KR100266754B1 - Udp－xylosepyrophosphorylase의유전자염기서열,그발현벡터와재조합uxpase의생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고온성 균주인Thermus caldophilusGK24로부터 신규한 내열성 UDP-xylose pyrophosphorylase를 분리 정제하여 유전자의 염기서열을 결정하고, 결정된 염기서열에 해당하는 DNA를 발현벡터에 삽입하고 이 발현벡터로 대장균을 형질전환시켜 배양하므로써 UDP-xylose pyrophosphorylase를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 UDP-xylose pyrophosphorylase는 주반응으로 UDP-xylose를 합성하고 부반응으로 다양한 당 핵산염을 합성하는 효과가 있다.

Description

ＵＤＰ-ｘｙｌｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ의 유전자 염기서열, 그 발현벡터와 재조합 ＵＸＰａｓｅ의 생산방법 {Nucleotide sequence of UDP-xylose pyrophosphorylase, the expression vector and a process for preparation of recombinant UXPase}

본 발명은 주반응으로 UDP-xylose를 합성하며, 부반응으로서는 TDP-glucose, UDP-glucose, UDP-mannose, UDP-N-acetylglucosamine, UDP-galactose 등 다양한 당 핵산염을 합성하는 신규한 UDP-xylose pyrophosphorylase (UXPase)에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 고온성 박테리아인Thermus caldophilusGK24로부터 UXPase를 분리하고 그의 유전자 염기서열을 결정한 후, 발현벡터를 이용하여 대장균을 형질전환시켜 배양하므로써 신규한 내열성 UXPase를 용이하게 대량생산하는 방법에 관한 것이다.

지금까지 알려진 당 핵산염 합성효소 중에는 UDP-xylose만을 주반응으로 합성하는 효소는 알려져 있지 않고 단지 부반응으로서만 촉매하는 것으로 알려져 있다.(Szumilo, T., Richard, R.D., York, J.L. and Elbein, A.D. GDP-Mannose Pyrophosphorylase; Purification to homogeneity, Properties, and utilization to prepare photoaffinity analogsJ.Biol. Chem. (1993) 17943-17950., Lee, L., Kimura, A. and Tchokura, T. (1979) Purification and Properties of UDP-glucose (UDP-galactose) Pyrophosphorylase from Bifidobacterium bifidum. J. Biochem. 86, 923-928., Ritter, J.E., Berlin, C. and Elling, L. (1996) A Continuous Microtiter Plate Assay for Screening Nucleotide Sugar-Synthesizing Nucleotidyltransferases. Anal. Biochem. 234, 74-82.)

당 핵산염 합성효소 (Nucleotide 5-diphosphate-hexose pyrophosphorylase (NHPase))는 삼인산염(NTP)과 hexose 1-P로부터 NDP-hexose를 합성하고 pyrophosphate를 방출하는 가역반응을 촉매한다. NHPase는 동물, 식물, 미생물 등에서 다양하게 발견되었다. 식물에서는 ADP-glucose가 starch 합성의 전구체로서 작용하고 이것을 합성하는 ADP-glucose 합성효소(AGPase)는 전분 함량과 질을 조절하는데 중요한 역할을 하는 효소로 알려져있다. 미생물에서는 펩티도당과 지질당의 탄수화물 잔기가 핵산염(NDP-hexose)의 형태로 제공되고 있고, 동물에서는 각종 당단백질의 탄수화물잔기가 역시 핵산염의 형태로 제공되고 있다.

핵산염 합성효소에 의해서 합성된 당 핵산염(NDP-hexose)은 효소를 이용하여 연속적으로 glycosyltransferase reaction의 기질로서 사용될수 있다. 즉 효소를 이용하여 전분이나 글리코겐 등을 합성할 때 값비싼 기질을 제공할 수 있고 (Heidlas, J.E., Lees, W.J. and Whitesides, G.M. (1992) J.Org. Chem. 57, 152-157), 효소적으로 활성화된 단당기의 재생산계를 구성하므로써 (Ichikawa, Y., Look, G.C. and Wong, C.H. (1992) Enzyme-Catalyzed Oligosaccharide SynthesisAnal. Biochem.202, 215-238) 생물학적 기능성이 있는 특정 복합 다당류를 합성할 때 사용할 수 있고, 방사능으로 표지된 3인산 핵산염(nucleotide triphosphate) 등 기질유도체를 기질로서 사용하여 각종 당 핵산염 유도체를 합성하므로써, 각종 육탄당 전이효소를 확인 및 분리하는 등 생화학 실험에도 사용할 수 있다(Szumilo, T., Richard, R.D., York, J.L. and Elbein, A.D. GDP-Mannose Pyrophosphorylase; Purification to homogeneity, Properties, and utilization to prepare photoaffinity analogsJ. Biol. Chem.(1993) 17943-17950., Drake, R.R. Evans, J.R.K., Wolf, M.J. and Haley, B.E., (1989) Synthesis of Properties of 5-Azido-UDP-Glucose; Development of Photoaffinity probes for Nucleotide Diphosphate sugar Binding Sites J.Biol. Chem.264 (20) 11928-11933.). 따라서 효소를 이용하여 생물학적 활성이 있는 각종 복합탄수화물 및 탄수화물 유도체를 합성하기 위해서는 전구체인 NDP-hexose를 합성하는 효소가 필요하며 특히, 효소의 정제를 쉽게하기 위하여 고온에서 안정한 내열성 효소가 필수적이다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규 내열성 UXPase 효소를 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 UXPase 효소의 유전자 염기서열을 결정하고 이 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 그에 의해 형질전환된 대장균(KCTC 8868P)을 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 형질전환된 대장균을 배양하여 신규한 내열성 재조합 UXPase 효소를 대량 생산함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 고온성 박테리아인Thermus caldophilusGK24로부터 신규 내열성 UDP-N-acetylglucosamine 합성효소(UDP-GlcNAc ppase)를 분리 정제한 후, 그의 유전자 염기서열 및 아미노산서열을 결정하고 이 효소의 유전자 염기서열로부터 UXPase 유전자를 클로닝한 후, 이 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하고 이 발현벡터로 대장균을 형질전환시킨 다음, 이 형질전환된 대장균(KCTC 8868P)을 배양하여 재조합 UXPase 유전자 발현을 유도한 후, 균체를 회수하고 상기 효소를 정제하여 정제된 UXPase를 다양한 기질과 반응시켜 기질 특이성을 조사한 후, Gel filtration으로 분자량을 결정한 다음 염 및 온도에 따른 재조합 UXPase의 활성을 측정하므로써 달성하였다.

도 1은 플라스미드 pGLB의 제한효소지도와 UXPase 유전자 위치를 나타낸

유전자 지도이다.

도 2는 UXPase 유전자 염기 서열과 그에 의해 암호화된 아미노산서열이다.

도 3는 발현된 재조합 UXPase와 정제단계에서의 분획을 SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동한 사진이다.

도 4는 UXPase 효소의 다양한 활성을 염화마그네슘(MgCl₂)의 농도에 따라 측정한 기질 특이성을 나타낸 그래프이다.

도 5은 다양한 2가 양이온의 농도 변화에 따른 UXPase 활성 변화를 나타낸 그래프이다.

도 6(a)는 UXPase의 내열성을 온도별로 측정한 그래프이다.

도 6(b)는 UXPase의 내열성을 시간별로 측정한 그래프이다.

본 발명은Thermus caldophilusGK24를 배양하고 이 균주로부터 당 핵산염 합성효소를 분리하고 정제하는 단계; 당 핵산염 합성효소의 활성을 HPLC로 측정하고 단백질을 정량하는 단계;Thermus caldophilusGK24로부터 UDP-GlcNAc ppase를 DEAE-Sephacel 이온 교환 크로마토그래피, phenylsepharose CL6B 크로마토그래피, Affi-Gel Blue 친화 크로마토그래피 및 Mono-Q 이온 교환크로마토그래피로 정제하는 단계; SDS-PAGE와 native-PAGE로 분자량을 분석하고 N-terminal과 internal 염기서열을 결정하는 단계; 제한효소 절단, cosmid library 제조, transformation, southern hybridization 및 subcloning하여 UXPase 유전자를 클로닝하는 단계; pGLB와 UXPase를 발현시키기 위한 프라이머 유전자를 사용하여 PCR을 수행한 후, 발현벡터에 삽입하고 대장균에 도입하여 UXPase 유전자를 발현시키는 단계; UXPase 유전자가 발현되는 대장균을 배양하여 균체를 회수하고 정제하는 단계; UXPase를 다양한 기질과 반응시켜 기질 특이성을 조사하는 단계; gel filtration으로 분자량을 측정하는 단계 및 다양한 염과 온도변화에 따른 활성을 측정하는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 구체적인 UXPase의 유전자 염기서열과 이 유전자 염기서열로 형질전환된 대장균 및 이 대장균을 배양하여 UXPase를 생산하는 구체적인 방법은 실시예를 들어 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에 한정하는 것을 아니다.

실시예 1: Thermus caldophilus GK24 균주의 배양과 당 핵산염 합성효소 분리

Thermus caldophilusGK24 균주의 배양은 이미 공지된 방법에 따라 75℃에서 24시간 배양한 후, (Taguchi, H., Hamaoki, M., Matsuzawa, H. and Ohta, T. (1983) Heat-stable extracellular proteolytic enzyme produced byThermus caldophilusstrain GK24, an extremely thermophilic bacterium. J.Biochem.93, 7-13) 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하였다.T. caldophilusGK24 200 g을 완충용액 A(50 mM KH₂PO₄, pH 7.0, 5 mM β-mercaptoethanol and 1μM PMSF) 에 녹인 후, 전체부피 1.2 L내의 세포는 sonicator(model Cole-Parmer 4710 series) 를 이용하여 완전히 파쇄시켰다. 초원심분리(Beckman, 45 Ti rotor, 35,000 rpm, 2 hr, 4℃)하여 얻은 상층액 1L에 유안((NH₄)₂SO₄)를 이용하여 20-80%로 fractionation한 후, 약 100 volume의 완충용액 B(20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM β-mercaptoethanol)로 투석하였다. 이것을 다시 원심분리하여 불용성 물질을 제거한 후 조효소액을 얻었다. 이 조효소액에는 UDP-xylose pyrophosphorylase (UXPase), TDP-glucose pyrophosphorylase (TGPase), UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase), UDP-mannose pyrophosphorylase (UMPase), UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase (UDP-GlcNAc ppase), UDP-galactose pyrophosphorylase (UGPase) 등 각종 NHPase의 효소가 함유되어 있다.

실시예 2: 당 핵산염 합성효소의 활성 측정 및 단백질 정량

상기 실시예 1에서 얻은 각종 NHPase의 효소 활성은 HPLC를 이용하여 합성되는 NDP-hexose 의 양을 측정하였으며, Sweeney 등(Sweeney, C., Mackintosh, D. and Matson, R.M. (1993) UDP-sugar metabolism in Swarm rat chondrosarcoma chondrocytes.Biochem. J.290, 563-570) 의 방법을 변형하여 실시하였다. 전체반응물( 50 mM Hepes (pH8.0), MgCl₂, 5 mM hexose 1-phosphate, 5 mM NTP) 50 μl를 80 ℃ 에서 10분 동안 반응시켰다. MgCl₂의 농도는 대부분 12 mM 을 사용하였으나, TGPase는 4mM, UGPase는 1.5 mM을 사용하였다.T. caldophilusGK24로 부터 ppase 효소를 정제할 때, UDP-GlcNAc ppase activity 는 50 mM Tris-Cl (pH8.0), 3 mM MgCl₂, 1 mM GlcNAc 1-phosphate, 1 mM UTP을 포함하는 전체 반응물 50 μl를 72 ℃ 에서 10분 동안 반응 시켰다. 반응이 끝난 후 바로 얼음에 침지하여 반응을 종결시켰으며, 반응혼합물을 HPLC에 삽입하여 분석하였다. 1단위의 각 NHPase의 활성도는 1분동안 1 μmole 의 NDP-hexose의 합성을 촉매하는 효소의 양으로 정의 하였다.

본 실시예에서 HPLC 분석은 모델 126 programmable solvent module, 모델 166 programmable detector solvent module 과 Premium 286 개인용 컴퓨터로 구성된 Beckman사의 System Gold를 사용하였다. ODS C-18 (5 μm)의 역상 (reverse-phase) 컬럼 (4.6 × 300 mm )과 ionophore로서 tetrabutylammonium chloride(TBA-Cl)을 다양한 분석에 이용하였다. 표준시료는 0.04-0.5 mM 로 하고, 주입량은 표준시료와 시료 공히 50 μl로 하였다. 전개용매는 5 mM TBA-Cl을 포함하는 25 mM potassium phosphate(pH 4.0) 완충용액에 75% 까지의 acetonitrile로 gradient를 가하여 사용하였다.

실시예 3: Thermus caldophilus GK24로 부터 UDP-GlcNAc ppase 효소의 정제

정제과정은 하기 4 단계의 크로마토그래피 과정을 거쳐서 완료했다. 모든 실험은 4 ℃에서 수행하였다.

1단계; DEAE-Sephacel 이온 교환 크로마토그래피

상기 실시예 1에서 사용된 완충용액 B로 평형화 된 DEAE-sephacel 컬럼(1.5 X 20 cm)위에 실시예 1에서 얻은 조효소액을 흡착시킨 후, 280 nm에서 흡광도가 거의 0이 될 때까지 동일한 완충용액으로 씻어주었다. 각각 60, 150, 300 mM KCl을 포함하는 완충용액 B를 400 ml씩 전개시켜 효소를 용출한 후, 활성이 있는 분획인 60-150 mM KCl 분획을 Diafuro YM 30 membrane (Amicon Co., Beverly, MA, USA)으로 농축하여 다음 정제단계의 시료로 사용하였다. 이 단계를 네 번 반복하였다.

2단계; Phenylsephrose CL6B 크로마토그래피

1단계에서 농축된 시료 100 ml을 완충용액 C (20 mM potassium phosphate, pH 7.0, 1mM β-mercaptoethanol and 0.5 M ((NH₄)₂SO₄))로 투석한 후 동일한 완충용액으로 이미 평형화되어 있는 Phenylsepharose CL6B column (1.5 X 15 cm)위에 흡착시킨 후, 3 volume의 동일한 완충용액으로 전개시켰다. 3 volume의 완충용액 D (20 mM KH₂PO₄, pH 7.0)로 전개시킨 다음 증류수로 전개시켰다. 활성이 있는 증류수 분획을 모은 다음 1단계와 동일한 방법으로 농축한 후 완충용액 B 로 투석하였다. 이 단계를 두 번 반복하였다.

3단계; Affi-Gel Blue 친화 크로마토그래피

완충용액 B로 이미 평형화되어 있는 Affi-Gel Blue 컬럼 (1.2 x 12 cm)에 시료용액을 통과시켰으나 UDP-GlcNAc ppase가 흡착되지 않았다. 흡착되지 않은 분획을 농축한 다음 완충용액 B 로 투석하였다. 이 단계를 네 번 반복하였다.

4단계; Mono-Q 이온 교환 크로마토그래피

보다 진보된 정제를 위하여 Mono-Q HR 10/10 칼럼 (0.5 × 5 cm)을 FPLC(Phamacia Co.)에 장착하고 농축된 시료를 상기 완충용액 C로 평형을 만들어준 후 loading하였다. 전체 칼럼부피의 5배 부피의 완충용액 C로 충분히 씻어주어 280nm에서의 흡광도가 거의 0에 도달한 다음 KCl을 이용하여 직선 gradient (100ml, 50-200 mM)를 걸어주었으며 분당 0.5 ml의 속도로 용출시켰다. 효소의 활성은 75-90 mM KCl에서 나타났다. 이 단계를 네 번 반복하였다.

실험결과, 정제도는 하기 표1에 나타냈고 정제된 효소는 contaminants를 포함할지라도 peptide sequencing을 위해 사용하였다.

T. caldophilusGK24로 부터 UDP-GlcNAc ppase의 정제

	Totalprotein(mg)	Total Activity(U)	Specific Activity(U/mg)	Fold	Recovery(%)
1.Crude	30,000	975	0.0325	1	100
2.(NH4)2SO4	7,500	480	0.064	1.97	49.2
3.DEAE-sephacel	3,344	242	0.0724	2.23	24.82
4.phenylsepharose CL6B	1,242	243	0.196	5.2	24.92
5.Blue Affinity	168	60	0.357	11	6.15
6.Mono Q	15.8	21.8	1.38	42.46	2.24

실시예 4: SDS-PAGE와 native-PAGE에 의한 분석

상기 실시예 3에서 여러단계를 거친 단백질 추출물을 native-polyacrylamide gel 전기영동과 Lammli의 방법 (Lammli, U.K. (1970) Cleavage of Structual proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature227, 680-685.) 에 따른 12%의 SDS-polyacrylamide gel 전기영동으로 분석하였다. 정제된 효소의 분자량은 표준단백질 분자량의 log값에 대하여 이동거리의 그래프로 표시하였다. 발색시약으로는 Coomassie Blue방법을 이용하였으며, native- polyacrylamide gel 전기영동은 Davis의 방법 (Davis, B.T. (1964) Disk electrophoresis Ⅱ. Method and application to human serum proteins.Ann. N. Y. Acad.Sci.121, 404-427.)을 사용하였다.

실시예 5: N-terminal and internal peptide sequence 결정

UXPase의 아미노말단의 서열은 PTH-Xaa 분석기 (Applied Biosystems model 120A)가 달린 기체상의 peptide sequencer (Applied Biosystem model 477A)를 이용하여 결정하였다. Phenylhydantion 유도체(PTH-Xaa)는 제조회사의 방법에 따라 분석하였다. 내부의 아미노산 서열을 결정하기 위하여, UDP-GlcNAc ppase 활성이 있는 단백질 band를 SDS-polyacrylamide gel로 부터 용출한 다음 endopeptidase인 Glu-C (Promega, Madison, Wi U.S.A)로 처리하였다. 처리방법은 제조회사 및 Cleveland의 방법 (Cleveland, D.W., Fisher, S.G., Kirschner, M.W. and Laemmli, U.K. (1977) Peptide Mapping by Limited Proteolysis in Sodium Dodecyl Sulfate and Analysis by Gel Electrophoresis.J. Biol. Chem.252 (3) 1102-1106.)에 따라 수행하였다. 반응이 끝난 시료는 제조회사의 방법에 따라 PVDF-plus transfer membrane(MSI, Westboro, MA 01581)에 blotting한 후, 위에서 언급한 기체상의 peptide sequencer를 이용하여 아미노산 서열을 결정하였다.

실시예 6: UXPase 유전자의 클로닝

제한효소 절단, cosmid library 제조, transformation, southern hybridization, colony hybridization 등과 같은 일반적인 분자생물학적 실험방법은 Samboook 등의 방법(Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., (1989) Molecular Cloning. A laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York.) 또는 Ausubel 등(Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. and Struhl, K. (1995) Short Protocols in Molecular Biology. 3rd. John ＆Wiley Sons, Inc.)의 방법을 따랐다.

상기 실시예 5에서 확보된 peptide sequence를 근거로하여 random primer인 sense primer N1, Antisense primer B5, B8를 합성하였다. 합성된 primer를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR은T. caldophilusGK24 의 chromsomal DNA를 주형으로하고 50 ℃의 annealing 온도에서 진행하였다. Primer N1, B5로 부터는 약 0.2kb DNA 단편을 얻었으며, Primer N1, B8 로 부터는 약 0.7kb DNA 단편을 얻었다. 이 두 개의 DNA 단편 중에 0.7 kb DNA 단편을 pUC18의smaI site 에 cloning 한 후, DNA 의 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열에 따르면, 이 PCR 산물은 240개의 아미노산으로 구성되어 있으며 각 말단에는 primer site이외에 peptide sequencing 으로부터 확인된 아미노산 서열이 이어지는 것을 알 수 있고, 특히, internal peptide sequence B5가 48-61 번째 아미노산 잔기에 위치함을 알 수 있었다. 또한, 다른 균주로부터 알려진 NDP-hexose pyrophosphorylase의 아미노산 서열과 비교해본 결과 30-45%의 동일성이 있었다. 따라서 PCR 산물이 pyrophosphorylase gene 의 일부임이 확인되었으므로, 이 PCR 산물을 프로브로하여T. caldophilusGK24의 cosmid library로부터 full gene을 확보하기 위한 실험을 수행하였다. cosmid library 로부터 10개의 positive clone을 확보하고, 두 개의 Transformants (cos#1, 2)로부터 cosmid DNA를 분리한 후, BamHI, SacI, KpnI, SalI 와 XbaI 제한효소로 분리하여 절단하였다. 각 절단된 DNA 시료를 0.8% agarose gel에서 전기영동한 다음 southern hybridization을 수행하였다. 다양한 크기의 DNA band 중, 도 1에 나타낸 바와 같이 클로닝하기에 적당한 size이고, UXPase의 full structural region을 모두 포함하기에 충분한 약 4.6 kbBamHIDNA 단편을 선택하여 agarose gel로 용출한 다음 pUC18의BamHIsite 로 서브클로닝 하여 pGLB를 얻고 pGLB의 4.6kb DNA를 더 작은 크기로 서브클로닝한 후 염기서열을 결정하였다. UXPase gene은 1044개의 뉴클레오티드로 구성되어 있으며 G+C content가 70 % 이었다. 아미노산 서열은 도 2에 나타낸 바와 같이 348개로 구성되어 있으며 계산된 분자량은 38kDa 이었고 계산된 pI는 5.8이었다. 다른 종으로부터 분리된 UDP-glucose 또는 TDP-glucose pyrophosphorylase (TGPase) 유전자와 아미노산 서열을 비교해본 결과 20-45%의 동일성을 나타냈으며, 특히, TGPase(Streptomyces griseus의strDgene 과 Streptomyces argillaceus 의 mtmD gene)와는 45%의 높은 동일성을 나타냈다.

실시예 7: UXPase 유전자의 발현벡터 구축 및 발현

UXPase 유전자를 발현하기 위하여 PCR Primer를 합성하였다. Sense primer GU1은 ATG start codon을 포함하고, 발현벡터에 클로닝하기 위한EcoRI site를 포함한다. Antisense primer GU2는 1686-1704번째 염기에 위치하고, 이 두 primers 사이에는DraIII site를 포함한다. 따라서 pGLB를 주형으로하고 상기 primers를 사용하여 50℃의 annealing 온도에서 PCR을 수행하므로써 기대되는 0.35kb의 DNA band를 agarose 전기영동으로 확인하였고EcoRⅠ과DraⅢ 제한효소로 동시에 처리하여 agarose gel로부터 0.25 kb를 용출하였다. 그리고 pGLB를pstI 과DraⅢ 제한효소로 처리하여 agarose gel에서 약 1.5 kb의 DNA band를 용출하고, 발현벡터인 pJR (한국 특허출원 제 92-6370 호 참조)을EcoRⅠ과pstI 제한효소로 동시에 처리한 후, 상기 제한효소로 처리하여 얻은 0.25 kb와 1.5 kb DNA 단편을 pJR 과 함께 ligation 한 후, 대장균 MV1184에 transformation 하여E.coliMV1184/pGLM을 얻었다. 클로닝된 UXPase 유전자를 발현시키기 위해,E. coliMV1184/pGLM을 70 μg/l의 ampicillin이 첨가된 LB broth에 각각 접종하였다. 37℃에서 약 2시간 배양한 후, 약 0.5 mM의 IPTG(isopropyl β-D-thiogalactopyranoside)첨가하고 약 10시간 계속 배양하여 유전자의 발현을 유도하였다. 원심분리하여 균체를 회수한 다음, 완충용액 B에 균체를 현탁시키고 sonicator(model Cole-Parmer 4710 series)를 사용하여 세포를 파쇄하였다. 실시예 2와 같은 방법으로 DNA 중합효소 활성도를 측정한 결과, 배양액 mL당 3.9 Unit의 활성을 나타냈다. 이 플라스미드를 함유하는 대장균E. coliMV1184/pGLM을 1998년 1월 21일자로 한국과학 기술원 부설 생명공학 연구소 유전자 은행에 기탁 번호 KCTC 8868P로 기탁하였다.

실시예 8: 재조합 UXPase의 정제

E. coliMV1184/pGLM을 대량 배양하여 원심분리한 후 균체를 회수하였다. 실시예 1과 같이 완충용액 A에 균체를 현탁시킨 후, sonicator로 세포를 파쇄하였다. 이 현탁액을 8,000 rpm에서 원심분리한 후, 파쇄되지 않은 균체들을 제거하였다. 상층 부분을 85℃에서 25분간 열처리하여 대장균 유래의 단백질을 침전시킨 후, 12,000 rpm으로 원심분리하여 변성된 단백질을 제거하고, 상층부분을 저장용 완충용액 B로 투석하였다. 완충용액 B로 이미 평형화되어 있는 DEAE-sephacel 컬럼(1.5 X 10 cm)위에 조효소액을 흡착시킨 후, 280 nm에서 흡광도가 거의 0이 될 때까지 동일한 완충용액으로 씻어주었다. KCl이 0에서 300 mM에 이르도록 200 ml의 완충용액 B로 전개하여 효소를 용출한 후, 활성이 있는 150-200 mM KCl 분획 (5 ml/fraction, 17-20 fraction)을 모아 (20 ml) 농축하였다. 도 3은 약 38kDa의 재조합 UXPase가 단일 단백질로서 정제됨을 나타내고, 표2는 약 20배로 정제되었음 나타낸다. 농축된 UXPase는 storage buffer (50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 50 % glycerol, 1 mM MgCl₂)에 투석한 후 일부는 특성 연구에 사용하였고 나머지는 -70 ℃에 보관하였다.

재조합 UXPase의 정제 (0.9 L 배양액)

	TotalProtein(mg)	TotalActivity(U)	Specific Activity (U/mg)	Fold	Recovery(%)
1.Crude	429.19	3466	8.076	1	100
2.Heat treatment	60.765	2428	39.96	4.95	70.1
3.DEAE-sephacel	8.996	1482.8	158.74	19.7	41.2
1단위는 1분 동안 합성되는 1μmole의 생성물에 해당함

실시예 9: UXPase의 기질 특이성 실험

UXPase를 UTP와 xylose 1-phosphate외에 다양한 기질과 반응시켰다. 도 4에서 보는 바와 같이 hexose 1-P로는 mannose 1-P, galactose 1-P, GlcNAc 1-P, glucose 1-P를 반응시켰고, nucleotide triphosphate로는 GTP, TTP를 반응시켰다. 실험결과, TGPase 와 UGPase 의 활성은 비교적 높아서 UXPase의 활성과 비교하여 각각 32%, 21%의 활성을 나타냈다. glucose 1-P와는 전혀 반응을 하지 않으며 ATP 와는 0.1%미만의 반응성을 보였다. 또한 최대 활성을 나타내는 MgCl₂의 농도는 대부분 12 mM이지만 UGPase activity는 1.5 mM 이었고 TGPase activity는 4 mM 이었다. 역 반응을 조사하기 위하여 pyrophosphate와 NDP-hoxose를 기질로 사용하였다. UDP-glucose는 37.3 Unit/mg의 specific activity를 나타냈으나, TDP-glucose와 UDP-xylose는 UDP-lucose와 비교하여 2%미만의 specific activity를 나타냈다.

실시예 10: UXPase분자량 측정

Native 조건에서 gel filtration을 수행하여 UXPase의 분자량을 160kDa으로 결정하였다. 이 수치는 아미노산 서열로부터 계산된 분자량(38kDa)과 비교하였을 때 tetramer로서 작용함을 알 수 있다.

실시예 11: 반응속도에 따른 효소와 기질 사이의 안정도(Km) 측정

실시예 10에서 반응시킨 각 기질활성에 대한 Km값을 결정하였다. TGPase activity에 있어서 TTP에 대한 Km값은 2.6 mM 이었고 G 1-P에 대한 Km값은 1 mM 이었다. UGPase와 UXPase에 대한 Km값은 매우 높아서 현재의 assay system으로는 결정할 수가 없었다. 그러나 추정되는 Km값은 8 mM 이상으로 추측된다.

실시예 12: 염에 따른 활성조사

UXPase는 2가 양이온을 cofactor로서 필요로한다. 도 5에서 보는 바와같이 UXPase를 Mg²⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Mn²⁺의 존재하에 활성을 측정한 결과, 특히, Mn²⁺을 사용했을 때에는 Mg²⁺보다 높은 활성을 나타냈다. (Mn²⁺＞ Mg²⁺＞ Ni²⁺＞ Co²⁺) 또한, 최대 활성을 나타내는 각 2가 양이온의 농도는 다르게 나타났다. 즉, Mg²⁺는 12 mM, Co²⁺는 5 mM, Ni²⁺는 6 mM, Mn²⁺는 4 mM 이였다.

실시예 13: 온도에 따른 활성조사

UXPase를 90℃이상의 온도에서 시간에 따른 활성을 조사하였다. 도6에 나타낸 바와 같이 UXPase는 80℃ 에서 1시간동안 100 %의 활성을 유지하므로서 열에 매우 안정함을 알수 있다. 그러나 90 ℃ 이상의 온도에서는 불안정하여, 95 ℃ 에서 15 분의 half-life를 나타냈다.

이상, 실시예에서 설명한 바와 같이 본 발명은Thumus caldophilusGK24로부터 주반응으로 UDP-xylose를 합성하고 부반응으로 다양한 당 핵산염을 합성하는 신규한 효소 UXPase를 분리하고 그의 유전자를 클로닝하여 유전자 염기서열을 결정하고, 이 유전자 염기서열을 벡터에 삽입한 후 대장균에 도입하여 대장균을 형질전환시키고 이를 배양하므로써 UXPase를 대량 생산하는 효과가 있다. 따라서, 본 발명은 탄수화물 공학에서 기능적 생당체 합성 등 여러 당 핵산염을 필요로 하는 생물공학 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (6)

1. 써머스 칼도필러스 GK24로부터 분리한 내열성 UDP-자이로스 파이로포스포릴레이즈(UDP-xylose pyrophosphorylase; UXPase)를 암호화하는 유전자의 하기와 같은 염기서열.
2. 써머스 칼도필러스 GK24로부터 분리한 내열성 단백질 UDP-자이로스 파이로포스포릴레이즈(UDP-xylose pyrophosphorylase; UXPase)의 하기와 같은 아미노산서열.
3. 제1항의 내열성 UDP-자이로스 파이로포스포릴레이즈(UXPase) 암호화 유전자의 염기서열을 포함하는 재조합 발현벡터.
4. 제3항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균.
5. 제3항에 있어서, 상기 형질전환된 대장균이 이.콜라이 MV1184/pGLM(KCTC 8868P).
6. 제3항의 형질전환된 대장균을 배양하는 것을 포함하는 UDP-자이로스 파이로포스포릴레이즈(UXPase)의 제조방법.