重组蔗糖异构酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用50mM柠檬酸-磷酸氢二钠(pH 6.0)重悬，冰浴条件下超声破碎菌体20min(100W，破碎1s，间歇3s)，超声后离心(12000r/min，10min，4℃)，取上清液，得粗酶液；采用Ni-NTA柱进行纯化，用5-10倍柱体积上样平衡缓冲液(50mM Tris-HCl，250mM NaCl和5mM咪唑，pH 8.0)平衡，流速1.5mL/min；以1.5mL/min的速率进行粗酶液上样；用上样平衡缓冲液洗涤以除去未吸附的杂蛋白；分别用0-500mM咪唑浓度的洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl、250mM NaCl、pH 8.0)进行梯度洗脱，收集含50mM咪唑的洗脱缓冲液的流出液，超滤膜(10kDa截留分子量)脱盐浓缩，收集截留液，在-71℃，9.0Pa条件下冻干，获得蔗糖异构酶纯酶。

进一步，所述冻干菌体是将湿菌体在-17℃冷冻干燥24h，获得冻干菌体。

本发明蔗糖异构酶基因来自于欧文氏菌Ejp617(Erwinia sp.Ejp617，GenBank:G37835)，通过密码子优化合成了其表达基因，并含有Nco I和Xho I限制性位点。将含有NcoI和XhoI限制性位点的合成基因连接到pET-28b载体中，形成含6个组氨酸标签的重组质粒pET-28b-SI，该目的片段含有一个长为1797bp的开放阅读框(SEQ ID NO.2)，利用软件对该基因序列进行分析，推知所述蔗糖异构酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。将重组载体pET-28b-SI转化至大肠杆菌BL21中，获得的重组大肠杆菌BL21/pET-28b-SI。重组大肠杆菌经诱导培养，培养液经离心分离得到含有蔗糖异构酶的菌体细胞。菌体细胞超声波破碎后，离心去除细胞碎片，所得的上清液通过Ni-NTA金属螯合亲和层析分离纯化，得到重组蔗糖异构酶纯酶。

所述重组蔗糖异构酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

MetSerArgPheThrLeuSerThrValMETAlaLeuLeuValAlaProValLeuSerValLeuProGlyGlnValMETAlaGlyLysMETAspMETAlaThrThrGlnLeuAlaGlnLysSerAspAspPheProAlaTrpTrpLysGlnAlaValPheTyrGlnValTyrProArgSerPheLysAspThrAsnGlyAspGlyIleGlyAspLeuLysGlyIleIleGluLysLeuAspTyrLeuLysArgLeuGlyValAspAlaIleTrpIleAsnProHisTyrAspSerProAsnThrAspAsnGlyTyrAspIleArgAspTyrArgLysIleMETLysGluTyrGlyThrMETGluAspPheAspArgLeuIleAlaGluMETAsnLysArgAsnMETArgLeuMETIleAspIleValIleAsnHisThrSerAspGlnHisSerTrpPheValGlnSerLysGlySerLysAspAsnProTyrArgAspTyrTyrPheTrpArgAspGlyLysAsnGlyGlnProProAsnAsnTyrProSerPhePheGlyGlySerAlaTrpLysLysGluAspAsnSerGlyGlnTyrTyrLeuHisTyrPheAlaThrGlnGlnProAspLeuAsnTrpAspAsnProLysValArgGluAspLeuTyrAlaMETLeuArgPheTrpLeuAspLysGlyValAlaGlyLeuArgPheAspThrValAlaThrTyrAlaLysIleProGlyPheProAspLeuThrProGlnGlnArgLysAsnPheAlaArgThrTyrThrGluGlyProSerIleHisArgTyrIleLysGluMETHisGlnGlnValPheSerHisTyrAsnIleAlaThrAlaGlyGluIlePheGlyValProLeuGluLysSerIleAspTyrPheAspArgArgArgGlyGluLeuAsnIleAlaPheThrPheAspLeuIleArgLeuAspArgGlyValGluGluArgTrpArgGlnLysAlaTrpSerLeuThrAspPheArgGlnThrIleAspLysValAspArgValAlaGlyLysTyrGlyTrpAsnAlaPhePheLeuAspAsnHisAspAsnProArgAlaValSerHisPheGlyAspAspArgProGlnTrpArgGlnAlaSerAlaLysAlaLeuAlaThrLeuMETIleThrGlnArgAlaThrProPheIleTyrGlnGlySerGluLeuGlyMETThrAsnTyrProPheLysSerIleAlaAspPheAspAspIleGluValLysGlyPheTrpGlnAspTyrValSerSerGlyLysValAspProGluGluPheMETArgAsnValArgLeuThrSerArgAspAsnSerArgThrProPheGlnTrpAspGluSerAlaAsnAlaGlyPheThrSerGlyThrProTrpPheAsnValAsnProAsnTyrLysLeuIleAsnAlaAlaAspGlnThrArgAspProAspSerValPheAsnTyrTyrArgLysLeuIleGlyLeuArgHisAlaIleProAlaLeuThrTyrGlyGluTyrLysAspLeuAspProAsnAsnAspThrValTyrAlaPheThrArgThrHisGlyAspLysArgTyrLeuValValIleAsnPheLysGluAsnValValAsnTyrArgLeuProAspGlnLeuThrIleArgGlnThrLeuSerGluSerSerAlaIleGlnProValAlaGluAsnAlaArgGluLeuLeuLeuGlnProTrpGlnSerGlyIleTyrGlnLeuAsn

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上、且具有相同的酶活性，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明所述蛋白的片段、衍生物或类似物是指基本上保持本发明所述的蛋白酶相同的生物学功能或活性的蛋白，可以是下列情形：(Ⅰ)一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；(II)一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；(Ⅲ)成熟蛋白与另一种化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(Ⅳ)附加的氨基酸序列融合进成熟的蛋白而形成的蛋白序列(如用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列)。

所述蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是纯天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如：细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的。本发明的蛋白还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明所述重组蔗糖异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示：

ATGTCTCGTT TCACCCTGTC TACCGTTATG GCTCTGCTGG TTGCTCCGGT

TCTGTCTGTT

CTGCCGGGTC AGGTTATGGC TGGTAAAATG GACATGGCTA

CCACCCAGCT GGCTCAGAAA

TCTGACGACT TCCCGGCGTG GTGGAAACAG GCGGTCTTCT

ACCAGGTGTA CCCGCGCTCT

TTCAAAGACA CCAACGGTGA CGGTATCGGT GACCTGAAAG

GTATCATCGA AAAACTGGAC

TACCTGAAAC GTCTGGGTGT TGACGCTATC TGGATCAACC

CGCACTACGA CTCTCCGAAC

ACCGACAACG GTTACGACAT CCGTGACTAC CGTAAAATCA

TGAAAGAATA CGGTACCATG

GAAGACTTCG ACCGTCTGAT CGCTGAAATG AACAAACGTA

ACATGCGTCT GATGATCGAC

ATCGTTATCA ACCACACCTC TGACCAGCAC TCTTGGTTCG TTCAGTCTAA

AGGTTCTAAA

GACAACCCGT ACCGTGACTA CTACTTCTGG CGTGACGGTA

AAAACGGTCA GCCGCCGAAC

AACTACCCGT CTTTCTTCGG TGGTTCTGCT TGGAAAAAAG

AAGACAACTC TGGTCAGTAC

TACCTGCACT ACTTCGCTAC CCAGCAGCCG GACCTGAACT

GGGACAACCC GAAAGTTCGT

GAAGACCTGT ACGCTATGCT GCGTTTCTGG CTGGACAAAG

GTGTTGCTGG TCTGCGTTTC

GACACCGTTG CTACCTACGC TAAAATCCCG GGTTTCCCGG

ACCTGACCCC GCAGCAGCGT

AAAAACTTCG CTCGTACCTA CACCGAAGGT CCGTCTATCC

ACCGTTACAT CAAAGAAATG

CACCAGCAGG TTTTCTCTCA CTACAACATC GCTACCGCTG

GTGAAATCTT CGGTGTTCCG

CTGGAAAAAT CTATCGACTA CTTCGACCGT CGTCGTGGTG

AACTGAACAT CGCTTTCACC

TTCGACCTGA TCCGTCTGGA CCGTGGTGTT GAAGAACGTT

GGCGTCAGAA AGCTTGGTCT

CTGACCGACT TCCGTCAGAC CATCGACAAA GTTGACCGTG

TTGCTGGTAA ATACGGTTGG

AACGCTTTCT TCCTGGACAA CCACGACAAC CCGCGTGCTG TTTCTCACTT

CGGTGACGAC

CGTCCGCAGT GGCGTCAGGC TTCTGCTAAA GCTCTGGCTA

CCCTGATGAT CACCCAGCGT

GCTACCCCGT TCATCTACCA GGGTTCTGAA CTGGGTATGA

CCAACTACCC GTTCAAATCT

ATCGCTGACT TCGACGACAT CGAGGTTAAA GGCTTCTGGC

AGGACTACGT TTCTTCTGGT

AAAGTTGACC CGGAAGAATT CATGCGTAAC GTTCGTCTGA

CCTCTCGTGA CAACTCTCGT

ACCCCGTTCC AGTGGGACGA ATCTGCTAAC GCTGGTTTCA

CCTCTGGTAC CCCGTGGTTC

AACGTTAACC CGAACTACAA ACTGATCAAC GCTGCTGACC

AGACCCGTGA CCCGGACTCT

GTTTTCAACT ACTACCGTAA ACTGATCGGT CTGCGTCACG

CTATCCCGGC TCTGACCTAC

GGTGAATACA AAGACCTGGA CCCGAACAAC GACACCGTTT

ACGCTTTCAC CCGTACCCAC

GGTGACAAAC GTTACCTGGT TGTTATCAAC TTCAAAGAAA

ACGTTGTTAA CTACCGTCTG

CCGGACCAGC TGACCATCCG TCAGACCCTG TCTGAATCTT

CTGCTATCCA GCCGGTTGCT

GAAAACGCTC GTGAACTGCT GCTGCAGCCG TGGCAGTCTG

GTATCTACCA GCTGAAC

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有70％以上同源性、且具有相同的功能，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。

另外，可与SEQ ID NO：2所示多核苷酸序列杂交的多核苷酸(至少具有50％同源性，优选具有70％同源性)，也在本发明保护范围之列，特别是在严格条件下可与本发明所述核苷酸序列杂交的多核苷酸。所述“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清，0.1％Ficoll，42℃；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的蛋白与SEQ ID NO：1所示的蛋白有相同的生物学功能和活性。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种来源于欧文氏菌Ejp617(Erwinia sp.Ejp617)的蔗糖异构酶基因，该基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，再转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌；该重组大肠杆菌经细胞破碎，分离纯化获得重组蔗糖异构酶；利用重组大肠杆菌或重组蔗糖异构酶为生物催化剂转化蔗糖，可以生成异麦芽酮糖，转化率达82％以上，无副产物；而目前大部分生物法只能制备65％左右产率的异麦芽酮糖(K.planticola UQ14S，66％；Erwiniasp.D12，65％；E.rhapontici NCPPB1578，65％)。与此同时，这些菌株催化反应过程中还会产生海藻酮糖、葡萄糖以及果糖等副产物，严重影响异麦芽酮糖产品质量。

(四)附图说明

图1为异麦芽酮糖化学结构图。

图2为PCR扩增的蔗糖异构酶基因和双酶切质粒pET-28b的琼脂糖凝胶电泳图，泳道M为标准蛋白，泳道1和2均为重组质粒pET-28b-SI；泳道3为质粒pET-28b。

图3为构建的重组质粒pET-28b-SI示意图。

图4为异麦芽酮糖标准曲线图。

图5为重组蔗糖异构酶的最适pH图。

图6为重组蔗糖异构酶的pH稳定性图。

图7为重组蔗糖异构酶的最适温度图。

图8为重组蔗糖异构酶的热稳定性图。

图9为重组蔗糖异构酶的反应时间进程图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

LB培养基组成：5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，溶剂为水，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

LB平板组成：在LB液体培养基的基础上加入20g/L的琼脂粉。

实施例1：新型蔗糖异构酶的克隆

1、采用基因组挖掘方法，从NCBI数据库中挖掘获得来自于欧文氏菌Ejp617(Erwinia sp.Ejp617，GenBank:G37835)的新型蔗糖异构酶，通过密码子优化合成了其表达基因，并含有Nco I和Xho I限制性位点。将含有Nco I和Xho I限制性位点的合成基因连接到pET-28b载体中，形成含6个组氨酸标签的重组质粒pET-28b-SI，该目的片段含有一个长为1797bp的开放阅读框(核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示)，琼脂糖凝胶电泳显示条带见图2(泳道1和2)。利用软件对该基因序列进行分析，推知所述蔗糖异构酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、载体线性化：用限制性核酸内切酶Nco I和Xho I将质粒pET-28b进行双酶切。双酶切反应体系各组分加入量(总体积20μL):Buffer 2μL，质粒10μL，Nco I和Xho I各1μL，加水补至20μL。37℃孵育1小时，用DNA快速回收试剂盒纯化。琼脂糖凝胶电泳显示条带大小为6500bp左右(图2泳道3)。

3、将步骤1扩增片段和步骤2酶切质粒用T4 DNA连接酶(ThermoFisher有限公司)进行连接，22℃连接1小时，得到重组质粒pET-28b-SI，构建示意图如图3所示。

4、取10μL重组质粒pET-28b-SI转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，加入1000μLLB培养基，37℃，200rpm培养1h。5000rpm离心5min，弃900μL上清，用剩余培养基将菌重悬，涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。获得的阳性重组子经培养后，提取质粒，送样测序，利用软件分析测序结果，显示重组质粒构建成功，获得重组大肠杆菌BL21/pET-28b-SI。

实施例2：蔗糖异构酶重组菌的发酵

将实施例1获得的重组大肠杆菌BL21/pET-28b-SI接种至含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃下培养12-16h，再以1％(v/v)接种量接种到新鲜的含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下培养至OD₆₀₀＝0.6，再向LB液体培养基加入终浓度为0.1mM的IPTG，22℃下诱导培养10-12h，然后在4℃下8000rpm离心10min，收集重组大肠杆菌BL21/pET-28b-SI湿菌体，获得含有重组蔗糖异构酶基因的菌体细胞。

实施例3：重组蔗糖异构酶的分离纯化

取1g实施例2方法获得的重组大肠杆菌BL21/pET-28b-SI湿菌体，于50mM柠檬酸-磷酸氢二钠(pH 6.0)缓冲液中，冰浴条件下超声20min(100W，破碎1s，间歇3s)，12000r/min、4℃离心10min，取上清液，得粗酶液；采用Ni-NTA柱进行纯化，装柱体积10mL，用5倍柱体积上样平衡缓冲液(50mM Tris-HCl、250mM NaCl、5mM咪唑，pH 8.0)平衡，流速1.5mL/min；以1.5mL/min的速率进行粗酶液上样，用平衡缓冲液洗涤未吸附的杂蛋白；分别用50，100，150，200，250，500mM咪唑浓度的洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl、250mM NaCl、pH8.0)进行梯度洗脱，收集含50mM咪唑的洗脱缓冲液的流出液，超滤膜(10kDa截留分子量)脱盐浓缩，收集截留液，在-71℃，9.0Pa条件下冻干，获得纯化的蔗糖异构酶纯酶26mg，于-20℃保藏。

酶活测定体系：0.02mg纯酶、1mL 50mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH6.0)，蔗糖加入浓度50g/L。于40℃条件下反应30min，反应结束后在沸水浴中加热10min灭活。离心后取上清液，用流动相(乙腈：水＝4：1，v/v)稀释5倍后，用0.45μm孔径的微孔滤膜(水系)过滤，取滤液采用高效液相色谱测定异麦芽酮糖峰面积，根据异麦芽酮糖的标准曲线(如图4所示)，获得异麦芽酮糖的转化率为81.5％。而Lee等人(Bioresour Technol，2011，120(19)：9179-9184)将Enterobacter sp.FMB-1中的蔗糖异构酶基因ESI在S.cerevisiae EBY100菌株中异源表达，其重组菌的蔗糖转化率仅为6.4％。

液相色谱仪为Waters2414，采用安捷伦ZORBAX糖分析专用色谱柱，规格为4.6×250mm，孔径为70埃，粒径为5μm，比表面积300m²/g，载碳量3.5％，pH范围2.0-8.0；流动相采用乙腈和水，其体积比为4:1；检测器则选用示差折光检测器；进样量设置为10μL；柱温和外部温度分别设置为30℃和35℃；流动相流速设置为1.5mL/min。

酶活力定义：40℃，pH 6.0的条件下，1min内催化蔗糖产生1μmol异麦芽酮糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

转化率计算：转化率(％)＝实际异麦芽酮糖生成量/蔗糖总含量。

实施例4：重组蔗糖异构酶的最适pH

取实施例3方法获得的纯酶0.02mg分别加入1mL含50g/L蔗糖的不同pH值的50mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 4.6、5.0、5.6、6.0、6.5、7.0、7.5)，50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5、8.0、8.6)，以及50mM Gly-NaOH缓冲液(pH8.6、9.0、9.6、10.0)中，于40℃、180rpm条件下反应30min，反应结束后在沸水浴中加热10min灭活。离心后取上清液，采用实施例3方法测试酶活。结果如图5所示，蔗糖异构酶在pH 4.5-10之间都展示了一定酶活，当pH为6时，蔗糖异构酶转化能力最强，转化率达到80.4％。因此，确定该充足蔗糖异构酶的最适pH为6。

实施例5：重组蔗糖异构酶的pH稳定性

取实施例3方法获得的纯酶0.02mg分别在1mL不同pH值的50mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 4.6、5.0、5.6、6.0、6.5、7.0、7.5)，50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5、8.0、8.6)，以及50mM Gly-NaOH缓冲液(pH 8.6、9.0、9.6、10.0)中30℃孵育24小时，采用实施例3方法测试酶活。结果如图6所示，pH值为6.5时，蔗糖异构酶最稳定，转化率达到78.2％。此外，当pH值高于9.0时，相对蔗糖异构酶活性迅速下降，而当pH值为10时，几乎没有活性。

实施例6：重组蔗糖异构酶的最适温度

取实施例3方法获得的纯酶0.02mg加入1mL含50g/L蔗糖、pH 6.0的50mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，于20-55℃(20、25、30、35、40、45、50、55℃)、180rpm下反应30min，反应结束后在沸水浴中加热10min灭活。离心后取上清液，采用实施例3方法测试酶活。结果如图7所示，蔗糖异构酶在20-55℃之间都有活性，当反应温度为40℃时，蔗糖异构酶转化能力最强，转化率达到81.7％。因此，确定该充足蔗糖异构酶的最适反应温度为40℃。

实施例7：重组蔗糖异构酶的热稳定性

取实施例3方法获得的纯酶0.02mg分别在22-55℃(25、30、35、40、45、50、55℃)的不同温度下孵育1h，然后加入1mL含50g/L蔗糖、pH 6.0的50mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，于40℃、180rpm下反应30min，反应结束后在沸水浴中加热10min灭活。离心后取上清液，采用实施例3方法测试酶活。结果如图8所示，在35℃孵育1h后，其活性保持在原来的94.7％左右，转化率达到77.8％。而当孵育温度达到50℃和55℃时，其剩余活性分别急剧下降到1.7％和1.3％。这些结果表明，蔗糖异构酶在低于50℃的温度下是稳定的。

实施例8：重组蔗糖异构酶的反应时间进程曲线

取实施例3方法获得的纯酶1mg，分别加入10mL含300、400和500g/L蔗糖、pH 6.0的50mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，在40℃、180rpm下反应3h，间隔30min取样，采用实施例3方法测定异麦芽酮糖的生成量。结果如图9所示，在蔗糖浓度为300g/L时，异麦芽酮糖的转化率在60min内达到75.5％，在反应时间延长到180min时最终达到80.5％，但当底物浓度进一步提高到400g/L和500g/L时，酶的催化效率降低，相应的转化率分别为79.6％和78.4％，高于已报道的蔗糖异构酶(K.planticola UQ14S，66％；Erwinia sp.D12，65％；E.rhapontici NCPPB 1578，65％)，且不产生海藻酮糖、葡萄糖以及果糖等副产物，简化了下游分离纯化的工艺。

实施例9：重组蔗糖异构酶转化蔗糖制备异麦芽酮糖

将实施例2方法获得的2g湿菌体在-17℃冷冻干燥24h，获得冻干菌体0.2g。取1mg冻干菌体加入1mL含50g/L蔗糖、pH 6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，于40℃、180rpm下反应30min，反应结束后在沸水浴中加热灭活10min。离心后取上清液，通过旋转蒸发进行浓缩10倍体积后，获得浓缩液，室温冷却至30℃并以每克浓缩液加入0.01g晶种的量加入0.001g干的异麦芽酮糖作为晶种，得到小的白色晶体，通过离心过滤收集晶体，干燥后得到产品异麦芽酮糖0.05g。反应上清液用高效液相色谱测定异麦芽酮糖(同实施例3)，其转化率为80.9％。

实施例10：重组蔗糖异构酶转化蔗糖制备异麦芽酮糖

将实施例2方法获得的2g湿菌体在-17℃冷冻干燥24h，获得冻干菌体0.2g。取冻干菌体2mg加入1mL含100g/L蔗糖，pH 6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，于40℃、180rpm下反应30min，反应结束后在沸水浴中加热灭活10min。离心后取上清液，采用实施例9方法，得到产品异麦芽酮糖0.09g，其转化率为82.3％。

实施例11：重组蔗糖异构酶转化蔗糖制备异麦芽酮糖

将实施例2方法获得的2g湿菌体在-17℃冷冻干燥24h，获得冻干菌体0.2g。取冻干菌体4mg加入1mL含300g/L蔗糖、pH 6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，于40℃、180rpm下反应30min，反应结束后在沸水浴中加热灭活10min。离心后取上清液，采用实施例10方法，得到产品异麦芽酮糖0.24g，其转化率为81.5％。

实施例12：重组蔗糖异构酶转化蔗糖制备异麦芽酮糖

取实施例3方法获得的0.02mg纯酶加入1mL含50g/L蔗糖、pH 6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，于40℃、180rpm下反应30min，反应结束后在沸水浴中加热10min灭活。离心后取上清液，采用实施例10方法，得到产品异麦芽酮糖0.04g，其转化率为80.6％。

实施例13：重组蔗糖异构酶转化蔗糖制备异麦芽酮糖

取实施例3方法获得的0.04mg纯酶加入1mL含150g/L蔗糖、pH 6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，于40℃、180rpm下反应30min，反应结束后在沸水浴中加热灭活10min。离心后取上清液，采用实施例10方法，得到产品异麦芽酮糖0.13g，其转化率为82.3％。

实施例14：重组蔗糖异构酶转化蔗糖制备异麦芽酮糖

取实施例3方法获得的0.06mg纯酶加入1mL含300g/L蔗糖、pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，于40℃、180rpm下反应30min，反应结束后在沸水浴中加热10min灭活。离心后取上清液，采用实施例10方法，得到产品异麦芽酮糖0.25g，其转化率为81.9％。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术内容作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种重组蔗糖异构酶在转化蔗糖制备异麦芽酮糖中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 627

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Met Ser Arg Phe Thr Leu Ser Thr Val Met Glu Thr Ala Leu Leu Val

1 5 10 15

Ala Pro Val Leu Ser Val Leu Pro Gly Gln Val Met Glu Thr Ala Gly

20 25 30

Lys Met Glu Thr Asp Met Glu Thr Ala Thr Thr Gln Leu Ala Gln Lys

35 40 45

Ser Asp Asp Phe Pro Ala Trp Trp Lys Gln Ala Val Phe Tyr Gln Val

50 55 60

Tyr Pro Arg Ser Phe Lys Asp Thr Asn Gly Asp Gly Ile Gly Asp Leu

65 70 75 80

Lys Gly Ile Ile Glu Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Arg Leu Gly Val Asp

85 90 95

Ala Ile Trp Ile Asn Pro His Tyr Asp Ser Pro Asn Thr Asp Asn Gly

100 105 110

Tyr Asp Ile Arg Asp Tyr Arg Lys Ile Met Glu Thr Lys Glu Tyr Gly

115 120 125

Thr Met Glu Thr Glu Asp Phe Asp Arg Leu Ile Ala Glu Met Glu Thr

130 135 140

Asn Lys Arg Asn Met Glu Thr Arg Leu Met Glu Thr Ile Asp Ile Val

145 150 155 160

Ile Asn His Thr Ser Asp Gln His Ser Trp Phe Val Gln Ser Lys Gly

165 170 175

Ser Lys Asp Asn Pro Tyr Arg Asp Tyr Tyr Phe Trp Arg Asp Gly Lys

180 185 190

Asn Gly Gln Pro Pro Asn Asn Tyr Pro Ser Phe Phe Gly Gly Ser Ala

195 200 205

Trp Lys Lys Glu Asp Asn Ser Gly Gln Tyr Tyr Leu His Tyr Phe Ala

210 215 220

Thr Gln Gln Pro Asp Leu Asn Trp Asp Asn Pro Lys Val Arg Glu Asp

225 230 235 240

Leu Tyr Ala Met Glu Thr Leu Arg Phe Trp Leu Asp Lys Gly Val Ala

245 250 255

Gly Leu Arg Phe Asp Thr Val Ala Thr Tyr Ala Lys Ile Pro Gly Phe

260 265 270

Pro Asp Leu Thr Pro Gln Gln Arg Lys Asn Phe Ala Arg Thr Tyr Thr

275 280 285

Glu Gly Pro Ser Ile His Arg Tyr Ile Lys Glu Met Glu Thr His Gln

290 295 300

Gln Val Phe Ser His Tyr Asn Ile Ala Thr Ala Gly Glu Ile Phe Gly

305 310 315 320

Val Pro Leu Glu Lys Ser Ile Asp Tyr Phe Asp Arg Arg Arg Gly Glu

325 330 335

Leu Asn Ile Ala Phe Thr Phe Asp Leu Ile Arg Leu Asp Arg Gly Val

340 345 350

Glu Glu Arg Trp Arg Gln Lys Ala Trp Ser Leu Thr Asp Phe Arg Gln

355 360 365

Thr Ile Asp Lys Val Asp Arg Val Ala Gly Lys Tyr Gly Trp Asn Ala

370 375 380

Phe Phe Leu Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Ala Val Ser His Phe Gly

385 390 395 400

Asp Asp Arg Pro Gln Trp Arg Gln Ala Ser Ala Lys Ala Leu Ala Thr

405 410 415

Leu Met Glu Thr Ile Thr Gln Arg Ala Thr Pro Phe Ile Tyr Gln Gly

420 425 430

Ser Glu Leu Gly Met Glu Thr Thr Asn Tyr Pro Phe Lys Ser Ile Ala

435 440 445

Asp Phe Asp Asp Ile Glu Val Lys Gly Phe Trp Gln Asp Tyr Val Ser

450 455 460

Ser Gly Lys Val Asp Pro Glu Glu Phe Met Glu Thr Arg Asn Val Arg

465 470 475 480

Leu Thr Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Phe Gln Trp Asp Glu Ser

485 490 495

Ala Asn Ala Gly Phe Thr Ser Gly Thr Pro Trp Phe Asn Val Asn Pro

500 505 510

Asn Tyr Lys Leu Ile Asn Ala Ala Asp Gln Thr Arg Asp Pro Asp Ser

515 520 525

Val Phe Asn Tyr Tyr Arg Lys Leu Ile Gly Leu Arg His Ala Ile Pro

530 535 540

Ala Leu Thr Tyr Gly Glu Tyr Lys Asp Leu Asp Pro Asn Asn Asp Thr

545 550 555 560

Val Tyr Ala Phe Thr Arg Thr His Gly Asp Lys Arg Tyr Leu Val Val

565 570 575

Ile Asn Phe Lys Glu Asn Val Val Asn Tyr Arg Leu Pro Asp Gln Leu

580 585 590

Thr Ile Arg Gln Thr Leu Ser Glu Ser Ser Ala Ile Gln Pro Val Ala

595 600 605

Glu Asn Ala Arg Glu Leu Leu Leu Gln Pro Trp Gln Ser Gly Ile Tyr

610 615 620

Gln Leu Asn

625

<210> 2

<211> 1797

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

atgtctcgtt tcaccctgtc taccgttatg gctctgctgg ttgctccggt tctgtctgtt 60

ctgccgggtc aggttatggc tggtaaaatg gacatggcta ccacccagct ggctcagaaa 120

tctgacgact tcccggcgtg gtggaaacag gcggtcttct accaggtgta cccgcgctct 180

ttcaaagaca ccaacggtga cggtatcggt gacctgaaag gtatcatcga aaaactggac 240

tacctgaaac gtctgggtgt tgacgctatc tggatcaacc cgcactacga ctctccgaac 300

accgacaacg gttacgacat ccgtgactac cgtaaaatca tgaaagaata cggtaccatg 360

gaagacttcg accgtctgat cgctgaaatg aacaaacgta acatgcgtct gatgatcgac 420

atcgttatca accacacctc tgaccagcac tcttggttcg ttcagtctaa aggttctaaa 480

gacaacccgt accgtgacta ctacttctgg cgtgacggta aaaacggtca gccgccgaac 540

aactacccgt ctttcttcgg tggttctgct tggaaaaaag aagacaactc tggtcagtac 600

tacctgcact acttcgctac ccagcagccg gacctgaact gggacaaccc gaaagttcgt 660

gaagacctgt acgctatgct gcgtttctgg ctggacaaag gtgttgctgg tctgcgtttc 720

gacaccgttg ctacctacgc taaaatcccg ggtttcccgg acctgacccc gcagcagcgt 780

aaaaacttcg ctcgtaccta caccgaaggt ccgtctatcc accgttacat caaagaaatg 840

caccagcagg ttttctctca ctacaacatc gctaccgctg gtgaaatctt cggtgttccg 900

ctggaaaaat ctatcgacta cttcgaccgt cgtcgtggtg aactgaacat cgctttcacc 960

ttcgacctga tccgtctgga ccgtggtgtt gaagaacgtt ggcgtcagaa agcttggtct 1020

ctgaccgact tccgtcagac catcgacaaa gttgaccgtg ttgctggtaa atacggttgg 1080

aacgctttct tcctggacaa ccacgacaac ccgcgtgctg tttctcactt cggtgacgac 1140

cgtccgcagt ggcgtcaggc ttctgctaaa gctctggcta ccctgatgat cacccagcgt 1200

gctaccccgt tcatctacca gggttctgaa ctgggtatga ccaactaccc gttcaaatct 1260

atcgctgact tcgacgacat cgaggttaaa ggcttctggc aggactacgt ttcttctggt 1320

aaagttgacc cggaagaatt catgcgtaac gttcgtctga cctctcgtga caactctcgt 1380

accccgttcc agtgggacga atctgctaac gctggtttca cctctggtac cccgtggttc 1440

aacgttaacc cgaactacaa actgatcaac gctgctgacc agacccgtga cccggactct 1500

gttttcaact actaccgtaa actgatcggt ctgcgtcacg ctatcccggc tctgacctac 1560

ggtgaataca aagacctgga cccgaacaac gacaccgttt acgctttcac ccgtacccac 1620

ggtgacaaac gttacctggt tgttatcaac ttcaaagaaa acgttgttaa ctaccgtctg 1680

ccggaccagc tgaccatccg tcagaccctg tctgaatctt ctgctatcca gccggttgct 1740

gaaaacgctc gtgaactgct gctgcagccg tggcagtctg gtatctacca gctgaac 1797

Claims

1.一种重组蔗糖异构酶在转化蔗糖制备异麦芽酮糖中的应用，其特征在于所述重组蔗糖异构酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以含有重组蔗糖异构酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体、湿菌体提取的纯酶或湿菌体的冻干菌体为催化剂，以蔗糖为底物，以pH 4.6-10.0的缓冲液为反应介质，在20-55℃、180rpm进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得异麦芽酮糖；所述重组蔗糖异构酶基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述湿菌体用量以缓冲液体积计为5～20g/L，所述纯酶用量以缓冲液体积计为0.01-0.5g/L，所述冻干菌体用量以缓冲液体积计为1-5g/L，所述底物用量以缓冲液体积计为10-600g/L。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述缓冲液为50mM，pH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述反应液分离纯化方法为：反应结束后，反应液在沸水浴中加热灭活10min，离心后取上清液，通过旋转蒸发进行浓缩至1/10倍体积后，获得浓缩液，室温冷却至30℃并加入干的异麦芽酮糖作为晶种，得到小的白色晶体，通过离心收集晶体，干燥后得到异麦芽酮糖。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述晶种加入量以浓缩液重量计为0.01g/g。

7.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含重组蔗糖异构酶基因的工程菌接种至含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，在37℃下培养12-16h，获得种子液；再以体积浓度1-2％的接种量将种子液接种到新鲜的含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下培养至菌体浓度OD₆₀₀为0.4-0.8，再加入终浓度为0.1mM的IPTG，25℃下诱导培养10-12h，然后在4℃下8000rpm离心10min，收集湿菌体。

8.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述纯酶按如下方法制备：将含重组蔗糖异构酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH 6.0、50mM柠檬酸-磷酸氢二钠重悬，冰浴条件下100W、破碎1s、间歇3s超声破碎菌体20min后，离心，取上清液，得粗酶液；采用Ni-NTA柱进行纯化，用5-10倍柱体积上样平衡缓冲液平衡，流速1.5mL/min；以1.5mL/min的速率进行粗酶液上样；用上样平衡缓冲液洗涤以除去未吸附的杂蛋白；分别用0-500mM咪唑浓度的洗脱缓冲液进行梯度洗脱，收集含50mM咪唑的洗脱缓冲液的流出液，超滤膜脱盐浓缩，收集截留液，在-71℃，9.0Pa条件下冻干，获得蔗糖异构酶纯酶；所述平衡缓冲液为250mM NaCl+5mM咪唑+50mM Tris-HCl，pH 8.0；所述洗脱缓冲液为250mM NaCl+50mM Tris-HCl、pH 8.0。