CN110438100B

CN110438100B - 一种生物催化合成甘油葡萄糖苷的方法

Info

Publication number: CN110438100B
Application number: CN201910710353.3A
Authority: CN
Inventors: 杨建刚; 张同; 曾艳; 孙媛霞; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2019-08-02
Filing date: 2019-08-02
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2039-08-02
Also published as: CN110438100A

Abstract

本发明公开了一种生物催化合成甘油葡萄糖苷的方法，本发明通过建立体外多酶级联反应体系或全细胞催化体系，可分别转化廉价底物蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、葡萄糖和甘油合成高附加值的甘油葡萄糖苷，甘油葡萄糖苷转化率均达到80％以上，并且进一步构建了高浓度的大反应，可高效生成甘油葡萄糖苷，该方法实现了磷酸基团的循环利用，可在低磷条件下反应，是环境友好型的技术路线，具有很强的应用潜力，所合成的甘油葡萄糖苷可用于化妆品、食品和医药等领域。

Description

一种生物催化合成甘油葡萄糖苷的方法

技术领域

本发明属于生物催化领域，具体涉及一种多酶催化制备甘油葡萄糖苷的方法。

背景技术

甘油葡萄糖苷是由葡萄糖和甘油通过糖苷键连接而成，其作为活性化合物，显示出对人体皮肤的保湿作用，已经作为保湿剂应用于化妆品，是名贵化妆品的常用成分之一；甘油葡萄糖苷给人以鲜明的甜味和良好的口感，甜度为蔗糖的一半，且不具有致龋性，可应用于食品保健行业；甘油葡萄糖苷与抗糖尿病药物伏格列波糖具有类似的结构，可应用于糖尿病的治疗。

甘油葡萄糖苷的生产方法包括化学法、微生物发酵法等。化学法可以催化糖类如葡萄糖、海藻糖等和多元醇合成甘油葡萄糖苷，然而化学合成方法得率低、立体选择性差，产物多是混合物，后续的分离纯化步骤繁琐且耗费较高；目前能够合成甘油葡萄糖苷的菌株已发现数十种，但这些菌株生产效率低，体内甘油葡萄糖苷的代谢途径还不清晰，因此，亟待开发一种低成本、低污染的制备高纯度甘油葡萄糖苷的新方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明通过挖掘筛选得到用于催化α-葡萄糖1-磷酸和甘油合成甘油葡萄糖苷的甘油葡萄糖苷磷酸化酶，并通过构建多酶反应体系，实现甘油葡萄糖苷的制备。

第一方面，本发明提供了一种用于催化α-葡萄糖1-磷酸和甘油合成甘油葡萄糖苷的甘油葡萄糖苷磷酸化酶，所述甘油葡萄糖苷磷酸化酶选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白；或

(b)将SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有催化α-葡萄糖1-磷酸和甘油合成甘油葡萄糖苷的衍生蛋白；或

(c)序列中含有(a)或(b)中所述蛋白序列的蛋白；或

(d)氨基酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的相同性≥60％(较佳地≥80％，更佳地≥90％)，且具有催化α-葡萄糖1-磷酸和甘油合成甘油葡萄糖苷的蛋白。

其中氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶来源于Zhongshania aliphaticivorans，命名为ZaGGP，在UniProt上的编号为A0A127M3Y3；氨基酸序列为SEQ ID NO:2的酶来源于Marinobacter psychrophilus，命名为MpGGP，在UniProt上的编号为A0A0H4I8H1。

第二方面，本发明提供了第一方面所述甘油葡萄糖苷磷酸化酶在催化α-葡萄糖1-磷酸和甘油合成甘油葡萄糖苷中的应用。

第三方面，本发明提供了一种制备甘油葡萄糖苷的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)以糖类为底物，将糖类转化为α-葡萄糖1-磷酸；和

(2)采用第一方面所述的甘油葡萄糖苷磷酸化酶催化，将甘油和生成的α-葡萄糖1-磷酸转化为甘油葡萄糖苷。

其中所述步骤(1)采用至少一种酶催化，所述糖类选自蔗糖、麦芽糖、淀粉或其衍生物、葡萄糖中的任意一种或多种。

所述至少一种酶催化选自由蔗糖磷酸化酶、麦芽糖磷酸化酶、异淀粉酶、葡聚糖磷酸化酶组成的组。

所述糖类是淀粉或其衍生物，所述淀粉或其衍生物选自由直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精组成的组。

当所述糖类是淀粉或其衍生物时，所述方法步骤中加入4-α-葡聚糖转移酶。

具体地，所述甘油葡萄糖苷的制备方法可通过构建体外多酶催化或全细胞催化反应体系来进行。

进一步地，所述体外多酶催化或全细胞催化反应体系中还包括缓冲液成分，优选地缓冲液为磷酸盐缓冲液。

根据本发明，本发明提供一种转化蔗糖和甘油合成甘油葡萄糖苷的方法，包括构建体外多酶反应体系转化蔗糖和甘油生成甘油葡萄糖苷，进一步包括全细胞催化转化蔗糖和甘油生成甘油葡萄糖苷，更进一步包括构建高浓度的体外多酶反应体系转化蔗糖和甘油生成甘油葡萄糖苷。

A、所述体外多酶反应体系包含蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7)和甘油葡萄糖苷磷酸化酶(EC 2.4.1.359)，转化蔗糖和甘油合成甘油葡萄糖苷。

所述反应体系中，蔗糖磷酸化酶来源于变形链球菌Streptococcus mutansUA159，命名为SmSP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4，在UniProt上的编号为P10249，以及与SmSP氨基酸序列相似性在70％以上的，且具有催化蔗糖和磷酸合成α-G1P和果糖功能的多肽；或者来源于明串珠菌Leuconostoc mesenteroides，命名为LmSP，其氨基酸序列为SEQID NO:5，在UniProt上的编号为Q59495，以及与LmSP氨基酸序列相似性在70％以上的，具有催化蔗糖和磷酸合成α-G1P和果糖功能的多肽；甘油葡萄糖苷磷酸化酶来源于Zhongshaniaaliphaticivorans，命名为ZaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，在UniProt上的编号为A0A127M3Y3，以及与ZaGGP氨基酸序列相似性在70％以上的，且具有催化α-G1P和甘油合成甘油葡萄糖苷功能的多肽；或者来源于Marinobacter psychrophilus，命名为MpGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2，在UniProt上的编号为A0A0H4I8H1，以及与MpGGP氨基酸序列相似性在70％以上的，且具有催化α-G1P和甘油合成甘油葡萄糖苷功能的多肽；或者来源于黏附性海洋杆菌Marinobacter adhaerens HP15，命名为MaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，在UniProt上的编号为E4PMA5，以及与MaGGP氨基酸序列相似性在70％以上的，且具有催化α-G1P和甘油合成甘油葡萄糖苷功能的多肽。

所述反应体系中，缓冲液的浓度为10-100mM，蔗糖的浓度为20mM-2M，甘油的浓度为20mM-2M，蔗糖磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL，甘油葡萄糖苷磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL。

优选的缓冲液为磷酸盐缓冲液，缓冲液浓度为50mM，蔗糖浓度为100mM，甘油的浓度为150mM，蔗糖磷酸化酶用量为4U/mL，甘油葡萄糖苷磷酸化酶用量为4U/mL。

所述酶催化的反应温度为10-80℃，反应pH为5.0-9.0，反应时间为1-120小时。

优选的反应温度为30℃、反应pH为6.5，反应时间为8h。

B、所述全细胞催化蔗糖和甘油合成甘油葡萄糖苷的方法，其特征为构建包含蔗糖磷酸化酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶的重组菌株，全细胞催化蔗糖和甘油合成甘油葡萄糖苷。

所述重组菌株中蔗糖磷酸化酶所述和甘油葡萄糖苷磷酸化酶的来源同上述A中所述。

所述重组菌株的构建方法，包括将蔗糖磷酸化酶基因和甘油葡萄糖苷磷酸化酶基因各自转入宿主菌株中分别获得2个重组菌株；或者是将蔗糖磷酸化酶基因和甘油葡萄糖苷磷酸化酶基因组合共转入宿主菌株中获得1个重组菌株。所述宿主菌株可以为谷氨酸棒杆菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，乳酸菌，酿酒酵母中的一种菌株。

所述反应体系中，缓冲液的浓度为10-100mM，蔗糖的浓度为20mM-2M,甘油的浓度为20mM-2M，重组菌株的用量为OD₆₀₀＝0.2-200，所述酶催化的反应温度为10-80℃，反应pH为5.0-9.0，反应时间为1-120小时。

优选的缓冲液为磷酸盐缓冲液，缓冲液浓度为50mM，蔗糖浓度为100mM,甘油的浓度为150mM，重组菌株的用量为OD₆₀₀＝10，反应温度为30℃、反应pH为6.5，反应时间为12h。

C、所述体外多酶级联转化高浓度蔗糖和甘油合成甘油葡萄糖苷的方法，其特征为所述高浓度底物为0.5M-2M的蔗糖及甘油，所述多酶反应体系包含蔗糖磷酸化酶(EC2.4.1.7)和甘油葡萄糖苷磷酸化酶(EC 2.4.1.359)。

所述反应体系中，蔗糖磷酸化酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶的来源同上述A中所述。

所述反应体系中，缓冲液的浓度为20-200mM，蔗糖的浓度为0.5M-3M，甘油的浓度为0.5M-3M，蔗糖磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL，甘油葡萄糖苷磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL。

优选的缓冲液为磷酸盐缓冲液，缓冲液浓度为100mM，蔗糖浓度为0.5M(或者1M，或者1.5M，或者2M)甘油的浓度为0.5M(或者1M，或者1.5M，或者2M)，蔗糖磷酸化酶用量为40U/mL，甘油葡萄糖苷磷酸化酶用量为40U/mL。

优选的反应温度为30℃、反应pH为6.5，并分别于2h、6h、24h、48h取样进行高效液相色谱检测。

根据本发明，本发明提供一种转化麦芽糖和甘油合成甘油葡萄糖苷的方法，其特征包括构建体外多酶反应体系转化麦芽糖和甘油合成甘油葡萄糖苷，进一步包括全细胞催化转化麦芽糖和甘油生成甘油葡萄糖苷，更进一步包括构建高浓度的体外多酶反应体系转化麦芽糖和甘油生成甘油葡萄糖苷。

A、所述体外多酶反应体系包含麦芽糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7)和甘油葡萄糖苷磷酸化酶(EC 2.4.1.332)，转化麦芽糖和甘油合成甘油葡萄糖苷。

所述反应体系中，麦芽糖磷酸化酶来源于嗜酸乳杆菌Lactobacillusacidophilus，命名为LaMP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:6，基因在UniProt上的编号为Q5FI04，以及与LaMP氨基酸序列相似性在70％以上的，且具有催化麦芽糖和磷酸合成β-G1P和葡萄糖功能的多肽；甘油葡萄糖苷磷酸化酶来源于硒还原芽孢杆菌Bacillusselenitireducens，命名为BsGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:7，基因在UniProt上的编号为D6XZ22，以及与BsGGP氨基酸序列相似性在70％以上的，且具有催化β-G1P和甘油合成甘油葡萄糖苷功能的多肽。

所述反应体系中，缓冲液的浓度为10-100mM，麦芽糖的浓度为20mM-1M,甘油的浓度为20mM-2M，麦芽糖磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL，甘油葡萄糖苷磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL。

优选的缓冲液为磷酸盐缓冲液，缓冲液浓度为50mM，麦芽糖浓度为100mM,甘油的浓度为200mM，麦芽糖磷酸化酶用量为4U/mL，甘油葡萄糖苷磷酸化酶用量为4U/mL。

优选的反应温度为30℃、反应pH为6.5，反应时间为8h。

B、所述全细胞催化麦芽糖和甘油合成甘油葡萄糖苷的方法，其特征为构建包含麦芽糖磷酸化酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶的重组菌株，全细胞催化麦芽糖和甘油合成甘油葡萄糖苷。

所述重组菌株中麦芽糖磷酸化酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶的来源同上述A所述。

所述重组菌株的构建方法，包括将麦芽糖磷酸化酶基因和甘油葡萄糖苷磷酸化酶基因各自转入宿主菌株中分别获得2个重组菌株；或者是将麦芽糖磷酸化酶基因和甘油葡萄糖苷磷酸化酶基因组合共转入宿主菌株中获得1个重组菌株。所述宿主菌株可以为谷氨酸棒杆菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，乳酸菌，酿酒酵母中的一种菌株。

所述反应体系中，缓冲液的浓度为10-100mM，麦芽糖的浓度为20mM-2M,甘油的浓度为20mM-2M，重组菌株的用量为(OD₆₀₀＝0.2-200)，所述酶催化的反应温度为10-80℃，反应pH为5.0-9.0，反应时间为1-120小时。

优选的缓冲液为磷酸盐缓冲液，缓冲液浓度为50mM，麦芽糖浓度为100mM,甘油的浓度为200mM，重组菌株的用量为OD₆₀₀＝10，反应温度为30℃、反应pH为6.5，反应时间为12h。

C、所述体外多酶级联转化高浓度麦芽糖和甘油合成甘油葡萄糖苷的方法，其特征为所述高浓度底物为0.5M-3M的麦芽糖及甘油，所述多酶反应体系包含麦芽糖糖磷酸化酶(EC 2.4.1.8)和甘油葡萄糖苷磷酸化酶(EC 2.4.1.332)。

所述反应体系中，麦芽糖磷酸化酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶的来源同上述A所述。

所述反应体系中，缓冲液的浓度为20-200mM，麦芽糖的浓度为0.5M-3M，甘油的浓度为0.5M-3M，麦芽糖磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL，甘油葡萄糖苷磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL。

优选的缓冲液为磷酸盐缓冲液，缓冲液浓度为100mM，麦芽糖浓度为1M，甘油的浓度为2M，麦芽糖磷酸化酶用量为40U/mL，甘油葡萄糖苷磷酸化酶用量为40U/mL。

优选的反应温度为30℃、反应pH为6.5，并分别于2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h取样进行高效液相色谱检测。

根据本发明，本发明提供一种转化麦芽糊精和甘油合成甘油葡萄糖苷的方法，其特征包括构建体外多酶反应体系转化麦芽糊精和甘油合成甘油葡萄糖苷，进一步包括全细胞催化转化麦芽糊精和甘油生成甘油葡萄糖苷，更进一步包括构建高浓度的体外多酶反应体系转化麦芽糊精和甘油生成甘油葡萄糖苷。

A、所述体外多酶反应体系包含异淀粉酶(EC 3.2.1.68)、葡聚糖磷酸化酶(EC2.4.1.1)、4-α-葡聚糖转移酶(4GT，EC 2.4.1.25)和甘油葡萄糖苷磷酸化酶(EC2.4.1.359)，转化麦芽糊精和甘油合成甘油葡萄糖苷。

所述反应体系中，异淀粉酶来源于超嗜热古菌Sulfurisphaera tokodaii，命名为StIA，其氨基酸序列为SEQ ID NO:8，基因在UniProt上的编号为Q973H3，以及与StIA氨基酸序列相似性在70％以上的，且具有催化麦芽糊精中以α-1,6糖苷键连接的支链的断裂，形成直链聚糖功能的多肽；葡聚糖磷酸化酶来源于大肠杆菌Escherichia coli strain K12，命名为EcGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:9，基因在UniProt上的编号为P00490，以及与EcGP氨基酸序列相似性在70％以上的，且具有催化直链聚糖和磷酸基团(PO₄ ^3-)合成α-G1P功能的多肽；4-α-葡聚糖转移酶来源于集胞藻属Synechocystis sp.PCC 6803，命名为SsGT，其氨基酸序列为SEQ ID NO:10，基因在UniProt上的编号为P72785，以及与SsGT氨基酸序列相似性在70％以上的，且具有催化麦芽糖聚合生成麦芽四糖或更高聚合度的寡糖功能的多肽；甘油葡萄糖苷磷酸化酶来源于Zhongshania aliphaticivorans，命名为ZaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，在UniProt上的编号为A0A127M3Y3，以及与ZaGGP氨基酸序列相似性在70％以上的，且具有催化α-G1P和甘油合成甘油葡萄糖苷功能的多肽；或者来源于Marinobacter psychrophilus，命名为MGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2，基因在UniProt上的编号为A0A0H4I8H1，以及与MpGGP氨基酸序列相似性在70％以上的，且具有催化α-G1P和甘油合成甘油葡萄糖苷功能的多肽；或者来源于黏附性海洋杆菌Marinobacteradhaerens HP15，命名为MaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，基因在UniProt上的编号为E4PMA5，以及与MaGGP氨基酸序列相似性在70％以上的，且具有催化α-G1P和甘油合成甘油葡萄糖苷功能的多肽。

所述反应体系中，缓冲液的浓度为10-100mM，麦芽糊精的浓度为5mM-1M(葡萄糖当量)，甘油的浓度为20mM-2M，异淀粉酶用量为0.1-1000U/mL，葡聚糖磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL，4-α-葡聚糖转移酶用量为0.1-1000U/mL，甘油葡萄糖苷磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL。

优选的缓冲液为磷酸盐缓冲液，缓冲液浓度为50mM，麦芽糊精浓度为55.6mM(葡萄糖当量)，甘油的浓度为200mM，异淀粉酶用量为2U/mL，葡聚糖磷酸化酶用量为4U/mL，4-α-葡聚糖转移酶用量为2U/mL，甘油葡萄糖苷磷酸化酶用量为4U/mL。

优选的反应温度为30℃、反应pH为6.5，反应时间为8h。

B、所述全细胞催化麦芽糊精和甘油合成甘油葡萄糖苷的方法，其特征为构建包含异淀粉酶、葡聚糖磷酸化酶、4-α-葡聚糖转移酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶的重组菌株，全细胞催化麦芽糊精和甘油合成甘油葡萄糖苷。

所述重组菌株中异淀粉酶、葡聚糖磷酸化酶、4-α-葡聚糖转移酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶来源同上述A中所述。

所述重组菌株的构建方法为将异淀粉酶基因，葡聚糖磷酸化酶基因，4-α-葡聚糖转移酶基因和甘油葡萄糖苷磷酸化酶基因各自转入宿主菌株中分别获得4个重组菌株；或者是将异淀粉酶基因，葡聚糖磷酸化酶基因，4-α-葡聚糖转移酶基因和甘油葡萄糖苷磷酸化酶基因组合按照2个到4个的任意的排列组合方式转入到两个或两个以上的宿主菌株中获得两个或两个以上的转化菌株。所述宿主菌株可以为谷氨酸棒杆菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，乳酸菌，酿酒酵母中的一种菌株。

优选地，将异淀粉酶基因，葡聚糖磷酸化酶基因，4-α-葡聚糖转移酶基因和甘油葡萄糖苷磷酸化酶基因各自转入大肠杆菌BL21(DE3)中分别获得4个转化菌株。

其中，透性化处理包括但不限于反复冻融处理、热处理和化学试剂处理。

优选的缓冲液为磷酸盐缓冲液，缓冲液浓度为50mM，麦芽糊精浓度为55.6mM(葡萄糖当量)，甘油的浓度为200mM，含异淀粉酶的重组菌株OD₆₀₀为10，含葡聚糖磷酸化酶的重组菌株OD₆₀₀为10，含4-α-葡聚糖转移酶的重组菌株OD₆₀₀为10，含甘油葡萄糖苷酸化酶的重组菌株OD₆₀₀为10，反应温度为30℃、反应pH为6.5，反应时间为12h。

C、所述体外多酶级联转化高浓度麦芽糊精和甘油合成甘油葡萄糖苷的方法，其特征为所述高浓度底物为100mg/mL的麦芽糊精及1M甘油，所述多酶反应体系包含异淀粉酶(EC 3.2.1.68)、葡聚糖磷酸化酶(EC 2.4.1.1)、4-α-葡聚糖转移酶(4GT，EC 2.4.1.25)和甘油葡萄糖苷磷酸化酶(EC 2.4.1.359)

所述反应体系中，异淀粉酶、葡聚糖磷酸化酶、4-α-葡聚糖转移酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶的来源同上述A所述。

所述反应体系中，缓冲液的浓度为20-200mM，麦芽糊精的浓度为10mg/mL-200mg/mL，甘油的浓度为0.5M-3M，异淀粉酶用量为0.1-1000U/mL，葡聚糖磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL，4-α-葡聚糖转移酶用量为0.1-1000U/mL，甘油葡萄糖苷磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL。

优选的缓冲液为磷酸盐缓冲液，缓冲液浓度为100mM，麦芽糊精浓度为100mg/mL，甘油的浓度为1M，异淀粉酶用量为10U/mL，葡聚糖酸化酶用量为40U/mL，4-α-葡聚糖转移酶用量为10U/mL，甘油葡萄糖苷磷酸化酶用量为40U/mL。

根据本发明，本发明提供一种转化葡萄糖和甘油合成甘油葡萄糖苷的方法，其特征包括构建体外多酶反应体系转化葡萄糖和甘油合成甘油葡萄糖苷，进一步包括全细胞催化转化葡萄糖和甘油生成甘油葡萄糖苷。

A、所述体外多酶反应体系包含葡萄糖激酶(EC 2.7.1.6)和甘油葡萄糖苷磷酸化酶(EC 2.4.1.359)，转化葡萄糖和甘油合成甘油葡萄糖苷。

所述反应体系中，葡萄糖激酶来源于肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae，命名为SpGK，其氨基酸序列为SEQ ID NO:11，基因在UniProt上的编号为Q97NZ6，以及与SpGK氨基酸序列相似性在70％以上的，且具有催化葡萄糖和磷酸基团(PO₄ ^3-)合成α-G1P功能的多肽；甘油葡萄糖苷磷酸化酶来源于Zhongshania aliphaticivorans，命名为ZaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，在UniProt上的编号为A0A127M3Y3，以及与ZaGGP氨基酸序列相似性在70％以上的，且具有催化α-G1P和甘油合成甘油葡萄糖苷功能的多肽；或者来源于Marinobacter psychrophilus，命名为MGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2，基因在UniProt上的编号为A0A0H4I8H1，以及与MpGGP氨基酸序列相似性在70％以上的，且具有催化α-G1P和甘油合成甘油葡萄糖苷功能的多肽；或者来源于黏附性海洋杆菌Marinobacteradhaerens HP15，命名为MaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，基因在UniProt上的编号为E4PMA5，以及与MaGGP氨基酸序列相似性在70％以上的，且具有催化α-G1P和甘油合成甘油葡萄糖苷功能的多肽。

所述反应体系中，缓冲液的浓度为10-100mM，葡萄糖的浓度为20mM-2M,甘油的浓度为20mM-2M，葡萄糖激酶用量为0.1-1000U/mL，甘油葡萄糖苷磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL。

优选的缓冲液为磷酸盐缓冲液，缓冲液浓度为50mM，葡萄糖浓度为50mM，甘油的浓度为200mM，葡萄糖激酶用量为4U/mL，甘油葡萄糖苷磷酸化酶用量为4U/mL。

优选的反应温度为30℃、反应pH为6.5，反应时间为8h。

B、所述全细胞催化葡萄糖和甘油合成甘油葡萄糖苷的方法，其特征为构建包含葡萄糖激酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶的重组菌株，全细胞催化葡萄糖和甘油合成甘油葡萄糖苷。

所述重组菌株中葡萄糖激酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶来源同上述A中所述。

所述重组菌株的构建方法，包括将葡萄糖激酶基因和甘油葡萄糖苷磷酸化酶基因各自转入宿主菌株中分别获得2个重组菌株；或者是将葡萄糖激酶基因和甘油葡萄糖苷磷酸化酶基因组合共转入宿主菌株中获得1个重组菌株。所述宿主菌株可以为谷氨酸棒杆菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，乳酸菌，酿酒酵母中的一种菌株。

所述反应体系中，缓冲液的浓度为10-100mM，葡萄糖的浓度为20mM-2M,甘油的浓度为20mM-2M，重组菌株的用量为(OD₆₀₀＝0.2-200)，所述酶催化的反应温度为10-80℃，反应pH为5.0-9.0，反应时间为1-120小时。

优选的缓冲液为磷酸盐缓冲液，缓冲液浓度为50mM，葡萄糖浓度为50mM,甘油的浓度为150mM，重组菌株的用量为OD₆₀₀＝10，反应温度为30℃、反应pH为6.5，反应时间为12h。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)具有底物来源廉价且广泛；

(2)产物构型单一便于分离；

(3)生产速率和转化率高的优点。

附图说明

图1.为蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、葡萄糖和甘油合成甘油葡萄糖苷的技术路线。

图2.为以蔗糖和甘油为底物合成甘油葡萄糖苷的高效液相色谱分析结果。

图3.为高浓度的蔗糖和甘油合成甘油葡萄糖苷

图4.为以麦芽糖和甘油为底物合成甘油葡萄糖苷的高效液相色谱分析结果。

图5.为高浓度的麦芽糖和甘油合成甘油葡萄糖苷

图6.为以麦芽糊精和甘油为底物合成甘油葡萄糖苷的高效液相色谱分析结果。

图7.为高浓度的麦芽糊精和甘油合成甘油葡萄糖苷

具体实施方式

以下结合实施例进一步详述本发明。

本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

各实施例中所用相同名称的材料或试剂如无特别说明即为相同的。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为实施本发明时对生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

本发明中所用引物由江苏金唯智生物技术有限公司合成，所用基因由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

本发明中所述甘油葡萄糖苷的转化率是基于途径中的底物蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、葡萄糖计算所得。

本发明中酶活性测定方法及酶活性单位定义如下：

甘油葡萄糖苷磷酸化酶酶活性测定：在200uL反应体系中含有甘油葡萄糖苷磷酸化酶(50μg)，α-葡萄糖1-磷酸(50mM)，甘油(50mM)，磷酸盐缓冲液(50mM，pH 6.5)，30℃水浴反应10min，快速加入2μL 10％H₂SO₄终止反应，进行高效液相色谱检测甘油的消耗。甘油葡萄糖苷磷酸化酶酶活性定义为，每毫克甘油葡萄糖苷磷酸化酶每分钟所消耗的甘油的微摩尔含量。

实施例1、甘油葡萄糖苷磷酸化酶的挖掘与功能验证

通过数据库挖掘获得来源于Zhongshania aliphaticivorans的多肽序列(SEQ IDNO:1)，命名为ZaGGP，该多肽序列包含480个氨基酸，分子量为54.8kDa，基因在UniProt上的编号为A0A127M3Y3，被注释为蔗糖磷酸化酶；以及来源于Marinobacter psychrophilus的多肽序列(SEQ ID NO:2)，命名为MpGGP。该多肽序列包含480个氨基酸，分子量为54.9kDa，基因在UniProt上的编号为A0A0H4I8H1，被注释为糖磷酸化酶。将两个氨基酸序列经密码子优化后由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成，并克隆至pET21a载体中，获得相应的表达载体pET21a-ZaGGP、pET21a-MpGGP，转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白质表达，具体操作方法如下：

首先，培养及诱导含有ZaGGP基因的大肠杆菌重组菌株，选用LB培养基(含蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L)，培养基中添加氨苄青霉素(100mg/L)，在37℃、200rmp条件下对大肠杆菌重组菌株进行培养，当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，添加IPTG诱导蛋白表达，终浓度为1mM，降低摇床温度为16℃，诱导约20h。

其次，收集和浓缩大肠杆菌重组菌株，将诱导得到的大肠杆菌重组菌株菌液(100mL)，5000rpm、4℃离心10min收集菌体，用磷酸盐缓冲液(50mM，pH 6.5)洗涤菌液两次，最终用磷酸盐缓冲液(50mM，pH 6.5)浓缩菌液至2mL。

再次，纯化该酶，针对菌株浓缩液超声破碎，14000rpm、4℃离心30min，得破碎上清，采用Ni柱亲和层析的方法进行纯化，并进一步用10kDa的超滤管进行超滤，得到浓缩纯化的ZaGGP。

所述MpGGP的制备方法与ZaGGP一致。

对纯化的ZaGGP及MpGGP进行功能验证，在200uL反应体系中含有ZaGGP(或MpGGP)(100μg)，α-G1P(50mM)，甘油(50mM)，磷酸盐缓冲液(50mM，pH 6.5)，30℃水浴反应12h后加入2μL 10％H₂SO₄终止反应，进行高效液相色谱检测。

根据保留时间的不同，高效液相色谱可以用来区分反应体系中的甘油和甘油葡萄糖苷，并且可以对甘油进行定量。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，分析柱：Sugar-Pak色谱柱，流动相：超纯水，流速：0.4mL/min，柱温：80℃，检测器：示差折光检测器，上样量为10μL。

高效液相色谱图检测到甘油的消耗以及产物甘油葡萄糖苷(2-αGG)的生成，证明该酶可催化α-G1P和甘油生成甘油葡萄糖苷(2-αGG)。

进一步，对纯化的ZaGGP进行活性测定，在200uL反应体系中含有ZaGGP(或MpGGP)(50μg)，α-G1P(50mM)，甘油(50mM)，磷酸盐缓冲液(50mM，pH 6.5)，30℃水浴反应10min后，立即加入2μL 10％H₂SO₄终止反应，进行高效液相色谱检测，检测方法同上。测得ZaGGP的活性为3U/mg，MpGGP的活性为12.4U/mg。

实施例2、甘油葡萄糖苷磷酸化酶催化合成2-αGG

甘油葡萄糖苷磷酸化酶催化底物α-G1P和甘油转化为甘油葡萄糖苷，所述甘油葡萄糖苷磷酸化酶可来源于Zhongshania aliphaticivorans，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，在UniProt上的编号为A0A127M3Y3；也可以是来源于Marinobacter psychrophilus的甘油葡萄糖苷磷酸化酶，命名为MpGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2，在UniProt上的编号为A0A0H4I8H1；也可以是来源于黏附性海洋杆菌Marinobacter adhaerens HP15的甘油葡萄糖苷磷酸化酶，命名为MaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，在UniProt上的编号为E4PMA5。

所述甘油葡萄糖苷磷酸化酶的制备方法与实施例1中相同。

在一个1mL的反应体系中含有50mM的磷酸盐缓冲液(pH 6.5)，所述甘油葡萄糖苷磷酸化酶的用量为4U/mL，200mMα-G1P和200mM甘油，在30℃进行催化反应，反应8小时。

根据保留时间的不同，高效液相色谱可以用来区分反应体系中的甘油和甘油葡萄糖苷，并且可以对甘油进行定量。高效液相色谱分析条件与实施例1相同。

反应结束后，三种不同来源的甘油葡萄糖苷磷酸化酶所催化的反应中甘油葡萄糖苷的终浓度均为172mM，甘油葡萄糖苷转化率均达到86％。

实施例3、转化蔗糖和甘油合成甘油葡萄糖苷

A、体外多酶催化转化蔗糖和甘油合成甘油葡萄糖苷

建立体外多酶催化体系将蔗糖和甘油转化为甘油葡萄糖苷(图1)。这些关键酶包括：(1)蔗糖磷酸化酶(SP，EC 2.4.1.7)，催化蔗糖和磷酸基团(PO4^3-)合成α-G1P；(2)甘油葡萄糖苷磷酸化酶(GGP，EC 2.4.1.359)，催化α-G1P和甘油合成甘油葡萄糖苷。

在本发明中，蔗糖磷酸化酶来源于明串珠菌Leuconostoc mesenteroides，命名为LmSP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5，在UniProt上的编号为Q59495；甘油葡萄糖苷磷酸化酶来源于黏附性海洋杆菌Marinobacter adhaerens HP15，命名为MaGGP，其氨基酸序列为SEQID NO:3，在UniProt上的编号为E4PMA5。这些基因的氨基酸序列都可以从UniProt数据库中获得，通过密码子优化后由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成，并克隆至pET21a载体中，获得相应的表达载体pET21a-LmSP和pET21a-MaGGP。这两个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白质表达，具体操作方法与实施例1相同。

所述反应体系中所需要的酶制备方法与实施案例1一致。

在一个200μL的反应体系中含有50mM的磷酸盐缓冲液(pH 6.5)，所述蔗糖磷酸化酶的用量为4U/mL，所述甘油葡萄糖苷磷酸化酶的用量为4U/mL，100mM蔗糖和150mM甘油，在30℃进行催化反应，反应8小时。

根据保留时间的不同，高效液相色谱可以用来区分反应体系中的蔗糖、甘油、果糖和甘油葡萄糖苷，并且可以对甘油进行定量。高效液相色谱分析条件与实施例1相同。

结果如图2所示，反应结束后，甘油葡萄糖苷的终浓度是95mM，甘油葡萄糖苷转化率达到95％。

B、全细胞催化转化蔗糖和甘油合成甘油葡萄糖苷

1、含有蔗糖磷酸化酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶基因重组菌株Sucrose 1的构建

首先，以实施例3-A所述重组表达载体pET21a-LmSP中携带的蔗糖磷酸化酶基因为模板设计引物5和引物6，以表达载体pET21a-MaGGP中携带的甘油葡萄糖苷磷酸化酶基因为模板设计引物7和引物8，提取质粒pETDuet，并设计引物9和引物10、引物11和引物12。其中引物5和引物9、引物6和引物10内含21bp同源区域；引物7和引物11、引物8和引物12内含21bp同源区域。采用引物5和引物6，以pET21a-LmSP为模板，PCR扩增蔗糖磷酸化酶基因LmSP；采用引物9和引物10，以pETDuet质粒为模板，PCR扩增来线性化质粒pETDuet；通过重组酶连接得到重组载体pETDuet-LmSP，进一步采用引物7和引物8，以pET21a-MaGGP为模板，PCR扩增甘油葡萄糖苷磷酸化酶基因MaGGP；采用引物11和引物12，以pETDuet-LmSP质粒为模板，PCR扩增来线性化质粒pETDuet-LmSP；通过重组酶连接得到重组载体pETDuet-LmSP-MaGGP。将所得重组质粒采用化学转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组菌株，命名为Sucrose1。

2、全细胞催化剂的制备

首先，培养及诱导分别含有蔗糖磷酸化酶基因和甘油葡萄糖苷磷酸化酶基因的重组菌株Sucrose 1，选用LB培养基(含蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L，培养基中添加氨苄青霉素(100mg/L)，在37℃、200rmp条件下对重组菌株Sucrose 1株进行培养，当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，添加IPTG，终浓度为1mM，降低摇床温度为16℃，诱导约20h。

其次，收集和浓缩大肠杆菌重组菌株，将诱导得到的重组菌株Sucrose 1菌液(100mL)，5000rpm、4℃离心10min收集菌体，用磷酸盐缓冲液(50mM，pH 6.5)洗涤菌液两次，最终用磷酸盐缓冲液(50mM，pH 6.5)浓缩菌液至2mL，用紫外分光光度计测定菌液的OD₆₀₀。

3、全细胞催化蔗糖和甘油合成甘油葡萄糖苷

采用如上所述制备的全细胞催化剂合成甘油葡萄糖苷，反应体系(20mL)中磷酸盐缓冲液浓度为50mM，pH＝6.5，表达有蔗糖磷酸化酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶的重组菌株Sucrose 1菌体浓度为OD₆₀₀＝10，蔗糖浓度为100mM，甘油浓度为200mM，在30℃进行催化反应，反应12小时。

反应结束后，甘油葡萄糖苷的终浓度是90mM，甘油葡萄糖苷转化率达到90％。

C、高浓度反应体系转化蔗糖和甘油合成甘油葡萄糖苷

建立高浓度的体外多酶反应体系转化蔗糖和甘油合成甘油葡萄糖苷。所述关键酶包括蔗糖磷酸化酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶，所述酶的来源以及制备方法同本实施例中A所述，所述高浓度的蔗糖包括0.5M、1M、1.5M、2M。

在一个1mL的反应体系中含有100mM的磷酸盐缓冲液(pH 6.5)，所述蔗糖磷酸化酶的用量为40U/mL，所述甘油葡萄糖苷磷酸化酶的用量为40U/mL，0.5M蔗糖和0.5M甘油(或1M蔗糖和1M甘油，或1.5M蔗糖和1.5M甘油，或2M蔗糖和2M甘油)，在30℃进行催化反应，并分别于2h、6h、24h、48h取样进行高效液相色谱检测。

实验结果图3所述，反应48h后，0.5M、1M、1.5M、2M蔗糖浓度的反应中甘油葡萄糖苷的终浓度分别为390mM、786mM、1183mM、1486mM，甘油葡萄糖苷转化率为78.0％、78.6％、78.9％、74.3％。

实施例4、转化麦芽糖和甘油合成甘油葡萄糖苷

A、体外多酶催化转化麦芽糖和甘油合成甘油葡萄糖苷

建立体外多酶催化体系将麦芽糖和甘油转化为甘油葡萄糖苷(图1)。这些关键酶包括：(1)麦芽糖磷酸化酶(MP，EC 2.4.1.8)，催化麦芽糖和磷酸基团(PO₄ ^3-)合成β-G1P；(2)甘油葡萄糖苷磷酸化酶(GGP,EC 2.4.1.332)，催化β-G1P和甘油合成甘油葡萄糖苷。

在本发明中，麦芽糖磷酸化酶来源于嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus，命名为LaMP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:6，基因在UniProt上的编号为Q5FI04，甘油葡萄糖苷磷酸化酶来源于硒还原芽孢杆菌Bacillus selenitireducens，命名为BsGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:7，基因在UniProt上的编号为D6XZ22，这些基因的氨基酸序列都可以从UniProt数据库中获得，通过密码子优化后由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成，并克隆至pET21a载体中，获得相应的表达载体pET21a-LaMP、pET21a-BsGGP。这两个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白质表达，具体操作方法同实施案例1。

所述反应体系中所需要的酶制备方法与实施案例1一致。

在一个200μL的反应体系中含有50mM的磷酸盐缓冲液(pH 6.5)，所述麦芽糖磷酸化酶的用量为4U/mL，所述甘油葡萄糖苷磷酸化酶BsGGP的用量为4U/mL，100mM麦芽糖和200mM甘油，在30℃进行催化反应，反应8小时。

根据保留时间的不同，高效液相色谱可以用来区分反应体系中的麦芽糖、甘油和甘油葡萄糖苷，并且可以对甘油进行定量。高效液相色谱分析条件与实施例1相同。

结果如图4所示，反应结束后，甘油葡萄糖苷的终浓度是85mM，甘油葡萄糖苷转化率达到85％。

B、全细胞催化转化麦芽糖和甘油合成甘油葡萄糖苷

1、含有麦芽糖磷酸化酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶基因重组菌株Maltose 1的构建

首先，以实施例4-A所述重组表达载体pET21a-LaMP中携带的麦芽糖磷酸化酶基因为模板设计引物13和引物14，以表达载体pET21a-BsGGP中携带的甘油葡萄糖苷磷酸化酶基因为模板设计引物15和引物16，提取质粒pETDuet，所设计引物同实施例5中的引物9、引物10、引物11、引物12。其中引物13和引物9、引物14和引物10内含21bp同源区域；引物15和引物11、引物16和引物12内含21bp同源区域。采用引物13和引物14，以pET21a-LaMP为模板，PCR扩增麦芽糖磷酸化酶基因LaMP；采用引物9和引物10，以pETDuet质粒为模板，PCR扩增来线性化质粒pETDuet；通过重组酶连接得到重组载体pETDuet-LaMP，进一步采用引物15和引物16，以pET21a-BsGGP为模板，PCR扩增甘油葡萄糖苷磷酸化酶基因BsGGP；采用引物11和引物12，以pETDuet-LaMP质粒为模板，PCR扩增来线性化质粒pETDuet-LaMP，通过重组酶连接得到重组载体pETDuet-LaMP-BsGGP。将所得重组质粒采用化学转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组菌株，命名为Maltose 1。

2、全细胞催化剂的制备

重组菌株Maltose 1全细胞催化剂的制备方法同实施例4中重组菌株Sucrose1相同。

3、全细胞催化麦芽糖和甘油合成甘油葡萄糖苷

制备全细胞催化反应体系，反应体系(20mL)中磷酸盐缓冲液浓度为50mM，pH＝6.5，表达有麦芽糖磷酸化酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶的重组菌株Maltose 1菌体浓度为OD₆₀₀＝10，麦芽糖浓度为100mM，甘油浓度为200mM，在30℃进行催化反应，反应12小时。

反应结束后，最终甘油葡萄糖苷的终浓度是80mM，甘油葡萄糖苷转化率达到80％。

C、高浓度反应体系转化麦芽糖和甘油合成甘油葡萄糖苷

建立高浓度的体外多酶反应体系转化蔗糖和甘油合成甘油葡萄糖苷。所述关键酶包括麦芽糖磷酸化酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶，所述酶的来源以及制备方法同上所述，所述高浓度的麦芽糖为1M。

在一个1mL的反应体系中含有100mM的磷酸盐缓冲液(pH 6.5)，所述麦芽糖磷酸化酶的用量为40U/mL，所述甘油葡萄糖苷磷酸化酶的用量为40U/mL，1M麦芽糖和2M甘油，在30℃进行催化反应，并分别于2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h取样进行高效液相色谱检测。

结果如图5所示，反应结束后，甘油葡萄糖苷的终浓度分别为725mM，甘油葡萄糖苷转化率为72.5％。

实施例5、转化麦芽糊精和甘油合成甘油葡萄糖苷

A、体外多酶催化转化麦芽糊精和甘油合成甘油葡萄糖苷

1、建立体外多酶催化体系将麦芽糊精和甘油转化为甘油葡萄糖苷。这些关键酶包括：(1)异淀粉酶(IA，EC 3.2.1.68)，催化麦芽糊精中以α-1,6糖苷键连接的支链的断裂，形成直链聚糖；(2)葡聚糖酸化酶(GP，EC 2.4.1.1)，催化直链聚糖和磷酸基团(PO₄ ^3-)合成α-G1P；(4)甘油葡萄糖苷磷酸化酶(GGP，EC 2.4.1.359)，催化α-G1P和甘油合成甘油葡萄糖苷。

在本发明中，异淀粉酶来源于超嗜热古菌Sulfurisphaera tokodaii，命名为StIA，其氨基酸序列为SEQ ID NO:8，基因在UniProt上的编号为Q973H3，葡聚糖磷酸化酶来源于大肠杆菌Escherichia coli strain K12，命名为EcGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:9，基因在UniProt上的编号为P00490，甘油葡萄糖苷磷酸化酶来源于黏附性海洋杆菌Marinobacter adhaerens HP15，命名为MaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，基因在UniProt上的编号为E4PMA5，除EcGP外，其它基因的氨基酸序列都可以从UniProt数据库中获得，通过密码子优化后由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成，并克隆至pET21a载体中，获得相应的表达载体pET21a-StIA、pET21a-MaGGP。EcGP的基因序列可从KEGG的官方网站(www.kegg.jp)上获得，设计引物1和引物2从大肠杆菌E.coli strain K12的基因组DNA中通过PCR反应克隆EcGP的基因；提取质粒pET21a，并设计引物3和引物4对质粒pET21a进行线性化。其中引物1和引物3、引物2和引物4内含21bp同源区域，通过重组酶连接的方法将基因EcGP克隆至pET21a载体中，获得相应的表达载体pET21a-EcGP。这三个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白质表达，具体操作方法同实施案例1。

所述反应体系中所需要的酶制备方法与实施案例1一致。

在一个200μL的反应体系中含有50mM的磷酸盐缓冲液(pH 6.5)，所述异淀粉酶的用量为2U/mL，所述葡聚糖磷酸化酶的用量为4U/mL，所述甘油葡萄糖苷磷酸化酶的用量为4U/mL，55.6mM麦芽糊精(葡萄糖当量)和100mM甘油，在30℃进行催化反应，反应8小时。

反应结果如图6所示，反应结束后，甘油葡萄糖苷的终浓度是47mM，甘油葡萄糖苷转化率达到85％。

2、优化体外多酶催化体系，提高麦芽糊精的转化率，在1中所述的多酶反应体系的基础上，进一步添加葡聚糖转移酶，构成四酶催化的体外反应体系转化麦芽糊精和甘油合成甘油葡萄糖苷(图1)。这些关键酶包括：(1)异淀粉酶(IA，EC 3.2.1.68)，催化麦芽糊精中以α-1,6糖苷键连接的支链的断裂，形成直链聚糖；(2)葡聚糖酸化酶(GP，EC 2.4.1.1)，催化直链聚糖和磷酸基团(PO₄ ^3-)合成α-G1P；(3)4-α-葡聚糖转移酶(4GT，EC 2.4.1.25)，催化麦芽糖聚合生成麦芽四糖或更高聚合度的寡糖；(4)甘油葡萄糖苷磷酸化酶(GGP，EC2.4.1.359)，催化α-G1P和甘油合成甘油葡萄糖苷。

在本发明中，异淀粉酶、葡聚糖磷酸化酶、甘油葡萄糖苷磷酸化酶的来源及表达载体的构建方法同1中所述，4-α-葡聚糖转移酶来源于集胞藻属Synechocystis sp.PCC6803，命名为SsGT，其氨基酸序列为SEQ ID NO:10，基因在UniProt上的编号为P72785，通过密码子优化后由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成，并克隆至pET21a载体中，获得相应的表达载体pET21a-SsGT，并转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，进行蛋白质表达，具体操作方法同实施案例1。

所述反应体系中所需要的酶制备方法与实施案例1一致。

在一个200μL的反应体系中含有50mM的磷酸盐缓冲液(pH 6.5)，所述异淀粉酶的用量为2U/mL，所述葡聚糖磷酸化酶的用量为4U/mL，所述4-α-葡聚糖转移酶的用量为2U/mL，所述甘油葡萄糖苷磷酸化酶的用量为4U/mL，55.6mM麦芽糊精(葡萄糖当量)和200mM甘油，在30℃进行催化反应，反应8小时。

反应结果如图6所示，反应结束后，甘油葡萄糖苷的终浓度是53mM，甘油葡萄糖苷转化率提高至95％。

B、全细胞催化转化麦芽糊精和甘油合成甘油葡萄糖苷

构建全细胞催化体系将麦芽糊精和甘油转化为甘油葡萄糖苷，所构建的全细胞催化体系包括：(1)含异淀粉酶的重组大肠杆菌，催化麦芽糊精中以α-1,6糖苷键连接的支链的断裂，形成直链聚糖；(2)含葡聚糖酸化酶的重组大肠杆菌，催化直链聚糖和磷酸基团(PO₄ ^3-)合成α-G1P；(3)含4-α-葡聚糖转移酶的重组大肠杆菌，催化麦芽糖聚生成麦芽四糖或更高聚合度的寡糖；(4)含甘油葡萄糖苷磷酸化酶的重组大肠杆菌，催化α-G1P和甘油合成甘油葡萄糖苷。

1.重组菌株构建

所述异淀粉酶、葡聚糖磷酸化酶、4-α-葡聚糖转移酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶的序列及来源同实施例5-A一致，将实施例3所述的重组质粒pET21a-IA、pET21a-4GT、pET21a-GP和pET21a-GGP分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌株IA、重组菌株4GT、重组菌株GP和重组菌株GGP。

2.全细胞催化剂制备

重组菌株IA、重组菌株4GT、重组菌株GP和重组菌株GGP全细胞催化剂的制备方法同实施例4中重组菌株Sucrose 1相同；将制备获得的全细胞催化剂放置-80度冰箱冷冻1h，然后取出室温融化，重复冻融步骤两到三次。

3、构建全细胞催化体系转化麦芽糊精和甘油合成甘油葡萄糖苷

制备全细胞催化反应体系，反应体系(20mL)中磷酸盐缓冲液浓度为50mM，pH＝6.5，含有重组菌株IA菌体浓度为OD₆₀₀＝10，重组菌株4GT菌体浓度为OD₆₀₀＝10，重组菌株GP菌体浓度为OD₆₀₀＝10，重组菌株GGP菌体浓度为OD₆₀₀＝10，麦芽糊精浓度为55.6mM(葡萄糖当量)，甘油浓度为200mM，在30℃进行催化反应，反应12小时。

反应结束后，甘油葡萄糖苷的终浓度是53mM，甘油葡萄糖苷转化率达到90％。

C、高浓度反应体系转化麦芽糊精和甘油合成甘油葡萄糖苷

建立高浓度的体外多酶反应体系转化麦芽糊精和甘油合成甘油葡萄糖苷。所述关键酶包括异淀粉酶、葡聚糖磷酸化酶、葡聚糖转移酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶，所述酶的来源以及制备方法同上所述，所述高浓度的麦芽糊精为100g/L。

在一个1mL的反应体系中含有100mM的磷酸盐缓冲液(pH 6.5)，所述异淀粉酶的用量为10U/mL，所述葡聚糖磷酸化酶的用量为40U/mL，所述葡聚糖转移酶的用量为10U/mL，所述甘油葡萄糖苷磷酸化酶的用量为40U/mL，100g/L麦芽糊精和1M甘油，在30℃进行催化反应，并分别于2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h取样进行高效液相色谱检测。

反应结果如图7所示，反应结束后，甘油葡萄糖苷的终浓度分别为479mM，甘油葡萄糖苷转化率为86.2％。

实施例7、转化葡萄糖和甘油合成甘油葡萄糖苷

A、体外多酶催化转化葡萄糖和甘油合成甘油葡萄糖苷

建立体外多酶催化体系将葡萄糖和甘油转化为甘油葡萄糖苷(图1)。这些关键酶包括：(1)葡萄糖激酶(GK，EC 2.7.1.6)，催化葡萄糖和磷酸基团(PO₄ ^3-)合成α-G1P；(2)甘油葡萄糖苷磷酸化酶(GGP,EC 2.4.1.359)，催化α-G1P和甘油合成甘油葡萄糖苷。

在本发明中，葡萄糖磷酸化酶来源于肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae，命名为SpGK，其氨基酸序列为SEQ ID NO:11，基因在UniProt上的编号为Q97NZ6，甘油葡萄糖苷磷酸化酶来源于黏附性海洋杆菌Marinobacter adhaerens HP15，命名为MaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，基因在UniProt上的编号为E4PMA5，这些基因的氨基酸序列都可以从UniProt数据库中获得，通过密码子优化后由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成，并克隆至pET21a载体中，获得相应的表达载体pET21a-SpGK、pET21a-MaGGP。这两个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白质表达，具体操作方法同实施案例1。

所述反应体系中所需要的酶制备方法与实施案例1一致。

在一个200μL的反应体系中含有50mM的磷酸盐缓冲液(pH 6.5)，所述葡萄糖激酶的用量为4U/mL，所述甘油葡萄糖苷磷酸化酶的用量为4U/mL，50mM葡萄糖和200mM甘油，在30℃进行催化反应，反应8小时。

根据保留时间的不同，高效液相色谱可以用来区分反应体系中的葡萄糖、甘油和甘油葡萄糖苷，并且可以对甘油进行定量。高效液相色谱分析条件与实施例1相同。

反应结束后，甘油葡萄糖苷的终浓度是43mM，甘油葡萄糖苷转化率达到86％。

B、全细胞催化转化葡萄糖和甘油合成甘油葡萄糖苷

1、含有葡萄糖激酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶基因重组菌株Glucose 1的构建

首先，以实施例4所述重组表达载体pET21a-SpGK中携带的葡萄糖激酶基因为模板设计引物17和引物18，以表达载体pET21a-MaGGP中携带的甘油葡萄糖苷磷酸化酶基因为模板设计引物，同实施例5中的引物7、引物8，提取质粒pETDuet，所设计引物同实施例5中的引物9、引物10、引物11、引物12。其中引物17和引物9、引物18和引物10内含21bp同源区域；引物7和引物11、引物8和引物12内含21bp同源区域。采用引物17和引物18，以pET21a-SpGK为模板，PCR扩增葡萄糖激酶基因SpGK；采用引物9和引物10，以pETDuet质粒为模板，PCR扩增来线性化质粒pETDuet；通过重组酶连接得到重组载体pETDuet-SpGK，进一步采用引物7和引物8，以pET21a-MaGGP为模板，PCR扩增甘油葡萄糖苷磷酸化酶基因MaGGP；采用引物11和引物12，以pETDuet-SpGK质粒为模板，PCR扩增来线性化质粒pETDuet-SpGK，通过重组酶连接得到重组载体pETDuet-SpGK-MaGGP。将所得重组质粒采用化学转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组菌株，命名为Glucose 1。

2、全细胞催化剂的制备

重组菌株Glucose 1全细胞催化剂的制备方法同实施例4中重组菌株Sucrose 1相同。

3、全细胞催化葡萄糖和甘油合成甘油葡萄糖苷

制备全细胞催化反应体系，反应体系(20mL)中磷酸盐缓冲液浓度为50mM，pH＝6.5，表达有葡萄糖激酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶的重组菌株Glucose 1菌体浓度为OD₆₀₀＝10，葡萄糖浓度为50mM，甘油浓度为200mM，在30℃进行催化反应，反应12小时。

反应结束后，甘油葡萄糖苷的终浓度是41mM，甘油葡萄糖苷转化率达到82％。

表1引物序列

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种生物催化合成甘油葡萄糖苷的方法

<130> 2019

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 480

<212> PRT

<213> Zhongshania aliphaticivorans

<400> 1

Met Ala Leu Arg Asn Ala Val Gln Met Ile Cys Tyr Pro Asn Arg Leu

1 5 10 15

Gly Asn Asn Leu Lys Asp Leu Tyr Thr Val Ile Glu Arg His Phe Ser

20 25 30

Asp Ala Ile Gly Gly Val His Ile Leu Pro Phe Phe Pro Ser Asn Ala

35 40 45

Asp Ala Gly Phe Ser Pro Leu Thr His Lys Glu Val Asp Pro Glu Phe

50 55 60

Gly Asp Trp Ala Asp Ile Glu Arg Ile Ser Ala Lys Tyr Asp Leu Cys

65 70 75 80

Cys Asp Val Thr Val Asn His Ile Ser Asp Glu Ser Glu Glu Phe Lys

85 90 95

Asp Phe Ile Ala Lys Gly Tyr Asp Ser Glu Tyr Ala Asp Leu Phe Val

100 105 110

His Val Asp Lys Phe Gly Glu Ile Ser Ser Asp Asp Leu Ala Lys Ile

115 120 125

His Ile Arg Lys Glu Lys Glu Pro Phe Arg Arg Val Asp Phe Ala Asp

130 135 140

Gly Gly Thr Gly Arg Val Trp Cys Thr Phe Thr Glu His Gln Val Asp

145 150 155 160

Leu Asn Tyr Asp Ser Glu Leu Thr Tyr Gln Leu Met Glu Asn Tyr Ile

165 170 175

Gly Phe Leu Ala Gln Arg Gly Val Lys Leu Phe Arg Leu Asp Ala Phe

180 185 190

Gly Tyr Thr Thr Lys Arg Ile Gly Thr Ser Cys Phe Leu Val Glu Pro

195 200 205

Asp Val Tyr Arg Asn Leu Asp Trp Ile Asn Gly Val Ala Gln Leu His

210 215 220

Gly Ala Glu Val Leu Pro Glu Val His Asp His Ser Ser Tyr Gln Tyr

225 230 235 240

Ala Ile Ser Arg Arg Asn Met His Pro Tyr Gly Phe Ala Leu Pro Pro

245 250 255

Leu Leu Leu Phe Ser Leu Leu Asp Ala Asn Ser Val Tyr Leu Lys Asn

260 265 270

Trp Leu Arg Met Cys Pro Arg Asn Met Val Thr Val Leu Asp Thr His

275 280 285

Asp Gly Ile Cys Ile Pro Asp Val Glu Gly Val Leu Pro Asp Asp Lys

290 295 300

Ile Arg Ala Leu Ile Asp Asn Ile Ser Ser Arg Ser Ala Asp Pro Ile

305 310 315 320

Leu Arg Arg Ser Ala Ala Asn Ile His Ser Val Gly Ala Ile Tyr Gln

325 330 335

Leu Thr Cys Thr Phe Tyr Asp Ala Leu Met Arg Asn Asp Asp Ala Tyr

340 345 350

Leu Ala Ala Arg Ala Ile Gln Phe Phe Thr Pro Gly Ile Pro Gln Val

355 360 365

Tyr Tyr Val Gly Leu Leu Ala Gly Cys Asn Asp Asn Glu Leu Met Glu

370 375 380

Glu Thr Gly Glu Leu Arg Asp Ile Asn Arg His Phe Tyr Ser Met Ser

385 390 395 400

Glu Ile Asp Glu Ala Val Ala Gln Pro Val Val Lys Arg Leu Leu Ala

405 410 415

Leu Met Arg Phe Arg Ser Asn Tyr Pro Ala Phe Asp Gly His Phe Glu

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Leu Gly Tyr Ser Asn Asp Ser Ser Val Ala Met Ala Trp Arg His Gly

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450 455 460

Ile Thr Tyr Leu Asp Glu Glu Ser Leu Ala Glu Cys Arg Leu Gln Cys

465 470 475 480

<210> 2

<211> 480

<212> PRT

<213> Marinobacter psychrophilus

<400> 2

Met Leu Leu Lys Asn Ala Val Gln Leu Ile Cys Tyr Pro Asn Arg Ile

1 5 10 15

Gly Asn Asn Leu Lys Asp Leu Tyr Thr Val Val Asp Lys His Leu Ser

20 25 30

Glu Ala Ile Gly Gly Leu His Ile Leu Pro Phe Phe Pro Ser Asn Ala

35 40 45

Asp Gly Gly Phe Ser Pro Leu Thr His Lys Glu Val Asp Pro Asp Phe

50 55 60

Gly Thr Trp Asp Asp Ile Glu Ala Phe Thr Lys Lys Tyr Asp Leu Cys

65 70 75 80

Val Asp Leu Thr Val Asn His Ile Ser Asp Glu Ser Pro Glu Phe Lys

85 90 95

Asp Phe Ile Ala His Gly Phe Asp Ser Lys Tyr Ala Asp Leu Phe Val

100 105 110

His Val Asp Lys Phe Gly Glu Ile Ser Pro Asp Asp Met Ala Lys Ile

115 120 125

His Ile Arg Lys Glu Lys Glu Pro Phe Arg Glu Val Thr Leu Ala Asp

130 135 140

Gly Thr Lys Thr Arg Val Trp Cys Thr Phe Thr Glu Gln Gln Ile Asp

145 150 155 160

Leu Asn Tyr Glu Ser Asp Gln Ala Tyr Arg Leu Met Glu Ser Tyr Ile

165 170 175

Gly Phe Leu Thr Ser Lys Gly Val Asn Leu Leu Arg Leu Asp Ala Phe

180 185 190

Gly Tyr Thr Thr Lys Arg Ile Gly Thr Ser Cys Phe Leu Val Glu Pro

195 200 205

Glu Val Tyr Arg Ile Leu Asp Trp Ile Asn Glu Val Ala Leu Lys His

210 215 220

Gly Ala Glu Cys Leu Pro Glu Val His Asp His Thr Ser Tyr Gln Tyr

225 230 235 240

Ala Ile Gly Arg Arg Asn Met His Pro Tyr Gly Phe Ala Leu Pro Pro

245 250 255

Leu Leu Leu Tyr Ser Leu Leu Asp Ala Asn Ser Val Tyr Leu Lys Asn

260 265 270

Trp Leu Arg Met Cys Pro Arg Asn Met Val Thr Val Leu Asp Thr His

275 280 285

Asp Gly Ile Cys Ile Pro Asp Val Glu Gly Val Leu Pro Asp Glu Lys

290 295 300

Ile Arg Ala Leu Ile Asp Asn Ile Asp Ala Arg Ser Ala Asp Pro Ile

305 310 315 320

Met Arg Arg Ser Ala Ala Asn Ile His Ser Val Gly Ala Ile Tyr Gln

325 330 335

Leu Thr Cys Thr Phe Tyr Asp Ala Leu Met Gln Asn Asp Asp Ala Tyr

340 345 350

Ile Ala Ala Arg Ala Ile Gln Phe Phe Thr Pro Gly Ile Pro Gln Val

355 360 365

Tyr Tyr Val Gly Leu Leu Ala Gly Cys Asn Asn His Glu Leu Met Lys

370 375 380

Gln Ser Gly Glu Leu Arg Asp Ile Asn Arg His Tyr Tyr Thr Leu Asp

385 390 395 400

Asp Val Glu Gln His Ile Gln Lys Pro Val Val Gln Arg Leu Leu Ala

405 410 415

Leu Met Thr Phe Arg Ser Asn Tyr Pro Ala Phe Asp Gly His Phe Glu

420 425 430

Leu Asn Tyr Ser Asn Asn Ser Ser Val Ala Met Ala Trp Arg His Gly

435 440 445

Asp Tyr Tyr Cys His Leu Phe Val Asp Leu Asn Phe Asn Thr Val Lys

450 455 460

Ile Gly Tyr Tyr Asp Leu Asp Thr Ala Gln Met Glu Lys Leu Ala Cys

465 470 475 480

<210> 3

<211> 480

<212> PRT

<213> 黏附性海洋杆菌(Marinobacter adhaerens HP15)

<400> 3

Met Leu Leu Lys Asn Ala Val Gln Leu Ile Cys Tyr Pro Asp Arg Ile

1 5 10 15

Gly Asn Asn Leu Lys Asp Leu Tyr Thr Val Val Asp Thr His Leu Ser

20 25 30

Glu Ala Ile Gly Gly Leu His Ile Leu Pro Phe Phe Pro Ser Asn Ala

35 40 45

Asp Gly Gly Phe Ser Pro Leu Thr His Lys Glu Val Asp Pro Lys Val

50 55 60

Gly Thr Trp Asp Asp Ile Glu Ala Phe Thr Ala Lys Tyr Asp Leu Cys

65 70 75 80

Val Asp Leu Thr Val Asn His Ile Ser Asp Glu Ser Pro Glu Phe Thr

85 90 95

Asp Phe Ile Ala Asn Gly Phe Asp Ser Glu Tyr Ala Asp Leu Phe Val

100 105 110

His Val Asp Lys Phe Gly Glu Ile Ser Pro Asp Asp Met Ala Lys Ile

115 120 125

His Ile Arg Lys Glu Lys Glu Pro Phe Arg Glu Val Thr Leu Ser Asp

130 135 140

Gly Thr Lys Thr Arg Val Trp Cys Thr Phe Thr Glu Gln Gln Ile Asp

145 150 155 160

Leu Asn Tyr Glu Ser Asp Leu Ala Tyr Gln Leu Met Glu Ser Tyr Ile

165 170 175

Gly Phe Leu Thr Ser Lys Gly Val Asn Leu Leu Arg Leu Asp Ala Phe

180 185 190

Gly Tyr Thr Thr Lys Arg Ile Gly Thr Ser Cys Phe Leu Val Glu Pro

195 200 205

Glu Val Tyr Gln Ile Leu Asp Trp Val Asn Gln Val Ala Leu Lys His

210 215 220

Gly Ala Glu Cys Leu Pro Glu Val His Asp His Thr Ser Tyr Gln Tyr

225 230 235 240

Ala Ile Ser Arg Arg Asn Met His Pro Tyr Gly Phe Ala Leu Pro Pro

245 250 255

Leu Leu Leu Tyr Ser Leu Leu Asp Ala Asn Ser Thr Tyr Leu Lys Asn

260 265 270

Trp Leu Arg Met Cys Pro Arg Asn Met Val Thr Val Leu Asp Thr His

275 280 285

Asp Gly Ile Cys Ile Pro Asp Val Glu Gly Val Leu Pro Asp Glu Lys

290 295 300

Ile Lys Val Leu Ile Asp Asn Ile Asp Ala Arg Ser Ala Asp Pro Ile

305 310 315 320

Met Arg Arg Ser Ala Ala Asn Ile His Ser Val Gly Ala Ile Tyr Gln

325 330 335

Leu Thr Cys Thr Phe Tyr Asp Ala Leu Met Gln Asn Asp Asp Ala Tyr

340 345 350

Ile Ala Ala Arg Ala Ile Gln Phe Phe Thr Pro Gly Ile Pro Gln Val

355 360 365

Tyr Tyr Val Gly Leu Leu Ala Gly Cys Asn Asp His Glu Leu Met Glu

370 375 380

Gln Ser Gly Glu Leu Arg Asp Ile Asn Arg His Tyr Tyr Thr Leu Glu

385 390 395 400

Glu Val Glu Gln Asp Ile Gln Lys Pro Val Val Gln Arg Leu Leu Ser

405 410 415

Leu Met Lys Phe Arg Ser Asn Tyr Pro Ala Phe Asp Gly His Phe Glu

420 425 430

Leu Asn Tyr Ser Asn Asn Ser Ser Val Ala Met Ala Trp Arg His Gly

435 440 445

Asp Tyr Tyr Cys His Leu Phe Val Asp Leu Asn Phe Lys Thr Val Lys

450 455 460

Val Thr Tyr Thr Asp Val Glu Thr Gly Glu Thr Arg His Leu Glu Cys

465 470 475 480

<210> 4

<211> 481

<212> PRT

<213> 变形链球菌(Streptococcus mutans UA159)

<400> 4

Met Pro Ile Ile Asn Lys Thr Met Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Leu

1 5 10 15

Gly Lys Asn Leu Lys Glu Leu Asn Glu Asn Ile Glu Asn Tyr Phe Gly

20 25 30

Asp Ala Val Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Phe Pro Ser Thr Gly

35 40 45

Asp Arg Gly Phe Ala Pro Ile Asp Tyr His Glu Val Asp Ser Ala Phe

50 55 60

Gly Asp Trp Asp Asp Val Lys Cys Leu Gly Glu Lys Tyr Tyr Leu Met

65 70 75 80

Phe Asp Phe Met Ile Asn His Ile Ser Arg Gln Ser Lys Tyr Tyr Lys

85 90 95

Asp Tyr Gln Glu Lys His Glu Ala Ser Ala Tyr Lys Asp Leu Phe Leu

100 105 110

Asn Trp Asp Lys Phe Trp Pro Lys Asn Arg Pro Thr Gln Glu Asp Val

115 120 125

Asp Leu Ile Tyr Lys Arg Lys Asp Arg Ala Pro Lys Gln Glu Ile Gln

130 135 140

Phe Ala Asp Gly Ser Val Glu His Leu Trp Asn Thr Phe Gly Glu Glu

145 150 155 160

Gln Ile Asp Leu Asp Val Thr Lys Glu Val Thr Met Asp Phe Ile Arg

165 170 175

Ser Thr Ile Glu Asn Leu Ala Ala Asn Gly Cys Asp Leu Ile Arg Leu

180 185 190

Asp Ala Phe Ala Tyr Ala Val Lys Lys Leu Asp Thr Asn Asp Phe Phe

195 200 205

Val Glu Pro Glu Ile Trp Thr Leu Leu Asp Lys Val Arg Asp Ile Ala

210 215 220

Ala Val Ser Gly Ala Glu Ile Leu Pro Glu Ile His Glu His Tyr Thr

225 230 235 240

Ile Gln Phe Lys Ile Ala Asp His Asp Tyr Tyr Val Tyr Asp Phe Ala

245 250 255

Leu Pro Met Val Thr Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Ser Lys Val Asp Arg

260 265 270

Leu Ala Lys Trp Leu Lys Met Ser Pro Met Lys Gln Phe Thr Thr Leu

275 280 285

Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Val Lys Asp Ile Leu Thr

290 295 300

Asp Glu Glu Ile Thr Tyr Thr Ser Asn Glu Leu Tyr Lys Val Gly Ala

305 310 315 320

Asn Val Asn Arg Lys Tyr Ser Thr Ala Glu Tyr Asn Asn Leu Asp Ile

325 330 335

Tyr Gln Ile Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Ala Leu Gly Asp Asp Asp Gln

340 345 350

Lys Tyr Phe Leu Ala Arg Leu Ile Gln Ala Phe Ala Pro Gly Ile Pro

355 360 365

Gln Val Tyr Tyr Val Gly Phe Leu Ala Gly Lys Asn Asp Leu Glu Leu

370 375 380

Leu Glu Ser Thr Lys Glu Gly Arg Asn Ile Asn Arg His Tyr Tyr Ser

385 390 395 400

Ser Glu Glu Ile Ala Lys Glu Val Lys Arg Pro Val Val Lys Ala Leu

405 410 415

Leu Asn Leu Phe Thr Tyr Arg Asn Gln Ser Ala Ala Phe Asp Leu Asp

420 425 430

Gly Arg Ile Glu Val Glu Thr Pro Asn Glu Ala Thr Ile Val Ile Glu

435 440 445

Arg Gln Asn Lys Asp Gly Ser His Ile Ala Lys Ala Glu Ile Asn Leu

450 455 460

Gln Asp Met Thr Tyr Arg Val Thr Glu Asn Asp Gln Thr Ile Ser Phe

465 470 475 480

Glu

<210> 5

<211> 490

<212> PRT

<213> 明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)

<400> 5

Met Glu Ile Gln Asn Lys Ala Met Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Leu

1 5 10 15

Gly Lys Asn Leu Lys Asp Val His Gln Val Leu Lys Glu Asp Ile Gly

20 25 30

Asp Ala Ile Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Phe Pro Ser Thr Gly

35 40 45

Asp Arg Gly Phe Ala Pro Ala Asp Tyr Thr Arg Val Asp Ala Ala Phe

50 55 60

Gly Asp Trp Ala Asp Val Glu Ala Leu Gly Glu Glu Tyr Tyr Leu Met

65 70 75 80

Phe Asp Phe Met Ile Asn His Ile Ser Arg Glu Ser Val Met Tyr Gln

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Gly Glu Glu Gln Ile Asp Ile Asp Val Asn Ser Ala Ile Ala Lys Glu

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Phe Ile Lys Thr Thr Leu Glu Asp Met Val Lys His Gly Ala Asn Leu

180 185 190

Ile Arg Leu Asp Ala Phe Ala Tyr Ala Val Lys Lys Val Asp Thr Asn

195 200 205

Asp Phe Phe Val Glu Pro Glu Ile Trp Asp Thr Leu Asn Glu Val Arg

210 215 220

Glu Ile Leu Thr Pro Leu Lys Ala Glu Ile Leu Pro Glu Ile His Glu

225 230 235 240

His Tyr Ser Ile Pro Lys Lys Ile Asn Asp His Gly Tyr Phe Thr Tyr

245 250 255

Asp Phe Ala Leu Pro Met Thr Thr Leu Tyr Thr Leu Tyr Ser Gly Lys

260 265 270

Thr Asn Gln Leu Ala Lys Trp Leu Lys Met Ser Pro Met Lys Gln Phe

275 280 285

Thr Thr Leu Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Ala Arg Asp

290 295 300

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Leu Asp Ile Tyr Gln Ile Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Ala Leu Gly Asn

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Asp Asp Ala Ala Tyr Leu Leu Ser Arg Val Phe Gln Val Phe Ala Pro

355 360 365

Gly Ile Pro Gln Ile Tyr Tyr Val Gly Leu Leu Ala Gly Glu Asn Asp

370 375 380

Ile Ala Leu Leu Glu Ser Thr Lys Glu Gly Arg Asn Ile Asn Arg His

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Tyr Tyr Thr Arg Glu Glu Val Lys Ser Glu Val Lys Arg Pro Val Val

405 410 415

Ala Asn Leu Leu Lys Leu Leu Ser Trp Arg Asn Glu Ser Pro Ala Phe

420 425 430

Asp Leu Ala Gly Ser Ile Thr Val Asp Thr Pro Thr Asp Thr Thr Ile

435 440 445

Val Val Thr Arg Gln Asp Glu Asn Gly Gln Asn Lys Ala Val Leu Thr

450 455 460

Ala Asp Ala Ala Asn Lys Thr Phe Glu Ile Val Glu Asn Gly Gln Thr

465 470 475 480

Val Met Ser Ser Asp Asn Leu Thr Gln Asn

485 490

<210> 6

<211> 756

<212> PRT

<213> 嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)

<400> 6

Met Lys Arg Ile Phe Glu Ile Asp Pro Trp Lys Val Ile Thr His Lys

1 5 10 15

Phe Asp Pro Lys Asp Lys Arg Leu Gln Glu Ser Met Thr Ala Ile Gly

20 25 30

Asn Asp Tyr Met Gly Met Arg Gly Asn Phe Glu Glu Gly Tyr Ser Gly

35 40 45

Asp Ser Leu Gln Gly Thr Tyr Leu Ala Gly Val Trp Phe Pro Asp Lys

50 55 60

Thr Val Val Gly Trp Trp Lys Asn Gly Tyr Pro Lys Tyr Phe Gly Lys

65 70 75 80

Thr Pro Asn Ala Pro Ser Phe Ile Gly Ile Gly Ile Asn Val Asn Gly

85 90 95

Glu Lys Val Asp Leu Ala Lys Val Lys Phe Ser Asp Phe Glu Leu Ser

100 105 110

Leu Asp Met His Gln Gly Leu Leu Ser Arg Ser Phe Ile Tyr Glu Gly

115 120 125

Lys Asp Val Lys Val Lys Leu Glu Phe Glu Arg Phe Leu His Ile Val

130 135 140

Gln Lys Glu Ala Ala Leu Ile Lys Val Lys Ala Thr Val Leu Glu Gly

145 150 155 160

His Ala Lys Ile Asp Phe Asp Ser Thr Leu Asp Gly Thr Val Val Asn

165 170 175

Glu Asp Ser Asn Tyr Gly Asp Arg Phe Trp Ile Pro Leu Gly Glu Asp

180 185 190

Lys Asp Glu Lys Thr Ile Gln Val Lys Thr Lys Lys Asn Pro Tyr Asp

195 200 205

Val Pro Gln Phe Thr Val Leu Leu Lys Glu Ala Leu Arg Asn Asn Gly

210 215 220

Val Ala Val Asn Gly Glu Val Thr Thr Glu Asp Ala Lys Leu Ser Glu

225 230 235 240

Arg Phe Ser Val Glu Leu Asp Glu Gly Gln Ser Tyr Glu Leu Glu Lys

245 250 255

Asp Val Ile Val Val Thr Ser Arg Asp Val Glu Glu Lys Asp Gln Ala

260 265 270

Ala Val Ala Asn Asn Leu Met Ser Lys Leu Gln Thr Lys Ser Phe Glu

275 280 285

Asp Asn Leu Ala Asp His Thr Glu Ala Trp Lys Lys Arg Trp Glu Thr

290 295 300

Ser Asp Val Glu Ile Ser Gly Asp Asp Ala Ala Gln Gln Gly Ile Arg

305 310 315 320

Phe Asn Ile Cys Gln Leu Phe Met Thr Tyr Tyr Gly Glu Asp Lys Arg

325 330 335

Leu Asn Val Gly Pro Lys Gly Phe Thr Gly Glu Lys Tyr Gly Gly Ala

340 345 350

Thr Tyr Trp Asp Thr Glu Ala Phe Ile Val Pro Met Tyr Leu Ala Val

355 360 365

Thr Lys Pro Ser Val Thr Arg Ala Leu Leu Gln Tyr Arg His Asp Gln

370 375 380

Leu Pro Gly Ala Tyr His Asn Ala Lys Glu Gln Gly Leu Pro Gly Ala

385 390 395 400

Leu Phe Pro Met Val Thr Phe Asn Gly Ile Glu Cys His Asn Glu Trp

405 410 415

Glu Ile Thr Phe Glu Glu Ile His Arg Asn Ala Asp Ile Pro His Ala

420 425 430

Ile Ala Met Tyr Thr Asp Tyr Thr Gly Asp Asp Ser Tyr Val Lys Asn

435 440 445

Glu Gly Met Asp Val Leu Val Gly Thr Ala Arg Phe Trp Ala Ala Arg

450 455 460

Val His Trp Ser Lys Met Arg Asn Lys Tyr Val Met His Gly Val Thr

465 470 475 480

Gly Pro Asn Glu Tyr Glu Asn Asn Val Asn Asn Asn Trp Phe Thr Asn

485 490 495

Thr Met Ala Arg Trp Leu Leu Lys Tyr Thr Leu Glu Arg Leu Pro Leu

500 505 510

Ala Thr Lys Glu Ala Gln Glu Arg Val Arg Val Thr Asp Glu Glu Lys

515 520 525

Ala Lys Trp Gln Asp Ile Val Asp Asn Met Tyr Leu Pro Glu Asp Glu

530 535 540

Asp Leu Gly Ile Phe Leu Gln Gln Asp Asp Phe Leu Asp Lys Asp Ile

545 550 555 560

Arg Pro Val Thr Glu Ile Glu Asp Gln Arg Pro Ile Asn Gln His Trp

565 570 575

Ser Trp Asp Lys Ile Leu Arg Ser Pro Phe Ile Lys Gln Ala Asp Val

580 585 590

Leu Gln Gly Ile Tyr Phe Phe Asp Asp Gln Tyr Thr Met Asp Gln Lys

595 600 605

Glu Lys Asn Phe Asp Phe Tyr Glu Pro Leu Thr Val His Glu Ser Ser

610 615 620

Leu Ser Pro Cys Ile Tyr Ser Ile Met Ala Ala Glu Leu Gly Lys Lys

625 630 635 640

Glu Lys Ala Val Glu Leu Tyr Gln Arg Thr Ala Arg Leu Asp Leu Asp

645 650 655

Asn Tyr Asn Asn Asp Thr Val Asp Gly Leu His Ile Thr Ser Met Ser

660 665 670

Gly Ser Trp Leu Ala Ile Val Gln Gly Phe Ala Gly Met Arg Tyr Asp

675 680 685

His Asp Gln Leu Lys Phe Asn Pro Phe Val Pro Asp Gly Trp Asp His

690 695 700

Tyr Ser Phe Lys Ile Asn Tyr Arg Gly Arg Leu Ile Glu Val Tyr Val

705 710 715 720

Asp His Asp Glu Cys Lys Ile Thr Leu Leu Ser Gly Asp Asp Leu Glu

725 730 735

Val Met Val His Asp Asn Lys Leu Asp Leu Lys Glu Gly Lys Thr Lys

740 745 750

Cys Leu Lys Ala

755

<210> 7

<211> 761

<212> PRT

<213> 硒还原芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)

<400> 7

Met His Glu Ile Gly Glu His Leu Thr Thr Asn Thr Gly Trp Asp Ile

1 5 10 15

Ile Lys Asn Arg Tyr Glu Ala Ala Gln Ala Ile Thr Glu Gly Ser Asn

20 25 30

Phe Met Ile Gly Asn Gly Phe Met Gly Tyr Arg Gly Thr Phe Ala Glu

35 40 45

Asp Gly Lys Asp Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Val Thr Asp Thr Trp Asp

50 55 60

Lys Ala Asp Gly Lys Trp Glu Glu Leu Ser Thr Val Pro Asn Ala Leu

65 70 75 80

Leu Thr Leu Leu His Val Asp Gly Glu Pro Phe Ile Met Ser Glu Glu

85 90 95

Ala Ala Ser Phe Glu Arg Thr Leu Asp Leu Ser Gln Gly Val Thr Ser

100 105 110

Arg Lys Val Ser Gln Arg Met Lys Asn Gly Ala Thr Ile Thr Ile His

115 120 125

Glu Glu Lys Phe Ala Ser Tyr Arg Lys Lys His Ala Val Leu Met Lys

130 135 140

Tyr Thr Val Glu Ser Asp Gln Asp Thr Asp Ala Val Leu Asp Thr Gly

145 150 155 160

Ile Asp Tyr Asp Val Trp Ser Ile Asn Gly Asp His Leu Gln Gly His

165 170 175

His Tyr Phe Ser His Pro Thr Gly Asp Gly Val Thr Ala Lys Thr Val

180 185 190

Ser Tyr Glu Asp Thr Val Thr Val Val Glu Thr Cys Ser Leu Asp Ala

195 200 205

Asp Ala Ser Glu Glu Asp Tyr Gln Asn Pro Asp Gly Ser Gly Arg Thr

210 215 220

Phe Ser Leu Ser Leu Glu Ala Gly Lys Pro Val Thr Leu Glu Lys Ala

225 230 235 240

Met Ile Ile Tyr Ser Ser Asn Asp Val Asp Asn Pro Gln Asp Glu Ala

245 250 255

Leu Leu Glu Ala Lys His Met Gln Ser Tyr Glu Glu Glu Lys Ala Ala

260 265 270

Asn Arg Leu Glu Trp Asp Asn Leu Trp Ser His Tyr Asp Val Thr Ile

275 280 285

Gln Asn Asn Ile Ile Asp Gln Val Ala Leu Arg Phe Asn Ile Tyr His

290 295 300

Ala Ile Ile Ala Thr Pro Val His Lys Ser Leu Pro Ile Gly Ala Arg

305 310 315 320

Gly Leu Ser Cys Gln Ala Tyr Gln Gly Ala Ala Phe Trp Asp Gln Glu

325 330 335

Ile Tyr Asn Met Pro Met Tyr Leu Tyr Ser Asn Pro Glu Ile Ala Arg

340 345 350

Asn Ile Leu Lys Tyr Arg His Arg Thr Leu Asp Gly Ala Arg Arg Lys

355 360 365

Ala Lys Arg Leu Gly Tyr Glu Gly Ala Tyr Tyr Ala Trp Ile Ser Gly

370 375 380

Lys Thr Gly Asp Glu Leu Cys Pro Asp Phe Phe Phe Lys Asp Val Leu

385 390 395 400

Ser Gly Arg Asp Ile Arg Asn His Phe Asn Asp Trp Gln Ile His Ile

405 410 415

Ser Pro Asp Ile Ala Tyr Ala Val Lys Lys Tyr His Gln Val Thr Gly

420 425 430

Asp Asp Ala Phe Ile Arg Asp Tyr Gly Ala Glu Met Ile Phe Glu Ile

435 440 445

Ala Arg Phe Leu Ala Ser His Ala Val Tyr Lys Pro Met Arg Gly Arg

450 455 460

Tyr Glu Phe Met Arg Val Gln Gly Pro Asp Glu Tyr His Glu Asn Val

465 470 475 480

Asp Asn Asn Ala Phe Thr Asn His Gln Ala Met Phe Thr Leu Gln Ala

485 490 495

Ala Asp Glu Leu Leu Gln Thr Leu Asp Glu Lys Thr Leu Ser Ala Val

500 505 510

Lys Glu Lys Ile Gly Leu Ser Asp Asp Glu Ile Ser Leu Trp Arg Asp

515 520 525

Met Leu Ala Asn Thr Tyr Val Pro Lys Pro Asp Lys His Gly Ile Ile

530 535 540

Glu Gln Phe Asp Gly Tyr Tyr Asp Leu Glu Thr Ile Ile Pro Ala Lys

545 550 555 560

Lys Val Thr Glu Arg Leu Ile Lys Glu Asp Glu Tyr Tyr Gly Tyr Pro

565 570 575

Asn Gly Val Thr Val Arg Thr Gln Cys Ile Lys Gln Ala Asp Val Ile

580 585 590

Gln Leu Phe Val Leu His Pro His Leu Tyr Asp Arg Lys Thr Val Glu

595 600 605

Leu Asn Tyr Glu Phe Tyr Glu Pro Arg Thr Leu His Phe Ser Ser Leu

610 615 620

Ser Pro Ser Ser Tyr Ala Ile Val Ala Ala Gln Ile Asp Lys Val Glu

625 630 635 640

Glu Ala Tyr Arg Asn Phe Arg Lys Ser Val Met Ile Asp Leu Leu Asn

645 650 655

Thr Asn Glu Ala Val Ser Gly Gly Thr Phe Ile Gly Gly Ile His Thr

660 665 670

Ala Ala Asn Gly Ala Ser Trp Gln Met Val Val Asn Gly Phe Gly Gly

675 680 685

Leu Ser Val His Gly Asp Asp Ile His Leu Ser Pro Arg Leu Pro Asp

690 695 700

Ala Trp Asp Gly Tyr Thr Phe Lys Ala Ile Val Lys Gly Gln Thr Leu

705 710 715 720

Glu Val Asp Val Thr Lys Glu Gln Ile Thr Ile Thr Asn Lys Ser Glu

725 730 735

Asp Arg Lys Pro Leu Thr Leu His Ile Phe Gly Glu Lys Ser Val Leu

740 745 750

Asp Ser Glu Arg Ile Thr Lys Ser Arg

755 760

<210> 8

<211> 716

<212> PRT

<213> 超嗜热古菌(Sulfurisphaera tokodaii)

<400> 8

Met Val Phe Ser His Lys Asp Arg Pro Leu Arg Pro Gly Glu Pro Tyr

1 5 10 15

Pro Leu Gly Ala Asn Trp Glu Glu Glu Asp Asp Gly Val Asn Phe Ser

20 25 30

Ile Phe Ser Glu Asn Ala Thr Lys Val Glu Leu Leu Ile Tyr Ser Pro

35 40 45

Thr Asn Gln Lys Tyr Pro Lys Glu Val Ile Glu Val Lys Gln Arg Ser

50 55 60

Gly Asp Ile Trp His Val Phe Val Pro Gly Leu Gly Pro Gly Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Ala Tyr Arg Ile Tyr Gly Pro Tyr Lys Pro Asp Gln Gly Leu Arg

85 90 95

Phe Asn Pro Asn Lys Val Leu Ile Asp Pro Tyr Ala Lys Ala Ile Asn

100 105 110

Gly Thr Leu Asn Trp Asn Asp Ala Val Phe Gly Tyr Lys Ile Gly Asp

115 120 125

Ser Asn Gln Asp Leu Ser Phe Asp Asp Arg Pro Asp Asp Glu Phe Ile

130 135 140

Pro Lys Gly Val Val Ile Asn Pro Tyr Phe Glu Trp Asp Asp Asp His

145 150 155 160

Phe Phe Arg Arg Lys Lys Ile Pro Leu Lys Asp Thr Ile Ile Tyr Glu

165 170 175

Val His Val Lys Gly Phe Thr Lys Leu Arg Pro Asp Leu Pro Glu Asn

180 185 190

Ile Arg Gly Thr Tyr Lys Gly Phe Ala Ser Arg Gln Met Ile Glu Tyr

195 200 205

Leu Lys Asp Leu Gly Val Thr Thr Val Glu Ile Met Pro Val Gln Gln

210 215 220

Phe Val Asp Asp Arg Phe Leu Val Glu Lys Gly Leu Arg Asn Tyr Trp

225 230 235 240

Gly Tyr Asn Pro Ile Asn Tyr Phe Ser Pro Glu Cys Arg Tyr Ser Ser

245 250 255

Ser Gly Cys Met Gly Glu Gln Val Asn Glu Phe Lys Glu Met Val Asn

260 265 270

Glu Leu His Asn Ala Gly Phe Glu Val Ile Ile Asp Val Val Tyr Asn

275 280 285

His Thr Ala Glu Gly Asn His Leu Gly Pro Thr Leu Ser Phe Arg Gly

290 295 300

Ile Asp Asn Leu Ala Tyr Tyr Met Leu Val Pro Asp Asn Lys Arg Tyr

305 310 315 320

Tyr Leu Asp Phe Thr Gly Thr Gly Asn Thr Leu Asn Leu Ser His Pro

325 330 335

Arg Val Leu Gln Met Val Leu Asp Ser Leu Arg Tyr Trp Val Leu Glu

340 345 350

Met His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ala Ala Leu Ala Arg

355 360 365

Gln Leu Tyr Ser Val Asn Met Leu Ser Thr Phe Phe Val Ala Ile Gln

370 375 380

Gln Asp Pro Val Leu Ser Gln Val Lys Leu Ile Ala Glu Pro Trp Asp

385 390 395 400

Val Gly Pro Gly Gly Tyr Gln Val Gly Asn Phe Pro Tyr Leu Trp Ala

405 410 415

Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Thr Ile Arg Arg Phe Trp Arg Gly

420 425 430

Glu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Leu Ala Asn Arg Leu Met Gly Ser Pro

435 440 445

Asp Leu Tyr Ala Gly Asn Asn Lys Thr Pro Phe Ala Ser Ile Asn Tyr

450 455 460

Ile Thr Ser His Asp Gly Phe Thr Leu Glu Asp Leu Val Ser Tyr Asn

465 470 475 480

Gln Lys His Asn Glu Ala Asn Gly Phe Asn Asn Gln Asp Gly Met Asn

485 490 495

Glu Asn Tyr Ser Trp Asn Cys Gly Val Glu Gly Glu Thr Asn Asp Ala

500 505 510

Asn Val Ile Gln Cys Arg Glu Lys Gln Lys Arg Asn Phe Ile Ile Thr

515 520 525

Leu Phe Val Ser Gln Gly Val Pro Met Ile Leu Gly Gly Asp Glu Leu

530 535 540

Ser Arg Thr Gln Arg Gly Asn Asn Asn Ala Phe Cys Gln Asp Asn Glu

545 550 555 560

Ile Ser Trp Phe Asn Trp Asn Leu Asp Glu Arg Lys Gln Arg Phe His

565 570 575

Asp Phe Val Arg Ser Met Ile Tyr Phe Tyr Arg Ala His Pro Ile Phe

580 585 590

Arg Arg Glu Arg Tyr Phe Gln Gly Lys Lys Leu His Gly Met Pro Leu

595 600 605

Lys Asp Val Thr Phe Leu Lys Pro Asp Gly Asn Glu Ala Asp Glu Gln

610 615 620

Thr Trp Lys Ser Pro Thr Asn Phe Ile Ala Tyr Ile Leu Glu Gly Ser

625 630 635 640

Val Ile Asp Glu Val Asn Asp Arg Gly Glu Arg Ile Ala Asp Asp Ser

645 650 655

Phe Leu Ile Ile Leu Asn Gly Ser Pro Asn Asn Ile Lys Phe Lys Phe

660 665 670

Pro Gln Gly Lys Trp Ser Leu Val Val Ser Ser Tyr Leu Arg Glu Leu

675 680 685

Arg Asp Asp Glu Arg Val Val Asp Gly Gly Lys Glu Leu Glu Ile Glu

690 695 700

Gly Arg Thr Ala Met Val Tyr Arg Arg Ile Glu Tyr

705 710 715

<210> 9

<211> 797

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli strain K12)

<400> 9

Met Ser Gln Pro Ile Phe Asn Asp Lys Gln Phe Gln Glu Ala Leu Ser

1 5 10 15

Arg Gln Trp Gln Arg Tyr Gly Leu Asn Ser Ala Ala Glu Met Thr Pro

20 25 30

Arg Gln Trp Trp Leu Ala Val Ser Glu Ala Leu Ala Glu Met Leu Arg

35 40 45

Ala Gln Pro Phe Ala Lys Pro Val Ala Asn Gln Arg His Val Asn Tyr

50 55 60

Ile Ser Met Glu Phe Leu Ile Gly Arg Leu Thr Gly Asn Asn Leu Leu

65 70 75 80

Asn Leu Gly Trp Tyr Gln Asp Val Gln Asp Ser Leu Lys Ala Tyr Asp

85 90 95

Ile Asn Leu Thr Asp Leu Leu Glu Glu Glu Ile Asp Pro Ala Leu Gly

100 105 110

Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ala Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala

115 120 125

Thr Val Gly Gln Ser Ala Thr Gly Tyr Gly Leu Asn Tyr Gln Tyr Gly

130 135 140

Leu Phe Arg Gln Ser Phe Val Asp Gly Lys Gln Val Glu Ala Pro Asp

145 150 155 160

Asp Trp His Arg Ser Asn Tyr Pro Trp Phe Arg His Asn Glu Ala Leu

165 170 175

Asp Val Gln Val Gly Ile Gly Gly Lys Val Thr Lys Asp Gly Arg Trp

180 185 190

Glu Pro Glu Phe Thr Ile Thr Gly Gln Ala Trp Asp Leu Pro Val Val

195 200 205

Gly Tyr Arg Asn Gly Val Ala Gln Pro Leu Arg Leu Trp Gln Ala Thr

210 215 220

His Ala His Pro Phe Asp Leu Thr Lys Phe Asn Asp Gly Asp Phe Leu

225 230 235 240

Arg Ala Glu Gln Gln Gly Ile Asn Ala Glu Lys Leu Thr Lys Val Leu

245 250 255

Tyr Pro Asn Asp Asn His Thr Ala Gly Lys Lys Leu Arg Leu Met Gln

260 265 270

Gln Tyr Phe Gln Cys Ala Cys Ser Val Ala Asp Ile Leu Arg Arg His

275 280 285

His Leu Ala Gly Arg Lys Leu His Glu Leu Ala Asp Tyr Glu Val Ile

290 295 300

Gln Leu Asn Asp Thr His Pro Thr Ile Ala Ile Pro Glu Leu Leu Arg

305 310 315 320

Val Leu Ile Asp Glu His Gln Met Ser Trp Asp Asp Ala Trp Ala Ile

325 330 335

Thr Ser Lys Thr Phe Ala Tyr Thr Asn His Thr Leu Met Pro Glu Ala

340 345 350

Leu Glu Arg Trp Asp Val Lys Leu Val Lys Gly Leu Leu Pro Arg His

355 360 365

Met Gln Ile Ile Asn Glu Ile Asn Thr Arg Phe Lys Thr Leu Val Glu

370 375 380

Lys Thr Trp Pro Gly Asp Glu Lys Val Trp Ala Lys Leu Ala Val Val

385 390 395 400

His Asp Lys Gln Val His Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly Phe

405 410 415

Ala Val Asn Gly Val Ala Ala Leu His Ser Asp Leu Val Val Lys Asp

420 425 430

Leu Phe Pro Glu Tyr His Gln Leu Trp Pro Asn Lys Phe His Asn Val

435 440 445

Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Ile Lys Gln Cys Asn Pro Ala

450 455 460

Leu Ala Ala Leu Leu Asp Lys Ser Leu Gln Lys Glu Trp Ala Asn Asp

465 470 475 480

Leu Asp Gln Leu Ile Asn Leu Glu Lys Phe Ala Asp Asp Ala Lys Phe

485 490 495

Arg Gln Gln Tyr Arg Glu Ile Lys Gln Ala Asn Lys Val Arg Leu Ala

500 505 510

Glu Phe Val Lys Val Arg Thr Gly Ile Glu Ile Asn Pro Gln Ala Ile

515 520 525

Phe Asp Ile Gln Ile Lys Arg Leu His Glu Tyr Lys Arg Gln His Leu

530 535 540

Asn Leu Leu His Ile Leu Ala Leu Tyr Lys Glu Ile Arg Glu Asn Pro

545 550 555 560

Gln Ala Asp Arg Val Pro Arg Val Phe Leu Phe Gly Ala Lys Ala Ala

565 570 575

Pro Gly Tyr Tyr Leu Ala Lys Asn Ile Ile Phe Ala Ile Asn Lys Val

580 585 590

Ala Asp Val Ile Asn Asn Asp Pro Leu Val Gly Asp Lys Leu Lys Val

595 600 605

Val Phe Leu Pro Asp Tyr Cys Val Ser Ala Ala Glu Lys Leu Ile Pro

610 615 620

Ala Ala Asp Ile Ser Glu Gln Ile Ser Thr Ala Gly Lys Glu Ala Ser

625 630 635 640

Gly Thr Gly Asn Met Lys Leu Ala Leu Asn Gly Ala Leu Thr Val Gly

645 650 655

Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Ala Glu Lys Val Gly Glu Glu

660 665 670

Asn Ile Phe Ile Phe Gly His Thr Val Glu Gln Val Lys Ala Ile Leu

675 680 685

Ala Lys Gly Tyr Asp Pro Val Lys Trp Arg Lys Lys Asp Lys Val Leu

690 695 700

Asp Ala Val Leu Lys Glu Leu Glu Ser Gly Lys Tyr Ser Asp Gly Asp

705 710 715 720

Lys His Ala Phe Asp Gln Met Leu His Ser Ile Gly Lys Gln Gly Gly

725 730 735

Asp Pro Tyr Leu Val Met Ala Asp Phe Ala Ala Tyr Val Glu Ala Gln

740 745 750

Lys Gln Val Asp Val Leu Tyr Arg Asp Gln Glu Ala Trp Thr Arg Ala

755 760 765

Ala Ile Leu Asn Thr Ala Arg Cys Gly Met Phe Ser Ser Asp Arg Ser

770 775 780

Ile Arg Asp Tyr Gln Ala Arg Ile Trp Gln Ala Lys Arg

785 790 795

<210> 10

<211> 505

<212> PRT

<213> 集胞藻属(Synechocystis sp. PCC 6803)

<400> 10

Met Leu Asp Lys Arg Cys Ser Gly Ile Leu Leu His Pro Thr Ser Leu

1 5 10 15

Pro Ser Arg Phe Gly Ile Gly Asp Leu Gly Asp Gly Ala Phe Gln Phe

20 25 30

Ile Asp Phe Leu Ala Asp Ala Asp Gln Ser Val Trp Gln Ile Leu Pro

35 40 45

Leu Gly Pro Thr Gly Phe Gly Asn Ser Pro Tyr Leu Cys Tyr Ser Ala

50 55 60

Leu Ala Ile Asn Pro Trp Leu Ile Ser Leu Asp Arg Leu Ala Glu Glu

65 70 75 80

Gly Phe Leu Pro Pro Ser Leu Leu Asp Gln Ala Pro Pro Phe Thr Asn

85 90 95

Pro Arg Val Asp Tyr Asp Gln Ala Ile Ala Tyr Lys Ser Gln Val Leu

100 105 110

Lys Gln Ala Phe Ala Gln Phe Arg Thr Asn Ile Glu Leu Ala Ile Glu

115 120 125

Gln Glu Phe Ala Glu Phe Cys Gln Ala Gln Ser Asp Trp Leu Ala Asp

130 135 140

Tyr Ala Leu Phe Met Ala Ile Lys Glu Ala His Asn Gly Ala Gly Trp

145 150 155 160

His Gln Trp Asp Lys Asp Ile Ala Trp Arg Glu Pro Glu Ala Leu Lys

165 170 175

Ile Trp Gly Asp Arg Leu Lys Thr Glu Val Leu Tyr His Gln Phe Leu

180 185 190

Gln Phe Leu Gly Phe Arg Gln Trp Gln Glu Val Lys Ala Tyr Ala Asn

195 200 205

Gln Arg His Ile Ala Ile Phe Gly Asp Leu Pro Ile Tyr Val Ala His

210 215 220

Asp Ser Ala Asp Val Trp Ala Asn Pro Glu Asn Phe Cys Leu Asp Pro

225 230 235 240

Glu Thr Gly Glu Ala Ala Met Met Ala Gly Val Pro Pro Asp Tyr Phe

245 250 255

Ser Ala Thr Gly Gln Leu Trp Gly Asn Pro Val Tyr Asp Trp Glu Thr

260 265 270

Leu Lys Ala Thr Gly Phe Ala Trp Trp Ile Lys Arg Phe Lys Ala Asn

275 280 285

Leu Gln Tyr Leu Asp Ile Val Arg Ile Asp His Phe Arg Gly Phe Glu

290 295 300

Ser Tyr Trp Gly Val Pro Gln Gly Glu Lys Thr Ala Glu Asn Gly Glu

305 310 315 320

Trp Tyr Pro Ala Pro Gly Lys Glu Phe Phe Gln Ala Leu Gly Lys Ala

325 330 335

Leu Gly Asp Asn Leu Pro Ile Val Ala Glu Asp Leu Gly Val Ile Thr

340 345 350

Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Asp Glu Phe Asn Phe Pro Gly Met Lys

355 360 365

Val Leu His Phe Ala Phe Asp Ser Asp Arg Gly Asn Pro Phe Leu Pro

370 375 380

Phe Asn Tyr Ser Asn Gly Asn Ala Val Val Tyr Thr Gly Thr His Asp

385 390 395 400

Asn Asp Thr Thr Val Gly Trp Phe Gln Glu Arg Ser Glu Asp Asp Gln

405 410 415

Gln Lys Val Ile Asn Tyr Leu Gly Cys Val Cys Asn Glu Gly Ile His

420 425 430

Trp Ser Leu Ile Arg Leu Ala Ser Ser Ser Val Ala Ala Leu Ala Ile

435 440 445

Phe Pro Leu Gln Asp Ile Leu Gly Leu Gly Ser Asp Cys Arg Met Asn

450 455 460

Leu Pro Gly Thr Ala Ala Gly Asn Trp Gly Trp Arg Tyr His Pro Asp

465 470 475 480

Gln Leu Asn Asp Trp Leu Ser Gly His Leu Ser Phe Ile Thr Glu Leu

485 490 495

Tyr Gly Arg Arg Ile Tyr His Thr Asp

500 505

<210> 11

<211> 392

<212> PRT

<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)

<400> 11

Met Ala Gln His Leu Thr Thr Glu Ala Leu Arg Lys Asp Phe Leu Ala

1 5 10 15

Val Phe Gly Gln Glu Ala Asp Gln Thr Phe Phe Ser Pro Gly Arg Ile

20 25 30

Asn Leu Ile Gly Glu His Thr Asp Tyr Asn Gly Gly His Val Phe Pro

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Leu Gly Thr Tyr Gly Ala Ala Arg Lys Arg Asp Asp

50 55 60

Gln Val Leu Arg Phe Tyr Ser Ala Asn Phe Glu Asp Lys Gly Ile Ile

65 70 75 80

Glu Val Pro Leu Ala Asp Leu Lys Phe Glu Lys Glu His Asn Trp Thr

85 90 95

Asn Tyr Pro Lys Gly Val Leu His Phe Leu Gln Glu Ala Gly His Val

100 105 110

Ile Asp Lys Gly Phe Asp Phe Tyr Val Tyr Gly Asn Ile Pro Asn Gly

115 120 125

Ala Gly Leu Ser Ser Ser Ala Ser Leu Glu Leu Leu Thr Gly Val Val

130 135 140

Ala Glu His Leu Phe Asp Leu Lys Leu Glu Arg Leu Asp Leu Val Lys

145 150 155 160

Ile Gly Lys Gln Thr Glu Asn Asn Phe Ile Gly Val Asn Ser Gly Ile

165 170 175

Met Asp Gln Phe Ala Ile Gly Met Gly Ala Asp Gln Arg Ala Ile Tyr

180 185 190

Leu Asp Thr Asn Thr Leu Glu Tyr Asp Leu Val Pro Leu Asp Leu Lys

195 200 205

Asp Asn Val Val Val Ile Met Asn Thr Asn Lys Arg Arg Glu Leu Ala

210 215 220

Asp Ser Lys Tyr Asn Glu Arg Arg Ala Glu Cys Glu Lys Ala Val Glu

225 230 235 240

Glu Leu Gln Val Ser Leu Asp Ile Gln Thr Leu Gly Glu Leu Asp Glu

245 250 255

Trp Ala Val Asp Gln Tyr Ser Tyr Leu Ile Lys Asp Glu Asn Arg Leu

260 265 270

Lys Arg Ala Arg His Ala Val Leu Glu Asn Gln Arg Thr Leu Lys Ala

275 280 285

Gln Val Ala Leu Gln Ala Gly Asp Leu Glu Thr Phe Gly Arg Leu Met

290 295 300

Asn Ala Ser His Val Ser Leu Glu His Asp Tyr Glu Val Thr Gly Leu

305 310 315 320

Glu Leu Asp Thr Leu Val His Thr Ala Trp Ala Gln Glu Gly Val Leu

325 330 335

Gly Ala Arg Met Thr Gly Ala Gly Phe Gly Gly Cys Ala Ile Ala Leu

340 345 350

Val Gln Lys Asp Thr Val Glu Ala Phe Lys Glu Ala Val Gly Lys His

355 360 365

Tyr Glu Glu Val Val Gly Tyr Ala Pro Ser Phe Tyr Ile Ala Glu Val

370 375 380

Ala Gly Gly Thr Arg Val Leu Asp

385 390

Claims

1.一种生物催化蔗糖和甘油合成甘油葡萄糖苷的方法，其特征是，

A、利用体外多酶反应体系包含蔗糖磷酸化酶（EC 2.4.1.7）和甘油葡萄糖苷磷酸化酶（EC 2.4.1.359），转化蔗糖和甘油合成甘油葡萄糖苷；

所述反应体系中，蔗糖磷酸化酶来源于变形链球菌Streptococcus mutans UA159，命名为SmSP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4，在UniProt上的编号为P10249；或者来源于明串珠菌Leuconostoc mesenteroides，命名为LmSP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5，在UniProt上的编号为Q59495；甘油葡萄糖苷磷酸化酶来源于Zhongshania aliphaticivorans，命名为ZaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，在UniProt上的编号为A0A127M3Y3；或者来源于Marinobacter psychrophilus，命名为MpGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2，在UniProt上的编号为A0A0H4I8H1；或者来源于黏附性海洋杆菌Marinobacter adhaerens HP15，命名为MaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，在UniProt上的编号为E4PMA5；

体外多酶反应体系中，缓冲液的浓度为10-100 mM，蔗糖的浓度为20 mM-2 M，甘油的浓度为20 mM-2 M，蔗糖磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL，甘油葡萄糖苷磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL；

所述酶催化的反应温度为10-80℃，反应pH为5.0-9.0，反应时间为1-120小时；

B、全细胞催化蔗糖和甘油合成甘油葡萄糖苷的方法，构建包含蔗糖磷酸化酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶的重组菌株，全细胞催化蔗糖和甘油合成甘油葡萄糖苷；

蔗糖磷酸化酶来源于变形链球菌Streptococcus mutans UA159，命名为SmSP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4，在UniProt上的编号为P10249；或者来源于明串珠菌Leuconostoc mesenteroides，命名为LmSP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5，在UniProt上的编号为Q59495；甘油葡萄糖苷磷酸化酶来源于Zhongshania aliphaticivorans，命名为ZaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，在UniProt上的编号为A0A127M3Y3；或者来源于Marinobacter psychrophilus，命名为MpGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2，在UniProt上的编号为A0A0H4I8H1；或者来源于黏附性海洋杆菌Marinobacter adhaerens HP15，命名为MaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，在UniProt上的编号为E4PMA5；

全细胞催化反应体系中，缓冲液的浓度为10-100 mM，蔗糖的浓度为20 mM-2 M, 甘油的浓度为20 mM-2 M，重组菌株的用量为OD₆₀₀=0.2-200，所述酶催化的反应温度为10-80℃，反应pH为5.0-9.0，反应时间为1-120小时；

C、体外多酶级联合转化高浓度蔗糖和甘油合成甘油葡萄糖苷的方法，高浓度底物为0.5M-2M的蔗糖及甘油，所述多酶反应体系包含蔗糖磷酸化酶（EC 2.4.1.7）和甘油葡萄糖苷磷酸化酶（EC 2.4.1.359）；

蔗糖磷酸化酶来源于变形链球菌Streptococcus mutans UA159，命名为SmSP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4，在UniProt上的编号为P10249；或者来源于明串珠菌Leuconostoc mesenteroides，命名为LmSP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5，在UniProt上的编号为Q59495；甘油葡萄糖苷磷酸化酶来源于Zhongshania aliphaticivorans，命名为ZaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，在UniProt上的编号为A0A127M3Y3，或者来源于Marinobacterpsychrophilus，命名为MpGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2，在UniProt上的编号为A0A0H4I8H1，或者来源于黏附性海洋杆菌Marinobacter adhaerens HP15，命名为MaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，在UniProt上的编号为E4PMA5；

上述反应体系中，缓冲液的浓度为20-200 mM，蔗糖的浓度为0.5 M-3 M，甘油的浓度为0.5 M-3 M，蔗糖磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL，甘油葡萄糖苷磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL；

2.一种生物催化麦芽糖和甘油合成甘油葡萄糖苷的方法，其特征是，

A、所述体外多酶反应体系包含麦芽糖磷酸化酶（EC 2.4.1.7）和甘油葡萄糖苷磷酸化酶（EC 2.4.1.332），转化麦芽糖和甘油合成甘油葡萄糖苷；

所述反应体系中，麦芽糖磷酸化酶来源于嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus，命名为LaMP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:6，基因在UniProt上的编号为Q5FI04；甘油葡萄糖苷磷酸化酶来源于硒还原芽孢杆菌Bacillus selenitireducens，命名为BsGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:7，基因在UniProt上的编号为D6XZ22；

体外多酶应体系中，缓冲液的浓度为10-100 mM，麦芽糖的浓度为20 mM-1 M, 甘油的浓度为20 mM-2 M，麦芽糖磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL，甘油葡萄糖苷磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL；

B、全细胞催化麦芽糖和甘油合成甘油葡萄糖苷的方法，构建包含麦芽糖磷酸化酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶的重组菌株，全细胞催化麦芽糖和甘油合成甘油葡萄糖苷；

麦芽糖磷酸化酶来源于嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus，命名为LaMP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:6，基因在UniProt上的编号为Q5FI04；甘油葡萄糖苷磷酸化酶来源于硒还原芽孢杆菌Bacillus selenitireducens，命名为BsGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:7，基因在UniProt上的编号为D6XZ22；

全细胞催化反应体系中，缓冲液的浓度为10-100 mM，麦芽糖的浓度为20 mM-2 M, 甘油的浓度为20 mM-2 M，重组菌株的用量为（OD₆₀₀=0.2-200），所述酶催化的反应温度为10-80℃，反应pH为5.0-9.0，反应时间为1-120小时；

C、体外多酶级联转化高浓度麦芽糖和甘油合成甘油葡萄糖苷的方法，所述高浓度底物为0.5M-3M的麦芽糖及甘油，所述多酶反应体系包含麦芽糖糖磷酸化酶（EC 2.4.1.8）和甘油葡萄糖苷磷酸化酶（EC 2.4.1.332）；

上述反应体系中，缓冲液的浓度为20-200 mM，麦芽糖的浓度为0.5 M-3 M，甘油的浓度为0.5 M-3 M，麦芽糖磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL，甘油葡萄糖苷磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL；

3.一种生物催化麦芽糊精和甘油合成甘油葡萄糖苷的方法，其特征是，

A、所述体外多酶反应体系包含异淀粉酶（EC 3.2.1.68）、葡聚糖磷酸化酶（EC2.4.1.1）、4-α-葡聚糖转移酶（4GT，EC 2.4.1.25）和甘油葡萄糖苷磷酸化酶（EC2.4.1.359），转化麦芽糊精和甘油合成甘油葡萄糖苷；

所述反应体系中，异淀粉酶来源于超嗜热古菌Sulfurisphaera tokodaii，命名为StIA，其氨基酸序列为SEQ ID NO:8，基因在UniProt上的编号为Q973H3；葡聚糖磷酸化酶来源于大肠杆菌Escherichia coli strain K12，命名为EcGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:9，基因在UniProt上的编号为P00490；4-α-葡聚糖转移酶来源于集胞藻属Synechocystis sp.PCC 6803，命名为SsGT，其氨基酸序列为SEQ ID NO:10，基因在UniProt上的编号为P72785；甘油葡萄糖苷磷酸化酶来源于Zhongshania aliphaticivorans，命名为ZaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，在UniProt上的编号为A0A127M3Y3；或者来源于Marinobacter psychrophilus，命名为MGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2，基因在UniProt上的编号为A0A0H4I8H1；或者来源于黏附性海洋杆菌Marinobacter adhaerens HP15，命名为MaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，基因在UniProt上的编号为E4PMA5；

体外多酶反应体系中，缓冲液的浓度为10-100 mM，麦芽糊精的浓度为5 mM-1 M（葡萄糖当量），甘油的浓度为20 mM-2 M，异淀粉酶用量为0.1-1000U/mL，葡聚糖磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL，4-α-葡聚糖转移酶用量为0.1-1000U/mL，甘油葡萄糖苷磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL；

B、全细胞催化麦芽糊精和甘油合成甘油葡萄糖苷的方法，构建包含异淀粉酶、葡聚糖磷酸化酶、4-α-葡聚糖转移酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶的重组菌株，全细胞催化麦芽糊精和甘油合成甘油葡萄糖苷；

异淀粉酶来源于超嗜热古菌Sulfurisphaera tokodaii，命名为StIA，其氨基酸序列为SEQ ID NO:8，基因在UniProt上的编号为Q973H3；葡聚糖磷酸化酶来源于大肠杆菌Escherichia coli strain K12，命名为EcGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:9，基因在UniProt上的编号为P00490；4-α-葡聚糖转移酶来源于集胞藻属Synechocystis sp. PCC6803，命名为SsGT，其氨基酸序列为SEQ ID NO:10，基因在UniProt上的编号为P72785；甘油葡萄糖苷磷酸化酶来源于Zhongshania aliphaticivorans，命名为ZaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，在UniProt上的编号为A0A127M3Y3；或者来源于Marinobacter psychrophilus，命名为MGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2，基因在UniProt上的编号为A0A0H4I8H1；或者来源于黏附性海洋杆菌Marinobacter adhaerens HP15，命名为MaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，基因在UniProt上的编号为E4PMA5；

全细胞催化的缓冲液为磷酸盐缓冲液，缓冲液浓度为50 mM，麦芽糊精浓度为55.6 mM葡萄糖当量，甘油的浓度为200 mM，含异淀粉酶的重组菌株OD₆₀₀为10，含葡聚糖磷酸化酶的重组菌株OD₆₀₀为10，含4-α-葡聚糖转移酶的重组菌株OD₆₀₀为10，含甘油葡萄糖苷酸化酶的重组菌株OD₆₀₀为10，反应温度为30℃、反应pH为6.5，反应时间为12 h；

C、体外多酶级联转化高浓度麦芽糊精和甘油合成甘油葡萄糖苷的方法，所述高浓度底物为100mg/mL的麦芽糊精及1M甘油，所述多酶反应体系包含异淀粉酶（EC 3.2.1.68）、葡聚糖磷酸化酶（EC 2.4.1.1）、4-α-葡聚糖转移酶（4GT，EC 2.4.1.25）和甘油葡萄糖苷磷酸化酶（EC 2.4.1.359）；

上述反应体系中，缓冲液的浓度为20-200 mM，麦芽糊精的浓度为10mg/mL-200mg/mL，甘油的浓度为0.5 M-3 M，异淀粉酶用量为0.1-1000U/mL，葡聚糖磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL，4-α-葡聚糖转移酶用量为0.1-1000U/mL，甘油葡萄糖苷磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL；

4.一种生物催化葡萄糖和甘油合成甘油葡萄糖苷的方法，其特征是，

A、所述体外多酶反应体系包含葡萄糖激酶（EC 2.7.1.6）和甘油葡萄糖苷磷酸化酶（EC2.4.1.359），转化葡萄糖和甘油合成甘油葡萄糖苷；

所述反应体系中，葡萄糖激酶来源于肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae，命名为SpGK，其氨基酸序列为SEQ ID NO:11，基因在UniProt上的编号为Q97NZ6；甘油葡萄糖苷磷酸化酶来源于Zhongshania aliphaticivorans，命名为ZaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，在UniProt上的编号为A0A127M3Y3；或者来源于Marinobacter psychrophilus，命名为MGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2，基因在UniProt上的编号为A0A0H4I8H1；或者来源于黏附性海洋杆菌Marinobacter adhaerens HP15，命名为MaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，基因在UniProt上的编号为E4PMA5；

体外多酶反应体系中，缓冲液的浓度为10-100 mM，葡萄糖的浓度为20 mM-2 M, 甘油的浓度为20 mM-2 M，葡萄糖激酶用量为0.1-1000U/mL，甘油葡萄糖苷磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL；

B、全细胞催化葡萄糖和甘油合成甘油葡萄糖苷的方法，构建包含葡萄糖激酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶的重组菌株，全细胞催化葡萄糖和甘油合成甘油葡萄糖苷；

葡萄糖激酶来源于肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae，命名为SpGK，其氨基酸序列为SEQ ID NO:11，基因在UniProt上的编号为Q97NZ6；甘油葡萄糖苷磷酸化酶来源于Zhongshania aliphaticivorans，命名为ZaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，在UniProt上的编号为A0A127M3Y3；或者来源于Marinobacter psychrophilus，命名为MGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2，基因在UniProt上的编号为A0A0H4I8H1；或者来源于黏附性海洋杆菌Marinobacter adhaerens HP15，命名为MaGGP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，基因在UniProt上的编号为E4PMA5；

全细胞催化的反应体系中，缓冲液的浓度为10-100 mM，葡萄糖的浓度为20 mM-2 M,甘油的浓度为20 mM-2 M，重组菌株的用量为OD₆₀₀=0.2-200，所述酶催化的反应温度为10-80℃，反应pH为5.0-9.0，反应时间为1-120小时。