CN116103353A - 一种纤维二糖磷酸化酶多肽的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明体涉及一种纤维二糖磷酸化酶多肽的应用。本发明首次发现来源于热纤维醋酸弧菌纤维二糖磷酸化酶多肽可以以乳糖为底物生成半乳糖‑1‑磷酸，提供了一种绿色高效、可规模化工业生产半乳糖‑1‑磷酸的方法。利用基因改造的重组菌，如重组大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、马克思克鲁维酵母和乳酸克鲁维酵母，表达CBP或CBP突变体，之后在CBP或CBP突变体的催化下，以乳糖为反应底物生成半乳糖‑1‑磷酸和葡糖糖。相较于化学法合成磷酸化糖，生物酶催化法具有条件温和、效率高、选择性高、副产物少等诸多优点。

Description

一种纤维二糖磷酸化酶多肽的应用
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种纤维二糖磷酸化酶多肽的应用。
背景技术
糖类是构成生命体的基本物质之一，常以游离形式(寡糖或多糖)或缀合物的形式参与生命代谢过程，一切重要的生命过程都离不开糖类及其衍生物的参与。磷酸化糖，如葡萄糖-1-磷酸、半乳糖-1-磷酸等广泛存在于动植物和微生物中，是许多酶的反应底物，在生物体的生命活动中发挥重要的生物功能。葡萄糖-1-磷酸是多糖合成过程中重要的中心代谢产物，作为重要的起始反应物可用于多种糖苷的生物合成。此外，葡萄糖-1-磷酸具有较高的医疗价值，能明显阻止脂肪肝浸润，促进骨骼及牙齿中钙的累积，增强钙在哺乳动物小肠内的主动运输；还可以用作抗菌剂，以及作为创面止血材料及药物缓释材料的制造成分(张尧等，重组Pyrococcus furiosus葡聚糖磷酸化酶催化淀粉合成葡萄糖-1-磷酸，2016，Vol.30，No.2)；其铂螯合物更可用于癌症的治疗。半乳糖-1-磷酸也具有重要的生物功能，它是筛选新生儿遗传性半乳糖代谢障碍的一个重要的早期诊断标志，可以通过抑制细胞代谢发挥细胞毒性。
目前工业生产得到葡萄糖-1-磷酸的步骤比较复杂，主要是通过蔗糖磷酸化酶(SPaSe)催化蔗糖或葡聚糖磷酸化酶(GPaSe)催化可溶性淀粉制备获得。前者方法中SPaSe是常温酶，较难工业化应用，且蔗糖中一半的碳原子转化为副产物果糖，造成糖源的不完全利用。后者方法就可溶性淀粉而言，原料生产工艺十分繁琐。对于半乳糖-1-磷酸的制备，可以利用半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶催化葡萄糖-1-磷酸与UDP-半乳糖形成半乳糖-1-磷酸和UDP-葡萄糖(CN201810182540.4)；或利用半乳糖激酶催化半乳糖获得(CN201010548354.1)。人工合成的磷酸化糖作为制备药品、食品或食品添加剂的前体原料有着巨大的应用潜力。
糖磷酸化酶可以催化糖苷键的磷酸化生成磷酸化糖。由于糖基磷酸键的能量不如糖基糖苷键(糖基转移酶的底物)的能量高，所以反应是可逆的。因此，可以利用糖磷酸化酶通过可逆反应直接合成或降解糖链生成磷酸化糖，其为一种绿色、简便且高效的途径。
纤维二糖磷酸化酶多肽(Cellobiose phosphorylase，简称CBP，EC2.4.1.20)，属于糖苷水解酶GH94家族的一个成员，1955年首次被发现于热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)中，以胞内酶的形式存在于利用纤维素的细菌细胞中，其被发现可以在不消耗ATP的情况下催化纤维二糖可逆磷酸化为葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖，且其磷酸化降解纤维二糖的活性要远远大于水解酶，研究发现，热纤梭菌来源的CBP对β-葡聚糖的磷酸解速率高出水解速率20倍以上，显示出了其在催化纤维二糖生成葡萄糖-1-磷酸方面具有较强的底物特异性。
另外，研究者们发现CBP的天然来源菌均为厌氧菌，并且多分布于生存条件十分严苛的环境中，例如热纤梭菌、白色瘤胃球菌、纤维弧菌、粪堆梭菌、牛黄瘤胃球菌、潮湿纤维单胞菌、新阿波罗栖热袍菌和海栖热袍菌等，因此获得较大量的CBP还是比较困难，阻碍其大规模应用于工业化生产中。
发明内容
现有技术中记载，纤维二糖磷酸化酶多肽在催化纤维二糖生成葡萄糖-1-磷酸方面具有较强的底物特异性，但是本发明人意外发现，纤维二糖磷酸化酶多肽在催化乳糖生成半乳糖-1-磷酸方面也具有优异的特性，目前还没有发现任何关于利用CBP催化乳糖生成半乳糖-1-磷酸的报道。
本发明还提供了一种适合工业化生成的纤维二糖磷酸化酶多肽的制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种纤维二糖磷酸化酶多肽在催化乳糖生成半乳糖-1-磷酸中的应用。
根据本发明优选的，所述纤维二糖磷酸化酶多肽包括：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的纤维二糖磷酸化酶多肽；
(2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经定点突变的具有催化乳糖生成半乳糖-1-磷酸的纤维二糖磷酸化酶多肽突变体。
进一步优选的，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的纤维二糖磷酸化酶多肽来源于热纤维醋酸弧菌(Acetivibrio thermocellus)。
进一步优选的，所述纤维二糖磷酸化酶多肽突变体的催化活性是氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的纤维二糖磷酸化酶多肽催化活性的-25～25％。
进一步优选的，所述纤维二糖磷酸化酶多肽突变体为定点单突变体、定点双突变体或定点多突变体。
进一步优选的，所述纤维二糖磷酸化酶多肽突变体的突变位点如下：
1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第355位从精氨酸定点突变为丙氨酸；或
2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第355位从精氨酸定点突变为亮氨酸；或
3)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第360位从精氨酸定点突变为亮氨酸；或
4)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第499位从谷氨酰胺定点突变为苯丙氨酸；或
5)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第636位从谷氨酸定点突变为丙氨酸；或
6)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第640位从酪氨酸定点突变为丙氨酸；或
7)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第645位从赖氨酸定点突变为丙氨酸；或
8)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第645位从赖氨酸定点突变为苯丙氨酸；或
9)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第645位从赖氨酸定点突变为亮氨酸；或
10)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第646位从谷氨酸定点突变为丙氨酸；或
11)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第651位从苯丙氨酸定点突变为酪氨酸；或
12)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第501位从苏氨酸定点突变为异亮氨酸，同时将第654位从天冬酰胺定点突变为丙氨酸；或
13)上述1)～12)不同突变位点的两种或两种以上的组合。
根据本发明优选的，所述纤维二糖磷酸化酶多肽催化乳糖生成半乳糖-1-磷酸是通过以下方法实现：在pH为3～11的缓冲液体系中，乳糖在纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体的催化作用下生成半乳糖-1-磷酸。
进一步优选的，所述缓冲液为HEPES缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
进一步优选的，所述缓冲液体系中含有KH2PO4，KH2PO4与缓冲液溶质的摩尔比为(3-5):5。
进一步优选的，所述缓冲液体系的pH为6～9；更进一步优选为8。
进一步优选的，所述纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体可以以游离酶或固定化酶的形式参与催化反应。
更进一步优选的，所述纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体的固定化酶，按以下方法制备：
在20-30℃温度范围内，将纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体与固定化树脂混合混匀，12-24小时后，分离，用缓冲液洗涤固体，得固定化酶。
优选的，所述固定化树脂选自氨基703树脂、氨基700树脂或环氧600树脂，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
进一步优选的，所述催化的反应温度为20℃～80℃；更进一步优选为40℃～60℃。
根据本发明一种优选的技术方案，所述纤维二糖磷酸化酶多肽催化乳糖生成半乳糖-1-磷酸的具体步骤如下：
(1)构建纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体编码基因重组质粒，将纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体编码基因重组质粒导入到宿主菌中，构建纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体工程菌株；
(2)诱导表达步骤(1)的纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体工程菌株，细胞破碎后得纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体粗酶液；
(3)以乳糖为底物，以步骤(2)的纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体粗酶液为生物催化剂，在含有KH2PO4的pH为3～11的缓冲液体系中，20℃～80℃催化生成半乳糖-1-磷酸。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、马克思克鲁维酵母或乳酸克鲁维酵母。
根据本发明优选的，步骤(1)中当宿主菌为大肠杆菌时，所述重组质粒的质粒载体为pET28a；当宿主菌为枯草芽孢杆菌或地衣芽胞杆菌时，所述重组质粒的质粒载体为pEB03；当宿主菌为马克思克鲁维酵母或乳酸克鲁维酵母时，所述重组质粒的质粒载体为pklac1。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述诱导表达采用的培养基为LB培养基或YPD培养基，其中，当宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或地衣芽胞杆菌时，采用的培养基为LB培养基，当宿主为马克思克鲁维酵母或乳酸克鲁维酵母时，采用的培养基为YPD培养基。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述纤维二糖磷酸化酶多肽粗酶液还可经纯化后作为生物催化剂，用于催化生成半乳糖-1-磷酸。
有益效果：
本发明提供了一种在纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体存在下，以乳糖为底物，合成半乳糖-1-磷酸的方法，该方法是一种绿色高效、可规模化工业生产半乳糖-1-磷酸的方法。
本发明还提供了利用基因改造的重组菌表达的CBP或CBP突变体。
本发明技术方案相较于化学法合成磷酸化糖，具有条件温和、效率高、选择性高、副产物少等诸多优点，避免了化学法中繁琐的保护和去保护过程，并大大减少了有机试剂的使用，且与金属催化剂(银、钯)相比价格相对较低。既有利于节约生产成本，还能大规模应用到工业生产中。而目前，对于生物酶法生产糖苷来说，使用比较广泛的是糖基转移酶和糖苷水解酶。糖基转移酶必须以高能的核苷酸糖作为糖基反应底物，造成工艺要求和成本较高；糖苷水解酶的水解速率已被证实在很多反应中远远低于CBP的磷酸解速率，且CBP可以在不消耗ATP的情况下催化生成磷酸化糖，极大地降低了生产成本，简化工艺。本发明技术方案的CBP产酶水平高、催化特性优异，在大规模工业化制备磷酸化糖以及促进磷酸化糖进一步应用于合成其他糖类衍生物中具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例1的CBP的SDS-PAGE电泳图。
图2为实施例2的CBP突变体(R355A)的SDS-PAGE电泳图。
图3为实施例3的CBP突变体(T501I/N654A)的SDS-PAGE电泳图。
图4为CBP在不同温度下的酶催化活性。
图5为CBP在不同温度下的热稳定性。
图6为CBP在不同pH下的相对酶活。
图7为实施例5中利用CBP催化乳糖合成半乳糖-1-磷酸浓度的变化曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下面通过实施例对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，在不偏离本发明的结构思路、使用范围下对本技术方案的细节和形式进行修改或替换均落入本发明的保护范围内。
本发明纤维二糖磷酸化酶多肽及其突变体活性测定体系和方法如下：
测定体系：10mM纤维二糖，10mM KH2PO4，5mM Mg2+，5mM二硫苏糖醇，实验组加入20μg CBP或CBP突变体，对照组加入等量煮沸后的CBP或CBP突变体，加入50mM HEPES缓冲液(pH7.0)至1mL。
测定方法：以上反应体系置于50℃水浴锅中，水浴反应15min，煮沸10min终止反应，通过高效液相色谱检测葡萄糖的量来测定纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体的酶活，定义1分钟生成1μmol葡萄糖所需要的酶量为1U。
本发明纤维二糖磷酸化酶多肽及其突变体蛋白定量测定方法为考马斯亮蓝法(Bradford法)，具体如下：
蛋白标准曲线的制作方法如下：取标准牛血清蛋白(5mg/mL)稀释至0、5、10、15、20、25、30、40、50、100μg/mL，取20μL稀释后的标准牛血清蛋白梯度溶液于酶标板槽中，加200μL的Bradford试剂充分混匀，后立即使用酶标仪检测混合液595nm吸光值，实际吸光值是用检测所得的A595nm吸光值减去空白对照的A595nm吸光值，以实际吸光值作为横坐标数据，以标准牛血清蛋白的浓度为纵坐标，做出CBP蛋白标准曲线如下：y＝0.163x+0.0388，R2＝0.997，线性范围为0.1-0.5mg/mL。
蛋白样品定量测定方法为：将待测样品稀释适当浓度，使其检测时在标准曲线线性范围内，取20μL稀释后的样品于酶标板槽中，加入200μL的Bradford试剂充分混匀，以无蛋白的水或缓冲液为空白对照，混匀后立即使用酶标仪检测混合液595nm吸光值，实际吸光值是用检测所得的A595nm吸光值减去空白对照的A595nm吸光值，将检测后的实际吸光值代入标准曲线中，计算待测样本中蛋白的实际浓度。
半乳糖-1-磷酸和葡萄糖-1-磷酸的产量计算是通过反应底物乳糖或纤维二糖的消耗量来定量，消耗的乳糖或纤维二糖的摩尔浓度即为生成半乳糖-1-磷酸或葡萄糖-1-磷酸的摩尔浓度(mM)。
实施例1.纤维二糖磷酸化酶多肽(CBP)及其突变体在大肠杆菌中的表达和纯化
纤维二糖磷酸化酶(CBP)编码基因来自于热纤维醋酸弧菌(Acetivibriothermocellus)，CBP的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，将CBP编码基因克隆到pET28a质粒中，然后导入到大肠杆菌中进行表达，具体步骤如下：
(1)构建重组质粒pET28a-CBP
以热纤维醋酸弧菌(Acetivibrio thermocellus)基因组为模板，PCR扩增CBP编码基因，选择PET-28a质粒载体，将CBP编码基因插入PET-28a质粒载体中，构建CBP编码基因重组质粒pET28a-CBP；
首先，引物设计如下所示：
CBP-F：5’-ACCATGGGCAGCAGCTTAGCCTAGCAACAC-3’，SEQ ID No:2；
CBP-R：5’-GTGGTGGTGGTGGTGATGAAGTACGGTTTT-3’，SEQ ID No:3；
PET28a-CBP-F：5’-AAAACCGTACTTCATCACCACCACCACCAC-3’，SEQ ID No:4；
PET28a-CBP-R：5’-GTGTTGCTAGGCTAAGCTGCTGCCCATGGT-3’，SEQ ID No:5；
用高保真Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，以CBP-F/CBP-R为引物，热纤维醋酸弧菌基因组为模板，PCR扩增CBP编码基因，其中：
PCR扩增反应体系50μL：热纤维醋酸弧菌基因组1μL，2×Phanta Max Buffer 25μL，10pmol/μL dNTP Mix 1μL，10pmol/μL正反向引物CBP-F/CBP-R各2μL，1U/μL Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase 1μL，添加ddH2O至50μL；
PCR扩增反应程序：95℃3min；95℃15s，60℃15s，72℃1.5min，33个循环；72℃5min；4℃保存；
同时，以PET28a-CBP-F/PET28a-CBP-R为引物，以PET-28a空质粒载体为模板，PCR扩增携带有15bp CBP编码基因同源臂的PET-28a线性片段，其中：
PCR扩增反应体系50μL：PET-28a空质粒载体1μL，2×Phanta Max Buffer 25μL，10pmol/μL dNTP Mix 1μL，10pmol/μL正反向引物PET28a-CBP-F/PET28a-CBP-R各2μL，1U/μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，添加ddH2O至50μL；
PCR扩增反应程序：95℃3min；95℃15s，60℃15s，72℃4min，33个循环；72℃5min；4℃保存。
PCR扩增结束后，用胶回收试剂盒回收每个片段，保证每个DNA片段的浓度较高以保证后续试验的成功。然后用MultiF Seamless Assembly Mix试剂盒进行PET-28a线性片段和CBP编码基因的连接，获得重组质粒PET28a-CBP。
使用点突变试剂盒(KOD-Plus-Mutagenesis Kit，Code No.SMK-101)，利用以下引物，对上述获得的重组质粒进行定点突变，获得突变体重组质粒PET28a-CBP’，具体突变位点如下：
R355A:CBP氨基酸序列第355位从精氨酸(R)定点突变为丙氨酸(A)；
R355L:CBP氨基酸序列第355位从精氨酸(R)定点突变为亮氨酸(L)；
R360L:CBP氨基酸序列第360位从精氨酸(R)定点突变为亮氨酸(L)；
Q499F:CBP氨基酸序列第499位从谷氨酰胺(Q)定点突变为苯丙氨酸(F)；
E636A:CBP氨基酸序列第636位从谷氨酸(E)定点突变为丙氨酸(A)；
Y640A:CBP氨基酸序列第640位从酪氨酸(Y)定点突变为丙氨酸(A)；
K645A:CBP氨基酸序列第645位从赖氨酸(K)定点突变为丙氨酸(A)；
K645L:CBP氨基酸序列第645位从赖氨酸(K)定点突变为亮氨酸(L)；
K645F:CBP氨基酸序列第645位从赖氨酸(K)定点突变为苯丙氨酸(F)；
E646A:CBP氨基酸序列第646位从谷氨酸(E)定点突变为丙氨酸(A)；
F651Y:CBP氨基酸序列第651位从苯丙氨酸(F)定点突变为酪氨酸(Y)；
以上定点突变对应的引物序列如下：
R355A-F:5’-GCTGGTATGGGTTTCAGAGATTCAAACCAGGACTTG-3’，SEQ ID No:6，
R355A-R:5’-TCCGATACCGGATTCAAAGTATGAAGCGC-3’，SEQ ID No:7；
R355L-F:5’-CTGGGTATGGGTTTCAGAGATTCAAACCAGGACTTG-3’，SEQ ID No:8，
R355L-R:5’-TCCGATACCGGATTCAAAGTATGAAGCGC-3’，SEQ ID No:9；
R360L-F:5’-TTAGATTCAAACCAGGACTTGCTGGGATTTGTACACCAGAT-3’，SEQ ID No:10，
R360L-R:5’-GAAACCCATACCTCTTCCGATACCGGATTCAAAGTATGAAG-3’，SEQ ID No:11；
Q499F-F:5’-TTCACCACAACAAGCAAAGACGGAAAAGTGGCAGAG-3’,SEQ ID No:12，
Q499F-R:5’-GAACGACTCATCCGGAACGGTGGAGAAGC-3’，SEQ ID No:13；
E636A-F:5’-CTATTTCAACATATCCACCGGGATACAAAGAAAATGCCG-3’，SEQID No:14，
E636A-R:5’-CTCCGTACTCAATATAGTATCTTGTAAACGCGGG-3’，SEQ ID No:15；
Y640A-F:5’-GCTCCACCGGGATACAAAGAAAATGCCG-3’，SEQ ID No:16，
Y640A-R:5’-TGTTGAAATTTCTCCGTACTCAATATAGTATCTTGTAAACGCGGG-3’，SEQ IDNo:17；
K645A-F:5’-GCTGAAAATGCCGGTATATTCTGCCACAACAATGC-3’，SEQ ID No:18，
K645A-R:5’-GTATCCCGGTGGATATGTTGAAATTTCTCCGTACTCAA-3’，SEQ ID No:19；
K645L-F:5’-CTGGAAAATGCCGGTATATTCTGCCACAACAATGC-3’，SEQ ID No:20，
K645L-R:5’-GTATCCCGGTGGATATGTTGAAATTTCTCCGTACTCAA-3’，SEQ ID No:21。
K645F-F:5’-TTCGAAAATGCCGGTATATTCTGCCACAACAATGC-3’，SEQ ID No:22，
K645F-R:5’-GTATCCCGGTGGATATGTTGAAATTTCTCCGTACTCAA-3’，SEQ ID No:23；
E646A-F:5’-CTAATGCCGGTATATTCTGCCACAACAATGCATGGATAATC-3’，SEQ ID No:24，
E646A-R:5’-CTTTGTATCCCGGTGGATATGTTGAAATTTCTCCGTACTC-3’，SEQ ID No:25；
F651Y-F:5’-ATTGCCACAACAATGCATGGATAATCTGTGCTGAAACG-3’，SEQ ID No:26，
F651Y-R:5’-ATATACCGGCATTTTCTTTGTATCCCGGTGGATATGTTGAAATTTCTCCG-3’，SEQID No:27；
(2)大肠杆菌的质粒转化
取50μL感受态细胞E.coli BL21(DE3)，加入1μL重组质粒pET28a-CBP或pET28aCBP’，用预冷的枪尖混匀，冰浴30min；然后42℃热浴45s后迅速插入冰水浴中2min；加入800μL无抗性LB液体培养基，置于37℃，200rpm金属摇床中培养1h；培养结束后，取100μL菌液涂布于卡那霉素抗性的LB固体培养基中，37℃培养箱培养12～24h。
(3)大肠杆菌的培养和CBP/CBP突变体的诱导表达
配制LB液体培养基，121℃高温蒸汽灭菌30min，冷却至室温备用，挑取步骤(2)转化后的单菌落置于50mL带有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃，200rpm摇床培养12h，获得种子液；取10mL种子液转接到1L带有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养约3h；待菌液OD600为0.60.8时，加入1mL 1M的IPTG溶液，使IPTG终浓度为1mM，16℃，150rpm摇床培养12～18h后，将菌液10000×g离心10min，收集诱导后的菌体；菌体沉淀使用20mM咪唑缓冲液(含PBS)重悬，置于冰中，使用超声破碎仪破碎30min，至菌悬液由浑浊变为可透光的胶体状液体，获得破碎菌悬液，释放目标蛋白；将破碎菌悬液置于50mL离心管中，10000×g离心30min，弃去沉淀，留取上清液，即得到CBP或CBP突变体粗酶液。
(4)CBP/CBP突变体的纯化
先用0.22μm滤膜过滤CBP或CBP突变体粗酶液，再用GE HisTrap HP(5mL)镍柱进行蛋白纯化。首先使用超纯水冲洗6个柱体积，再使用20mM咪唑(含PBS)平衡6个柱体积，然后上样经过0.22μm滤膜过滤的CBP或CBP突变体粗酶液，上样完成后，使用20mM咪唑缓冲液(含PBS)、40mM咪唑缓冲液(含PBS)和250mM咪唑缓冲液(含PBS)梯度洗脱，接取250mM咪唑缓冲液(含PBS)洗脱的蛋白；使用脱盐柱对纯化后的蛋白进行脱盐处理，去除蛋白中的咪唑等盐分；然后使用50mM Tris-HCl缓冲液洗脱蛋白，利用SDS-PAGE电泳验证，其中CBP的SDS-PAGE验证结果如图1，其他CBP突变体的验证结果与CBP相同，获得大小约为100kDa的CBP多肽或CBP突变体多肽的蛋白条带。
(5)CBP/CBP突变体活性测定
测定上述CBP/CBP突变体的活性，并以CBP的活性为基础，计算CBP突变体的活性变化，结果如表1所示。结果表明，相对于CBP活性，除突变体CBPQ499F的活性没有变化，其他突变体的活性均有不同程度的提高或降低。
表1 大肠杆菌重组表达CBP突变体的活性变化。
位点突变 CBP突变体相对于CBP活性变化
<![CDATA[CBP<sup>R355A</sup>]]> 6％
<![CDATA[CBP<sup>R355L</sup>]]> 13％
<![CDATA[CBP<sup>R360L</sup>]]> -12％
<![CDATA[CBP<sup>Q499F</sup>]]> 0
<![CDATA[CBP<sup>Y640A</sup>]]> -14％
<![CDATA[CBP<sup>E636A</sup>]]> 22％
<![CDATA[CBP<sup>K645A</sup>]]> 15％
<![CDATA[CBP<sup>K645L</sup>]]> 4％
<![CDATA[CBP<sup>K645F</sup>]]> -1％
<![CDATA[CBP<sup>E646A</sup>]]> -25％
<![CDATA[CBP<sup>F651Y</sup>]]> -12％
说明：
1.R为精氨酸；A为丙氨酸；L为亮氨酸；Q为谷氨酰胺；F为苯丙氨酸；E为谷氨酸；K为赖氨酸，Y为酪氨酸。。
2.未突变的CBP活性记为100％。
实施例2.CBP/CBP突变体在枯草芽孢杆菌和地衣芽胞杆菌中的表达和纯化
将CBP编码基因克隆到穿梭质粒pEB03中，然后导入枯草芽孢杆菌或地衣芽胞杆菌中进行高效表达，具体步骤如下：
(1)构建重组质粒pEB03-CBP
按照实施例1，获得CBP编码基因和质粒pEB03线性片段后，用MultiF SeamlessAssembly Mix试剂盒进行pEB03线性片段和CBP编码基因的连接，获得重组质粒pEB03-CBP；其中，pEB03线性片段的PCR扩增的引物序列如下：
pEB03-CBP-F：5’-GATAAGCTTATGAAGTTCGGTTTTTTTGATGATGCAAACAAA-3’，SEQ IDNo:28；
pEB03-CBP-R：5’-CAGGAATTCTCCCATAATTACTTCAACTTTGTGAGTCTTTCC-3’，SEQ IDNo:29。
同实施例1的方法，使用点突变试剂盒(KOD-Plus-Mutagenesis Kit，CodeNo.SMK-101)，引物设计同实施例1，对CBP氨基酸序列中关键氨基酸位点(R355、Q499、E636或K645)进行突变，获得突变体重组质粒pEB03 CBP’，具体突变位点如下：
R355A:CBP氨基酸序列第355位从精氨酸(R)定点突变为丙氨酸(A)；
R355L:CBP氨基酸序列第355位从精氨酸(R)定点突变为亮氨酸(L)；
Q499F:CBP氨基酸序列第499位从谷氨酰胺(Q)定点突变为苯丙氨酸(F)；
E636A:CBP氨基酸序列第636位从谷氨酸(E)定点突变为丙氨酸(A)；
K645A:CBP氨基酸序列第645位从赖氨酸(K)定点突变为丙氨酸(A)；
K645L:CBP氨基酸序列第645位从赖氨酸(K)定点突变为亮氨酸(L)；
(2)游离型重组质粒pEB03-CBP/pEB03-CBP’在枯草芽孢杆菌或地衣芽胞杆菌中的转化
取一满环枯草芽孢杆菌或地衣芽胞杆菌甘油菌液划LB平板(LB培养基：蛋白胨1％,酵母粉0.5％，NaCl 1％，平板加1.5％琼脂粉，均为质量百分比)，37℃培养箱培养过夜；挑取单菌落至1mL LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，隔日取200μL培养液转接至200mL生长培养基中(即LB液体培养基加入0.5M山梨醇)，37℃，200rpm培养至OD600nm达到0.85-0.95，冰浴10min，4℃，5000rpm离心5min，接着利用预冷的电转培养基洗4次(电转培养基：LB液体培养基加入0.5M山梨醇，10％甘油)，最后利用2mL预冷的电转培养基重悬。
将上述处理后的菌液分装成80μL每管，加入1μL(约50ng)重组质粒pEB03-CBP或pEB03-CBP’，转移至预冷的电转杯，冰上放置1-1.5min，接着利用电转仪进行电转化，电转化参数设置如下：电压2000V，电阻200Ω；接着冰浴2分钟，然后加入1mL恢复培养基(即LB液体培养基加入0.5M山梨醇，0.38M甘露醇)，然后置于37℃，200rpm培养90分钟，取菌液涂布氯霉素(50μg/mL)LB平板，挑取转化子即得重组枯草芽孢杆菌或地衣芽胞杆菌基因工程菌株。
(3)重组枯草芽孢杆菌或地衣芽胞杆菌的培养和CBP/CBP突变体的表达
将上述重组枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌基因工程菌株单菌落在10mL LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，所得的菌液为一级种子液；一级种子液接种于1L LB液体培养基，于37℃，200rpm培养至OD600到0.8左右，得二级种子液；将二级种子液接种到100L LB液体发酵罐中，37℃，以柠檬酸、NaOH控pH7.0左右，通风搅拌，溶氧控制在20～30％，培养至OD600到0.8左右，得三级种子液；最后，将三级种子液接种到3T发酵罐中，LB液体培养基，36～38℃，通风搅拌，溶氧控制在20～30％，以柠檬酸、NaOH控pH6～8，培养约26小时，10000×g离心30min除去菌体，用截留分子量10000-30000超滤膜浓缩上清液后，即得CBP或CBP突变体浓缩液，利用SDS-PAGE电泳验证，其中在枯草芽孢杆菌中重组表达的突变体CBPR355A的SDS-PAGE验证结果如图2，其他CBP或CBP突变体的验证结果与上述CBP相同，获得大小约为100kDa的CBP多肽或CBP突变体多肽的蛋白条带。
(4)CBP/CBP突变体的纯化
采用GE公司AKTApurifier层析仪和5mLHisTrapFFcrude柱对CBP或CBP突变体浓缩液进行亲和层析纯化。先用6倍柱体积纯水洗柱，后用bufferB(0.5M咪唑(imidazole)，0.5MNaCl，20mMTris·HCl，pH8.0)平衡柱子，流速为10mL/min；以同样流速再用bufferA(0.5MNaCl，20mMTris·HCl，pH8.0)平衡柱子至基线平稳，流速为10mL/min；之后，将CBP或CBP突变体浓缩液上样，流速为5mL/min；上样完成后，用bufferB洗脱，见峰起开始收集蛋白酶液。
(5)CBP/CBP突变体活性测定
测定上述CBP/CBP突变体的活性，并以各宿主菌中CBP的活性为基础，分别计算CBP突变体的活性变化，结果如表2所示。结果表明，在不同芽孢杆菌中表达的CBP突变体，相对于该芽孢杆菌CBP活性，除突变体CBPQ499F的活性没有变化，其他突变体的活性均有不同程度的提高。
表2 重组表达CBP突变体的活性变化。
Figure BDA0003347534070000101
说明：
1.表中R为精氨酸；A为丙氨酸；L为亮氨酸；Q为谷氨酰胺；F为苯丙氨酸；E为谷氨酸；K为赖氨酸。
2.未突变的CBP活性记为100％。
实施例3.CBP/CBP突变体在马克思克鲁维酵母或乳酸克鲁维酵母中的表达
(1)重组质粒构建
将未突变的CBP编码基因与pklac1质粒连接，获得重组质粒pklac1-CBP；同时将SEQ ID No:1所示的CBP氨基酸序列中关键氨基酸位点进行突变，并按照酵母菌的密码子偏好性进行密码子优化，获得CBP突变体编码基因片段后，将CBP突变体编码基因与pklac1质粒连接，获得突变体重组质粒pklac1-CBP’。以上重组质粒的构建均委托华大基因协助完成。
其中，CBP氨基酸序列中关键氨基酸的突变位点具体如下：
R355A:CBP氨基酸序列第355位从精氨酸(R)定点突变为丙氨酸(A)；
R355L:CBP氨基酸序列第355位从精氨酸(R)定点突变为亮氨酸(L)；
Q499F:CBP氨基酸序列第499位从谷氨酰胺(Q)定点突变为苯丙氨酸(F)；
E636A:CBP氨基酸序列第636位从谷氨酸(E)定点突变为丙氨酸(A)；
K645A:CBP氨基酸序列第645位从赖氨酸(K)定点突变为丙氨酸(A)；
K645L:CBP氨基酸序列第645位从赖氨酸(K)定点突变为亮氨酸(L)；
T501I/N654A:CBP氨基酸序列第501位从苏氨酸(T)定点突变为异亮氨酸(I)，第654位从天冬酰胺(N)定点突变为丙氨酸(A)。
(2)CBP/CBP突变体表达盒的扩增
根据重组质粒pklac1-CBP/pklac1-CBP’的核苷酸序列，设计引物经PCR扩增得到CBP/CBP突变体表达盒；
其中，PCR引物的核苷酸序列如下：
CBP-F1:5’-GTCGTTCCAGACCATAACAAGCAAAGACGGAAAAGTGGCA-3’,SEQ ID No:30，
CBP-R1:5’-TATCCATGCATTGGCGTGGCAGAATATACCGGCATTTTCTTT-3’,SEQ ID No:31，
R355L-F1:5’-CTGGGTATGGGTTTTAGAGATTCTAATCAAGACTTGTTGG-3’,SEQ ID No:32，
R355L-R1:5’-TCCGATACCGGATTCAAAGTATGAAGCGC-3’,SEQ ID No:33，
R355A-F1:5’-GCCGGTATGGGTTTTAGAGATTCTAATCAAGACTTGTTG-3’,SEQ ID No:34，
R355A-R1:5’-ACCAATACCAGACTCAAAGTAAGAAGCAGACC-3’,SEQ ID No:35，
Q499F-F1:5’-TTCACTACTACTTCTAAAGACGGCAAGGTCGC-3’,SEQ ID No:36，
Q499F-R1:5’-AAAAGACTCATCTGGGACAGTAGAGAAGCAG-3’,SEQ ID No:37，
E636A-F1:5’-CCATCTCTACTTATCCACCAGGTTATAAAGAGAATGCTG-3’,SEQ ID No:38，
E636A-R1:5’-CGCCGTACTCAATGTAATATCTAGTAAAAGCTGG-3’,SEQ ID No:39，
K645A-F1:5’-GCCGAGAATGCTGGTATTTTCTGCCACAATAACG-3’,SEQ ID No:40，
K645A-R1:5’-ATAACCTGGTGGATAAGTAGAGATCTCGCCGT-3’,SEQ ID No:41，
K645L-F1:5’-CTCGAGAATGCTGGTATTTTCTGCCACAATAACG-3’,SEQ ID No:42，
K645L-R1:5’-GTATCCCGGTGGATATGTTGAAATTTCTCCGTACTCAA-3’,SEQ ID No:43，
T501I/N654A-F1：5’-CCGCGGGGATCGACTCATAAAATAGTAACCTTCT-3’,SEQ ID No:44，
T501I/N654A-R1：5’-GCCGCGGAAATTTAGGAATTTTAAACTTGGGCTTG-3’,SEQ ID No:45；
PCR扩增反应体系50μL：DNA模板(pklac1-CBP/pklac1-CBP’)1μL(约50ng)，2×Phanta Max Buffer 25μL，10pmol/μL dNTP Mix 1μL，10pmol/μL上下游引物各2μL，1U/μLPhanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，添加超纯水至50μL；
PCR扩增反应程序：95℃3min；95℃15s，60℃15s，72℃5min，33个循环；72℃5min；4℃保存；
琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，得到两端含有马克思克鲁维酵母和乳酸克鲁维酵母同源臂的CBP/CBP突变体表达盒。
(3)CBP/CBP突变体表达盒转化到马克思克鲁维酵母和乳酸克鲁维酵母中
挑取新鲜培养的马克思克鲁维酵母或乳酸克鲁维酵母菌落至1mL YPD培养基中，置于恒温振荡器中，在30℃条件下，250rpm培养12-14h；将培养液转接至50mL新鲜YPD培养基中，初始接种OD600为0.2，30℃，200rpm培养3-4h至OD600为0.8～1；离心收集菌体后，取5～10μg菌体加入冰无菌超纯水，4℃，5000×g离心5min，弃上清液，收集菌体，之后加入1mL0.1M LiCl溶液重悬菌体，4℃，13000×g离心15s，弃上清液后加入400μL 0.1M LiCl溶液重悬菌体，取出50μL重悬菌体，4℃，13000×g离心15s后弃上清液；向处理后的菌体中加入240μL 50％PEG3350溶液，36μL 1M LiCl溶液，25μL预处理(于PCR仪中95℃，反应10min后，迅速冰水浴冷却，置于冰上备用)的鲑鱼精DNA溶液(2mg/mL)，50μL待转化CBP/CBP突变体表达盒溶液，涡旋剧烈混匀至菌体完全分布，置于30℃水浴30min，之后在42℃恒温水浴锅中热激25min；室温降温，8000×g离心2min收集菌体，用1mL YPD培养基重悬菌体，在30℃摇床中培养1～4h后取25～100μL菌液涂于含G418抗性的YPD培养基平板；将平板放于30℃恒温培养箱，倒置培养2-3天，挑取转化子进行验证CBP/CBP突变体表达盒是否成功转入。
(4)马克思克鲁维酵母和乳酸克鲁维酵母的培养和CBP/CBP突变体的表达
将上述转化成功的马克思克鲁维酵母或乳酸克鲁维酵母单菌落在1mL YPD液体培养基中，30℃、200rpm培养过夜，所得的菌液为一级种子液；一级种子液接种于100mL YPD液体培养基，于30℃，200rpm培养至OD600到0.8左右，得二级种子液；将二级种子液接种到100LYPG液体发酵罐中，30℃，以柠檬酸、NaOH控pH7.0左右，通风搅拌，溶氧控制在20～30％，培养约26小时，10000×g离心30min除去菌体，用截留分子量10000-30000超滤膜浓缩上清液后，即得CBP/CBP突变体浓缩液，利用SDS-PAGE电泳验证，其中在马克斯克鲁维酵母中重组表达的突变体CBPT501I/N654A的SDS-PAGE验证结果如图3，其他CBP或CBP突变体的验证结果与CBPT501I/N654A相同，获得大小约为100kDa的CBP多肽或CBP突变体多肽的蛋白条带。
(5)CBP/CBP突变体活性测定
测定上述CBP/CBP突变体的活性，并以各宿主菌中CBP的活性为基础，分别计算CBP突变体的活性变化，结果如表3所示。结果表明，在不同酵母菌中表达的CBP突变体，相对于该酵母菌CBP活性，除突变体CBPQ499F的活性没有变化，其他突变体的活性均有不同程度的变化。
表3.马克思克鲁维酵母或乳酸克鲁维酵母中各CBP突变体活性变化
Figure BDA0003347534070000121
说明：
1.表中R为精氨酸；A为丙氨酸；L为亮氨酸；Q为谷氨酰胺；F为苯丙氨酸；E为谷氨酸；K为赖氨酸；T为苏氨酸；I为异亮氨酸；N为天冬酰胺。
2.未突变的CBP活性记为100％。
试验例1.温度对纤维二糖磷酸化酶多肽及其突变体催化活性和稳定性的影响
1、温度对酶催化活性的影响
分别在10-80℃条件下测定实施例1所得CBP的催化活性。将CBP在50℃时的催化活性定义为100％，以此作为其他温度的参考条件。实验结果如图4所示，CBP对纤维二糖的催化活性在20℃时开始显现，在60℃时达到最大，在60℃后随着温度的升高，催化活性快速下降，80℃仍有活性。
2、温度对酶稳定性的影响
在10-80℃条件下，采用不同温度孵育CBP，分别于12h和24h取样测定活性，检测CBP在各温度下的热稳定性。
实验结果如图5所示，CBP对纤维二糖的催化活性在40℃～60℃范围内有着良好的稳定性，孵育12h仍能保持较高的活力。值得注意的是，CBP在60℃孵育24h时，催化活力降低较大；超过60℃时，CBP的稳定性较差。
采用上述方法检测温度对实施例1-3其他CBP和CBP突变体催化活性和稳定性的影响，与上述CBP检测结果一致，在20℃-80℃范围内有活性，在60℃活性最强，在40℃～60℃范围内有着良好的稳定性。
试验例2.pH对CBP及其突变体催化活性的影响
测定pH对实施例1所得CBP催化活性的影响，选择3～11之间不同的pH值，分别使用柠檬酸缓冲液和50mM HEPES缓冲液对CBP的活性进行测定。将CBP在pH 7.0的HEPES缓冲液下的催化活性定义为100％，以此作为其他pH的参考条件。
实验结果显示，实施例1所得CBP在pH3-11之间均有活性，在pH 6～9之间活性更好，在pH 8.0时有最佳的催化活性，如图6所示。
采用上述方法检测pH对实施例1-3其他CBP和CBP突变体催化活性的影响，与CBP检测结果一致。
实施例4.利用CBP(Q499F)突变体催化纤维二糖合成葡萄糖-1-磷酸
将纤维二糖与KH2PO4和实施例1纯化后的CBPQ499F突变体在50mM HEPES缓冲液(pH8.0)中混合，在混合溶液中纤维二糖的浓度为20mM，KH2PO4的浓度为30mM，CBP(Q499F)的浓度为0.2g/L，60℃下反应后，定时取样，检测葡萄糖-1-磷酸的产量。结果显示，在反应的第6小时，第12小时和第24小时，葡萄糖-1-磷酸的产量分别为12.82mM，14.05mM，13.11mM。
实施例5.利用CBP催化乳糖生成半乳糖-1-磷酸
将乳糖与KH2PO4和实施例1纯化后的CBP在50mM HEPES缓冲液(pH8.0)中混合，在混合溶液中乳糖的浓度为20mM，KH2PO4的浓度为30mM，CBP的浓度为0.2g/L，60℃下反应后，定时取样，检测半乳糖-1-磷酸的产量。结果如图7所示。在反应的第2小时，第6小时和第12小时，半乳糖-1-磷酸的产量分别为7.6mM，13.75mM，13.5mM。
实施例6.利用固定化的CBP催化乳糖生成半乳糖-1-磷酸
酶固定化：取实施例1纯化后的CBP，分别与氨基703树脂、氨基700树脂、环氧600树脂混合，25℃下，100-150rpm摇床18-20h得混合液；将上述混合液抽滤，并用50mM pH8.0Tris-HCl缓冲液洗三遍，将固定在树脂上的固定化酶放在4℃保存待用。记录滤液体积，用微量测定仪检测蛋白液含量，计算固定化酶的吸附率。1g氨基703树脂吸附610mg CBP，吸附率为61％；1g氨基700树脂吸附490mg CBP，吸附率为49％；1g环氧600树脂吸附183mg CBP，吸附率为18.3％。
取乳糖和1mg固定化酶CBP、KH2PO4，在50mM HEPES缓冲液(pH8.0)中混合，用HEPES缓冲液定容至1mL，在混合溶液中乳糖的浓度为20mM，KH2PO4的浓度为50mM。在60℃下反应12h后，取样，检测氨基703树脂固定化酶的半乳糖-1-磷酸的产量为13.7mM，氨基700树脂固定化酶的半乳糖-1-磷酸的产量为11.5mM，环氧600树脂固定化酶的半乳糖-1-磷酸的产量为4.1mM。
实施例7.利用CBPT501I/N654A突变体催化乳糖生成半乳糖-1-磷酸
取实施例3马克思克鲁维酵母表达纯化的CBPT501I/N654A突变体，CBP突变体酶固定化方法与实施例6相同，以氨基703树脂为固定化载体。
取乳糖和1mg固定化酶CBPT501I/N654A突变体、KH2PO4，在50mM HEPES缓冲液(pH8.0)中混合，用HEPES缓冲液定容至1mL，在混合溶液中乳糖的浓度为20mM，KH2PO4的浓度为50mM。在60℃下反应12h后，取样，检测半乳糖-1-磷酸的产量为10.4mM。
实施例8.利用CBP/CBP突变体催化乳糖生成半乳糖-1-磷酸
将乳糖与KH2PO4和实施例2枯草芽孢杆菌表达纯化后的CBP/CBP突变体在50mMTris-HCl缓冲液(pH6.5)中混合，在混合溶液中乳糖的浓度为20mM，KH2PO4的浓度为30mM，CBP/CBP突变体的浓度为0.2g/L，55℃下反应6h后取样，检测半乳糖-1-磷酸的产量，结果如表4所示。
表4.重组表达CBP/CBP突变体的半乳糖-1-磷酸催化产量
CBP/CBP突变体 半乳糖-1-磷酸产量
CBP 13.75mM
<![CDATA[CBP<sup>R355A</sup>]]> 14.9mM
<![CDATA[CBP<sup>R355L</sup>]]> 15.5mM
<![CDATA[CBP<sup>Q499F</sup>]]> 13.7mM
<![CDATA[CBP<sup>E636A</sup>]]> 16.5mM
<![CDATA[CBP<sup>K645A</sup>]]> 15.95mM
<![CDATA[CBP<sup>K645L</sup>]]> 14.0mM
实施例9.利用CBP催化麦芽糖、海藻糖和蔗糖
分别将麦芽糖、海藻糖或蔗糖与KH2PO4和实施例1纯化后的纤维二糖磷酸化酶多肽CBP或CBP突变体在50mM Tris-HCl缓冲液(pH6.5)中混合，其中麦芽糖、海藻糖或蔗糖的浓度分别为20mM，KH2PO4的浓度为30mM，CBP/CBP突变体的浓度为0.2g/L，55℃下反应6h后取样，进行检测。结果发现，随着时间推移，以上三种二糖的含量没有发生变化，并未被消耗，这说明CBP对此三糖并不具备催化作用。
综上实施例1～9可看出，相较于未突变的CBP，CBP多肽突变后，以突变点位的不同，突变体活性有增高，也有降低，没有固定规律可循，但都可以以乳糖为底物生成半乳糖-1-磷酸。另外，CBP及其突变体对麦芽糖、海藻糖和蔗糖等其他二糖并无催化作用。
对比例1.大肠杆菌表达的CBP(来源于纤维单胞菌属)催化乳糖的研究
纤维二糖磷酸化酶多肽(CBP)编码基因来自于纤维单胞菌(Cellulomonas udaDSM20108，GenBank ID:AY343322)，将CBP编码基因(AY343322)克隆到pGEM-T质粒中，然后导入到大肠杆菌中进行表达，具体步骤如下：
以C.uda DSM20108基因组为模板，PCR扩增CBP编码基因，选择pGEM-T质粒，按照实施例1的方法，将CBP编码基因插入pGEM-T质粒中构建重组质粒，CBP编码基因的PCR扩增引物设计如下所示：
上游引物:5’-AACGTTACGGGCACTTCGACGAC-3’，SEQ ID No:46，
下游引物:5’-ATTCTGCAGCTAGAGGGTCACGTCGACGC-3’，SEQ ID No:47；
按照实施例1，获得CBP编码基因和pGEM-T线性片段后，用MultiF SeamlessAssembly Mix试剂盒进行pGEM-T线性片段和CBP编码基因的连接，获得重组质粒pGEM-T-CBP。之后将pGEM-T CBP质粒转化至大肠杆菌中。将阳性转化子大肠杆菌培养在TSB液体培养基16h后，10000×g离心30min除去菌体，用截留分子量10000-30000超滤膜浓缩上清液后，即得纤维二糖磷酸化酶多肽浓缩液。
利用上述CBP浓缩液催化乳糖生成半乳糖-1-磷酸，具体如下：将30mL CBP浓缩液与170mL底物溶液(200mM乳糖和30mM KH2PO4在50mM Mes缓冲液(pH 6.6)中)混合，在37℃下进行催化反应12h后，取样检测，结果发现半乳糖-1-磷酸的产量极其微小，仅为0.1mM，可忽略不计。
对比例1说明：大肠杆菌表达的CBP(来源于纤维单胞菌属)没有催化乳糖生成半乳糖-1-磷酸的活性。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东恒鲁生物科技有限公司
<120> 一种纤维二糖磷酸化酶多肽的应用
<160> 47
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 807
<212> PRT
<213> Acetivibrio thermocellus
<400> 1
Met Lys Phe Gly Phe Phe Asp Asp Ala Asn Lys Glu Tyr Val Ile Thr
1               5                   10                  15
Val Pro Arg Thr Pro Tyr Pro Trp Ile Asn Tyr Leu Gly Thr Glu Asn
            20                  25                  30
Phe Phe Ser Leu Ile Ser Asn Thr Ala Gly Gly Tyr Cys Phe Tyr Arg
        35                  40                  45
Asp Ala Arg Leu Arg Arg Ile Thr Arg Tyr Arg Tyr Asn Asn Val Pro
    50                  55                  60
Ile Asp Met Gly Gly Arg Tyr Phe Tyr Ile Tyr Asp Asn Gly Asp Phe
65                  70                  75                  80
Trp Ser Pro Gly Trp Ser Pro Val Lys Arg Glu Leu Glu Ser Tyr Glu
                85                  90                  95
Cys Arg His Gly Leu Gly Tyr Thr Lys Ile Ala Gly Lys Arg Asn Gly
            100                 105                 110
Ile Lys Ala Glu Val Thr Phe Phe Val Pro Leu Asn Tyr Asn Gly Glu
        115                 120                 125
Val Gln Lys Leu Ile Leu Lys Asn Glu Gly Gln Asp Lys Lys Lys Ile
    130                 135                 140
Thr Leu Phe Ser Phe Ile Glu Phe Cys Leu Trp Asn Ala Tyr Asp Asp
145                 150                 155                 160
Met Thr Asn Phe Gln Arg Asn Phe Ser Thr Gly Glu Val Glu Ile Glu
                165                 170                 175
Gly Ser Val Ile Tyr His Lys Thr Glu Tyr Arg Glu Arg Arg Asn His
            180                 185                 190
Tyr Ala Phe Tyr Ser Val Asn Ala Lys Ile Ser Gly Phe Asp Ser Asp
        195                 200                 205
Arg Asp Ser Phe Ile Gly Leu Tyr Asn Gly Phe Asp Ala Pro Gln Ala
    210                 215                 220
Val Val Asn Gly Lys Ser Asn Asn Ser Val Ala Asp Gly Trp Ala Pro
225                 230                 235                 240
Ile Ala Ser His Ser Ile Glu Ile Glu Leu Asn Pro Gly Glu Gln Lys
                245                 250                 255
Glu Tyr Val Phe Ile Ile Gly Tyr Val Glu Asn Lys Asp Glu Glu Lys
            260                 265                 270
Trp Glu Ser Lys Gly Val Ile Asn Lys Lys Lys Ala Tyr Glu Met Ile
        275                 280                 285
Glu Gln Phe Asn Thr Val Glu Lys Val Asp Lys Ala Phe Glu Glu Leu
    290                 295                 300
Lys Ser Tyr Trp Asn Ala Leu Leu Ser Lys Tyr Phe Leu Glu Ser His
305                 310                 315                 320
Asp Glu Lys Leu Asn Arg Met Val Asn Ile Trp Asn Gln Tyr Gln Cys
                325                 330                 335
Met Val Thr Phe Asn Met Ser Arg Ser Ala Ser Tyr Phe Glu Ser Gly
            340                 345                 350
Ile Gly Arg Gly Met Gly Phe Arg Asp Ser Asn Gln Asp Leu Leu Gly
        355                 360                 365
Phe Val His Gln Ile Pro Ala Arg Ala Arg Glu Arg Leu Leu Asp Leu
    370                 375                 380
Ala Ala Thr Gln Leu Glu Asp Gly Gly Ala Tyr His Gln Tyr Gln Pro
385                 390                 395                 400
Leu Thr Lys Lys Gly Asn Asn Glu Ile Gly Ser Asn Phe Asn Asp Asp
                405                 410                 415
Pro Leu Trp Leu Ile Leu Ala Thr Ala Ala Tyr Ile Lys Glu Thr Gly
            420                 425                 430
Asp Tyr Ser Ile Leu Lys Glu Gln Val Pro Phe Asn Asn Asp Pro Ser
        435                 440                 445
Lys Ala Asp Thr Met Phe Glu His Leu Thr Arg Ser Phe Tyr His Val
    450                 455                 460
Val Asn Asn Leu Gly Pro His Gly Leu Pro Leu Ile Gly Arg Ala Asp
465                 470                 475                 480
Trp Asn Asp Cys Leu Asn Leu Asn Cys Phe Ser Thr Val Pro Asp Glu
                485                 490                 495
Ser Phe Gln Thr Thr Thr Ser Lys Asp Gly Lys Val Ala Glu Ser Val
            500                 505                 510
Met Ile Ala Gly Met Phe Val Phe Ile Gly Lys Asp Tyr Val Lys Leu
        515                 520                 525
Cys Glu Tyr Met Gly Leu Glu Glu Glu Ala Arg Lys Ala Gln Gln His
    530                 535                 540
Ile Asp Ala Met Lys Glu Ala Ile Leu Lys Tyr Gly Tyr Asp Gly Glu
545                 550                 555                 560
Trp Phe Leu Arg Ala Tyr Asp Asp Phe Gly Arg Lys Val Gly Ser Lys
                565                 570                 575
Glu Asn Glu Glu Gly Lys Ile Phe Ile Glu Ser Gln Gly Phe Cys Val
            580                 585                 590
Met Ala Glu Ile Gly Leu Glu Asp Gly Lys Ala Leu Lys Ala Leu Asp
        595                 600                 605
Ser Val Lys Lys Tyr Leu Asp Thr Pro Tyr Gly Leu Val Leu Gln Asn
    610                 615                 620
Pro Ala Phe Thr Arg Tyr Tyr Ile Glu Tyr Gly Glu Ile Ser Thr Tyr
625                 630                 635                 640
Pro Pro Gly Tyr Lys Glu Asn Ala Gly Ile Phe Cys His Asn Asn Ala
                645                 650                 655
Trp Ile Ile Cys Ala Glu Thr Val Val Gly Arg Gly Asp Met Ala Phe
            660                 665                 670
Asp Tyr Tyr Arg Lys Ile Ala Pro Ala Tyr Ile Glu Asp Val Ser Asp
        675                 680                 685
Ile His Lys Leu Glu Pro Tyr Val Tyr Ala Gln Met Val Ala Gly Lys
    690                 695                 700
Asp Ala Lys Arg His Gly Glu Ala Lys Asn Ser Trp Leu Thr Gly Thr
705                 710                 715                 720
Ala Ala Trp Asn Phe Val Ala Ile Ser Gln Trp Ile Leu Gly Val Lys
                725                 730                 735
Pro Asp Tyr Asp Gly Leu Lys Ile Asp Pro Cys Ile Pro Lys Ala Trp
            740                 745                 750
Asp Gly Tyr Lys Val Thr Arg Tyr Phe Arg Gly Ser Thr Tyr Glu Ile
        755                 760                 765
Thr Val Lys Asn Pro Asn His Val Ser Lys Gly Val Ala Lys Ile Thr
    770                 775                 780
Val Asp Gly Asn Glu Ile Ser Gly Asn Ile Leu Pro Val Phe Asn Asp
785                 790                 795                 800
Gly Lys Thr His Lys Leu Lys
                805
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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gtggtggtgg tggtgatgaa gtacggtttt 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaaaccgtac ttcatcacca ccaccaccac 30
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gtgttgctag gctaagctgc tgcccatggt 30
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<211> 36
<212> DNA
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 44
ccgcggggat cgactcataa aatagtaacc ttct 34
<210> 45
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
gccgcggaaa tttaggaatt ttaaacttgg gcttg 35
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
aacgttacgg gcacttcgac gac 23
<210> 47
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
attctgcagc tagagggtca cgtcgacgc 29

Claims (10)

1.一种纤维二糖磷酸化酶多肽及其突变体在催化乳糖生成半乳糖-1-磷酸中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纤维二糖磷酸化酶多肽及其突变体包括：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的纤维二糖磷酸化酶多肽；
(2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经定点突变的具有催化乳糖生成半乳糖-1-磷酸的纤维二糖磷酸化酶多肽突变体。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的纤维二糖磷酸化酶多肽来源于热纤维醋酸弧菌(Acetivibrio thermocellus)；
优选的，所述纤维二糖磷酸化酶多肽突变体的催化活性是氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的纤维二糖磷酸化酶多肽催化活性的-25～25％；
优选的，所述纤维二糖磷酸化酶多肽突变体为定点单突变体、定点双突变体或定点多突变体；
进一步优选的，所述纤维二糖磷酸化酶多肽突变体的突变位点如下：
1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第355位从精氨酸定点突变为丙氨酸；或
2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第355位从精氨酸定点突变为亮氨酸；或
3)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第360位从精氨酸定点突变为亮氨酸；或
4)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第499位从谷氨酰胺定点突变为苯丙氨酸；或
5)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第636位从谷氨酸定点突变为丙氨酸；或
6)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第640位从酪氨酸定点突变为丙氨酸；或
7)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第645位从赖氨酸定点突变为丙氨酸；或
8)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第645位从赖氨酸定点突变为苯丙氨酸；或
9)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第645位从赖氨酸定点突变为亮氨酸；或
10)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第646位从谷氨酸定点突变为丙氨酸；或
11)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第651位从苯丙氨酸定点突变为酪氨酸；或
12)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第501位从苏氨酸定点突变为异亮氨酸，同时将第654位从天冬酰胺定点突变为丙氨酸；或
13)上述1)～12)不同突变位点的两种或两种以上的组合。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纤维二糖磷酸化酶多肽及其突变体催化乳糖生成半乳糖-1-磷酸是通过以下方法实现的：在pH为3～11的缓冲液体系中，乳糖在纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体的催化作用下生成半乳糖-1-磷酸。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述缓冲液为HEPES缓冲液或Tris-HCl缓冲液；
优选的，所述缓冲液体系中含有KH2PO4，KH2PO4与缓冲液溶质的摩尔比为(3-5):5；
优选的，所述缓冲液体系的pH为6～9；更进一步优选为8。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体以游离酶或固定化酶的形式参与催化反应。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体的固定化酶，按以下方法制备：
在20-30℃温度范围内，将纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体与固定化树脂混合混匀，12-24小时后，分离，用缓冲液洗涤固体，得固定化酶；
优选的，所述固定化树脂为氨基703树脂、氨基700树脂或环氧600树脂，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述催化的反应温度为20℃～80℃；进一步优选为40℃～60℃。
9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纤维二糖磷酸化酶多肽及其突变体催化乳糖生成半乳糖-1-磷酸的具体步骤如下：
(1)构建纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体编码基因重组质粒，将纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体编码基因重组质粒导入到宿主菌中，构建纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体工程菌株；
(2)诱导表达步骤(1)的纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体工程菌株，细胞破碎后得纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体粗酶液；
(3)以乳糖为底物，以步骤(2)的纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体粗酶液为生物催化剂，在含有KH2PO4的pH为3～11的缓冲液体系中，20℃～80℃催化生成半乳糖-1-磷酸。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：
i.步骤(1)中所述宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、马克思克鲁维酵母或乳酸克鲁维酵母；
ii.步骤(1)中当宿主菌为大肠杆菌时，所述重组质粒的质粒载体为pET28a；当宿主菌为枯草芽孢杆菌或地衣芽胞杆菌时，所述重组质粒的质粒载体为pEB03；当宿主菌为马克思克鲁维酵母或乳酸克鲁维酵母时，所述重组质粒的质粒载体为pklac1；
iii.步骤(2)中所述诱导表达采用的培养基为LB培养基或YPD培养基，其中，当宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或地衣芽胞杆菌时，采用的培养基为LB培养基，当宿主为马克思克鲁维酵母或乳酸克鲁维酵母时，采用的培养基为YPD培养基；
iv.步骤(3)中所述纤维二糖磷酸化酶多肽或其突变体粗酶液还可经纯化后用于催化生成半乳糖-1-磷酸。
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