KR100370882B1 - 서머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래 재조합 효소 및이를 이용한 알파-1,4-아밀로오스 제조방법 - Google Patents

서머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래 재조합 효소 및이를 이용한 알파-1,4-아밀로오스 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서머스 칼도필러스 지케이24(Thermus caldophilusGK24) 균주 유래의 재조합 효소 및 이를 이용한 알파-1,4-아밀로오스(α-1,4-amylose) 제조방법에 관한 것으로, 본 발명은 상기 균주 유래 내열성 글루코실 트랜스퍼라아제를 암호화하는 유전자가 도입된 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주로부터 글루코실 트랜스퍼라아제를 제조하고 당 핵산염으로부터 당전이 반응을 촉매하여 알파-1,4-아밀로오스를 대량 생산하는데 뛰어난 효과가 있다.

Description

서머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래 재조합 효소 및 이를 이용한 알파-1,4-아밀로오스 제조방법{Recombinant enzyme from Thermus caldophilus GK24 and process for preparation of α-1,4-amylose using the same}
본 발명은 서머스 칼도필러스 지케이24(Thermus caldophilusGK24) 균주로부터 유래한 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제 및 이를 이용한 알파-1,4-아밀로오스 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 서머스 칼도필러스 지케이24로부터 유래된 글루코실 트랜스퍼라아제를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 대장균으로부터 얻은 재조합 내열성 글루코실 트랜스퍼라아제를 이용한 알파-1,4-아밀로오스 제조방법에 관한 것이다.
글리코겐은 포도당 단위가 알파-1,4 결합에 의해 연결된 다당류가 알파-1,6 결합에 의해 사슬로 연결된 구조로 많은 세균이나 진핵생물체에 존재하며, 주요한 탄수화물 에너지 저장형태이다. 이러한 세균내 글리코겐은 과량의 탄소 존재하에서 제한된 성장 조건의 결과로서 축적된다. 또한 글루코스-1-포스페이트(glucose-1-phosphate)으로부터 글리코겐(glycogen)의 합성은 3종류의 효소, 즉 ADP-글루코스 파이로포스포릴라아제(ADP-glucose pyrophosphorylase), 글루코실 트랜스퍼라아제(glucosyl transferase), 브랜칭 효소(branching enzyme)에 의해 촉매 되며 그 반응식은 하기와 같다.
ATP + α-glucose-1-P ↔ ADP-glucose + PPi ADP-glucose + α-glucan → α-1,4-glucosyl-glucan + ADP
α-1,4-glucosyl-glucan → glycogen(α-1,4 / α-1,6-glucan)
한편, 글루코실 트랜스퍼라아제는 ADP-글루코스 또는 UDP-글루코스를 주게 분자로 하여 α-1,4-글루칸 또는 말토덱스트린 사슬로 글루코스를 전이한다 (ADP-glucose: 1,4 α-D-glucan 4-α glucosyl transferase). 이 효소는 대장균(E.coli), 바실러스 (Bacillus)종 등을 포함한 세균과 포유동물에 존재하며, 촉매작용에 있어서 유사성을 나타낸다. 또한 당 핵산염으로부터 글리코겐의 비환원당 부분으로 글루코스를 전이하는 반응을 촉매 하는 효소로써, 포도당(글루코스) 주게 분자의 특이성에 따라 두 개의 그룹으로 분류된다.
대장균을 포함한 세균과 고등식물체(starch synthase)에 존재하는 효소들은 ADP-글루코스를 포도당(글루코스) 주게 분자로 사용하고, 분자량이 49 kD-58 kD 정도이고, 30% 정도의 아미노산 유사성을 나타낸다. 포유동물과 효모에서는 UDP-글루코스를 포도당(글루코스) 주게 분자로 사용하고, 78 kD-85 kD 정도의 분자량을 가지며, 50% 정도의 아미노산 유사성을 보여준다. 돌연변이를 이용한 아미노산 기능연구 결과에 의하면, 촉매활성 및 기질결합 부위는 Lys-X-Gly-Gly중에서 Lys-15는 ADP-글루코스에서 글루코스 가까이 있는 인산기에 이온결합을 통해 결합하며, Gly-17은 활성부위의 구조변형을 유도하고 전이상태를 안정화시키므로 직접적으로 촉매작용에 관여한다고 밝혀졌다. 또한 활성부위에 있는 Lys277은 기질과의 결합보다는 촉매작용에 관여한다 (Furukawa, K. et al.:J.Biol. Chem.,269(2), 868~871). 전분의 생물전환 산업에 있어서 이러한 효소들에 의한 공정이 개발되고, 새로운 적용 가능성을 탐색하기 위한 많은 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 고호열성 미생물이 생산하는 내열성 효소들은 기초 및 응용 연구에 있어서 관심의 대상이며, 이들의 산업적 적용 가능성이 크다.
그러나 아직까지 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제와 ADP-글루코스 파이로포스포릴라아제의 복합작용에 의해 알파-1,4-아밀로오스를 대량 생산하는 방법은 없었다. 따라서 본 발명자들은 고호열성 미생물 균주로부터 유래된 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제를 이용한 알파-1,4-아밀로오스 제조 방법을 개발하고자 연구한 결과, 서머스 칼도필러스 지케이24로부터 글루코실 트랜스퍼라아제 유전자를 분리한 후, 염기서열을 암호화하여 재조합 발현 벡터를 구축하고 IPTG(isopropyl β-D-thiogalactopyranoside)를 이용하여 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제의 발현을 유도하여 정제하였으며 효소 활성을 확인하고, 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제와 ADP-글루코스 파이로포스포릴라아제-중합효소와의 복합작용에 의해 알파 아밀로오스를 대량 생산함으로서 본 발명을 완성하였으며 상기 생산된 알파 아밀로오스는 식품, 화학 및 의약 산업에서 환형덱스트린 생성의 전구물질로써 유용하다.
따라서, 본 발명의 목적은 내열성 글루코실 트랜스퍼라아제의 유전자를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 형질 전환된 재조합 균주를 배양하여 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제의 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 ADP-파이로포스포릴라아제와 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제의 공동작용에 의한 알파 아밀로오스를 대량 생산함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 서머스 칼도필러스 지케이24 균주로부터 글루코실 트랜스퍼라아제 유전자를 확인하고, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)을 이용하여 얻은 유전자를 대장균에 형질 전환시킨 후 상기 재조합 플라스미드를 분리하여 글루코실 트랜스퍼라아제 유전자의 염기서열을 결정한 후 재조합 발현벡터를 제작하고, 이 발현벡터로 형질 전환된 균주를 제조하고, 이 균주를 배양하여 글루코실 트랜스퍼라아제를 생산한 후, 분리 정제하여 상기 효소와 ADP-글루코스 파이로포스포릴라아제와의 공동작용에 의해 알파 아밀로오스를 대량 생산함으로 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성을 설명한다 .
도 1은 본 발명에서 서머스 칼도필러스 지케이24(Thermus caldophilusGK24) 균주로부터 유래한 내열성 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제와 ADP-글루코스 파이로포스포릴라아제를 사용하여 알파-1,4-아밀로오스 합성결과에 대한 분석도이다.도 2는 서머스 칼도필러스 지케이24 균주로부터 유래한 내열성 글루코실 트랜스퍼라아제의 효소활성에 대한 온도의 영향을 나타낸 그래프이다.도 3은 서머스 칼도필러스 지케이24 균주로부터 유래한 내열성 글루코실 트랜스퍼라아제의 효소활성에 대한 pH의 영향을 나타낸 그래프이다.도 4은 서머스 칼도필러스 지케이24 균주로부터 유래한 내열성 글루코실 트랜스퍼라아제의 당 기질에 따른 당전이 반응의 결과 분석도이다.
도 5는 서머스 칼도필러스 지케이24 균주로부터 유래한 내열성 글루코실 트랜스퍼라아제의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 유전자 염기서열이다.도 6은 서머스 칼도필러스 지케이24 균주로부터 유래한 내열성 ADP-글루코스 파이로포스포릴라아제의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 유전자 염기서열이다. 도 7은 글루코실 트랜스퍼라아제들간의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이다.
도 8은 서머스 칼도필러스 지케이24 균주로부터 유래한 재조합 내열성 글루코실 트랜스퍼라아제의 전기영동 결과이다.
본 발명은 서머스 칼도필러스 지케이24 균주로부터 분리한 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제의 분자량을 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동으로 결정하고, 상기 효소의 최적 반응온도 및 열안정성, 최적 pH와 pH 안정성을 결정하며 효소 활성 및 효소의 기질 특이성을 측정하는 단계; 상기 효소 유전자의 염기서열을 결정하는 단계; 상기 결정된 유전자 염기서열을 플라스미드 벡터에 결합시킨 후 재조합 벡터로 대장균을 형질전환시켜 재조합 대장균을 제조하는 단계; 상기 재조합 대장균을 배양하여 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 재조합 글루코스 트랜스퍼라아제액을 ATP, 글루코스-1-포스페이트, 말토올리고당과 반응시켜 알파-1,4-아밀로오스를 대량 생산하는 것을 포함하는 단계들로 구성된다.서머스 칼도필러스 지케이24는 내열성 균주로 이로부터 내열성 단백질 분해효소 및 풀루란아제 등이 이미 분리·정제되어 보고된 바 있다(Taguchi, H. et al., J. Biochem., 93, 7-13, 1983; 대한민국 특허출원 제95-43764호).
상기의 유전자 조작 등과 관련된 실험방법은 문헌(Sambrook, J. et al.:Molecular Cloning. A laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York., 1989; Ausubel, F. et al.:Short Protocols in Molecular Biology. 3rd. John Wiley Sons, Inc., 1995)에 기술된 공지 방법을 따랐다. 호열성 미생물인 서머스 칼도필러스 지케이24 균주(Kwon S. T. et al.:Mole. Cells, 7, 264∼271(1997); Park, J. et al.:Eur. J. Biochem., 214, 135-140(1993); Taguchi, H. et al.:J. Biochem., 93, 7∼13(1983))를 배양한 후 코스미드 라이브러리(cosmid library)로부터 ADP-글루코스 파이로포스포릴라아제(Ko et al.;Biochem. J., 319, 977~983)의 유전자를 프로브로하여 ADP-글루코스 파이로포스포릴라아제를 포함하는 코스미드를 선택하였다.본 발명에서 사용된 ADP-글루코스 파이로포스포릴라아제는 공개특허공보 제1998-035102호(1998.08.05)에서 공개된 서머스 칼도필러스로부터 생산되는 내열성 ADP-글루코스 파이로포스포릴라아제의 제조방법에 의하여 제조되었다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만,본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 서머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제의 특성
서머스 칼도필러스 지케이24 균주로부터 유래한 효소를 전기영동법에 의하여 분자량 분석을 실시하였다. 분자량을 공지의 방법(Lammli,U.K.:Nature, 227, 680~685(1970))과 같은 변성 조건인 12.5% SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동(SDS-PAGE, SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)을 이용하여 분석하였으며, 분자량 크기 마커(Pharmacia LKB)를 표준 단백질로 사용하였다. 또한 이 효소의 최적 반응 온도 는 각기 다른 온도에서 1시간 효소반응을 시킨 후 효소활성을 측정하였다. 열안정성의 경우에는 각기 다른 온도에서 효소액을 1시간동안 처리한 후, 기질의 존재하에서 70℃로 1시간 효소반응을 시켰다. 최적 pH와 pH 안정성을 결정하기 위하여 각기 다른 pH의 완충용액하에서 70℃로 1시간 효소반응을 시켰다. 글루코실 트랜스퍼라아제의 효소 활성은 조합하여 20 mM 인산화 칼륨 완충용액(pH 7.0)하에서 70℃로 1시간 효소반응을 시켰다. 상기 반응액을 함유한 용기를 얼음에 집어 넣어 반응을 중지시키고 반응 혼합물을 HPLC에 삽입하여 분석하였다. HPLC의 경우, 효소 활성도는 70℃에서 1분당 1μmole의 ADP-글루코스 소모를 촉매 하는 효소의 양으로 정의하였다. 기질 특이성의 측정은 10 mM 말토올리고당 기질들을 포함한 20 mM 인산화칼륨 완충용액(pH 7.0)에서 정제된 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제를 사용하여 70℃에서 1시간 반응시킴으로써 수행하였다. 전이반응정도의 측정은 20 mM 인산화칼륨 완충용액(pH 7.0)에 각기 다른 농도별로 받게 분자인 말토펜토오스와 주게 분자인 ADP-글루코스의 혼합물로서 70℃에서 24시간 반응시킴으로써 수행하였다. 반응을 중지시키기 위하여 반응 혼합물을 10분간 끓이고 원심분리하였다. 기질의 가수분해 및 당전이반응의 당산물은 다이오넥스사의 HPAEC-PAD(Dionex high performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detector)와 카보팩 피에이-1 컬럼(Dionex CarboPac PA-1, 0.4 X 25 cm)을 사용하여 유속 1 mL/min로 140 mM (또는 100 mM) 수산화 나트륨 및 0mM 내지 300 mM(또는 100-500mM) 아세트산 나트륨 농도 기울기로 분석하였다.
실험 결과, 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제의 분자량은 50 kDa였으며, 효소 반응의 최적 온도는 도 2에 나타낸 바와 같이 80℃이며 90℃이하에서 열안정성을 보여주었다. 상기 효소의 최적 pH는 도 3에 나타낸 바와 같이 7.0이며, pH 6.0 ∼ 8.5에서 pH 안정성을 보여주었다. 기질 특이성은 다양한 기질에 대한 상대적 전이 정도에 따라 표1, 2와 도 4에 나타내었다. 이 효소는 대장균(E.coli)을 포함한 세균과 고등식물체(starch synthase)에 존재하는 효소들처럼 ADP-글루코스를 포도당(글루코스) 주게 분자로 사용하는 그룹에 속함을 알 수 있었으며, 받게 분자로써 맥아당이 되어야만 ADP-글루코스로부터 전이되는 글루코스를 수용할 수 있었다. 상기의 내용에 있어서 본 발명에서의 서머스 칼도필러스 균주 유래 글루코실 트랜스퍼라아제는 신규한 효소이다.
서머스 칼도필러스 지케이24 유래 글루코실 트랜스퍼라아제의 기질 특이성
받게 분자` 주게 분자 상대적 포도당 전이율(%)
포도당(glucose) ADP-포도당(ADP-glucose) 0.0
맥아당(maltose) 〃 71.8
말토트라이오스(maltotriose) 〃 92.8
말토테트라오스(maltotetraose) 〃 82.6
말토펜토오스(maltopentaose) 〃 100
말토헥소오스(maltohexose) 〃 82.5
말토헵타오스(maltohexose) 〃 84.8
얼로오스(Erlose) 〃 51.0
멜리바이오스(Mellibiose) 〃 0.0
파노스(panose) 〃 0.0
셀로 바이오스셀로 트라이오스셀로 테트라오스셀로 펜타오스 〃 0.0
서머스 칼도필러스 지케이24 유래 글루코실 트랜스퍼라아제의 기질 특이성(II)
주게 분자 받게 분자 상대적 포도당 전이율(%)
말토헥소오스(maltohexose) ADP-포도당 100
〃 CDP-포도당 0.0
〃 GDP-포도당 0.0
〃 TDP-포도당 0.0
〃 UDP-포도당 0.0
〃 UDP-만노오스 0.0
〃 UDP-갈락토스 0.0
〃 UDP-자일로스 0.0
실시예 2 : 글루코실 트랜스퍼라아제 유전자의 발현벡터 제작, 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제의 발현
제 1 공정: 글루코실 트랜스퍼라아제 유전자의 발현벡터 제작
본 공정에서는 글루코실 트랜스퍼라아제 유전자의 코딩영역(ORF, open reading frame)에 해당되는 DNA를 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 증폭 및 회수하고, 단백질 발현용 플라스미드 벡터인 pKK223-3(Pharmacia)에 결합 및 발현용 숙주 대장균에 형질전환시켜 글루코실 트랜스퍼라아제 발현 재조합체를 제조하였다. 즉, 글루코실 트랜스퍼라아제 N-말단 유전자를 기초로 하여 새로이 제한효소EcoRI 절단부위와 전사개시 코돈 ATG를 포함하는 하기와 같은 PCR 프라이머를 사용하였다.
5'-GAATTCGTGATACGCGTGCTCCACCTGGCC-3'
또한, C-말단을 포함하는 하기와 같은 PCR 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써 1.3 kb에 해당하는 유전자를 증폭·분리하여 유전자의 염기서열을
5'-CCATCCTAGCCCAAGGCCTCCCGGTACACC-3'
결정하고 글루코실 트랜스퍼라아제 유전자의 존재를 확인하였다. 상기 증폭된 글루코실 트랜스퍼라아제 유전자 DNA를 제한효소EcoRI,PstI으로 처리하고 분리, 정제한 후 동일한 효소로 처리한 단백질 발현용 플라스미드 벡터 pKK223-3(Pharmacia)에 결합시켰다. 서로 결합되어 구성된 글루코실 트랜스퍼라아제 발현 플라스미드 pKKglgA를 발현 대장균(E. coliMV1184)에 형질전환시켜 글루코실 트랜스퍼라아제 발현 재조합체(E. coli: MV1184/pKKglgA)를 제조하였다. 염기서열 결정은 자동화 염기서열 결정기(AB1373A automatic DNA sequencer)를 사용하였다. 서열목록 1과 도 5에 나타낸 바와 같이 서머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제 유전자의 염기서열을 결정하였다. 이와 같이 결정된 아미노산과 DNA 염기서열에 의하면 서머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래 글루코실 트랜스퍼라아제는 438개의 아미노산으로 구성되고 효소 단백질 분자량은 50 kDa이며, 상기 효소의 유전자는 1317개의 염기로 구성되고 G+C의 구성비가 67.4%를 이루고 있다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 다른 종으로부터 분리된 글루코실 트랜스퍼라아제와 아미노산 서열을 비교해본 결과 써머토가 마리시마(Thermatoga maritima)와 38.0%, 바실러스 서틸러스(Bacillus subtilus)와 36%, 바실러스 스테아로서머필러스(bacillus stearothermophilus)와 37%, 대장균(Escherichia coli)와 37.3%, 헤모필러스 인풀루엔자(Haemophilus influenza)와 34.4%, 아그로박테리움 튜머페시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 34.7%의 상동성을 보여주었다 (Kiel,J. A. K. W. et al.:Mol. Microbiol., 11(1), 203-218; Furukawa, K. et al.:J. Biol. Chem. 269(2)). 서머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제는 상기와 같이 아미노산 서열에 있어서 상동성을 보여주며, 도 7에 도시한 바와 같이, 여러 군데의 보존구역을 가지고 있음을 알 수 있다.
상기 플라스미드 pKKg1gA를 함유한 재조합 대장균(MV1184/pKKglgA)은 생명공학연구소 부설 유전자은행에 2000년 6월 7일 기탁번호 KCTC 0797BP로서 기탁하였다.또한, 공개특허공보 제1998-035102호(1998.08.05)에서 공개된 서머스 칼도필러스로부터 유래되는 내열성 ADP-글루코스 파이로포스포릴라아제의 염기서열도 자동화 염기서열 결정기(AB1373A automatic DNA sequencer)를 사용하였고, 그 결과 서열목록 3에 나타내었다.
제 2 공정 : 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제의 발현 및 정제
클로닝된 글루코실 트랜스퍼라아제의 유전자를 발현시키기 위해, 대장균 (MV1184 /pKKglgA) KCTC 0797BP를 50 μg/mL의 앰피실린이 첨가된 LB 액체배지에 접종하여 대량 배양하였다. 37℃에서 3시간 배양한 후, 최종농도로 1 mM IPTG를 첨가하고 12시간 계속 배양하여 유전자의 발현을 유도하였으며, 발현율은 총 세포 단백질의 10%였다. 상기와 같이 배양한 균체를 원심분리하여 회수한 다음, 20 mM 인산화칼륨 완충용액(pH 7.0; 완충용액A)에 현탁시키고 초음파 세포파쇄기로 세포를 파쇄하였고, 파쇄된 상기 세포 용액을 4℃에서 12,500Xg로 30분간 원심분리하여 미파쇄 세포 및 불용성 세포 파쇄물을 제거한 효소액을 제조하였다. 상기 얻어진 수용성 상층 효소액만을 85℃에서 30분간 열처리하고 원심분리하여 대장균 유래 변성 단백질을 제거하였다. 상기 효소액을 12,500Xg로 30분간 원심분리하여 효소액만을 수득하였다. 상기 효소액에 무게 대 부피비로 50%되는 황산 암모늄을 4℃에서 서서히 첨가하면서 잘 교반하여 주었다. 상기 효소액을 12,500Xg로 30분간 원심분리하여 침전물만을 모아 상기 침전물을 완충용액 A에 녹이고 동일 완충용액에서 투석하였다. 상기 투석된 효소액을 다시 원심분리하여 불용성 물질을 제거한 다음 글루코실 트랜스퍼라아제의 정제에 사용하였다. 상기 효소액을 1 M 황산암모늄을 포함한 완충용액 A로 완충용액 교체를 마친 후 동일 완충용액으로 평형화된 소수성 수지 컬럼(Butyl-Sepharose column)에 통과시키고 세척하였다. 분리된 각각의 효소 분획들 중 효소활성이 있는 분획만을 모아 100 mM 염화나트륨을 포함한 완충용액 A로 완충용액 교체를 한 후 동일 완충용액으로 평형화된 젤 여과 수지 컬럼(Sephacryl S-200 column)에 통과시켜 효소 단백질을 분획하여 도 8과같이 순수하게 정제된 글루코실 트랜스퍼라아제를 수득하였다.
실시예 3: 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제에 의한 알파-1,4-아밀로오스 대량생산 방법
2.0 mM 말토올리고당(말토펜토오스, 말토헥소스, 말토헵토오스)을 받게분자로 하여 ATP, 글루코스-1-포스페이트기질들을 포함한 20 mM 인산화칼륨 완충용액(pH 7.0)에서 정제된 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제와 ADP-글루코스 파이로포스포릴라아제하에서 70℃에서 반응시킴으로써 알파-1,4-아밀로오스를 생산하였다. ADP-글루코스 파이로포스포릴라아제는 공개특허공보 제1998-035102호(1998.08.05)에서 공개된 서머스 칼도필러스로부터 생산되는 내열성 ADP-글루코스 파이로포스포릴라아제의 제조방법에 의하여 제조되었다.
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 서머스 칼도필러스 지케이24(Thermus caldophilusGK24)균주로부터 유래된 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제는 ADP-글루코스 파이로포스포릴라아제와의 복합반응으로 알파-아밀로오스를 대량 생산하는데 뛰어난 효과가 있을 뿐만아니라, 70~90℃의 고온에서 알파-아밀로오스를 효율적으로 제조할 수 있으므로 식품, 화학 및 생물 의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (8)

  1. 서머스 칼도필러스 지케이24(Thermus caldophilusGK24) 균주 유래의 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제를 암호화하는 서열목록 1에 기재된 유전자 염기서열.
  2. 서열목록 2에 기재된 아미노산 서열로 구성되는 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항 기재의 유전자 서열로 구성된 글루코실 트랜스퍼라아제 유전자를 플라스미드 pKK223-3에 결합시켜 제조한 재조합 벡터 pKKg1gA.
  6. 제 5항 기재의 재조합 벡터 pKKg1gA에 의해 형질전환된 대장균E.coliMV1184/pkkglgA (KCTC 0797BP).
  7. 삭제
  8. ATP와 글루코스-1-포스페이트를 포함한 20mM 인산화칼륨 완충용액에 2.0 mM 말토올리고당을 첨가하는 단계; 상기 말토올리고당이 첨가된 완충용액에 제 2항 기재의 재조합 글루코실 트랜스퍼라아제와 서열목록 4에 기재된 아미노산 서열로 구성된 ADP-글루코스 파이로포스포릴라아제를 첨가하고 반응시키는 단계를 포함하는 알파-1,4-아밀로오스 제조방법.
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