CN115261366B

CN115261366B - 一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体、工程菌及其应用

Info

Publication number: CN115261366B
Application number: CN202210645184.1A
Authority: CN
Inventors: 柳志强; 贾东旭; 王番; 余海; 金利群; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Henan Zhongyuan Yuze Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-06-08
Filing date: 2022-06-08
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2042-06-08
Also published as: CN115261366A

Abstract

本发明公开了一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体、工程菌及其应用，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第226位或第242位进行突变获得。本发明筛选得到一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体，增强了突变酶在70℃下的半衰期，提高了酶对合成乳果糖所用底物乳糖的底物亲和力和转化效率。运用含有改造酶的基因工程菌进行生物转化，产物乳果糖得率显著增加，副产物依匹乳糖得率明显降低。本发明展示了纤维二糖差向异构酶在合成乳果糖绿色环保、毒性低，副产物少和产物得率高的技术优势，经过分子改造获得的纤维二糖差向异构酶突变体具有重要的工业应用前景。

Description

一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体、工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体，及其在微生物催化乳糖异构化制备乳果糖中的应用。

背景技术

乳果糖是由D-半乳糖和D-果糖两个基团通过β-1,4糖苷键连接而成的还原型二糖；乳果糖口服液具有治疗慢性便秘和肝性脑病的功效，需求量巨大；乳果糖还可以作为益生元改善人体肠道菌群关系。乳果糖的生产依赖化学法，其催化剂对人体有害，下游分离难度大。近年来，纤维二糖差向异构酶被发现能够高效催化乳糖制备乳果糖，该技术绿色环保、步骤简单，具有很强的产业化前景。

生物转化是一种利用微生物产生的一种或几种特殊的胞外或胞内酶作为生物催化剂，将底物转化为产物的过程。生物转化具有反应条件温和、原料利用率高的特点，同时转化过程具有优良的化学选择性、区域选择性和立体选择性，能够保证目标化合物的高效合成。目前，利用异构酶或含有该酶的细胞为生物催化剂进行异构化反应制备多种糖类化合物，已成为制糖工业重要的经济增长点。

纤维二糖差向异构酶(cellobiose 2-epimerase，EC 5.1.3.11，简称CE)属于N-乙酰-D-氨基葡萄糖2-差向异构酶(AGE)家族成员，可催化乳糖的D-葡萄糖醛酮异构化生成乳果糖。CE酶中使用最多的是来源于嗜热微生物Caldicellulosiruptor saccharolyticus的纤维二糖差向异构酶(简称CsCE)，该酶的研究报道近来很多，使用最为广泛；此外还有来源于Dictyoglomus turgidum、Caldicellulosiruptor obsidiansis、 Dictyoglomusthermophilum的CE也适合生产乳果糖。

尽管CE催化乳糖的效率较高，但仍然存在诸多问题：首先温度影响异构化反应过程中乳果糖得率，根据热力学反应平衡原理，CE反应体系必须能够长时间耐受高温才能生成高浓度乳果糖；其次是反应副产物依匹乳糖的占比问题，尽管依匹乳糖本身也是一种人体益生元，但各国药典对其含量均有严格限制，因此合成乳果糖的反应中依匹乳糖含量越低越好。

运用蛋白质工程技术开展酶分子改造，能通过分子手段极大限度地提高天然酶的催化性能，本发明通过开发新型CE，对其实施分子改造，获得高效制备乳果糖的生物催化剂，对于满足人民群众日益增长的摄糖需求具有重要意义。

发明内容

本发明目的是提供一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体、编码基因、工程菌及其在微生物催化乳糖异构化制备乳果糖中的应用，为乳果糖制备工艺提供一种绿色环保、卫生安全的生物制备方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体，所述突变体是将SEQ IDNO.1所示氨基酸序列第226位或第242位进行突变获得的；优选将第226位天冬氨酸突变为甘氨酸(D226G)，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；或第242位丙氨酸突变为缬氨酸(A242V)，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明还涉及一种所述耐高温纤维二糖差向异构酶突变体的编码基因，包含所述编码基因的重组载体，以及包含所述重组载体的重组基因工程菌；所述重组载体以 pET28b为载体，插入位点Xba I和Xho I，所述重组基因工程菌以E.coli BL21(DE3) 为宿主菌。

本发明还提供一种所述耐高温纤维二糖差向异构酶突变体在催化乳糖制备乳果糖中的应用，所述的应用为：以含纤维二糖差向异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌(优选E.coli BL21(DE3)/CmCE/D226G)经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的纯酶作为生物催化剂，以乳糖为底物，以pH 6-8的缓冲液为反应介质构成反应体系，在50-80℃、100-200r/min条件下反应，反应完全后，反应液分离纯化，获得乳果糖。

优选所述的反应体系中，乳糖加入终浓度为50-150g/L，优选100g/L；催化剂以湿菌体形式加入的量为40-60g/L，优选50g/L；催化剂以纯酶形式加入的量以蛋白浓度计为0.4-0.6mg/mL，优选0.5mg/mL。优选反应介质为pH 7.5、50mM的HEPES 缓冲液；反应条件优选为70℃、150r/min。

优选，所述湿菌体按如下方法制备：将含纤维二糖差向异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌划线至LB固体培养基，37℃倒置培养12h，接种于含终浓度50μg/mL 卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养8h；培养液以2％(v/v)转接量转接至含终浓度50μg/mL的卡那霉素抗性的LB培养基中，在37℃，150r/min的条件下培养OD₆₀₀＝0.6-0.8，添加终浓度为0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，在28℃，150r/min条件下，诱导发酵12h，离心弃上清液，收集湿菌体。

优选，所述纯酶按如下方法制备：将含纤维二糖差向异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌诱导培养的湿菌体按1g湿菌体用20mL的50mM HEPES(pH 7.5)缓冲液重悬，在50W条件下超声破碎30min，期间工作1s、间隔2s，破碎混合液在 8000r/min离心10min，收集上清液即为粗酶液，作为上样液；采用nickel-NTA亲和层析柱(Bio-Scale Mini ProfinityIMAC预装柱，40mm长×12.6mm内径)进行纯化，先用平衡缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，300mMNaCl，20mM咪唑，pH 8.0)平衡层析柱，上样液以1mL/min的速度上样4个柱体积，再使用洗脱液(50mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0)以1mL/min的速度进行洗脱，根据紫外检测器和电导率检测器的信号响应，当紫外检测器的信号和电导率检测器信号同时上升时收集相应的洗脱液，当电导率检测器信号不变且紫外检测器的信号下降时停止收集，即为纯酶。

优选的，所述反应液分离纯化制备乳果糖的方法为：反应液10000rpm离心10min后，取上清液，再以1.5mL/min的速率通过DOWEX MONOSPHERE 77阴离子交换树脂柱和DOWEXMONOSPHERE 88阳离子交换树脂柱洗脱盐离子，待溶液电导响应值趋近于零，停止脱盐，收集富含乳果糖的洗脱液；洗脱液减压蒸馏浓缩至糖浓度约为85％，同时加入200目的一水乳糖粉作为晶种进行结晶，晶种添加量与溶液占比为0.002％-0.004％(w/w)，以6℃/h的速度降温冷却结晶出乳糖晶体，10000rpm离心10min，得到乳果糖糖浆。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明筛选得到一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体，增强了突变酶在70℃下的半衰期，提高了酶对合成乳果糖所用底物乳糖的底物亲和力和转化效率，突变体70℃下的半衰期为117.7min，为原始酶的2.3倍。本发明通过突变改善野生酶高温下半衰期过短问题，突变酶相对作用时间长，运用含有改造酶的基因工程菌进行生物转化，产物乳果糖得率显著增加，副产物依匹乳糖得率明显降低，产物得率提高了10.1％。本发明扩展了相对稀少的酶库，克服了高产乳果糖纤维二糖差向异构酶酶库中酶数量相对稀缺；本发明展示了纤维二糖差向异构酶在合成乳果糖绿色环保、毒性低，副产物少和产物得率高的技术优势，克服了化学合成法易产生三废问题，具有重要的工业应用前景。

附图说明

图1为原始酶CmCE、DiCE和FsCE的SDS-PAGE电泳图。

图2为实施例1中催化乳糖转化乳果糖反应的高效液相色谱检测图。

图3为原始酶CmCE(A)及突变酶CmCE/D226G(B)的最适反应温度。

图4为原始酶CmCE(A)及突变酶CmCE/D226G(B)的半衰期。

图5为原始酶CmCE(A)及突变酶CmCE/D226G(B)纯酶的转化进程图。

图6为突变酶E.coli BL21(DE3)/CmCE/D226G不同湿菌体添加量对转化的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：新型纤维二糖差向异构酶的筛选与活力测定

1、原始酶(简称CE)筛选与重组菌的构建

以报道的Caldicellulosiruptor saccharolyticus CE(CscE，GenBank编号WP_011915904.1)核心催化区域为探针，从NCBI数据库中获得三株未被研究的潜在 CE，分别为来源于耐热细菌热解纤维素果汁杆细菌(Caldicellulosiruptor morganii， GenBank编号WP_045170066.1)、网团细菌ob1-4(Dictyoglomus sp.Ob1-4，GenBank 编号WP_148806989.1)及纺锤链杆细菌(Fusicatenibacter saccharivorans，GenBank 编号WP_215664306.1)，并分别命名为CmCE、DiCE、FsCE。依据大肠杆菌密码子偏好性对上述酶的氨基酸序列进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成核苷酸序列，其中，CmCE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；DiCE的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.5；FsCE的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。各个原始酶编码基因的两端加入酶切位点Xba I和XhoI，将该基因克隆至 pET28b(+)对应的Xba I和Xho I位点，获得重组表达质粒pET28b/CmCE、pET28b/DiCE 和pET28b/FsCE。

2、原始酶重组菌的转化与诱导表达

将步骤1获得的重组表达质粒pET28b/CmCE、pET28b/DiCE和pET28b/FsCE分别转化至E.coli BL21(DE3)受体菌，涂布于含终浓度100mM卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃下培养12h后，于平板上长出的菌落中随机挑取克隆并抽提质粒分别进行琼脂糖凝胶电泳鉴定和核苷酸序列测定，获得含CmCE、DiCE及FsCE基因的基因工程菌，即为E.coli BL21(DE3)/pET28b/CmCE、E.coli BL21(DE3)/pET28b/DiCE、E.coli BL21(DE3)/pET28b/FsCE。同时以表达质粒pET28b为对照，构建E.coli BL21(DE3)/pET28b。

将上述基因工程菌分别接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在 37℃、150r/min培养8h，获得种子液；将种子液以2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.6-0.8，再向培养液中加入终浓度1mM的IPTG，于28℃下诱导表达12h，4℃、 8000r/min离心10min，弃去上清液，并收集湿菌体，备用。所得菌体的可溶表达 SDS-PAGE结果见图1。

3、原始酶CE的酶活检测

反应体系：50mM HEPES缓冲液(pH 7.5)、200mM乳糖及25g/L湿菌体，共 1mL体系。反应条件：70℃条件下反应20min，冰浴10min终止反应。取反应液采用HPLC检测乳果糖含量，其中乳果糖(Lactulose)、乳糖(Lactose)和依匹乳糖 (Epilactose)三者标样混合的液相检测的各物质的分辨率及保留时间如图2所示。

HPLC检测条件：Agilent 1260HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，Shodex VG-50-4E色谱柱，Agilent示差检测器，流动相采用75％(v/v)乙腈、20％(v/v)甲醇和5％超纯水的混合溶液，柱温设定为40℃，流速为1mL/min，采用外标法，根据峰的保留时间和峰面积来确定乳果糖的产量。酶活定义：70℃和pH 7.5下，每分钟将乳糖异构化生成1μmol乳果糖所需酶量定义为一个酶活单位(U)。3株筛选CE的酶活计算结果见表1。

表1：CE酶活测定

由表1结果可知E.coli BL21(DE3)/pET28b以及E.coli BL21(DE3)/pET28b/FsCE的酶活均为0，E.coli BL21(DE3)/pET28b/CmCE为32.1U/g，E.coli BL21(DE3)/pET28b/DiCE为8.7U/g，E.coli BL21(DE3)/pET28b/CmCE的酶活表现最佳。

实施例2：原始酶CmCE的分子改造

1、选择突变位点

选择酶活最高的CmCE为研究对象，利用计算机软件FoldX (http://foldxsuite.crg.eu/)模拟原始酶位点突变前后热稳定性的变化，通过计算给出候选突变位点D226G、R56M和A242V。

2、突变体构建

根据原始酶CmCE的基因序列(氨基酸序列为SEQ ID NO.4，核苷酸序列为SEQ IDNO.1)设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/CmCE 为模板，分别对第226、56和242位引入单突变，设计引物为：

正向引物D226G：AAGCAACCGGTCATTTTAAAGTGTTTT(下划线为突变碱基)

反向引物D226G:TTAAAATGACCGGTTGCTTTGTCATAC(下划线为突变碱基)

正向引物R56M:TGAACAGCATGATCCTGTGGTTTTTTA(下划线为突变碱基)

反向引物R56M:CACAGGATCATGCTGTTCAGAATGCAA(下划线为突变碱基)

正向引物A242V:TGATCGATGTGATTAGTTATGGGCACG(下划线为突变碱基)

反向引物A242V:TAACTAATCACATCGATCAGATTTTCCC(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer 10μL，dNTPs 0.4μL，正向引物0.4μL(5pmol/μL)，反向引物0.4μL(5pmol/μL)，模板DNA 0.4μL(20ng/μL)，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.4μL，加入ddH₂O至20μL。

PCR扩增条件为95℃5min；(95℃15s，54℃15s，72℃6min)30×循环；72℃ 10min。

3、突变体转化表达

取5μL的PCR产物，加入100μL冰浴的E.coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中，冰上静置30min，将转化产物于42℃热击90s，迅速置于冰上冷却5min，向管中加入600μL的LB液体培养基，37℃，150r/min培养60min，4000r/min离心1min，弃去400μL上清液并重悬菌液。取200μL上述重悬液涂布于含终浓度50μg/mL卡那霉素抗性LB固体培养基板，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12h，挑取菌落接种于含终浓度50μg/mL的卡那霉素抗性的10mLLB液体培养基中，37℃培养 12h，获得各自的菌液。菌液送至测序公司检测核苷酸序列且测序结果比对正确，即为含突变酶重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/CmCE/D226G、E.coliBL21(DE3) /pET28b/CmCE/R56M、E.coli BL21(DE3)/pET28b/CmCE/A242V。

4、上述突变体热稳定性初筛

将步骤3含酶重组菌液以2％(v/v)转接量转接至含终浓度50μg/mL的卡那霉素抗性的100mL LB培养基中，在37℃，150r/min的条件下培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8，添加终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达，在28℃，150r/min条件下，诱导12h，离心弃上清液收集菌体。1g湿菌体用20mL的50mM HEPES(pH 7.5)缓冲液重悬，在 80℃下孵育15min，取培养液按实施例1方法检测(残余)酶活，以各酶的初始酶活为100％，孵育之后的酶活与之相比，所得结果见表2。其中，CmCE/D226G、 CmCE/R56M和CmCE/A242V的残余酶活分别为69.8％、0.3％和45.1％，说明突变 D226G对CmCE的热稳定性提升最为显著，明显优于原始酶CmCE。

表2：各CE的残余酶活测定

实施例3：原始酶CmCE与突变酶CmCE/D226G的纯化

1、重组酶培养与细胞破碎

将实施例1构建的E.coli BL21(DE3)/pET28b/CmCE，实施例2构建的E.coli BL21(DE3)/pET28b/CmCE/D226G分别划线至LB固体培养基，37℃倒置培养12h，挑取单菌落接种于10mL LB液体培养基，37℃下培养8h，接着以2％(v/v)转接量转接至100mL LB培养基中，在37℃，150r/min的条件下培养OD₆₀₀＝0.6-0.8，添加终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达，在28℃，150r/min条件下，诱导12h，离心弃上清液收集菌体。

将1g湿菌体用20mL的50mM HEPES(pH 7.5)缓冲液重悬，在50W条件下超声破碎30min，期间工作1s间隔2s，破碎混合液在8000r/min离心10min，收集上清液即为粗酶液，作为上样液。

2、纯化重组酶

采用nickel-NTA亲和层析柱(Bio-Scale Mini Profinity IMAC预装柱，40mm长×12.6mm内径)进行纯化，先用平衡缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl， 20mM咪唑，pH8.0)平衡层析柱，上样液以1mL/min的速度进行上样20mL(4个柱体积)，再使用洗脱液(50mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0)以1mL/min的速度进行洗脱，根据紫外检测器和电导率检测器的信号响应，当紫外检测器信号和电导率检测器信号同时上升时收集相应的洗脱液，当电导率检测器信号不变且紫外检测器的信号下降时停止收集，即为各自纯酶液。采用BCA试剂盒分别测试纯酶液的蛋白浓度，结果分别为2.08mg/mL和2.24mg/mL。

实施例4：原始酶CmCE及突变酶CmCE/D226G的最适反应温度测定

将实施例3制备的纯酶液作为转化用酶，测定酶的最适反应温度。反应体系：200mM的乳糖和0.4mg/mL纯酶液，再加入50mM HEPES(pH 7.5)缓冲液至总体系1 mL。于不同温度(40、50、60、65、70、75、80、85、90℃)条件下反应20min，其他条件同实施例1的酶活检测方法，结果见图3所示。由图可知，原始酶CmCE 和突变酶CmCE/D226G的最适反应温度均为70℃。

实施例5：原始酶CmCE及突变酶CmCE/D226G热稳定性测定

将实施例3制备的原始酶CmCE及突变酶CmCE/D226G纯酶液分别放置在70℃的水浴锅中保温120min，每隔15min取样，采用实施例1方法测定(残余)酶活，结果见图4。其中，原始酶CmCE在70℃下的半衰期为52min，突变酶CmCE/226G 在70℃下的半衰期为117.7min，是原始酶CmCE的2.3倍。

实施例6：原始酶CmCE及突变酶CmCE/D226G的动力学参数计算

选择不同浓度乳糖(50、100、150、200、300、400、600和800mM)和0.4mg/mL 实施例3制备的纯酶液，加入50mM HEPES(pH 7.5)缓冲液至总体系1mL。于70℃条件下反应20min，冰浴10min终止反应。采用实施例1所述方法计算酶活，采用计算机软件Origin拟合得到CmCE及其突变体D226G的动力学参数，结果见表3。其中，CmCE的K_m为79.98mM、k_cat为80.84min^-1、k_cat/K_m为1.01min^-1·mM^-1； CmCE/D226G的K_m为60.23mM、k_cat为76.63min^-1、k_cat/K_m为1.27min^-1·mM^-1。从该结果可知，突变酶CmCE/D226G对底物乳糖的亲和力更好、催化效率更高。

表3：酶动力学参数测定

实施例7：E.coli BL21(DE3)/pET28b/CmCE与E.coli BL21 (DE3)/pET28b/CmCE/D226G转化乳果糖进程对比

按照实施例1中的方法制备E.coli BL21(DE3)/pET28b/CmCE与E.coli BL21(DE3)/pET28b/CmCE/D226G重组菌湿菌体，将其作为生物催化剂，以乳糖为底物，生物转化制备乳果糖。催化体系：100g/L的乳糖、50g/L上述菌体，加入适量50mM HEPES缓冲液(pH7.5)至总体系100mL。反应体系于70℃、150r/min条件下反应5h，反应液用0.22μm膜过滤后，取滤液采用实施例1所述HPLC检测乳糖(Lactose)、乳果糖(Lactulose)和依匹乳糖(Epilactose)浓度。最终绘制转化进程图，见图5。

由图5可知，E.coli BL21(DE3)/CmCE/D226G的底物转化率(即乳糖终浓度与初始浓度之比)为70％，产物得率为50.2％，依匹乳糖得率为19.8％。相比之下，E.coli BL21(DE3)/pET28b/CmCE的底物转化率为67.0％，乳果糖得率为40.1％，依匹乳糖得率为26.9％。重组菌E.coli BL21(DE3)/CmCE/D226G的产物得率明显高于原始酶重组菌，同时生成更少的副产物。以上结果说明突变体E.coli BL21(DE3)/CmCE/D226G在热力学、动力学以及主产物得率等方面对乳果糖的生物转化产生了促进作用，具有重要的工业应用价值。

实施例8：催化剂用量对乳果糖产量的影响

按照实施例7的生物转化反应体系，分别调整E.coli BL21(DE3)/CmCE/D226G重组菌的添加量为40、50、60g/L，乳糖100g/L，再加入适量50mM HEPES缓冲液(pH 7.5)至总体系100mL。反应体系于70℃、150r/min条件下反应5h，反应液用0.22μm 膜过滤后，取滤液采用实施例1所述HPLC检测乳果糖浓度，计算所得乳果糖得率见图6。比较发现，E.coli BL21(DE3)/CmCE/D226G在添加50g/L的湿菌体，产物得率为 50.2％，40g/L时为45.7％，60g/L时为47.2％。因此，在后续工业化应用放大过程中，优选50g/L的E.coli BL21(DE3)/CmCE/D226G进行生物转化，已达到最佳转化效果。

实施例9：乳果糖产物的分离纯化

将实施例7中，E.coli BL21(DE3)/pET28b/CmCE与E.coli BL21 (DE3)/pET28b/CmCE/K335Q反应液10000rpm离心10min后，取上清液，再以1.5 mL/min的速率通过DOWEXMONOSPHERE 77阴离子交换树脂柱和DOWEX MONOSPHERE 88阳离子交换树脂柱洗脱盐离子，待溶液电导响应值趋近于零，停止脱盐，收集富含乳果糖的洗脱液；洗脱液减压蒸馏浓缩至糖浓度约为85％，同时加入200目的一水乳糖粉作为晶种进行结晶，晶种添加量与溶液占比为0.002％(w/w)，以6℃/h的速度降温冷却结晶出乳糖晶体，10000rpm离心10min，得到乳果糖糖浆，结果E.coli BL21(DE3)/pET28b/CmCE反应体系中回收乳果糖33.8g，回收率84.3％；相比之下，E.coli BL21(DE3)/pET28b/CmCE/K335Q反应体系中回收乳果糖含量为更高的43.4g，总回收率达到86.5％。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体、工程菌及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1170

<212> DNA

<213> 耐热细菌热解纤维素果汁杆菌(Caldicellulosiruptor morganii )

<400> 1

atgaaggaaa agatcctgaa attcgaactg cagaaccacc tgaccgaaaa aatcattccg 60

ttttggcaga gcctgaaaga cgaagaattt ggaggctact atggatatat ggattttgac 120

tgtaaggtgg acaaaaccgc agcaaaaggt tgcattctga acagcagaat cctgtggttt 180

tttagcgcat gttacaatgt tattaaggat gaaaagtgca tcgagtttgc aagccatgcc 240

tacgaatttc tgaaaaaatc attttgggac gacgaatttg gaggtctgta ttggatggtt 300

gatcataagg ggaatgttat tgatagtacc aagcatgttt acgttcaggc atttggtatt 360

tatggtctga gcgaatatta tcgggcaacc aagaatgatc aggcactgga atatgcacag 420

aaactgtttg aactgctgga gaaaacctgt aaaaaagaaa atggttacac ggaacagttt 480

aatcgtaatt ggaccccgaa agaaaatcgc tttctgagcg aaaatggagt gatagcaagc 540

aaaaccatga atacccatct gcatgttctg gaagcgtaca caaacctgta tcgtgtttat 600

aaaaacgaag acgtctacaa tagcctggaa tggattgtta aactgttcgt ggaaaaagtg 660

tatgacaaag caaccgatca ttttaaagtg ttttgcgatg aagcatggga aaatctgatc 720

gatgcgatta gttatgggca cgacatagaa gcaagctggt tactgtgtga ggcgagtgaa 780

tatctgaatg accgtaaact gaaggagaaa gcggagcaga tagcgctgaa agttgcagaa 840

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aaagaccata ttgtggataa gcgtggtgga agcgaatggt attggaaggt taacgaagat 1080

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<210> 2

<211> 1179

<212> DNA

<213> 网团细菌(Dictyoglomus sp.)

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<212> DNA

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<212> PRT

<213> 耐热细菌热解纤维素果汁杆菌(Caldicellulosiruptor morganii )

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<212> PRT

<213> 网团细菌(Dictyoglomus sp.)

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<212> PRT

<213> 细菌纺锤链杆菌(Fusicatenibacter saccharivorans)

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<213> 耐热细菌热解纤维素果汁杆菌(Caldicellulosiruptor morganii )

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<212> PRT

<213> 耐热细菌热解纤维素果汁杆菌(Caldicellulosiruptor morganii )

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Ile Ile Lys Arg Val

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Claims

1.一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体，其特征在于，所述突变体是将SEQ ID NO.4所示氨基酸序列第226位天冬氨酸突变为甘氨酸。

2.一种权利要求1所述耐高温纤维二糖差向异构酶突变体的编码基因。

3.一种包含权利要求2所述编码基因的重组基因工程菌。

4.一种权利要求1所述耐高温纤维二糖差向异构酶突变体在催化乳糖制备乳果糖中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以含纤维二糖差向异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的纯酶作为生物催化剂，以乳糖为底物，以pH 6-8的缓冲液为反应介质构成反应体系，在50-80℃、100-200 r/min条件下反应，反应完全后，反应液分离纯化，获得乳果糖。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的反应体系中，乳糖加入终浓度为50-150 g/L；催化剂以湿菌体形式加入的量为40-60 g/L；催化剂以纯酶形式加入的量以蛋白含量计为0.4-0.6 mg/L。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述反应介质为pH 7.5、50 mM的HEPES缓冲液。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述湿菌体按如下方法制备：将含纤维二糖差向异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌划线至LB固体培养基，37℃倒置培养12 h，接种于含终浓度50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养8 h；培养液以体积浓度2%转接量转接至含终浓度50 μg/mL的卡那霉素抗性的LB培养基中，在37℃，150 r/min的条件下培养OD₆₀₀=0.6-0.8，添加终浓度0.1 mM的异丙基硫代半乳糖苷诱导表达，在28℃，150 r/min条件下，诱导发酵12 h，离心弃上清液，收集湿菌体。

9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述纯酶按如下方法制备：将含纤维二糖差向异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌诱导培养的湿菌体用pH 7.5、50 mM HEPES缓冲液重悬，在50 W条件下超声破碎30 min，期间工作1 s间隔2 s，破碎混合液在8000 r/min离心10 min，收集上清液即为粗酶液，作为上样液；采用nickel-NTA亲和层析柱进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，上样液以1 mL/min的速度上样，再使用洗脱液以1 mL/min的速度进行洗脱，收集含目标蛋白的洗脱液，即为纯酶；所述平衡缓冲液：20 mM磷酸盐缓冲液，300 mM NaCl，20 mM咪唑，pH 8.0；所述洗脱液：50 mM 磷酸盐缓冲液，300 mM NaCl，500mM 咪唑，pH 8.0。