KR100637314B1

KR100637314B1 - 초내열성 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈 및이의 생산방법

Info

Publication number: KR100637314B1
Application number: KR1020040090793A
Authority: KR
Inventors: 박관화; 이명희; 양성재; 이희섭; 신현승
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2004-11-09
Filing date: 2004-11-09
Publication date: 2006-10-23
Also published as: KR20060041546A

Abstract

본 발명은 초내열성 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈 및 이의 생산방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하며 pH 5.0 내지 9.0 및 온도 70 내지 105℃에서 효소 활성을 갖는 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)에서 유래된 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈, 이의 생산방법, 이를 생산하는 형질전환체 및 이를 이용한 당전이 방법을 제공한다. 본 발명의 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈는 70 내지 105 ℃의 고온에서 효소 활성을 가져, 산업적 활용성이 매우 우수하다.

초내열성 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈, 사이클로덱스트린, 전분, 파이로코커스 퓨리오서스

Description

초내열성 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈 및 이의 생산방법{HYPERTHERMOPHILIC CYCLODEXTRIN GLUCANOTRANSFERASE FROM PYROCOCCUS FURIOSIS AND PRODUCTION METHOD THEREOF}

도 1은 p6xHTKNdCGT 벡터의 DNA 개열지도이다.

도 2는 정제된 초내열성 파이로코커스 퓨리오서스 유래 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈(Cyclodextrin glucanotransferase)의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.

도 3은 초내열성 파이로코커스 퓨리오서스 유래 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈의 최적 작용 온도를 나타낸 그래프이다.

도 4는 초내열성 파이로코커스 퓨리오서스 유래 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈의 최적 작용 pH를 나타낸 그래프이다.

도 5는 초내열성 파이로코커스 퓨리오서스 유래 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈에 대한 열안정성을 나타낸 그래프이다.

도 6는 초내열성 파이로코커스 퓨리오서스 유래 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈의 여러가지 기질에 대한 작용 결과를 보여주는 박막크로마토그라피 분석 결과이다.

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 초내열성 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈 및 이의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 pH 5.0 내지 9.0 및 온도 70 내지 105℃에서 효소 활성을 갖는 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈에 관한 것이다.

[종래기술]

사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈는 전분에 단독으로 작용하여 α-1,4 결합을 분해 및 생성하여 말토올리고당과 포도당 6-8개로 이루어진 환상의 덱스트린(cyclodextrin)을 생성하는 효소로, α-아밀레이즈와 유사한 작용기작(전분의 점도 저하 및 요오드반응의 감소)과 전달효소의 역할을 포함하고 있다. 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈는 전분 이외에 적당한 수용체가 존재하면 분자간 전달반응으로 사이클로덱스트린을 개열하여 그 분해생성물을 수용체의 4번 탄소 -OH기에 전달시킴으로써 α-1,4 결합을 생성한다(커플링 반응). 상기 효소를 이용하여 생산된 사이클로덱스트린의 분자 내부에는 소수성을, 외부에는 친수성을 나타내는 분자구조를 가져 소수성 유기화합물을 분자내의 동공에 취하여 포접할 수 있으며, 이러한 특성을 통해서 휘발성 물질의 불활성화, 산화 및 광분해성 물질의 안정화, 반응성의 변화 등의 기능을 나타낼 수 있다. 또한 커플링 반응에 의해서 생성된 물질은, 특유의 보습성으로 인하여 전분의 노화를 방지함으로써, 빵 등의 식품에 유용하게 이용되고 있다.

그러나, 기존에 공지된 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈는 효소의 최적 반응온도가 40 내지 60℃에 불과하여 고온에서의 효소 반응을 기대하긴 어려운 실정이다. 특히 노보자임 사(Novozymes)에서 생산하는 산업적으로 널리 이용되고 있는 토루자임(Toruzyme) 3.0L의 경우에도, 상기 효소가 유래된 미생물이 생육온도가 40 내지 75℃이고, 효소의 최적온도가 80 내지 90℃에 불과한 실정이다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 신규한 초내열성 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈 생산방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈를 생산하는 형질전환체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈를 이용한 당전이 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)에서 유래된 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈를 제공한다.

또한 본 발명은 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)에서 유래 된 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈를 전분에 접촉시키고, pH 5.0 내지 9.0 및 온도 70 내지 105℃에서 반응시켜 말토 올리고머, 사이클로덱스트린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 당화합물을 제조하는 것을 포함하는 당화합물 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (a)파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)에서 유래된 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈를 코딩하는 DNA 서열을 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; (c) 상기 형질전환체를 배양하여 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈를 생산하는 단계를 포함하는 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈 생산방법을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 2의 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈를 생산하는 Escherichia coli MC1061/PFCGT(KCTC 10711BP)을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)에서 유래된 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈에 관한 것으로, 상기 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈는 내열성이 우수한 효소이다.

본 발명에 따른 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, 약 80874.55 Da의 분자량을 갖는다.

본 발명의 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈는 pH 5.0 내지 9.0 및 온도 70 내지 105℃에서 효소 활성을 갖으며, 바람직하기로는 pH 5.8 내지 5.5 이고 온도는 85 내지 95 ℃이다.

본 발명에 따른 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈는 전분을 가수분해하여, 직쇄상의 말토스와 글루코스등의 말토올리고당 및 포도당 6 내지 8개로 이루어진 환상의 덱스트린(cyclodextrin)을 생성한다. 상기 효소의 기질에 작용하는 반응메카니즘은 하기 반응식 1과 같다.

본 발명의 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈의 염기서열은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 일예로 서열번호 1일 수 있다.

본 발명의 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈는 유전공학적인 방법으 로 원핵생물, 진핵생물 또는 진핵생물에서 유래된 진핵세포로부터 용이하게 생산할 수 있다. 일예로 본 발명에서는 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈의 생산방법을 제공한다.

사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈의 생산방법은 (a) 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)에서 유래된 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈를 코딩하는 DNA 서열을 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; (c) 상기 형질전환체를 배양하여 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈를 생산하는 단계를 포함한다.

상기 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈의 생산방법은 통상의 공지된 방법으로 용이하게 제조할 수 있으며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 자명한 것이다.

상기 (a) 단계에서, 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈를 코딩하는 서열은 통상의 발현용 벡터, 예컨대 p6xHTKNd 벡터(프로모터: pBLMA, 전사종결인자: Termination codon, 선별마커: 카나마이신 저항성 유전자)에 삽입하여 재조합 벡터를 제조한다. 상기 발현용 벡터는 숙주세포의 종류에 따라 적합한 벡터를 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명에서는 일실시예로 도 1의 DNA 개열지도를 갖는 p6xHTKNdCGT 벡터를 제조하였다.

상기 (b) 단계는 형질전환하는 단계로, 숙주세포는 원핵생물, 진핵생물 또는 진핵생물 유래 세포일 수 있으며, 예컨대 대장균, 유산균, 효모, 곰팡이 등이 있으 나, 이에 한정되는 것은 아니다. 형질전환방법은 통상의 공지방법으로 용이하게 실시할 수 있다.

상기 (c) 단계는 형질전환체를 배양하는 단계로, 숙주세포에 따라 적합한 배지를 선택할 수 있으며, 배양 조건 역시 숙주세포에 따라 달리 적용할 수 있다. 본 발명의 일실시예로 제조한 Escherichia coli MC1061/PFCGT는 2004년 10월 25일자로 대한민국 대전광역시 유성구 어은동에 소재한 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 10711BP를 부여받았다. 상기 Escherichia coli MC1061/PFCGT(KCTC 10711BP)는 에탄올이 1 내지 5 %로 첨가된 LBK배지(1% Bacto-Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 최종농도 10 ㎍/ml의 가나마이신)에서 배양하며, 25 내지 35℃에서 20 내지 24 시간 배양하여 다량의 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈를 생산할 수 있다.

또한 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈의 생산방법은 상기 (c) 단계이후에, 형질전환체 균체로부터 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈를 정제하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 정제단계는 형질전환체 균체를 파쇄한 후 이를 이온교환 크로마토그래피를 실시하는 것으로, 예컨대 Q-세파로즈 크로마토그래피, DEAE-toyopearl 크로마토그리피 및 GPC(gel permeation chromatography)순으로 실시하며, 50 mM의 pH 7.5 트리스 완충용액과 여기에 1M의 소디움 클로라이드를 첨가한 용매를 이용하여, 용출 정제할 수 있다.

상기한 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈 생산방법은, 모균주를 이용한 생산방법에 비하여 배양온도를 낮추어 실시하므로써 미생물 배양비용을 줄일 수 있는 효과가 있으며 또한 효소의 생산성을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈는 반응 최적온도가 매우 높고, 열안정성이 우수하며, 고온에서 효소반응이 가능하여 고농도의 기질에 작용할 수 있는 장점이 있다. 또한 상기 효소의 최적 작용 pH이 기존의 α-아밀레이즈나 내열성 α-글루코시데이즈와 유사하여 이들 효소와 함께 사용하는 경우, 반응조건의 조절이 매우 용이하다.

또한 본 발명은 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈를 전분에 반응시켜 말토올리고당, 사이클로덱스트린 또는 이들의 혼합물을 제조하는 당화합물 제조방법에 관한 것으로, 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈는 가용성 전분 100 mg당 0.5 내지 1 Unit로 혼합할 수 있으며, 반응온도는 70 내지 105℃, 바람직하기로는 85 내지 95℃일 수 있다. 또한 반응시 용매는 소디움 아세테이트 완충용액 또는 소디움 시트레이트 완충용액일 수 있으며, pH는 5.0 내지 9.0일 수 있다.

본 발명에 따른 파이로코커스 퓨리오서스의 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈는, pH 5.0 내지 9.0 및 온도 70 내지 105℃에서 효소 활성을 나타내어, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 기존의 다른 효소에 비해서 내열성이 우수하여 고온에서 사용가능하다는 장점이 있어, 고온 조작이 요구되는 식품산업에 용이하게 활용될 수 있다.

미생물	생장 온도(℃)	최적 pH	최적 온도 (℃)
Klebsiella pneumoniae	37	6.9	40
Bacillus macerans	30 - 45	5.2 - 5.7	55
Bacillus circulans	30 - 45	5.5	60
Bacillus stearothermophilus	65	6.0	60
Thermoanaerobacter (Toruzyme^TM3.0L, Novo)	40 - 75	5.0 - 5.5	85
Pyrococcus furiosus	70 - 103	5.0 - 9.0	90 - 95

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 내열성 파이로코커스 퓨리어서스 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈 유전자를 포함하는 형질전환체의 제조

파이로코커스 퓨리오서스 DSM 3638의 염색체 DNA는 North Carolina 주립대학 (Raleigh, NC)의 A. M. Grunden 박사로부터 제공받아서 사용하였다.

내열성 파이로코커스 퓨리오서스 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈의 유전자를 분리하기 위하여 PFCGT-Fco(서열번호 3) 및 PFCGT-Rxo(서열번호 4)의 프라이머를 제조하고 파이로코커스 퓨리어서스 DSM 3638의 염색체 DNA에 대하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하여 약 2.1 kb의 생성물을 얻었다. 증폭된 유전자 절편을 NcoI과 XhoI로 처리하고, 이를 NcoI과 XhoI로 처리한 p6xHTKNd 벡터와 라이게이션하여 p6xHTKNdCGT를 제조하였다. 도 1에 p6xHTKNdCGT의 벡터 맵을 간략히 도시하였다.

형질전환을 위하여, LB 배지 5 ml에 숙주세포인 E.coli MC1061을 접종하여 37℃에서 12 시간 배양한 다음 배양액 1.0 ml을 새로운 LB 배지 50 ml에 접종하고 600 nm에서 흡광도가 0.5가 될 때까지 배양하였다. 배양액 1.5 ml를 4℃에서 7000 x g로 5분간 원심 분리하여 균체를 회수한 뒤 0.75 ml의 형질전환용액 1을 넣고 균체를 현탁하여 얼음 속에서 30분간 방치하였다. 4℃에서 6000 x g로 2분간 원심 분리하여 균체를 다시 회수하였다. 회수된 균체에 0.15 ml의 형질전환용액 2를 넣고 균체를 현탁시킨 다음 얼음 속에서 30 분간 방치하였다. 현탁액 0.15 ml와 500 ng의 상기 라이게이션한 용액을 혼합하고, 얼음 속에서 1 시간 방치한 후 42℃에서 2 분간 열충격을 주었다. 여기에 1 ml의 LB 배지를 넣고 37℃에서 1 시간 배양시킨 다음 1.5%의 한천이 함유된 LBK 고체 배지에 도말하여 가나마이신에 대해 내성을 보이는 균주를 선별하여 형질전환체를 1차 선별하였다.

1차 선별된 형질전환체를 LB 배지 5 ml에 접종하여 37℃에서 12 시간 배양한 다음 원심 분리하여 균체를 얻었다. 회수한 균체는 pH 7.5의 50 mM 트리스 완충용액으로 현탁시킨 다음 초음파로 파괴한 뒤 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액의 효소 역가를 측정하여 활성을 보이는 균주를 내열성 파이로코커스 퓨리오서스 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈 생산균주(Escherichia coli MC1061 /PFCGT)로 최종 선발하였다.

실시예 2: 내열성 파이로코커스 퓨리어서스 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈 유전자 염기서열 분석

실시예 1에서 선발한 균주(Escherichia coli MC1061 /PFCGT)로부터 p6xHTKNdCGT를 분리하여, 이의 염기서열을 ABI377 PRISM 자동 서열분석기(Perkin-Elmer Co)로 분석하여, 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈 유전자가 성공적 으로 삽입되어 있음을 확인하였다.

실시예 3: 내열성 파이로코커스 퓨리어서스 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈의 정제

(3-1) 효소의 정제

내열성 파이로코커스 퓨리오서스 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈 생산균주(Escherichia coli MC1061/PFCGT)를 3% 에탄올이 첨가된 LBK 배지에 접종하여 30℃에서 72시간 배양하고, 원심분리하여 균체를 얻었다. 회수한 균체를 pH 7.5의 50 mM 트리스 완충용액으로 현탁시킨 다음 초음파로 파괴한 뒤 원심 분리하여 상등액을 취하였다. 발현된 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈를 이온교환수지를 이용한 크로마토그라피를 이용하여 정제하였다. 크로마토그래피는 Q-세파로즈, DEAE-toyopearl 및 GPC(gel permeation chromatography)순으로 실시하였다.

(3-2) 정제도 확인

SDS-PAGE를 이용하여 상기에서 제조된 내열성 파이로코커스 퓨리오서스 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈의 발현율 및 정제도를 확인하였다. 도 2는 Escherichia coli MC1061/PFCGT로부터 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈 정제단계별 시료의 전기영동 사진으로, M은 사이즈 마커이고, C는 초음파 처리한 것이고, H는 열처리한 것이고, Q는 Q-세파로즈로 정제한 것이고, D는 DEAE-toyopearl로 정제한 것이고, G는 GPC로 정제한 것이다. 도 2에서 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈가 정제과정을 거치면서 높은 수율로 정제됨을 확인할 수 있다.

실시예 4: 내열성 파이로코커스 퓨리어서스 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈의 효소적 특성

(4-1) 효소역가 측정

가수분해 역가는 효소액 0.05 ml에 pH 5.0의 50 mM 소디움 아세테이트 완충용액 0.1 ml와 1%(w/v)의 가용성전분 용액 0.15 ml를 넣은 후 90℃에서 10 분간 반응시키고, DNS(Dinitrosalicylic acid) 용액을 넣어 반응을 중단시킨 뒤 5 분간 끓여 발색시켜 575 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 흡광도는 말토오스 표준 곡선과 비교하여 분당 1 mmole의 말토스를 생산하는 효소량을 1 Unit(단위)로 정하였다.

(4-2) 온도 특성

효소의 작용 최적온도를 알아보기 위해, 1% 가용성 전분을 기질로 함유하는 pH 5.0의 50 mM 소디움 아세테이트 완충용액 0.15ml에, 기질을 함유하지 않는 동일한 완충용액 0.10ml을 섞어 각 반응온도에서 예열시킨 후, 실시예 3에서 얻은 효소액 0.05ml 넣고 효소역가를 측정하였다.

도 3은 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈의 반응온도에 따른 활성을 도시한 것으로, 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈는 약 90 ℃에서 100%의 활성을 나타내었으며, 70 내지 100 ℃에서 약 50% 이상의 활성을 유지하였다.

(4-3) pH 특성

사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈 활성에 대한 pH의 영향을 알아보 기 위하여, pH를 달리한 완충용액 0.10 ml과 1% 가용성 전분을 포함하는 동일한 완충용액 0.15ml을 섞어 90℃에서 예열시킨 후, 실시예 3에서 얻은 효소액을 각각 0.05ml을 첨가하여 10분간 반응시켜 실시예 (4-1)에서 기재된 방법으로 효소활성을 측정하였다.

도 4는 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈의 pH에 따른 활성을 나타낸 것으로, 최적 pH는 약 5이며, 50% 이상의 활성을 유지하는 pH는 5.7 내지 6.5인 것으로 관찰되었다.

(4-4) 효소활성에 대한 열처리의 효과

효소 활성에 대한 열처리의 효과를 알아보기 위하여, 실시예 3에서 얻은 효소액을 각각의 온도에서 시간별로 열처리한 후, 원심분리하여 상등액을 취하였다. 1% 가용성 전분을 기질로 함유하는 pH 5.0의 50 mM 소디움 아세테이트 완충용액 0.15ml과 기질을 함유하지 않는 동일한 완충용액 0.10ml을 섞어 90℃에서 예열시킨 후, 상기 열처리한 효소액 0.05ml을 넣어 반응시켜 효소역가를 측정하였다.

도 5 및 표 2는 열처리한 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈의 효소활성을 나타낸 것이다. 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈가 열처리에 의하여 효소 역가가 절반으로 줄어드는데 걸리는 시간(t_1/2)이 85℃에서 142분, 90℃에서 85분, 95℃에서 46분으로, 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈의 내열성이 매우 우수함을 알 수 있다.

온도(℃)	85	90	95
t_1/2(분)	142	85	46

실시예 5: 기질에 대한 반응산물 분석

가용성 전분을 50mM 소디움 아세테이트 완충액에 녹인 후, 실시예 3에서 얻은 효소액을 첨가하여 90℃에서 각각 12시간 반응시켰다. 반응액은 박막크로마토그라피(Thin Layer Chromatoghy, TLC)상에 전개하여 반응산물을 분석하고자 하였다.

각 효소반응액은 왓트만(Whatman) K5F TLC 플레이트(20cmX20cm)에 1 mL씩 점적하고, 아이소프로필 알코올, 에틸 아세테이트, 증류수의 비가 3:1:1 (v/v/v)인 전개액으로 1회 전개시켰다. 플레이트는 잘 건조시킨 다음 메탄올에 0.3% (w/v) N-(1-나프틸)-에틸렌다이아민과 5% (v/v) 황산을 용해시킨 발색액에 담갔다 꺼낸 후 110 ℃ 오븐에서 10 분동안 발색시켰다.

도 6은 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈에 의한 전분 대사산물을 나타낸 것으로, MD는 말토덱스트린 표준물질이고, 1은 4% 가용성 전분과 효소 반응액 및 2는 1% 가용성 전분이다. 도 6에서, 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈가 전분에 작용하여, 직쇄상의 말토올리고당을 생산하고, 고농도의 전분(4%)과 반응하여 사이클로덱스트린을 형성시킴을 확인할 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 파이로코커스 퓨리오서스의 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈는 pH 5.0 내지 9.0 및 온도 70 내지 105℃에서 효소 활성을 나타내어, 기존의 다른 효소에 비해서 내열성이 우수하여 고온에서 사용가능하다는 장점이 있고, 고온 조작이 요구되는 식품산업에 용이하게 활용될 수 있다.

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY FOUNDATION <120> HYPERTHERMOPHILIC CYCLODEXTRIN GLUCANOTRANSFERASE FROM PYROCOCCUS FURIOSIS AND PRODUCTION METHOD THEREOF <130> dpp20044129 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2115 <212> DNA <213> PYROCOCCUS FURIOSIS <400> 1 atgggctatt atgttccaga gagaagtgtt atatatcaaa taatggtgga cagattttac 60 gatagaaacc caacaaataa cgaacccttc tatgatccag agaagaaaaa ctacaggctc 120 tattggggag gagacattga aggcatcata gagagacttg actatataga gagtctaggt 180 gtttcaatga tatggctttc accattaaac gacaacataa acagaatggc aggtggaagc 240 gctccttatc atgggtattg gccaagagac ttcaaaagga tagacgagca ctttggcacc 300 tgggaagact ttagaaggtt agtagaagaa gctaagaaaa gaggaatttg cataatagta 360 gactatgtcc ccaaccattc aaatccagca actgatgggg agtttggagc tttgtacgat 420 aatggaacat tagtgactaa ctactatgaa gacagaaaaa atgccacaag aaatccctat 480 actgcgagcc tggaaaacat ctatcaccac aatggcaaca taaacgattg gtttggcttt 540 cagcttaagt acgcaaatct ttttggattg gcagatttca accaaatgaa tgactttgtg 600 gataattatc ttaaagaagg ggcagcttta ttcgtgaaaa atggcgcttg tggatttaga 660 attgatgctg ttaagcatat agagctggga tggcttgaaa ccttctacct ttacctatat 720 caaatctcag atgaaccact ctttatctac ggagaatact ttgcaaacac tcctgacaaa 780 acgtttgacc tctatgagtt ctataggtac tcaaatgtat cttccctctt aaatatccca 840 attagagaat caattgcgag aacttttgca tatggaggaa gttttgagca gctagcaaag 900 atgttagagg agtattacag tttgttcgtt tatcccaaca agcagttgaa cttcttagac 960 agccatgatt tagttaggtt cctgaacatg aacccaaaca aagacaggta ccacatggcc 1020 ctcggattag taatgacact cccaggaatt cctgttatat attatggaga tgaaagctat 1080 ttagtgagta aggaagggaa gggagacccc tacaacagac caatgatggt ttttgataac 1140 tctactaagg ctgctgagat tataagaaag ctttcattgc taagaaaagt caacgatgcc 1200 cttgcttata gtgatttcag aaccgtatat gtggactaca acacatggat atttgagaga 1260 aagtttggaa gccacaagat attagttgct ctaaacaaag ggccagacaa aaacatcacg 1320 atttccctaa actggacaga tggaacatac atagacatca tcgaaggagc aattctcaaa 1380 gttaaagaag gtcagggtga gataaagcta cccagatatt cattttatgt ctttcatgta 1440 gaggaagaac agaaaacccc tctcatagga tctataactc catacatagc ccaacctggg 1500 caaaaaatcc ttatagccgg agcaggcctc aatggaaaca tcaaggtgta tataggaggt 1560 aggagagcaa gaattattga gaaagaagaa aattccatcc ttgtagaggt tcccgagatt 1620 aaaactatga atgcgtggat tcctgtttgg gttgttgtta atggaactag aagcaatgag 1680 gttaagctta ggtactattc tagcaatgat atcccagcac taatagtcct acaaggaaac 1740 tacactggtt acctttgggt caaggggaac ataccagaac tctcagagcc gagacccctc 1800 ttgaaatctc caacgggaca ctactttgcc gtggttcccc tccccagaaa caaaactttt 1860 acagttcaac tatataaggg acttccctgg gaacctctcc aaccaacaaa tgtcacgttg 1920 tatggaattg gaaataaaac agtaatattg aatgaagccg ctccagaaac tcctgtatgc 1980 ggcccaggaa ttgtcgcagt atttgcactt ctcccattgt taaaaagaaa aaagaaaaag 2040 tcacccaaca ccacaataac tccatacgga gtacccatag tagccgttag ctggatcgtg 2100 aggtggtgcc tctag 2115 <210> 2 <211> 704 <212> PRT <213> PYROCOCCUS FURIOSIS <400> 2 Met Gly Tyr Tyr Val Pro Glu Arg Ser Val Ile Tyr Gln Ile Met Val 1 5 10 15 Asp Arg Phe Tyr Asp Arg Asn Pro Thr Asn Asn Glu Pro Phe Tyr Asp 20 25 30 Pro Glu Lys Lys Asn Tyr Arg Leu Tyr Trp Gly Gly Asp Ile Glu Gly 35 40 45 Ile Ile Glu Arg Leu Asp Tyr Ile Glu Ser Leu Gly Val Ser Met Ile 50 55 60 Trp Leu Ser Pro Leu Asn Asp Asn Ile Asn Arg Met Ala Gly Gly Ser 65 70 75 80 Ala Pro Tyr His Gly Tyr Trp Pro Arg Asp Phe Lys Arg Ile Asp Glu 85 90 95 His Phe Gly Thr Trp Glu Asp Phe Arg Arg Leu Val Glu Glu Ala Lys 100 105 110 Lys Arg Gly Ile Cys Ile Ile Val Asp Tyr Val Pro Asn His Ser Asn 115 120 125 Pro Ala Thr Asp Gly Glu Phe Gly Ala Leu Tyr Asp Asn Gly Thr Leu 130 135 140 Val Thr Asn Tyr Tyr Glu Asp Arg Lys Asn Ala Thr Arg Asn Pro Tyr 145 150 155 160 Thr Ala Ser Leu Glu Asn Ile Tyr His His Asn Gly Asn Ile Asn Asp 165 170 175 Trp Phe Gly Phe Gln Leu Lys Tyr Ala Asn Leu Phe Gly Leu Ala Asp 180 185 190 Phe Asn Gln Met Asn Asp Phe Val Asp Asn Tyr Leu Lys Glu Gly Ala 195 200 205 Ala Leu Phe Val Lys Asn Gly Ala Cys Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val 210 215 220 Lys His Ile Glu Leu Gly Trp Leu Glu Thr Phe Tyr Leu Tyr Leu Tyr 225 230 235 240 Gln Ile Ser Asp Glu Pro Leu Phe Ile Tyr Gly Glu Tyr Phe Ala Asn 245 250 255 Thr Pro Asp Lys Thr Phe Asp Leu Tyr Glu Phe Tyr Arg Tyr Ser Asn 260 265 270 Val Ser Ser Leu Leu Asn Ile Pro Ile Arg Glu Ser Ile Ala Arg Thr 275 280 285 Phe Ala Tyr Gly Gly Ser Phe Glu Gln Leu Ala Lys Met Leu Glu Glu 290 295 300 Tyr Tyr Ser Leu Phe Val Tyr Pro Asn Lys Gln Leu Asn Phe Leu Asp 305 310 315 320 Ser His Asp Leu Val Arg Phe Leu Asn Met Asn Pro Asn Lys Asp Arg 325 330 335 Tyr His Met Ala Leu Gly Leu Val Met Thr Leu Pro Gly Ile Pro Val 340 345 350 Ile Tyr Tyr Gly Asp Glu Ser Tyr Leu Val Ser Lys Glu Gly Lys Gly 355 360 365 Asp Pro Tyr Asn Arg Pro Met Met Val Phe Asp Asn Ser Thr Lys Ala 370 375 380 Ala Glu Ile Ile Arg Lys Leu Ser Leu Leu Arg Lys Val Asn Asp Ala 385 390 395 400 Leu Ala Tyr Ser Asp Phe Arg Thr Val Tyr Val Asp Tyr Asn Thr Trp 405 410 415 Ile Phe Glu Arg Lys Phe Gly Ser His Lys Ile Leu Val Ala Leu Asn 420 425 430 Lys Gly Pro Asp Lys Asn Ile Thr Ile Ser Leu Asn Trp Thr Asp Gly 435 440 445 Thr Tyr Ile Asp Ile Ile Glu Gly Ala Ile Leu Lys Val Lys Glu Gly 450 455 460 Gln Gly Glu Ile Lys Leu Pro Arg Tyr Ser Phe Tyr Val Phe His Val 465 470 475 480 Glu Glu Glu Gln Lys Thr Pro Leu Ile Gly Ser Ile Thr Pro Tyr Ile 485 490 495 Ala Gln Pro Gly Gln Lys Ile Leu Ile Ala Gly Ala Gly Leu Asn Gly 500 505 510 Asn Ile Lys Val Tyr Ile Gly Gly Arg Arg Ala Arg Ile Ile Glu Lys 515 520 525 Glu Glu Asn Ser Ile Leu Val Glu Val Pro Glu Ile Lys Thr Met Asn 530 535 540 Ala Trp Ile Pro Val Trp Val Val Val Asn Gly Thr Arg Ser Asn Glu 545 550 555 560 Val Lys Leu Arg Tyr Tyr Ser Ser Asn Asp Ile Pro Ala Leu Ile Val 565 570 575 Leu Gln Gly Asn Tyr Thr Gly Tyr Leu Trp Val Lys Gly Asn Ile Pro 580 585 590 Glu Leu Ser Glu Pro Arg Pro Leu Leu Lys Ser Pro Thr Gly His Tyr 595 600 605 Phe Ala Val Val Pro Leu Pro Arg Asn Lys Thr Phe Thr Val Gln Leu 610 615 620 Tyr Lys Gly Leu Pro Trp Glu Pro Leu Gln Pro Thr Asn Val Thr Leu 625 630 635 640 Tyr Gly Ile Gly Asn Lys Thr Val Ile Leu Asn Glu Ala Ala Pro Glu 645 650 655 Thr Pro Val Cys Gly Pro Gly Ile Val Ala Val Phe Ala Leu Leu Pro 660 665 670 Leu Leu Lys Arg Lys Lys Lys Lys Ser Pro Asn Thr Thr Ile Thr Pro 675 680 685 Tyr Gly Val Pro Ile Val Ala Val Ser Trp Ile Val Arg Trp Cys Leu 690 695 700 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tttcccaggt ccatgggcta ttatgttcca 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agtagcggat ggctcgagct agaggcacca 30

Claims

파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)에서 유래되며, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈(Cyclodextrin glucanotransferase).
파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)에서 유래되며, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈를 전분에 접촉시키고, pH 5.0 내지 9.0 및 온도 70 내지 105℃에서 반응시켜 말토 올리고머, 사이클로덱스트린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 당화합물을 제조하는 것을 포함하는 당화합물 제조방법.
제 2항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 뉴클레오타이드에 의해서 암호화되는 것인 제조방법.
(a) 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)에서 유래되며, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈를 코딩하는 DNA 서열을 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계;

(b) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;

(c) 상기 형질전환체를 배양하여 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈를 생산하는 단계;

를 포함하는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈 생산방법.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈를 생산하는 Escherichia coli MC1061/PFCGT(KCTC 10711BP).