CN114317509B - 一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。本发明公开了来源于微生物Caldicellulosiruptor saccharolyticus的纤维二糖差向异构酶(简称Casa‑WT酶)作为亲本，利用基因突变技术，第231位的苯丙氨酸Phe替换成半胱氨酸Cys和第173位的丝氨酸Ser替换成半胱氨酸Cys，得到双突变体F231C/S173C。最适催化条件下，双突变体酶在70℃的异构酶活提高到原有的287％。这一发现对于研究更多异构酶活较低的纤维二糖差向异构酶具有重要的研究价值。

Description

一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

乳糖(Lactose；4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡萄糖；C₁₂H₂₂O₁₁)是一种由半乳糖和葡萄糖组成的二糖，是普遍存在于哺乳动物乳汁中的碳水化合物。构成它的两种单糖都是六元环醛糖，乳糖在水中可发生水解，其葡萄糖部分能水解成开环形式，具有还原性。溶液中的乳糖仅有极小一部分(<0.1％)处于开环状态，但该部分却极其重要，它们处于化学活跃状态，易发生如美拉德反应等化学变化。与其他二糖相比，乳糖的溶解性很低。在25℃条件下，其溶解度仅为蔗糖的十分之一。但尽管它的溶解度很低，乳糖并不容易形成结晶，只有当过饱和度超过2.1时才会结晶析出。晶体乳糖以闭环形式存在，有两种端基异构体形态，分别是α-乳糖和β-乳糖。结晶后的α-乳糖以一水化合物形式存在，是干燥食品中乳糖的主要的存在形态。β-乳糖则以无水形态结晶。

乳果糖(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖；C₁₂H₂₂O₁₁)，由半乳糖和果糖通过β-1,4糖苷键连接而成。常温下为白色粉末状固体，稳定性好，安全性高，易溶于水，甜度低于乳糖。乳果糖不易被小肠消化，能增加人类小肠的蠕动，还能吸附水分，促进食物通过肠道，半个世纪以前就被应用于通便药物。在人类结肠中，乳果糖能为其中的乳杆菌和双歧杆菌提供能量，代谢过程中会产生乳酸、甲酸等有机酸，可以调节肠道内菌群平衡，促进矿物质吸收。此外乳果糖还具有治疗肝性脑病、降低血氨浓度、促进B族维生素生成、抗内毒素等多种有益作用。正是因为乳果糖这些特性，它也可作为功能食品添加剂被应用在食品中。如含0.5％乳果糖的配方奶粉能够刺激婴儿肠道内双歧杆菌的生长，含1％乳果糖的奶粉则具有通便效果，而且乳果糖的加入不会影响配方奶粉的存储品质。含乳果糖的酸奶也能缓解幼儿便秘，且乳果糖的效果好于大豆纤维和低聚乳糖。由于能促进双歧杆菌属微生物增殖，乳果糖能缩短酸奶的发酵。

现阶段乳果糖的工业制备方法大多基于洛布里·德·布鲁因-范·埃肯斯坦(Lobry de Bruyn-Van Ekenstein reaction)，常用的催化剂有氢氧化物、叔胺类化合物、硼酸、碳酸钾等，该反应以乳糖为原料，生成产物中包含乳糖、乳果糖、依匹乳糖等各种单糖，后续分离过程复杂。

在食品工业中，相比于传统化学制法，酶法制备功能性糖有巨大的优势。酶法制备不仅有转化率高，专一性强，操作程序简单等特点，更是在安全性和环境问题方面有比化学制法更突出的表现，也是目前制备功能性糖的趋势所向。纤维二糖差向异构酶是目前仅有的有效制备依匹乳糖的生物催化剂，也是目前为止最为专一高效制备乳果糖的生物催化剂。与其他产乳果糖酶相比，纤维二糖差向异构酶不需要向乳糖中添加共底物果糖，且转化效率更高，副产物更少。

虽然已经存在可以生产乳果糖的酶，但纤维二糖差向异构酶的比酶活较低，所以需要对其进行分子改造来提高酶活。

发明内容

本发明提供了一种纤维二糖差向异构酶突变体，所述纤维二糖差向异构酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的纤维二糖差向异构酶的第231位和第173位的氨基酸同时突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，编码所述纤维二糖差向异构酶的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述纤维二糖差向异构酶来源于微生物Caldicellulosiruptor saccharolyticus(GeneBank的登录号为WP_011915904.1)。

在本发明的一种实施方式中，所述纤维二糖差向异构酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的纤维二糖差向异构酶的第231位的苯丙氨酸突变为半胱氨酸，同时将第173位的丝氨酸Ser突变为半胱氨酸得到的；命名为：F231C/S173C。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体F231C/S173C的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述突变体F231C/S173C的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述纤维二糖差向异构酶来源于微生物Caldicellulosiruptor saccharolyticus(GeneBank的登录号为WP_011915904.1)。

本发明还提供了编码上述纤维二糖差向异构酶突变体的基因。

本发明还提供了携带上述基因的重组载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pET-22b(+)为表达载体。

本发明还提供了一种表达上述纤维二糖差向异构酶突变体，或携带上述基因，或携带上述重组载体的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以细菌或真菌为表达宿主。

本发明还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达了上述纤维二糖差向异构酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，以pET-22b(+)为表达载体。

本发明还提供了上述纤维二糖差向异构酶突变体F231C/S173C的制备方法，其具体步骤为：

(1)利用来源于Caldicellulosiruptor saccharolyticus的纤维二糖差向异构酶的蛋白质序列同源建模确定突变位点；

(2)设计突变体的定点突变引物，以携带纤维二糖差向异构酶基因的载体pET-22b(+)-Casa-WT为模板，进行定点突变构建突变质粒pET-22b(+)-F231C/S173C；

(3)将突变质粒pET-22b(+)-F231C/S173C转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，挑选验证后的阳性单克隆进行发酵培养；

(4)离心菌体，重悬后超声破碎，镍离子亲和层析纯化得到突变体酶F231C/S173C。

本发明还提供一种提高乳果糖产量的方法，所述方法为，将上述纤维二糖差向异构酶突变体，或上述重组细胞添加至含有乳糖的反应体系中进行反应制备。

在本发明的一种实施方式中，上述反应体系中，所述乳糖的浓度为：200mM/L。

在本发明的一种实施方式中，上述反应体系中，所述纤维二糖差向异构酶突变体的添加量为：0.2mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，反应体系的反应条件为：pH 7.0，温度为70℃，反应时间为40min。

本发明还提供了上述纤维二糖差向异构酶突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述在制备含有乳果糖产品中的应用。

有益效果

本发明提供了一种纤维二糖差向异构酶突变体F231C/S173C，与野生酶Casa-WT相比，所述纤维二糖差向异构酶突变体F231C/S173C的最适催化条件没有发生改变，但突变体在70℃的异构酶活提高到原有的287％。

将该突变体应用于工业上生产乳果糖领域，单位时间产率显著提升，进一步为纤维二糖差向异构酶的工业应用提供了有利基础。

附图说明

图1：70℃下原始酶Casa-WT和突变体酶的产物生成占比。

图2：突变体及原始酶纯酶液的琼脂糖凝胶电泳分析图，其中，最左侧的条带为Marker。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB液体培养基：5g/L酵母抽提物、10g/L胰蛋白胨、10g/L氯化钠。

LB固体培养基：在LB液体培养基基础上添加15g/L琼脂。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

乳果糖含量的检测：使用高效液相色谱仪对反应产物进行检测。

色谱柱：VG-50 4E；流动相：水、甲醇、乙腈的混合溶液(5：20：75，v/v)，柱温40℃，流速，1mL/min。

实施例1：Casa-WT酶突变体制备方法

具体步骤如下：

(1)重组质粒pET-22b(+)-Casa-WT构建：

根据Caldicellulosiruptor saccharolyticus(GeneBank登录号：WP_011915904.1)，合成纤维二糖差向异构酶的基因片段Casa-WT(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，并连接至pET-22b(+)的酶切位点NdeI和XhoI之间，获得重组质粒pET-22b(+)-Casa-WT。

(2)pET-22b(+)-F231C/S173C、pET-22b(+)-F231C、pET-22b(+)-S173C突变质粒的构建：

以pET-22b(+)-Casa-WT质粒为模板，经PCR l，PCR 2引入F231C/S173C定点突变，测序验证结果表明除了所需突变位点外，没有出现随机突变，因此，突变质粒pET-22b(+)-F231C/S173C、pET-22b(+)-F231C、pET-22b(+)-S173C构建成功。

F231C、S173C、F231C/S173C突变引物如下所示：(下划线为突变体)

F231C正向突变引物：5’-GGTCACTTCAAGGTATGTTGCGATGATAACTG-3；

F231C反向突变引物：5’-CTTGAAGTGACCTGTTCCTTTTTTGTAAATCTTG-3’；

S173C正向突变引物：5’-GGTTTTTGTGCGAAAATGGAGTAATTGCCTC-3’；

S173C反向突变引物：5’-TCGCACAAAAACCTGTTTTCTTTTTCTTGCCAG-3’；

PCR 1：反应体系的组成如表1所示，以带有纤维二糖差向异构酶目的基因的克隆载体pET-22b(+)-Casa-WT为模版。

表1：PCR 1反应体系的组成

PCR l扩增条件为：95℃预变性3min；随后95℃变性0.5min，56℃退火0.5min，72℃延伸3.5min，进行26个循环；最后72℃保温5min。

PCR 1扩增产物经琼脂糖电泳检测，割胶回收纯化。

经琼脂糖电泳胶回收纯化后的PCR 1扩增产物经限制性内切酶NdeI和XhoI酶切后连接至载体pET-22b(+)，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑单克隆于50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基培养，后分别提取突变质粒pET-22b(+)-F231C，突变质粒pET-22b(+)-S173C后转化至宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，突变质粒经测序鉴定为正确的突变，分别制备得到含有突变体的质粒pET-22b(+)-F231C、突变质粒pET-22b(+)-S173C。

PCR 2：反应体系的组成如表2所示。

表2：PCR 2反应体系的组成

10×PCR Buffer	5μL
		dNTP(2mmol/L)	4μL
S173C正向突变引物(10μM)	1μL
		S173C反向突变引物(10μM)	1μL
pET-22b(+)-Casa-WT-F231C	0.5μL
		Taq Plus DNA polymerase(5U/μL)	0.5μL
ddH2O	将体系补足50μL

PCR 2扩增条件为：95℃预变性3min；随后95℃变性0.5min，56℃退火0.5min，72℃延伸3.5min，进行26个循环；最后72℃保温5min。

PCR 2扩增产物经琼脂糖电泳检测，割胶回收纯化。

经琼脂糖电泳胶回收纯化后的PCR 2扩增产物经限制性内切酶NdeI和XhoI酶切后连接至载体pET22b(+)-F231C，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑单克隆于50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基培养，后提取得到突变质粒pET-22b(+)-F231C/S173C，将突变质粒pET-22b(+)-F231C/S173C转化至宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，突变质粒经测序鉴定为正确的突变。

实施例2：纤维二糖差向异构酶突变体F231C/S173C的表达纯化方法

具体步骤如下：

(1)分别将实施例1制备的得到的pET-22b(+)-Casa-WT，及含有突变体的质粒pET-22b(+)-F231C/S173C、pET-22b(+)-F231C、pET-22b(+)-S173C转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑取阳性转化子在LB液体培养基中37℃、200rpm摇瓶培养过夜，后接入LB液体培养基中，在37℃条件下培养3～4h至OD值为0.6～0.8，降温至28℃，加入IPTG终浓度为0.6mM诱导6h，制备得到发酵液。

(2)将制备得到的发酵液于4℃、l0000 rpm离心20min，取沉淀(菌体)。向菌体中加入20mL缓冲液(50mM PIPES，200mM NaCl，HCl调节pH至7)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间l s，停止时间2s，共计20min。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、10000rpm离心30min，得粗酶液。用0.45μm微孔滤膜过滤备用。

分别制备得到含有Casa-WT的粗酶液、含有F231C/S173C的粗酶液、含有F231C的粗酶液、含有S173C的粗酶液。

(3)含有突变体的纯酶液的获得

准备镍离子亲和层析柱，首先，在室温下利用恒流泵，向柱子里泵入去离子水冲洗柱子(约6～12倍柱体积)，然后用缓冲液A(500mmol/L NaCl，50mM PIPES，pH 7.0)平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的缓冲液A的pH值一致时(约需5倍柱体积缓冲液)，分别将步骤(2)得到的过膜粗酶液加入到柱子中。先用缓冲液B(500mmol/L NaCl，50mmol/L咪唑，50mM PIPES，pH 7.0)冲洗杂蛋白至基线平衡，再用含有高浓度咪唑的洗脱液(500mmol/L NaCl，500mmol/L咪唑，50mM PIPES，pH 7.0)洗脱。收集吸收峰的洗脱液，获得目的蛋白。

分别制备得到含有Casa-WT的纯酶液、含有F231C/S173C的纯酶液、含有F231C的纯酶液、含有S173C的纯酶液，分别对制备得到的纯酶液进行琼脂糖凝胶电泳分析(如图2所示)，结果显示：纯化得到的酶相对分子质量在40kDa附近，且为单一条带，与计算得到的分子质量吻合。

分别将制备得到的纯酶液稀释至终浓度为1mg/mL。

实施例3：纤维二糖差向异构酶的酶活测定

本发明的突变体的酶活的检测方法如下：

(1)α-乳糖PIPES溶液的制备：称取50mM的哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)于水中，加入NaOH调节pH，使PIPES溶解，随后继续加入NaOH使得pH为7.0，之后定容至1L。称取250mM的α-乳糖，使用配好的PIPES充分溶解并定容至1L。

(2)反应体系为1mL，分别向800μLα-乳糖PIPES溶液(250mM/L)中添加200μL实施例2制备得到的纯酶液，得到反应体系，将反应体系置于70℃条件下反应40min，加入100μL盐酸(1.5mol/L)终止反应，检测反应产物并计算酶活，结果如表3所示，此处的酶活的含义为：每分钟生产1μmol乳果糖所需的酶量。

1U总酶活定义为：在pH 7.0条件下反应，每分钟生产1μmol乳果糖所需的酶量。使用HPLC检测乳果糖的合成量，计算酶活。

表3：70℃条件下野生酶及不同突变体酶活

与野生酶WT相比，所述突变体酶F231C/S173C的最适催化条件没有发生改变，但酶在70℃的异构酶活提高到原有的287％。

实施例4：纤维二糖差向异构酶突变体的应用

乳果糖的工业制备方法大多基于洛布里·德·布鲁因-范·埃肯斯坦(Lobry deBruyn-Van Ekenstein reaction)，常用的催化剂有氢氧化物、叔胺类化合物、硼酸、碳酸钾等，该反应以乳糖为原料，生成产物中包含乳糖、乳果糖、依匹乳糖等各种单糖，后续分离过程复杂。β-半乳糖苷酶和葡萄糖异构酶的共催化生产乳果糖方法需要果糖作为共底物，而且转化效率率较低，后续获取乳果糖时需要分离大量副产物。纤维二糖差向异构酶底物只需要乳糖，不需要果糖为共底物，而且转化效率高。具体步骤如下：

反应体系(1mL)：

分别将实施例2制备得到的0.2mL含有Casa-WT的纯酶液、含有F231C/S173C的纯酶液、含有F231C的纯酶液、含有S173C的纯酶液，添加至含有0.8mL乳糖的体系中进行反应，其中乳糖的终浓度为：200mM/L，得到反应体系；将上述反应体系置于70℃条件下，进行反应，反应时间为：40min；结果如表4及图1所示。

表4：不同纤维二糖差向异构酶进行反应后的产物

结果显示：相比较于野生酶，F231C与S173C在单位时间内的乳果糖产量有所提高，而且两个突变位点叠加之后获得的F231C/S173C在单位时间内的乳果糖产量增加更加明显。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用

<130> BAA211366A

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1173

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggatatta caaggtttaa ggaagattta aaagctcatc ttgaagaaaa gataatacca 60

ttttggcaaa gtttaaagga cgatgaattt ggtggctact atggatatat ggactttaat 120

cttaacattg acagaaaagc tcaaaaaggt tgcattttga actcgaggat attgtggttt 180

ttctcagcat gttacaatgt gctgaaaagt gaaaaatgca aagagatggc ttttcatgcg 240

tttgaatttt taaaaaacaa gttttgggac aaagagtatg aaggactttt ctggagtgta 300

tcccacaaag gtgtgcccgt tgatgtgaca aaacatgttt atgttcaggc ttttggcata 360

tacgggcttt ctgagtacta tgaagcatcc ggggacgaag aagctcttca tatggctaag 420

aggcttttcg agattttaga gacaaaatgc aaaagggaaa atggatacac agaacagttt 480

gagagaaact ggcaagaaaa agaaaacagg tttttgagcg aaaatggagt aattgcctca 540

aaaacaatga acacgcatct tcatgtactg gagagctaca caaacctcta caggcttttg 600

aagcttgatg atgtgtatga agcgcttgag tggattgtaa gactctttgt tgacaagatt 660

tacaaaaaag gaacaggtca cttcaaggta ttttgcgatg ataactggaa cgaacttata 720

aaagcagtat catatggaca tgacattgaa gcaagctggc ttttagacca agctgccaag 780

tatctgaagg atgaaaagtt aaaagaggag gttgaaaagc tcgcattaga ggttgcccag 840

ataactttaa aagaagcctt tgatggtcaa agtcttataa atgaaatgat agaagatagg 900

attgacagga gtaaaatctg gtgggttgaa gcagagacgg ttgttggatt tttcaatgca 960

tatcaaaaga caaaagagga aaaatattta gatgcagcca tcaagacatg ggagttcata 1020

aaagagcatc ttgttgacag aagaaagaac tctgaatggc tgtggaaggt aaatgaggat 1080

ttagaagctg taaatatgcc aattgttgag caatggaagt gcccatatca caatggcaga 1140

atgtgtttgg agataataaa aagggttgac taa 1173

<210> 2

<211> 390

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Asp Ile Thr Arg Phe Lys Glu Asp Leu Lys Ala His Leu Glu Glu

1 5 10 15

Lys Ile Ile Pro Phe Trp Gln Ser Leu Lys Asp Asp Glu Phe Gly Gly

20 25 30

Tyr Tyr Gly Tyr Met Asp Phe Asn Leu Asn Ile Asp Arg Lys Ala Gln

35 40 45

Lys Gly Cys Ile Leu Asn Ser Arg Ile Leu Trp Phe Phe Ser Ala Cys

50 55 60

Tyr Asn Val Leu Lys Ser Glu Lys Cys Lys Glu Met Ala Phe His Ala

65 70 75 80

Phe Glu Phe Leu Lys Asn Lys Phe Trp Asp Lys Glu Tyr Glu Gly Leu

85 90 95

Phe Trp Ser Val Ser His Lys Gly Val Pro Val Asp Val Thr Lys His

100 105 110

Val Tyr Val Gln Ala Phe Gly Ile Tyr Gly Leu Ser Glu Tyr Tyr Glu

115 120 125

Ala Ser Gly Asp Glu Glu Ala Leu His Met Ala Lys Arg Leu Phe Glu

130 135 140

Ile Leu Glu Thr Lys Cys Lys Arg Glu Asn Gly Tyr Thr Glu Gln Phe

145 150 155 160

Glu Arg Asn Trp Gln Glu Lys Glu Asn Arg Phe Leu Ser Glu Asn Gly

165 170 175

Val Ile Ala Ser Lys Thr Met Asn Thr His Leu His Val Leu Glu Ser

180 185 190

Tyr Thr Asn Leu Tyr Arg Leu Leu Lys Leu Asp Asp Val Tyr Glu Ala

195 200 205

Leu Glu Trp Ile Val Arg Leu Phe Val Asp Lys Ile Tyr Lys Lys Gly

210 215 220

Thr Gly His Phe Lys Val Phe Cys Asp Asp Asn Trp Asn Glu Leu Ile

225 230 235 240

Lys Ala Val Ser Tyr Gly His Asp Ile Glu Ala Ser Trp Leu Leu Asp

245 250 255

Gln Ala Ala Lys Tyr Leu Lys Asp Glu Lys Leu Lys Glu Glu Val Glu

260 265 270

Lys Leu Ala Leu Glu Val Ala Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ala Phe Asp

275 280 285

Gly Gln Ser Leu Ile Asn Glu Met Ile Glu Asp Arg Ile Asp Arg Ser

290 295 300

Lys Ile Trp Trp Val Glu Ala Glu Thr Val Val Gly Phe Phe Asn Ala

305 310 315 320

Tyr Gln Lys Thr Lys Glu Glu Lys Tyr Leu Asp Ala Ala Ile Lys Thr

325 330 335

Trp Glu Phe Ile Lys Glu His Leu Val Asp Arg Arg Lys Asn Ser Glu

340 345 350

Trp Leu Trp Lys Val Asn Glu Asp Leu Glu Ala Val Asn Met Pro Ile

355 360 365

Val Glu Gln Trp Lys Cys Pro Tyr His Asn Gly Arg Met Cys Leu Glu

370 375 380

Ile Ile Lys Arg Val Asp

385 390

<210> 3

<211> 1173

<212> DNA

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<400> 3

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ttttggcaaa gtttaaagga cgatgaattt ggtggctact atggatatat ggactttaat 120

cttaacattg acagaaaagc tcaaaaaggt tgcattttga actcgaggat attgtggttt 180

ttctcagcat gttacaatgt gctgaaaagt gaaaaatgca aagagatggc ttttcatgcg 240

tttgaatttt taaaaaacaa gttttgggac aaagagtatg aaggactttt ctggagtgta 300

tcccacaaag gtgtgcccgt tgatgtgaca aaacatgttt atgttcaggc ttttggcata 360

tacgggcttt ctgagtacta tgaagcatcc ggggacgaag aagctcttca tatggctaag 420

aggcttttcg agattttaga gacaaaatgc aaaagggaaa atggatacac agaacagttt 480

gagagaaact ggcaagaaaa agaaaacagg tttttgtgcg aaaatggagt aattgcctca 540

aaaacaatga acacgcatct tcatgtactg gagagctaca caaacctcta caggcttttg 600

aagcttgatg atgtgtatga agcgcttgag tggattgtaa gactctttgt tgacaagatt 660

tacaaaaaag gaacaggtca cttcaaggta tgttgcgatg ataactggaa cgaacttata 720

aaagcagtat catatggaca tgacattgaa gcaagctggc ttttagacca agctgccaag 780

tatctgaagg atgaaaagtt aaaagaggag gttgaaaagc tcgcattaga ggttgcccag 840

ataactttaa aagaagcctt tgatggtcaa agtcttataa atgaaatgat agaagatagg 900

attgacagga gtaaaatctg gtgggttgaa gcagagacgg ttgttggatt tttcaatgca 960

tatcaaaaga caaaagagga aaaatattta gatgcagcca tcaagacatg ggagttcata 1020

aaagagcatc ttgttgacag aagaaagaac tctgaatggc tgtggaaggt aaatgaggat 1080

ttagaagctg taaatatgcc aattgttgag caatggaagt gcccatatca caatggcaga 1140

atgtgtttgg agataataaa aagggttgac taa 1173

<210> 4

<211> 390

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Asp Ile Thr Arg Phe Lys Glu Asp Leu Lys Ala His Leu Glu Glu

1 5 10 15

Lys Ile Ile Pro Phe Trp Gln Ser Leu Lys Asp Asp Glu Phe Gly Gly

20 25 30

Tyr Tyr Gly Tyr Met Asp Phe Asn Leu Asn Ile Asp Arg Lys Ala Gln

35 40 45

Lys Gly Cys Ile Leu Asn Ser Arg Ile Leu Trp Phe Phe Ser Ala Cys

50 55 60

Tyr Asn Val Leu Lys Ser Glu Lys Cys Lys Glu Met Ala Phe His Ala

65 70 75 80

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85 90 95

Phe Trp Ser Val Ser His Lys Gly Val Pro Val Asp Val Thr Lys His

100 105 110

Val Tyr Val Gln Ala Phe Gly Ile Tyr Gly Leu Ser Glu Tyr Tyr Glu

115 120 125

Ala Ser Gly Asp Glu Glu Ala Leu His Met Ala Lys Arg Leu Phe Glu

130 135 140

Ile Leu Glu Thr Lys Cys Lys Arg Glu Asn Gly Tyr Thr Glu Gln Phe

145 150 155 160

Glu Arg Asn Trp Gln Glu Lys Glu Asn Arg Phe Leu Cys Glu Asn Gly

165 170 175

Val Ile Ala Ser Lys Thr Met Asn Thr His Leu His Val Leu Glu Ser

180 185 190

Tyr Thr Asn Leu Tyr Arg Leu Leu Lys Leu Asp Asp Val Tyr Glu Ala

195 200 205

Leu Glu Trp Ile Val Arg Leu Phe Val Asp Lys Ile Tyr Lys Lys Gly

210 215 220

Thr Gly His Phe Lys Val Cys Cys Asp Asp Asn Trp Asn Glu Leu Ile

225 230 235 240

Lys Ala Val Ser Tyr Gly His Asp Ile Glu Ala Ser Trp Leu Leu Asp

245 250 255

Gln Ala Ala Lys Tyr Leu Lys Asp Glu Lys Leu Lys Glu Glu Val Glu

260 265 270

Lys Leu Ala Leu Glu Val Ala Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ala Phe Asp

275 280 285

Gly Gln Ser Leu Ile Asn Glu Met Ile Glu Asp Arg Ile Asp Arg Ser

290 295 300

Lys Ile Trp Trp Val Glu Ala Glu Thr Val Val Gly Phe Phe Asn Ala

305 310 315 320

Tyr Gln Lys Thr Lys Glu Glu Lys Tyr Leu Asp Ala Ala Ile Lys Thr

325 330 335

Trp Glu Phe Ile Lys Glu His Leu Val Asp Arg Arg Lys Asn Ser Glu

340 345 350

Trp Leu Trp Lys Val Asn Glu Asp Leu Glu Ala Val Asn Met Pro Ile

355 360 365

Val Glu Gln Trp Lys Cys Pro Tyr His Asn Gly Arg Met Cys Leu Glu

370 375 380

Ile Ile Lys Arg Val Asp

385 390

Claims (9)

1.一种纤维二糖差向异构酶突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQID NO. 2所示的纤维二糖差向异构酶的第231位的苯丙氨酸突变为半胱氨酸，同时将第173位的丝氨酸突变为半胱氨酸得到的。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的重组载体。

4.表达权利要求1所述的突变体，或携带权利要求2所述基因，或携带权利要求3所述重组载体的重组细胞。

5.如权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以细菌或真菌为表达宿主。

6.一种重组大肠杆菌，其特征在于，表达权利要求1所述的突变体。

7.如权利要求6所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，以pET-22b(+)为表达载体。

8.一种提高乳果糖产量的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1所述的突变体，或权利要求4或5所述的重组细胞添加至含有乳糖的反应体系中进行反应制备。

9.权利要求1所述的突变体，或权利要求2所述的基因，或权利要求3所述的重组载体，或权利要求4或5所述的重组细胞在制备含有乳果糖产品中的应用。