JP4505011B2 - ３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸の酵素合成法 - Google Patents
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Description
本発明は、耐熱性細菌ジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のアデノシン５’−トリリン酸スルフリラーゼ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｕｌｆｕｒｙｌａｓｅ：ＡＴＰＳ）とアデノシン５’−ホスホ硫酸キナーゼ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ５’−ｐｈｏｓｐｈｏｓｕｌｆａｔｅ ｋｉｎａｓｅ：ＡＰＳＫ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のポリリン酸依存的ヌクレオシド５’−ジリン酸キナーゼ（Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｄｒｉｖｅｎ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｋｉｎａｓｅ；ＰＮＤＫ）、該ＰＮＤＫを利用したアデノシン５’−トリリン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＡＴＰ）供給・再生系、および該ＡＴＰＳとＡＰＳＫとＡＴＰ供給・再生系をリンクさせた実用的な３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸（３’−ｐｈｏｓｐｈｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ ５’−ｐｈｏｓｐｈｏｓｕｌｆａｔｅ：ＰＡＰＳ）の酵素合成法に関するものである。
ＰＡＰＳは、微生物から植物、高等動物に至るまで広く生体内で利用される硫酸供与体である。また、プロテオグリカン疾患に代表されるいくつかの疾患とＰＡＰＳとの関わりも報告されており、ＰＡＰＳの生体内での役割は非常に重要で、医薬品などの分野で利用される可能性がある。
ＰＡＰＳの酵素合成法として、例えば、パン酵母やラット肝臓から抽出したＡＴＰＳとＡＰＳＫの二つの酵素を用いた２段階反応により、ＡＴＰから製造する方法（下記式１および２）が知られている。
しかし、この方法では、数ミリグラムから数十ミリグラムのＰＡＰＳしか製造することができず、かつ、高価なＡＴＰを必要とし、産業的に実用的な方法とはいい難い。
（上記式中、ＡＴＰはアデノシン５’−トリリン酸、ＡＤＰはアデノシン５’−ジリン酸、ＡＰＳはアデノシン５’−ホスホ硫酸、ＰＰｉは無機ピロリン酸、ＳＯ４ ２−は硫酸イオンを示す）
したがって、ＰＡＰＳを実用的に生産せしめるには、生産性および操作性に優れた微生物由来酵素を用いること（第１の課題）と、高価ＡＴＰを必要としないＡＴＰ供給・再生系の構築（第２の課題）が必須となる。
恩田らは、第１の課題を解決するため、バチルス属細菌またはサーマス属細菌由来の熱安定性の高いＡＴＰＳおよびＡＰＳＫの２つの酵素を用いることにより、２段階反応によりＰＡＰＳを効率よく生産せしめることが可能であることを報告している（特許文献１〜３）。
しかし、恩田らの方法を実施するためには、当該耐熱性細菌の菌体破砕液よりＡＴＰＳおよびＡＰＳＫを精製しなくてはならない。しかしながら、当該両酵素の細胞内含有量は低く、このため大量の菌体培養を必要とし、かつ、両酵素の精製操作が極めて煩雑であるという問題があった。
一方、第２の課題を解決するため、伊吹らは、ＰＡＰＳ合成系にアセチルリン酸と酢酸キナーゼからなるＡＴＰ再生系をリンクさせ、ＡＰＳＫ反応で生成するＡＤＰをＡＴＰに変換して再利用する方法を報告している（非特許文献１）。
しかし、反応当初には依然として高価なＡＴＰを基質として使用して、またＡＴＰ再生のためのリン酸供与体として高価なアセチルリン酸を多量に使用することから、該法は実践的な方法となり得なかった。
従来、安価なリン酸ドナーとしてはポリリン酸（Ｐｏｌｙ Ｐｎ）が知られており、このポリリン酸を用いたアデノシン５’−モノリン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＡＭＰ）からのＡＴＰ供給・再生系としては、下記式（３）および（４）で示されるポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）およびアデニル酸キナーゼ（ＡＤＫ）の協調作用を利用する系（特許文献４）と下記式（５）および（６）で示されるポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素（ＰＡＰ）およびＡＤＫを利用する系（特許文献５）が知られている。
（上記式中、ＡＴＰはアデノシン５’−トリリン酸、ＡＤＰはアデノシン５’−ジリン酸、ＡＭＰはアデノシン５’−モノリン酸、Ｐｏｌｙ Ｐｎはポリリン酸、ｎは整数を示す）
このＰＰＫおよびＡＤＫの協調作用を利用するＡＴＰ供給・再生系をＰＡＰＳの酵素合成に応用することも、既に報告されているが（特許文献６）、この方法を詳細に解析した結果、ＰＡＰＳの生成量は最大でも５ｍＭ程度でしかないことが判明した。この低収量の原因を鋭意検討したところ、ＰＰＫおよびＡＤＫの協調作用を利用したＡＴＰ供給・再生系が効果的に機能せず、反応系内のＡＴＰ濃度をＡＤＰやＡＭＰに対してドミナントに維持することが困難であり、これが結果としてＰＡＰＳ生成を非効率的なものとしていることが判明した（後述の比較例１参照）。
ＰＰＫは生体内ではポリリン酸合成酵素として機能していると考えられており、式（４）に示される該酵素反応の平衡はポリリン酸合成側に大きく偏っている（非特許文献２）。また、そのＡＴＰ合成活性は微弱であるため、該酵素を利用したＡＴＰ供給・再生系は、例えば、基質濃度が５ｍＭ程度以下の低い濃度での反応では良好に機能するものの、基質濃度が１０ｍＭを超えるような高い濃度での反応では十分に機能し得ないことが判明した。
また、ＰＡＰおよびＡＤＫを利用するＡＴＰ供給・再生系をＰＡＰＳの酵素合成に応用した例は報告されていないが、ＡＤＫが式（６）の反応を完全に可逆的に触媒するため、後述の比較例２に示すように、反応系内のＡＴＰ濃度を高く保つことができず、結果としてＰＡＰＳの生成は非効率的であった。
したがって、ＰＡＰＳの実践的製造を可能とするためには、ＡＴＰ濃度をＡＤＰやＡＭＰに対してドミナントに維持可能な、強力な新規ＡＴＰ供給・再生系を構築することが不可欠であった。
このような強力なＡＴＰ供給・再生系を構築するための一手段として、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のポリリン酸依存的ヌクレオシド５’−ジリン酸キナーゼ（Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｄｒｉｖｅｎ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｋｉｎａｓｅ；ＰＮＤＫ）の利用が考えられる。すなわち、最近、緑膿菌由来のＰＮＤＫが同定され（非特許文献３、４）、該酵素をコードする遺伝子も取得されている（非特許文献２、５）。
さらに、このＰＮＤＫが、ＰＰＫと類似したポリリン酸依存的なＡＤＰのリン酸化活性を示すものの、そのアミノ酸配列はＰＰＫのそれと全く相同性を有さず、また、大腸菌由来ＰＰＫの１００倍以上、緑膿菌由来ＰＰＫの約１０００倍にも及ぶ顕著に高い比活性を有する酵素であり（非特許文献２）、ＰＰＫとは対照的に、ポリリン酸合成活性が事実上無視できるほど微弱であり、反応平衡がＡＴＰ合成側に大きく偏っているため、ＡＴＰの供給・再生系に用いる酵素として理想的であると考えられる。
しかしながら、該酵素の緑膿菌における生産性は低いことから、該酵素を産業的に用いるためには、遺伝子組み換え技術を利用して当該酵素の遺伝子をクローン化し、大腸菌などを宿主として該酵素を大量生産させることが必要であるが、本発明者らが過去に行った実験では、遺伝子組み換え技術を利用したとしても、該酵素の生産性はあいかわらず低く、該酵素の実用化は困難であった。
特許第３０９８５９１号
特許第３０７８０６７号
特許第３０２９９１５号
ＷＯ９８／４８０３１
ＷＯ０３／１０００５６
特開２００２−７８４９８
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２７，１７１−１７２（１９９２）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，１６６８４−１６６８８（２００２）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，４３９−４４２（１９９７）
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２８１，８２１−８２６（２００１）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，１６６７８−１６６８３（２００２）
したがって、実用的なＰＡＰＳ製造法を確立すべく、本発明は、最初に耐熱性細菌ジオバチルス・ステアロサーモフィルス（旧バチルス・ステアロサーモフィルス）染色体よりＡＴＰＳおよびＡＰＳＫをコードする遺伝子を見出し、組換えＤＮＡ手法を用いた当該酵素の大量製造を目的とする。
次に、本発明は、組換えＤＮＡ技術を利用したＰＮＤＫの効率的な生産を確立することを目的とする。
最後に、本発明は、ＰＮＤＫを用いた極めて強力なＡＴＰ供給・再生系の構築と、このＡＴＰ供給・再生系と耐熱性細菌ジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のＡＴＰＳおよびＡＰＳＫをリンクさせたＰＡＰＳの効率的な製造法の提供を目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく、鋭意検討を重ねた結果、耐熱性細菌ジオバチルス・ステアロサーモフィルス染色体よりＡＴＰＳおよびＡＰＳＫをコードする遺伝子を初めて見出し、組換えＤＮＡ手法を用いて当該酵素の大量製造を可能なものにした。さらに、当該酵素を高生産する大腸菌粗抽出液に加熱処理を施すことで、ＰＡＰＳ合成活性が顕著に向上し、これによって、当該両酵素を特別な精製を施すことなく、効率的なＰＡＰＳ製造が可能となった。
次に、既に報告されている３５７アミノ酸残基より成るＰＮＤＫをコードするポリヌクレオチドを精査し、Ｎ末端側の数十アミノ酸残基相当分の塩基配列を人為的に欠失させたＤＮＡ断片を用いることで、当該酵素の生産性が著しく向上し、目的とする酵素活性も失わないことを見出した。
さらに、ＡＭＰをリン酸化してＡＤＰを生成させる酵素としてＰＡＰを、ＡＤＰをリン酸化してＡＴＰを生成・再生させる酵素として上記のＰＮＤＫをそれぞれ選択し、両者を組み合わせることで、極めて強力にＡＭＰからＡＴＰを供給でき、かつ供給されたＡＴＰを高い濃度で維持させることが可能であることを見出した（下記式７および８参照）。
さらに、ＰＮＤＫをＡＤＫと共存させた場合、ＰＰＫをＡＤＫと共存させた場合、特許文献４と同様に、両者の協調作用でポリリン酸依存的なＡＭＰのリン酸化活性が生じること、生じたＡＤＰは、ＰＮＤＫ単独での強力なＡＤＰリン酸化活性によって即座にＡＴＰに変換され、ＰＮＤＫとＡＤＫの組み合わせがやはりＡＭＰからの強力なＡＴＰ供給・再生系として機能しうることも見出した（下記式９および１０参照）。
そして、ＰＡＰおよびＰＮＤＫより成るＡＴＰ供給・再生系、またはＡＤＫおよびＰＮＤＫより成るＡＴＰ供給・再生系のいずれかを、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のＡＴＰＳおよびＡＰＳＫＰＡＰＳを用いたＰＡＰＳの酵素合成に応用した場合、いずれのＡＴＰ供給・再生系も反応系内のＡＴＰ濃度をＡＤＰやＡＭＰに対してドミナントに維持し、結果としてＰＡＰＳを効率的に合成できることを見出した。
したがって、本発明は、以下の通りのものである。
（１）配列番号１で示される塩基配列からなり、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のアデノシン５’−トリリン酸スルフリラーゼ（ＡＴＰＳ）をコードするＤＮＡ断片。
（２）配列番号１で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなり、ＡＴＰＳ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ断片。
（１）配列番号１で示される塩基配列からなり、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のアデノシン５’−トリリン酸スルフリラーゼ（ＡＴＰＳ）をコードするＤＮＡ断片。
（２）配列番号１で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなり、ＡＴＰＳ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ断片。
（３）上記（１）に記載のＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＡＴＰＳ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ断片。
（４）上記（１）〜（３）記載のいずれかのＤＮＡ断片を用い、組換えＤＮＡ手法にてＡＴＰＳ活性を有する粗酵素を調製し、得られた粗酵素を加熱処理することを特徴とする、ＡＴＰＳまたはＡＴＰＳ活性を有する酵素の調製法。
（４）上記（１）〜（３）記載のいずれかのＤＮＡ断片を用い、組換えＤＮＡ手法にてＡＴＰＳ活性を有する粗酵素を調製し、得られた粗酵素を加熱処理することを特徴とする、ＡＴＰＳまたはＡＴＰＳ活性を有する酵素の調製法。
（５）４５〜６５℃で加熱処理する、上記（４）の調製法。
（６）配列番号２で示される塩基配列からなり、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のアデノシン５’−ホスホ硫酸キナーゼ（ＡＰＳＫ）をコードするＤＮＡ断片。
（６）配列番号２で示される塩基配列からなり、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のアデノシン５’−ホスホ硫酸キナーゼ（ＡＰＳＫ）をコードするＤＮＡ断片。
（７）配列番号２で示される塩基配列からなり、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなり、ＡＰＳＫ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ断片。
（８）上記（６）に記載のＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＡＰＳＫ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ断片。
（８）上記（６）に記載のＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＡＰＳＫ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ断片。
（９）上記（６）〜（８）記載のいずれかのＤＮＡ断片を用い、組換えＤＮＡ手法にてＡＰＳＫ活性を有する粗酵素を調製し、得られた粗酵素を加熱処理することを特徴とする、ＡＰＳＫまたはＡＰＳＫ活性を有する酵素の調製法。
（１０）４５〜６５℃で加熱処理する、上記（９）の調製法。
（１０）４５〜６５℃で加熱処理する、上記（９）の調製法。
（１１）上記（４）記載の方法により調製されたＡＴＰＳと上記（９）記載の方法で調製されたＡＰＳＫを用い、硫酸イオンとアデノシン５’−トリリン酸（ＡＴＰ）から３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）を酵素的に合成することを特徴とする、ＰＡＰＳの製造法。
（１２）配列番号９で示される塩基配列中の１０１〜１１７１からなるポリリン酸依存的ヌクレオシド５’−二リン酸キナーゼ（ＰＮＤＫ）をコードするポリヌクレオチドにおいて、Ｎ末端側の少なくとも７２アミノ酸残基相当の塩基配列を欠失したＤＮＡ断片。
（１２）配列番号９で示される塩基配列中の１０１〜１１７１からなるポリリン酸依存的ヌクレオシド５’−二リン酸キナーゼ（ＰＮＤＫ）をコードするポリヌクレオチドにおいて、Ｎ末端側の少なくとも７２アミノ酸残基相当の塩基配列を欠失したＤＮＡ断片。
（１３）少なくとも７３アミノ酸残基相当分の塩基配列を欠失した、上記（１２）記載のＤＮＡ断片。
（１４）７２以上、８７以下のアミノ酸残基相当分の塩基配列を欠失した、上記（１２）記載のＤＮＡ断片。
（１４）７２以上、８７以下のアミノ酸残基相当分の塩基配列を欠失した、上記（１２）記載のＤＮＡ断片。
（１５）７３以上、８３以下のアミノ酸残基相当分の塩基配列を欠失した、上記（１２）記載のＤＮＡ断片。
（１６）７３、７７、８０または８３のアミノ酸残基相当分の塩基配列を欠失した、上記（１２）記載のＤＮＡ断片。
（１６）７３、７７、８０または８３のアミノ酸残基相当分の塩基配列を欠失した、上記（１２）記載のＤＮＡ断片。
（１７）上記（１２）〜（１６）いずれかの塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、挿入または付加された塩基配列からなり、ＰＮＤＫ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ断片。
（１８）上記（１２）〜（１６）いずれかに記載のＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＰＮＤＫ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ断片。
（１８）上記（１２）〜（１６）いずれかに記載のＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＰＮＤＫ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ断片。
（１９）上記（１２）〜（１８）記載のいずれかのＤＮＡ断片を用い、組換えＤＮＡ手法にてＰＮＤＫを調製する、ＰＮＤＫの製造法。
（２０）上記（１９）記載の方法により調製された、配列番号１０のＮ末端側の少なくとも７２アミノ酸を欠落したアミノ酸配列を有するＰＮＤＫ。
（２０）上記（１９）記載の方法により調製された、配列番号１０のＮ末端側の少なくとも７２アミノ酸を欠落したアミノ酸配列を有するＰＮＤＫ。
（２１）アデノシン５’−モノリン酸（ＡＭＰ）、ポリリン酸、ポリリン酸依存的ヌクレオシド５’−ジリン酸キナーゼ（ＰＮＤＫ）およびポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素（ＰＡＰ）からなるアデノシン５’−トリリン酸（ＡＴＰ）の供給・再生系。
（２２）アデノシン５’−モノリン酸（ＡＭＰ）、ポリリン酸、ポリリン酸依存的ヌクレオシド５’−ジリン酸キナーゼ（ＰＮＤＫ）およびアデニル酸キナーゼ（ＡＤＫ）からなるアデノシン５’−トリリン酸（ＡＴＰ）の供給・再生系。
（２２）アデノシン５’−モノリン酸（ＡＭＰ）、ポリリン酸、ポリリン酸依存的ヌクレオシド５’−ジリン酸キナーゼ（ＰＮＤＫ）およびアデニル酸キナーゼ（ＡＤＫ）からなるアデノシン５’−トリリン酸（ＡＴＰ）の供給・再生系。
（２３）ＰＮＤＫが、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物由来のものである、上記（２１）または（２２）記載のＡＴＰの供給・再生系。
（２４）ＰＮＤＫが、上記（２０）記載のＰＮＤＫである、上記（２１）または（２２）記載のＡＴＰの供給・再生系。
（２４）ＰＮＤＫが、上記（２０）記載のＰＮＤＫである、上記（２１）または（２２）記載のＡＴＰの供給・再生系。
（２５）ＰＡＰが、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物由来のものである、上記（２１）または（２２）記載のＡＴＰの供給・再生系。
（２６）ＡＤＫが大腸菌または酵母由来のものである、上記（２１）または（２２）記載のＡＴＰの供給・再生系。
（２６）ＡＤＫが大腸菌または酵母由来のものである、上記（２１）または（２２）記載のＡＴＰの供給・再生系。
（２７）組換えＤＮＡ手法で形質転換した形質転換体、該形質転換体の処理物または該処理物から得られる酵素を酵素源として使用する、上記（２１）または（２２）記載のＡＴＰの供給・再生系。
（２８）ＡＴＰをエネルギー源および／叉は基質として消費する酵素反応により生成される有用物質を安価かつ効率的に製造する方法であって、ＡＴＰの代わりに、上記（２１）〜（２６）のいずれか１項に記載のＡＴＰの供給・再生系を利用することを特徴とする有用物質の製造法。
（２８）ＡＴＰをエネルギー源および／叉は基質として消費する酵素反応により生成される有用物質を安価かつ効率的に製造する方法であって、ＡＴＰの代わりに、上記（２１）〜（２６）のいずれか１項に記載のＡＴＰの供給・再生系を利用することを特徴とする有用物質の製造法。
（２９）ＡＴＰをエネルギー源および／叉は基質として消費する酵素反応により生成される有用物質が、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）、糖ヌクレオチド、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）のいずれかである、上記（２８）記載の有用物質の製造法。
（３０）アデノシン５’−トリリン酸スルフリラーゼ（ＡＴＰＳ）とアデノシン５’−ホスホ硫酸キナーゼ（ＡＰＳＫ）とを用い、ＡＴＰを硫酸化およびリン酸化して３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）を製造する方法において、ＡＴＰの代わりに、上記（２１）〜（２７）のいずれか一項に記載のＡＴＰの供給・再生系を利用することを特徴とするＰＡＰＳの製造法。
（３１）ＡＴＰＳとＡＰＳＫとが、ジオバシラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物由来のものである、上記（３０）記載のＰＡＰＳの製造法。
（３１）ＡＴＰＳとＡＰＳＫとが、ジオバシラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物由来のものである、上記（３０）記載のＰＡＰＳの製造法。
（３２）上記（４）記載の方法により調製されたＡＴＰＳと上記（９）記載の方法で調製されたＡＰＳＫを用いる、上記（３０）記載のＰＡＰＳの製造法。
（３３）３０〜５０℃の反応温度下、ＰＡＰＳを酵素合成する、上記（３０）記載のＰＡＰＳの製造法。
（３３）３０〜５０℃の反応温度下、ＰＡＰＳを酵素合成する、上記（３０）記載のＰＡＰＳの製造法。
ジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のＡＴＰＳおよびＡＰＳＫのアミノ酸配列および塩基配列共にまったく報告されていない状況において、本発明者らによって、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のＡＴＰＳおよびＡＰＳＫに相当する遺伝子のクローニングに初めて成功し、これによりジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のＡＴＰＳおよびＡＰＳＫを遺伝子工学の手法で大量に製造することが可能となった。また、遺伝子工学で得られた両酵素は活性的に満足できるものではなかったが、加熱処理という極めて簡便かつ実践的な処理を施すことで両酵素のＰＡＰＳ合成活性が飛躍的に高まることを見出し、これによりＰＡＰＳをより簡便かつ大量に製造することを初めて可能とした。
また、既に報告されているＰＮＤＫのＮ末端側の少なくとも７２アミノ酸残基相当の塩基配列を欠失したＤＮＡ断片を使用することで、Ｎ末端側の少なくとも７２アミノ酸残基相当分を欠落したアミノ酸配列を有するＰＮＤＫを簡便かつ大量に製造することが初めて可能となった。このＮ末欠損のＰＮＤＫは、ＰＮＤＫ自体の活性は維持されているため、このＰＮＤＫを利用することで、実用的なＡＴＰ合成・再生系およびＧＴＰ合成・再生系を構築することができる。
さらに、本発明のＡＴＰの供給・再生系は、ＡＭＰ、ポリリン酸などの安価な原料のみを使用し、これをＰＡＰＳの合成に応用した場合、反応系内のＡＴＰ濃度をＡＤＰやＡＭＰに対してドミナントに維持可能であり、対ＡＭＰ転換率６０％以上の効率でＰＡＰＳを合成することができる。この合成効率は、従来のＰＰＫおよびＡＤＫの協調作用を利用したＡＴＰ供給・再生系を応用したときの５倍以上の効率であり、ＰＡＰおよびＡＤＫを利用したＡＴＰ供給・再生系を応用したときの１．５倍以上の効率である。
さらにまた、ＡＴＰＳとＡＰＳＫとしてジオバシラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物由来のもの、ＰＮＤＫとしてシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物由来のもの、ＰＡＰとしてアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物由来のもの、ＡＤＫとして大腸菌または酵母由来のものを使用することで、３０〜５０℃の反応温度であっても酵素活性の低下を招くことなく、それぞれの酵素が協調してＰＡＰＳを効率的に合成可能である。
（Ａ）ジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来ＡＴＰＳおよびＡＰＳＫ
ジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来ＡＴＰＳおよびＡＰＳＫは、それぞれ配列番号３および配列番号４に表したアミノ酸配列を有する酵素、あるいは、配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有する酵素である。
ジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来ＡＴＰＳおよびＡＰＳＫは、それぞれ配列番号３および配列番号４に表したアミノ酸配列を有する酵素、あるいは、配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有する酵素である。
数個のアミノ酸の欠失とは、例えば３０アミノ酸以内をいい、好ましくは１０アミノ酸以内の欠失を意味する。また、数個のアミノ酸の置換とは例えば２５アミノ酸以内をいい、好ましくは１０アミノ酸以内の置換を意味する。さらに、数個のアミノ酸の付加とは例えば４０アミノ酸以内をいい、好ましくは２０アミノ酸以内の付加を意味する。また、アミノ酸の欠失、置換または付加は、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列と８５％以上、さらに９０％以上、特に９５％以上の相同性を有するものが含まれる。これらの変更を有する場合でも、ＡＴＰＳまたはＡＰＳＫ活性をそれぞれ有することが必要である。
ジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来ＡＴＰＳおよびＡＰＳＫをコードする遺伝子は、それぞれ配列番号１および配列番号２に表した塩基配列を有する遺伝子であり、あるいは、配列番号１および配列番号２の塩基配列における１もしくは複数の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有する遺伝子である。１もしくは複数の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有する遺伝子としては、配列番号１または２のＤＮＡ断片とストリンジェントな条件でハイブリダイズするものが挙げられる。ここでストリンジェントな条件としては、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃、０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃等の条件が挙げられる。１もしくは複数の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有する遺伝子には、配列番号１または配列番号２の塩基配列と８５％以上、さらに９０％以上、特に９５％以上の相同性を有するものが含まれる。このような遺伝子は、例えば、配列番号１および配列番号２それぞれの両端部分の合成ＤＮＡをプライマーとし、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法によって目的遺伝子を増幅する方法によって取得することができる。
単離された各遺伝子はベクターＤＮＡに連結することにより各種の宿主―ベクター系に保持させることができる。宿主としては微生物、昆虫細胞、培養細胞等、種々のものを用いることができる。微生物、例えば大腸菌を用いた場合にはＥＫ１系、酵母を用いた場合にはＳＣ１系を用いることができる。
微生物を宿主として用いた場合、ベクターとしては菌体内に安定に保持されるものであれば市販のいかなるプラスミドも使用可能である。例えば、宿主として大腸菌を用いた場合には、ｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャム）等のプラスミドの使用が好ましい。
クローン化された遺伝子（ＤＮＡ断片）を特定のプロモーター配列の下流に連結することにより、本発明のＡＴＰＳおよびＡＰＳＫを大量に生産させることができる。例えば、ｐＴｒｃ９９Ａは発現誘導可能なｔｒｃプロモーターを有し、培養の途中でイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培地へ添加することにより、目的とするＡＴＰＳおよびＡＰＳＫを生産させることができる。
形質転換体の培養は、常法により実施できる。すなわち、バシラス属または大腸菌類に属する細菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキス、１％食塩）または２ｘＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキス、０．５％食塩）などを使用することができ、当該培地に種菌を接種後、３０〜５０℃で１０〜５０時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液を遠心分離して微生物菌体を回収することができる。
上記微生物菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの公知な方法で破砕し、得られる菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物などの菌体処理物を本発明のＡＴＰＳおよびＡＰＳＫの粗酵素液として用いることができる。
このようにして得られたＡＴＰＳおよびＡＰＳＫは、上記粗酵素液に加熱処理を施すことで、ＰＡＰＳ合成活性を高めることができる。加熱処理は、４５℃から６５℃の温度で５分から１時間程度保温することで行うことができ、好ましくは、５５℃で３０分程度の処理が効果的である。
（Ｂ）緑膿菌由来のＰＮＤＫ
本発明で使用するＤＮＡ断片は、配列番号９で示される塩基配列の１０１〜１１７１からなるＰＮＤＫをコードするポリヌクレオチドにおいて、少なくともＮ末端側の７２アミノ酸残基相当の塩基配列、好ましくは７３アミノ酸残基相当の塩基配列を欠失したＤＮＡ断片である。
このようなＤＮＡ断片の中で、７２以上、８７以下のアミノ酸残基相当分の塩基配列を欠失したＤＮＡ断片、好ましくは、７３以上、８３以下のアミノ酸残基相当分の塩基配列を欠失したＤＮＡ断片が例示され、より具体的には、後述実施例に示す７３、７７、８０または８３のアミノ酸残基相当分の塩基配列を欠失したＤＮＡ断片を挙げることができる。
このようなＤＮＡ断片は、後述実施例に詳述されているように、ＰＮＤＫをコードするｐｐｋ２構造遺伝子の目的とするアミノ酸相当分を欠失させた後の５’末端に対応する合成ＤＮＡ、およびｐｐｋ２構造遺伝子の３’末端部分の合成ＤＮＡの２種のプライマーを用い、緑膿菌染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によって目的とするＤＮＡ断片を増幅することによって取得することができる。
単離された各ＤＮＡ断片はベクターＤＮＡに連結することにより各種の宿主−ベクター系を構築でき、選択した宿主−ベクター系で汎用されている方法により目的とする本発明のＰＮＤＫを製造することができる。
本発明のＰＮＤＫの製造に際し、宿主としては、微生物、昆虫細胞、培養細胞等種々のものを用いることができる。例えば、大腸菌を用いた場合にはＥＫ１系、酵母を用いた場合にはＳＣ１系を用いることができる。
微生物を宿主として用いた場合、ベクターとしては菌体内に安定に保持されるものであれば市販のいかなるプラスミドをも使用可能である。例えば、宿主として大腸菌を用いた場合には、ｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャム）等のプラスミドの使用が好ましい。
クローン化された遺伝子（ＤＮＡ断片）を特定のプロモーター配列の下流に連結することにより、本発明のＰＮＤＫを大量に生産させることができる。例えば、ｐＴｒｃ９９Ａは発現誘導可能なｔｒｃプロモーターを有し、培養の途中でイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培地へ添加することにより、目的とするＰＮＤＫを生産させることができる。
形質転換体の培養は、常法により実施できる。すなわち、バシラス属または大腸菌類に属する細菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキス、１％食塩）または２ｘＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキス、０．５％食塩）などを使用することができ、当該培地に種菌を接種後、３０〜５０℃で１０〜５０時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液を遠心分離して微生物菌体を回収することができる。
上記微生物菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの公知な方法で破砕し、得られる菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物などの菌体処理物を本発明のＰＮＤＫ粗酵素液として用いることができる。
また、場合によっては、上記菌体処理物からＰＮＤＫ活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）により精製し、部分精製酵素あるいは精製酵素として用いることもできる。
このようにして調製した本発明のＰＮＤＫは、使用したＤＮＡ断片に対応し、配列番号１０のＮ末端側の少なくとも７２アミノ酸残基相当分を欠落したアミノ酸配列を有するＰＮＤＫである。
（Ｃ）ＡＴＰ供給・再生系
本発明のＡＴＰ供給・再生系としては、（ｉ）ＡＭＰ、ポリリン酸、ＰＮＤＫおよびＰＡＰからなるＡＴＰの供給・再生系と（ｉｉ）ＡＭＰ、ポリリン酸、ＰＮＤＫおよびＡＤＫからなるＡＴＰの供給・再生系が包含される。ここで、本発明のＡＴＰ供給・再生系は、ＡＴＰ供給・再生系を構成する試薬を包含する。
本発明のＡＴＰ供給・再生系としては、（ｉ）ＡＭＰ、ポリリン酸、ＰＮＤＫおよびＰＡＰからなるＡＴＰの供給・再生系と（ｉｉ）ＡＭＰ、ポリリン酸、ＰＮＤＫおよびＡＤＫからなるＡＴＰの供給・再生系が包含される。ここで、本発明のＡＴＰ供給・再生系は、ＡＴＰ供給・再生系を構成する試薬を包含する。
ＰＡＰ、ＡＤＫおよびＰＮＤＫはすべて公知の酵素であり、動物由来、植物由来、微生物由来など特定の由来に限定されない。酵素調製の簡便さなどの点から微生物由来の酵素を使用するのが好都合である。また、近年の遺伝子組換え技術を利用して当該遺伝子をクローン化し、大腸菌などを宿主として大量生産させ、得られた組換え菌より当該酵素を調製することも可能である。
この中でも、ＰＮＤＫとして上述したシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物由来のもの、ＰＡＰとしてアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物由来のもの、ＡＤＫとして大腸菌または酵母由来のものを酵素として使用するのが好ましい。
反応系に添加する上記各酵素は、所望の活性を有する限りどのような形態であってもよく、具体的には、微生物の菌体（形質転換体を含む）、該菌体の処理物または該処理物から得られる酵素などを例示することができる。微生物の菌体の調製は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離等で集菌する方法で行うことができる。具体的に、バシラス属または大腸菌類に属する細菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキス、１％食塩）または２ｘＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキス、０．５％食塩）などを使用することができ、当該培地に種菌を接種後、３０〜５０℃で１０〜５０時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液を遠心分離して微生物菌体を回収することができる。
微生物の菌体処理物としては、上記微生物菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。
酵素としては、上記菌体処理物から所望の酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示することができる。
本発明のＡＴＰの供給・再生系に添加するＡＭＰ（市販品）、ポリリン酸（市販品）、各種酵素（ＰＡＰ、ＰＮＤＫおよびＡＤＫ）濃度は、ＡＴＰ供給・再生系を応用する有用物質によって異なるものの、ＡＭＰとしては、例えば１〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭの範囲、ポリリン酸としては、無機リン酸に換算して１〜１０００ｍＭ、好ましくは５０〜５００ｍＭの範囲、酵素濃度としては０．００１ユニット／ｍＬ以上、好ましくは０．００１〜１０ユニット／ｍＬの範囲から適宜設定することができる。
このようなＡＴＰ供給・再生系を応用可能な有用物質としては、ＡＴＰをエネルギー源および／叉は基質として消費する酵素反応により生成される有用物質であればよく、具体的には、ＰＡＰＳ、糖ヌクレオチド、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）などを例示することができる。
（Ｄ）ＰＡＰＳの酵素合成
ＰＡＰＳの酵素合成反応は、ＡＴＰと硫酸イオンからＡＴＰＳの触媒作用によりＡＴＰの５’−リン酸を硫酸化し（式１）、生じるアデノシン−５’−ホスホ硫酸の３’−水酸基を、ＡＴＰをリン酸供与体としてＡＰＳＫの触媒作用によりリン酸化する（式２）ものである。
ＰＡＰＳの酵素合成反応は、ＡＴＰと硫酸イオンからＡＴＰＳの触媒作用によりＡＴＰの５’−リン酸を硫酸化し（式１）、生じるアデノシン−５’−ホスホ硫酸の３’−水酸基を、ＡＴＰをリン酸供与体としてＡＰＳＫの触媒作用によりリン酸化する（式２）ものである。
反応に添加するＡＴＰは、市販のものが使用できる。使用濃度としては、例えば１〜２００ｍＭ、好ましくは１〜２０ｍＭの範囲から適宜設定すればよい。また、反応に添加する硫酸基供与体としては、反応液中で硫酸イオンを生成するものであればよく、市販の硫酸ナトリウムや硫酸マグネシウムなどの硫酸塩を使用することができる。使用濃度としては、例えば１〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。
ＰＡＰＳの合成は、ｐＨ４〜９の範囲の適当な緩衝液中にＡＴＰおよび硫酸塩を添加し、さらに０．００１ユニット以上、好ましくは０．００１〜１．０ユニットのＡＴＰＳおよび０．００１ユニット以上、好ましくは０．００１〜１．０ユニットのＡＰＳＫを添加し、２０℃以上、好ましくは３０〜５０℃で１〜５０時間程、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。
また、ＡＴＰを使用せずに、前述のＡＴＰ供給・再生系を併用することも可能である。
すなわち、ＡＭＰ、ポリリン酸、ＰＮＤＫおよびＰＡＰからなるＡＴＰの供給・再生系を応用したＰＡＰＳの合成は、ｐＨ４〜９の範囲の適当な緩衝液中に、ＡＭＰ、硫酸基供与体およびポリリン酸を添加し、さらに０．００１ユニット／ｍＬ以上、好ましくは０．００１〜１０ユニット／ｍＬのＰＡＰ、０．００１ユニット／ｍＬ以上、好ましくは０．００１〜１０ユニット／ｍＬ以上のＰＮＤＫ、０．００１ユニット以上、好ましくは０．００１〜１０ユニットのＡＴＰＳおよび０．００１ユニット以上、好ましくは０．００１〜１０ユニットのＡＰＳＫを添加し、２０℃以上、好ましくは３０〜５０℃で１〜１００時間程、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。
また、ＡＭＰ、ポリリン酸、ＰＮＤＫおよびＡＤＫからなるＡＴＰの供給・再生系を応用したＰＡＰＳの合成は、ｐＨ４〜９の範囲の適当な緩衝液中に、ＡＭＰ、硫酸基供与体およびポリリン酸を添加し、さらに０．００１ユニット／ｍＬ以上、好ましくは０．００１〜１０ユニット／ｍＬのＡＤＫ、０．００１ユニット／ｍＬ以上、好ましくは０．００１〜１０ユニット／ｍＬ以上のＰＮＤＫ、０．００１ユニット以上、好ましくは０．００１〜１０ユニットのＡＴＰＳおよび０．００１ユニット以上、好ましくは０．００１〜１０ユニットのＡＰＳＫを添加し、２０℃以上、好ましくは３０〜５０℃で１〜１００時間程、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。
なお、上記いずれの反応においても、ＡＴＰＳ反応により生成するピロリン酸が生成物阻害を起こす場合があるため、０．００１ユニット／ｍＬ以上、好ましくは０．００１〜１０ユニット／ｍＬの無機ピロホスファターゼ（Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を添加することで合成効率を向上させることができる。
反応後、反応液中に生成したＰＡＰＳは、活性炭やイオン交換樹脂などを用いた通常のクロマトグラフィー処理法により単離精製することができる。
以下、実施例を示して本発明を詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の例によって限定されないことは明らかである。また、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ」（Ｍａｎｉａｔｉｓら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））に従って行った。また、反応液中のヌクレオチド類の定量はＨＰＬＣ法に従って行った。具体的には、分離にはＹＭＣ社製のＯＤＳ−ＡＱ３１２カラムを用い、溶出液として０．５Ｍリン酸一カリウム溶液を用いた。
実施例１
（１）ＡＴＰＳ遺伝子およびＡＰＳＫ遺伝子の同定
ジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来ＡＴＰＳ遺伝子およびＡＰＳＫ遺伝子は未同定であるが、該菌ストレイン１０株のゲノムＤＮＡの一部の塩基配列は公開されている（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＮＣ＿００２９２６）。そこで、ウェブサービス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ｇｅｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ｇｉ＝５０２５＆ｔａｘ＝２７２５６７）を利用し、公開されている該株ゲノムＤＮＡの部分配列中に、枯草菌由来の公知のＡＴＰＳ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＣＡＡ０４４１１）と類似したアミノ酸配列のオープンリーディングフレーム（以下、ＯＲＦと略称する）をコードしうるＤＮＡ領域が存在するか否かを、ｔＢＬＡＳＴｎプログラムを用いて検索した。
（１）ＡＴＰＳ遺伝子およびＡＰＳＫ遺伝子の同定
ジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来ＡＴＰＳ遺伝子およびＡＰＳＫ遺伝子は未同定であるが、該菌ストレイン１０株のゲノムＤＮＡの一部の塩基配列は公開されている（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＮＣ＿００２９２６）。そこで、ウェブサービス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ｇｅｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ｇｉ＝５０２５＆ｔａｘ＝２７２５６７）を利用し、公開されている該株ゲノムＤＮＡの部分配列中に、枯草菌由来の公知のＡＴＰＳ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＣＡＡ０４４１１）と類似したアミノ酸配列のオープンリーディングフレーム（以下、ＯＲＦと略称する）をコードしうるＤＮＡ領域が存在するか否かを、ｔＢＬＡＳＴｎプログラムを用いて検索した。
この結果、該株染色体には、枯草菌由来ＡＴＰＳとアミノ酸配列が類似したＯＲＦをコードし得るＤＮＡ領域が存在することが判明した。さらに該遺伝子の下流には、枯草菌由来ＡＰＳＫ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＣＡＡ０４４１２）とアミノ酸配列が類似したＯＲＦをコードし得るＮＡ領域が見出された。これらは、それぞれ、該菌におけるＡＴＰＳ遺伝子およびＡＰＳＫ遺伝子であると期待された。
そこで、該菌ＡＴＰＳ遺伝子と期待されるＤＮＡ断片を以下に示すＰＣＲ法で増幅した。すなわち、下記（Ａ）および（Ｂ）のプライマーを用い、反応液０．１ｍＬ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスＴＨ６−２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７５８）の染色体ＤＮＡ０．１μｇ、２種類のプライマーＤＮＡ各々０．２μＭ、ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１分）、ポリメライゼーション（７２℃、２分）のステップを３０回繰り返した。なお、当該ＴＨ６−２株は、バチルス・ステアロサーモフィルス ＴＨ６−２の名称で１９８９年２月４日に、〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−２７５８として寄託されている。なお、バチルス・ステアロサーモフィルスは、現在ジオバチルス・ステアロサーモフィルスに名称変更されたため、念のため、同一株を、２００５年１２月７日に、前記の特許生物寄託センターにジオバチルス・ステアロサーモフィルス ＴＨ６−２の名称で、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４６６として寄託した。
（Ａ）５’−ＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＴＧＣＣＴＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＧＣＡＧＣ−３’（配列番号５）
（Ｂ）５’−ＴＡＣＴＧＣＡＧＧＣＴＣＡＴＣＧＣＧＡＴＣＣＴＣＣＴＴＴＡＧ−３’（配列番号６）
（Ｂ）５’−ＴＡＣＴＧＣＡＧＧＣＴＣＡＴＣＧＣＧＡＴＣＣＴＣＣＴＴＴＡＧ−３’（配列番号６）
また、該菌ＡＰＳキナーゼ遺伝子と期待されるＤＮＡ断片を、（Ｃ）および（Ｄ）の２種類のプライマーＤＮＡを用いた上記と同様なＰＣＲ法で増幅した。
（Ｃ）５’−ＴＴＧＡＡＴＴＣＣＧＣＴＡＡＡＧＧＡＧＧＡＴＣＧＣＧＡＴＧＡ−３’（配列番号７）
（Ｄ）５’−ＴＴＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＴＴＧＴＣＡＡＡＴＧＡＣＣＴＣＣＣ−３’（配列番号８）
（Ｃ）５’−ＴＴＧＡＡＴＴＣＣＧＣＴＡＡＡＧＧＡＧＧＡＴＣＧＣＧＡＴＧＡ−３’（配列番号７）
（Ｄ）５’−ＴＴＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＴＴＧＴＣＡＡＡＴＧＡＣＣＴＣＣＣ−３’（配列番号８）
各遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加してＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、各ＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡ各々を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。各々の連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ｙｌｎＢおよびｐＴｒｃ−ｙｌｎＣを単離した。
プラスミドｐＴｒｃ−ｙｌｎＢはジオバチルス・ステアロサーモフィルスＴＨ６−２株由来ＡＴＰＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片を乗せたプラスミドであり、ｐＴｒｃ−ｙｌｎＣは同株由来ＡＰＳＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片を乗せたプラスミドである。クローン化した両遺伝子の塩基配列を解析した結果、該菌ＡＴＰＳ遺伝子は配列番号１、該菌ＡＰＳＫ遺伝子は配列番号２に表したＤＮＡ塩基配列であった。これらのＤＮＡ塩基配列をアミノ酸配列に翻訳した結果、該菌ＡＴＰＳは配列番号３、該菌ＡＰＳＫは配列番号４に表したアミノ酸配列であった。該菌ＡＴＰＳは枯草菌由来同酵素と６８％のアミノ酸配列相同性を、また、該菌ＡＰＳＫは枯草菌由来同酵素と６３％のアミノ酸配列相同性をそれぞれ示した。
（２）ＡＴＰＳおよびＡＰＳＫ粗酵素液の調製
大腸菌ＪＭ１０９株をｐＴｒｃ９９Ａベクター、ｐＴｒｃ−ｙｌｎＢおよびｐＴｒｃ−ｙｌｎＣの各々で形質転換し、得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地１００ｍＬに植菌し、３０℃で振とう培養した。４ｘ１０８菌／ｍＬに達した時点で、培養液に終濃度０．４ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で一晩振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（１０，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、１０ｍＬの緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ２−メルカプトエタノール）に懸濁した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（１０，０００ｘｇ、１０分）により菌体残さを除去した。このように得られた上清画分を粗酵素液とした。
大腸菌ＪＭ１０９株をｐＴｒｃ９９Ａベクター、ｐＴｒｃ−ｙｌｎＢおよびｐＴｒｃ−ｙｌｎＣの各々で形質転換し、得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地１００ｍＬに植菌し、３０℃で振とう培養した。４ｘ１０８菌／ｍＬに達した時点で、培養液に終濃度０．４ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で一晩振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（１０，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、１０ｍＬの緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ２−メルカプトエタノール）に懸濁した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（１０，０００ｘｇ、１０分）により菌体残さを除去した。このように得られた上清画分を粗酵素液とした。
各粗酵素液中のＡＴＰＳ活性を以下のように測定した。すなわち、最終濃度がそれぞれ、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）５０ｍＭ、硫酸マグネシウム２０ｍＭ、ＡＴＰ１ｍＭとなる反応混液に、１ｕｎｉｔ／ｍＬのピロホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）、１ｕｎｉｔ／ｍＬのＡＰＳＫ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）、および酵素液を添加し、３７℃で１０分間保温後、氷冷した０．５Ｍリン酸２水素ナトリウム溶液を加えることによって反応を停止した。生成したＰＡＰＳの量をＨＰＬＣによって定量し、１分間に１μｍｏｌｅのＰＡＰＳが生成するＡＴＰＳの量を１ユニットとした。
また、ＡＰＳＫ活性を以下のように測定した。すなわち、最終濃度がそれぞれ、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）５０ｍＭ、硫酸マグネシウム２０ｍＭ、ＡＴＰ１ｍＭとなる反応混液に、１ｕｎｉｔ／ｍＬのピロホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）、１ｕｎｉｔ／ｍＬのＡＴＰＳ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）、および酵素液を添加し、３７℃で１０分間保温後、氷冷した０．５Ｍリン酸２水素ナトリウム溶液を加えることによって反応を停止した。生成したＰＡＰＳの量をＨＰＬＣによって定量し、１分間に１μｍｏｌｅのＰＡＰＳが生成するＡＰＳＫの量を１Ｕユニットとした。それぞれの測定結果を表１および２に示す。
（３）ＡＴＰＳ粗酵素液およびＡＰＳＫ粗酵素液を用いたＰＡＰＳの合成
最終濃度がそれぞれ、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ８）５０ｍＭ、塩化マグネシウム２５ｍＭ、硫酸ナトリウム１００ｍＭ、ＡＴＰ５０ｍＭとなる反応混液に、５ユニット／ｍＬピロホスファターゼ（ロッシュ社製）、０．２％容量のＡＴＰＳ粗酵素液、０．５％容量のＡＰＳＫ粗酵素液を添加し、３７℃で保温した。
最終濃度がそれぞれ、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ８）５０ｍＭ、塩化マグネシウム２５ｍＭ、硫酸ナトリウム１００ｍＭ、ＡＴＰ５０ｍＭとなる反応混液に、５ユニット／ｍＬピロホスファターゼ（ロッシュ社製）、０．２％容量のＡＴＰＳ粗酵素液、０．５％容量のＡＰＳＫ粗酵素液を添加し、３７℃で保温した。
また、両粗酵素液の代わりに同加熱処理粗酵素液（各粗酵素液を５５℃に調温された水槽に３０分間浸した後、室温にて３０分間静置し、遠心分離によって得られた上清）を上記と同じ容量添加した反応混液を調製し、同様に保温した。さらに、コントロールとして両粗酵素液の代わりにｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌ＪＭ１０９株より調製した粗酵素液を上記と同じ容量添加した反応混液を調製し、同様に保温した。
これらの反応におけるＰＡＰＳの生成量の経時的変化を図１に示した。この結果、コントロールを除くいずれの反応においても、ＰＡＰＳの経時的生成が確認されたが、ＡＴＰＳおよびＡＰＳＫ加熱処理粗酵素液を用いた反応では、非加熱処理の同粗酵素液を用いた場合と比較して顕著にＰＡＰＳ合成効率が高く、各時点で２〜３倍のＰＡＰＳ生成量を示した。反応開始１０時間後の対１／２ＡＴＰ転換率は、両加熱処理粗酵素液を用いた反応の場合は７５％であるのに対し、非加熱処理の同粗酵素液を用いた場合は３８％にすぎないものであった。
実施例２
（１）Ｎ末端領域のアミノ酸残基が欠失したＰＮＤＫをコードする遺伝子のクローニング
緑膿菌 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１株（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−４７）の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，７２，６１９（１９６３））で調製した。次に、表３に示す１２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、表４に示した１から１１の組み合わせで２種類のプライマーＤＮＡを用い、上記染色体ＤＮＡをテンペレートとしたＰＣＲ法により、Ｎ末端領域のアミノ酸残基が様々な程度で欠失したＰＮＤＫをコードする遺伝子を増幅した。なお、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１株は、ＡＴＣＣから入手可能である。
（１）Ｎ末端領域のアミノ酸残基が欠失したＰＮＤＫをコードする遺伝子のクローニング
緑膿菌 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１株（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−４７）の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，７２，６１９（１９６３））で調製した。次に、表３に示す１２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、表４に示した１から１１の組み合わせで２種類のプライマーＤＮＡを用い、上記染色体ＤＮＡをテンペレートとしたＰＣＲ法により、Ｎ末端領域のアミノ酸残基が様々な程度で欠失したＰＮＤＫをコードする遺伝子を増幅した。なお、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１株は、ＡＴＣＣから入手可能である。
ＰＣＲによるＮ末端領域欠失ＰＮＤＫをコードする遺伝子の増幅は、反応液１００ｍＬ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ０．１μｇ、表４に示した組み合わせ１から１１の２種類のプライマーＤＮＡ各々０．２μＭ、ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、１．５分）のステップを３０回繰り返すことにより行った。
各遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加してＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、０．９〜１．３ｋｂ相当の各ＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡ各々を制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、同じく制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
各々の連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体より各プラスミド（ｐＴｒｃ−ｐｐｋ２、ｐＴｒｃ−ｐｐｋ２Ｎ３、ｐＴｒｃ−ｐｐｋ２Ｎ６０、ｐＴｒｃ−ｐｐｋ２Ｎ７２、ｐＴｒｃ−ｐｐｋ２Ｎ７４、ｐＴｒｃ−ｐｐｋ２Ｎ７８、ｐＴｒｃ−ｐｐｋ２Ｎ８０、ｐＴｒｃ−ｐｐｋ２Ｎ８１、ｐＴｒｃ−ｐｐｋ２Ｎ８４、ｐＴｒｃ−ｐｐｋ２Ｎ８９、ｐＴｒｃ−ｐｐｋ２Ｎ９４、およびｐＴｒｃ−ｐｐｋ２Ｎ１０９）を単離した。
プラスミドｐＴｒｃ−ｐｐｋ２は完全長のＰＮＤＫをコードする遺伝子を、ｐＴｒｃ−ｐｐｋ２Ｎ３はＮ末端側２アミノ酸残基を欠くＰＮＤＫ（以下、ＰＮＤＫＮ３と称する）をコードする遺伝子を、ｐＴｒｃ−ｐｐｋ２Ｎ６０はＮ末端側５９アミノ酸残基を欠くＰＮＤＫ（以下、ＰＮＤＫＮ６０と称する）をコードする遺伝子を、ｐＴｒｃ−ｐｐｋ２Ｎ７２はＮ末端側７１アミノ酸残基を欠くＰＮＤＫ（以下、ＰＮＤＫＮ７２と称する）をコードする遺伝子を、ｐＴｒｃ−ｐｐｋ２Ｎ７４はＮ末端側７３アミノ酸残基を欠くＰＮＤＫ（以下、ＰＮＤＫＮ７４と称する）をコードする遺伝子を、ｐＴｒｃ−ｐｐｋ２Ｎ７８はＮ末端側７７アミノ酸残基を欠くＰＮＤＫ（以下、ＰＮＤＫＮ７８と称する）をコードする遺伝子を、ｐＴｒｃ−ｐｐｋ２Ｎ８１はＮ末端側８０アミノ酸残基を欠くＰＮＤＫ（以下、ＰＮＤＫＮ８１と称する）をコードする遺伝子を、ｐＴｒｃ−ｐｐｋ２Ｎ８４はＮ末端側８３アミノ酸残基を欠くＰＮＤＫ（以下、ＰＮＤＫＮ８４と称する）をコードする遺伝子を、ｐＴｒｃ−ｐｐｋ２Ｎ８９はＮ末端側８８アミノ酸残基を欠くＰＮＤＫ（以下、ＰＮＤＫＮ８９と称する）をコードする遺伝子を、ｐＴｒｃ−ｐｐｋ２Ｎ９４はＮ末端側９３アミノ酸残基を欠くＰＮＤＫ（以下、ＰＮＤＫＮ９４と称する）をコードする遺伝子を、ｐＴｒｃ−ｐｐｋ２Ｎ１０４はＮ末端側１０３アミノ酸残基を欠くＰＮＤＫ（以下、ＰＮＤＫＮ１０４と称する）をコードする遺伝子を、それぞれ含有するＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片が、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ切断部位に挿入されたものである。
（２）各種Ｎ末端領域欠失ＰＮＤＫ粗酵素液の調製
上記の各プラスミドを保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地３００ｍＬに植菌し、３７℃で振とう培養した。４×１０８菌／ｍＬに達した時点で、培養液に終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で５時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（１０，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、３０ｍＬの緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ２−メルカプトエタノール）に懸濁した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（１０，０００ｘｇ、１０分）により菌体残さを除去した。このように得られた上清画分を粗酵素液とした。
上記の各プラスミドを保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地３００ｍＬに植菌し、３７℃で振とう培養した。４×１０８菌／ｍＬに達した時点で、培養液に終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で５時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（１０，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、３０ｍＬの緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ２−メルカプトエタノール）に懸濁した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（１０，０００ｘｇ、１０分）により菌体残さを除去した。このように得られた上清画分を粗酵素液とした。
（３）各種Ｎ末端領域欠失ＰＮＤＫ粗酵素液の活性測定
上記の粗酵素液中のＰＮＤＫ活性の単位（ユニット）を、以下に示す方法で測定、算出した。すなわち、１０ｍＭ塩化マグネシウム、８０ｍＭ硫酸アンモニウム、１０ｍＭ ＡＤＰ、およびポリリン酸（無機リン酸として３０ｍＭ）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に上記の粗酵素液各々を添加して、３７℃で保温することで反応を行い、１００℃、１分間の熱処理により反応を停止させた。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のＡＴＰを定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＡＴＰを生成する活性を１単位（ユニット）とした。上記の各種Ｎ末端領域欠失ＰＮＤＫ粗酵素液中のＰＮＤＫ活性を表５に示す。
上記の粗酵素液中のＰＮＤＫ活性の単位（ユニット）を、以下に示す方法で測定、算出した。すなわち、１０ｍＭ塩化マグネシウム、８０ｍＭ硫酸アンモニウム、１０ｍＭ ＡＤＰ、およびポリリン酸（無機リン酸として３０ｍＭ）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に上記の粗酵素液各々を添加して、３７℃で保温することで反応を行い、１００℃、１分間の熱処理により反応を停止させた。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のＡＴＰを定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＡＴＰを生成する活性を１単位（ユニット）とした。上記の各種Ｎ末端領域欠失ＰＮＤＫ粗酵素液中のＰＮＤＫ活性を表５に示す。
各ＰＮＤＫの比活性は特に大きく変動しているわけではないことから、上記表５から明らかなように、７３以上、８３以下のアミノ酸残基相当分の塩基配列を欠失したＤＮＡ断片を用いることで、ＰＮＤＫを大量に調製できることが明らかとなった。
実施例３
（１）ＰＮＤＫの調製
緑膿菌 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来ＰＮＤＫの調製は、実施例２に記載したとおりである。
（１）ＰＮＤＫの調製
緑膿菌 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来ＰＮＤＫの調製は、実施例２に記載したとおりである。
（２）ＰＰＫの調製
大腸菌ＰＰＫを文献（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９１，５５７−５６３（２００１））に記載の方法で調製した。
ＰＰＫの活性の単位（ユニット）は以下に示す方法で算出した。すなわち、１０ｍＭ塩化マグネシウム、８０ｍＭ硫酸アンモニウム、１０ｍＭ ＡＤＰ、およびポリリン酸（無機リン酸として３０ｍＭ）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素試料液を添加し、３７℃で１０分間保温後、沸騰湯浴中で１分間処理することにより反応を停止させた。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のＡＴＰを定量し、１分間に１μｍｏｌｅのＡＴＰを生成させる活性を１単位（ユニット）とした。
大腸菌ＰＰＫを文献（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９１，５５７−５６３（２００１））に記載の方法で調製した。
ＰＰＫの活性の単位（ユニット）は以下に示す方法で算出した。すなわち、１０ｍＭ塩化マグネシウム、８０ｍＭ硫酸アンモニウム、１０ｍＭ ＡＤＰ、およびポリリン酸（無機リン酸として３０ｍＭ）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素試料液を添加し、３７℃で１０分間保温後、沸騰湯浴中で１分間処理することにより反応を停止させた。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のＡＴＰを定量し、１分間に１μｍｏｌｅのＡＴＰを生成させる活性を１単位（ユニット）とした。
（３）ＰＡＰの調製
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ由来ＰＡＰを文献（ＷＯ０３／１０００５６）に記載の方法で調製した。
ＰＡＰの活性の単位（ユニット）は以下に示す方法で算出した。すなわち、１０ｍＭ塩化マグネシウム、８０ｍＭ硫酸アンモニウム、１０ｍＭ ＡＭＰ、およびポリリン酸（無機リン酸として３０ｍＭ）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素試料液を添加し、３７℃で１０分間保温後、沸騰湯浴中で１分間処理することにより反応を停止させた。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のＡＴＰを定量し、１分間に１μｍｏｌｅのＡＤＰを生成させる活性を１単位（ユニット）とした。
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ由来ＰＡＰを文献（ＷＯ０３／１０００５６）に記載の方法で調製した。
ＰＡＰの活性の単位（ユニット）は以下に示す方法で算出した。すなわち、１０ｍＭ塩化マグネシウム、８０ｍＭ硫酸アンモニウム、１０ｍＭ ＡＭＰ、およびポリリン酸（無機リン酸として３０ｍＭ）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素試料液を添加し、３７℃で１０分間保温後、沸騰湯浴中で１分間処理することにより反応を停止させた。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のＡＴＰを定量し、１分間に１μｍｏｌｅのＡＤＰを生成させる活性を１単位（ユニット）とした。
（４）ＡＤＫの調製
大腸菌ＡＤＫを文献（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，１４１６８−１４１７１（２０００））に記載の方法で調製した。
ＡＤＫの活性の単位（ユニット）は以下に示す方法で算出した。すなわち、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ ＡＭＰ、および１０ｍＭ ＡＴＰを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素試料液を添加し、３７℃で１０分間保温後、沸騰湯浴中で１分間処理することにより反応を停止させた。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のＡＴＰを定量し、１分間に２μｍｏｌｅのＡＤＰを生成させる活性を１単位（ユニット）とした。
大腸菌ＡＤＫを文献（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，１４１６８−１４１７１（２０００））に記載の方法で調製した。
ＡＤＫの活性の単位（ユニット）は以下に示す方法で算出した。すなわち、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ ＡＭＰ、および１０ｍＭ ＡＴＰを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素試料液を添加し、３７℃で１０分間保温後、沸騰湯浴中で１分間処理することにより反応を停止させた。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のＡＴＰを定量し、１分間に２μｍｏｌｅのＡＤＰを生成させる活性を１単位（ユニット）とした。
（５）無機ピロホスファターゼの調製
無機ピロホスファターゼはロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社のものを使用した。
無機ピロホスファターゼの活性の単位（ユニット）は以下に示す方法で算出した。すなわち、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１０ｍＭ無機ピロリン酸を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素試料液を添加し、３７℃で１０分間保温後、沸騰湯浴中で１分間処理することにより反応を停止させた。生成した無機リン酸の量をモリブデンブルー法（“Ｔｒｅａｔｉｓｅ ｏｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”Ｉ． Ｍ．Ｋｏｌｔｈｏｆｆ ＆ Ｐ．Ｊ．Ｅｌｖｉｎｇ編、第５巻、３１７〜４０２頁、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６１））によって定量し、１分間に２μｍｏｌの無機リン酸を生成させる無機ピロホスファターゼの量を１単位（ユニット）とした。
無機ピロホスファターゼはロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社のものを使用した。
無機ピロホスファターゼの活性の単位（ユニット）は以下に示す方法で算出した。すなわち、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１０ｍＭ無機ピロリン酸を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素試料液を添加し、３７℃で１０分間保温後、沸騰湯浴中で１分間処理することにより反応を停止させた。生成した無機リン酸の量をモリブデンブルー法（“Ｔｒｅａｔｉｓｅ ｏｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”Ｉ． Ｍ．Ｋｏｌｔｈｏｆｆ ＆ Ｐ．Ｊ．Ｅｌｖｉｎｇ編、第５巻、３１７〜４０２頁、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６１））によって定量し、１分間に２μｍｏｌの無機リン酸を生成させる無機ピロホスファターゼの量を１単位（ユニット）とした。
（６）ＡＴＰＳおよびＡＰＳＫの調製
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ＡＴＰＳおよびＡＰＳＫの調製は、実施例１に記載したとおりである。
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ＡＴＰＳおよびＡＰＳＫの調製は、実施例１に記載したとおりである。
（７）ＡＤＫおよびＰＮＤＫを利用した本発明のＡＴＰ供給・再生系を共役させたＰＡＰＳ合成
２５ｍＭ 塩化マグネシウム、２０ｍＭ ＡＭＰ、１００ｍＭ 硫酸ナトリウム、ポリリン酸（リン酸として１００ｍＭ）を含有する５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）にＡＤＫ（０．１ユニット／ｍＬ）、ＰＮＤＫ（０．１ユニット／ｍＬ）、ＡＴＰＳ（０．２５ユニット／ｍＬ）、ＡＰＳＫ（０．２５ユニット／ｍＬ）および無機ピロホスファターゼ（１．０ユニット／ｍＬ）を添加し、３７℃で保温した。反応液組成の経時的変化を図２に示す。該反応においては、生成したＡＴＰの濃度はＡＤＰやＡＭＰのそれに対して高く推移し、４８時間後のＰＡＰＳの生成量は１２．０ｍＭ（対ＡＭＰ転換率６０％）であった。
２５ｍＭ 塩化マグネシウム、２０ｍＭ ＡＭＰ、１００ｍＭ 硫酸ナトリウム、ポリリン酸（リン酸として１００ｍＭ）を含有する５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）にＡＤＫ（０．１ユニット／ｍＬ）、ＰＮＤＫ（０．１ユニット／ｍＬ）、ＡＴＰＳ（０．２５ユニット／ｍＬ）、ＡＰＳＫ（０．２５ユニット／ｍＬ）および無機ピロホスファターゼ（１．０ユニット／ｍＬ）を添加し、３７℃で保温した。反応液組成の経時的変化を図２に示す。該反応においては、生成したＡＴＰの濃度はＡＤＰやＡＭＰのそれに対して高く推移し、４８時間後のＰＡＰＳの生成量は１２．０ｍＭ（対ＡＭＰ転換率６０％）であった。
（８）ＰＡＰおよびＰＮＤＫを利用した本発明のＡＴＰ供給・再生系を共役させたＰＡＰＳ合成
２５ｍＭ 塩化マグネシウム、２０ｍＭ ＡＭＰ、１００ｍＭ 硫酸ナトリウム、ポリリン酸（リン酸として１００ｍＭ）を含有する５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）にＰＡＰ（０．１ユニット／ｍＬ）、ＰＮＤＫ（０．１ユニット／ｍＬ）、ＡＴＰＳ（０．２５ユニット／ｍＬ）、ＡＰＳＫ（０．２５ユニット／ｍＬ）および無機ピロホスファターゼ（１．０ユニット／ｍＬ）を添加し、３７℃で保温した。反応液組成の経時的変化を図３に示す。該反応においても、生成したＡＴＰの濃度はＡＤＰやＡＭＰのそれに対して高く推移し、４８時間後のＰＡＰＳの生成量は１２．３ｍＭ（対ＡＭＰ転換率６２％）であった。
２５ｍＭ 塩化マグネシウム、２０ｍＭ ＡＭＰ、１００ｍＭ 硫酸ナトリウム、ポリリン酸（リン酸として１００ｍＭ）を含有する５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）にＰＡＰ（０．１ユニット／ｍＬ）、ＰＮＤＫ（０．１ユニット／ｍＬ）、ＡＴＰＳ（０．２５ユニット／ｍＬ）、ＡＰＳＫ（０．２５ユニット／ｍＬ）および無機ピロホスファターゼ（１．０ユニット／ｍＬ）を添加し、３７℃で保温した。反応液組成の経時的変化を図３に示す。該反応においても、生成したＡＴＰの濃度はＡＤＰやＡＭＰのそれに対して高く推移し、４８時間後のＰＡＰＳの生成量は１２．３ｍＭ（対ＡＭＰ転換率６２％）であった。
（９）ＰＡＰおよびＰＮＤＫを利用した本発明のＡＴＰ供給・再生系を共役させたＰＡＰＳ合成（大量製造）
容量２Ｌの恒温反応層に、２５ｍＭ 塩化マグネシウム、４０ｍＭ ＡＭＰ、１００ｍＭ 硫酸ナトリウム、ポリリン酸（リン酸として１００ｍＭ）を含有する１Ｌの水溶液を調製し、水酸化ナトリウムにてｐＨを８．０に調整後、３７℃に調温した。これにＰＡＰを５００ユニット、ＰＮＤＫを５００ユニット、ＡＴＰＳを２５０ユニット、ＡＰＳＫを２５０ユニット、および無機ピロホスファターゼを１０，０００ユニット添加し、反応を開始した。反応開始６時間後にさらにポリリン酸（リン酸として１００ｍＭ）を添加した。なお、反応中は水酸化ナトリウムを用いて反応液のｐＨを８．０に維持した。この結果、反応開始３０時間後のＰＡＰＳ生成量は２９．３ｍＭ（対ＡＭＰ転換率７３％）に達した。
容量２Ｌの恒温反応層に、２５ｍＭ 塩化マグネシウム、４０ｍＭ ＡＭＰ、１００ｍＭ 硫酸ナトリウム、ポリリン酸（リン酸として１００ｍＭ）を含有する１Ｌの水溶液を調製し、水酸化ナトリウムにてｐＨを８．０に調整後、３７℃に調温した。これにＰＡＰを５００ユニット、ＰＮＤＫを５００ユニット、ＡＴＰＳを２５０ユニット、ＡＰＳＫを２５０ユニット、および無機ピロホスファターゼを１０，０００ユニット添加し、反応を開始した。反応開始６時間後にさらにポリリン酸（リン酸として１００ｍＭ）を添加した。なお、反応中は水酸化ナトリウムを用いて反応液のｐＨを８．０に維持した。この結果、反応開始３０時間後のＰＡＰＳ生成量は２９．３ｍＭ（対ＡＭＰ転換率７３％）に達した。
比較例１：ＰＰＫおよびＡＤＫの協調作用を利用した従来のＡＴＰ供給・再生系を共役させたＰＡＰＳ合成
２５ｍＭ 塩化マグネシウム、２０ｍＭ ＡＭＰ、１００ｍＭ 硫酸ナトリウム、ポリリン酸（リン酸として１００ｍＭ）を含有する５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）にＰＰＫ（０．１ユニット／ｍＬ）、ＡＤＫ（０．１ユニット／ｍＬ）、ＡＴＰＳ（０．２５ユニット／ｍＬ）、ＡＰＳＫ（０．２５ユニット／ｍＬ）および無機ピロホスファターゼ（１．０ユニット／ｍＬ）を添加し、３７℃で保温した。反応液組成の経時的変化を図４に示す。該反応においては、生成したＡＴＰの濃度はＡＤＰやＡＭＰのそれに対して低く推移し、４８時間後のＰＡＰＳの生成量は２．３ｍＭ（対ＡＭＰ転換率１２％）に過ぎなかった。
２５ｍＭ 塩化マグネシウム、２０ｍＭ ＡＭＰ、１００ｍＭ 硫酸ナトリウム、ポリリン酸（リン酸として１００ｍＭ）を含有する５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）にＰＰＫ（０．１ユニット／ｍＬ）、ＡＤＫ（０．１ユニット／ｍＬ）、ＡＴＰＳ（０．２５ユニット／ｍＬ）、ＡＰＳＫ（０．２５ユニット／ｍＬ）および無機ピロホスファターゼ（１．０ユニット／ｍＬ）を添加し、３７℃で保温した。反応液組成の経時的変化を図４に示す。該反応においては、生成したＡＴＰの濃度はＡＤＰやＡＭＰのそれに対して低く推移し、４８時間後のＰＡＰＳの生成量は２．３ｍＭ（対ＡＭＰ転換率１２％）に過ぎなかった。
比較例２：ＰＡＰおよびＡＤＫを利用した従来のＡＴＰ供給・再生系を共役させたＰＡＰＳ合成
２５ｍＭ 塩化マグネシウム、２０ｍＭ ＡＭＰ、１００ｍＭ 硫酸ナトリウム、ポリリン酸（リン酸として１００ｍＭ）を含有する５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）にＰＡＰ（０．１ユニット／ｍＬ）、ＡＤＫ（０．１ユニット／ｍＬ）、ＡＴＰＳ（０．２５ユニット／ｍＬ）、ＡＰＳＫ（０．２５ユニット／ｍＬ）および無機ピロホスファターゼ（１．０ユニット／ｍＬ）を添加し、３７℃で保温した。反応液組成の経時的変化を図５に示す。該反応においても、生成したＡＴＰの濃度はＡＤＰやＡＭＰのそれに対して低く推移し、４８時間後のＰＡＰＳの生成量は８．２ｍＭ（対ＡＭＰ転換率４１％）に留まった。
２５ｍＭ 塩化マグネシウム、２０ｍＭ ＡＭＰ、１００ｍＭ 硫酸ナトリウム、ポリリン酸（リン酸として１００ｍＭ）を含有する５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）にＰＡＰ（０．１ユニット／ｍＬ）、ＡＤＫ（０．１ユニット／ｍＬ）、ＡＴＰＳ（０．２５ユニット／ｍＬ）、ＡＰＳＫ（０．２５ユニット／ｍＬ）および無機ピロホスファターゼ（１．０ユニット／ｍＬ）を添加し、３７℃で保温した。反応液組成の経時的変化を図５に示す。該反応においても、生成したＡＴＰの濃度はＡＤＰやＡＭＰのそれに対して低く推移し、４８時間後のＰＡＰＳの生成量は８．２ｍＭ（対ＡＭＰ転換率４１％）に留まった。
Claims (13)
- 配列番号９で示される塩基配列中の１０１〜１１７１からなるポリリン酸依存的ヌクレオシド５’−二リン酸キナーゼ（ＰＮＤＫ）をコードするポリヌクレオチドにおいて、Ｎ末端側の７３以上、８３以下のアミノ酸残基相当の塩基配列を欠失したＤＮＡ断片。
- ７３、７７、８０または８３のアミノ酸残基相当分の塩基配列を欠失した、請求項１記載のＤＮＡ断片。
- 請求項１又は２記載のＤＮＡ断片を用い、組換えＤＮＡ法にて調製された、配列番号１０のＮ末端側の７３以上、８３以下のアミノ酸を欠落したアミノ酸配列を有するＰＮＤＫ。
- アデノシン５’−モノリン酸（ＡＭＰ）、ポリリン酸、請求項３記載のポリリン酸依存的ヌクレオシド５’−ジリン酸キナーゼ（ＰＮＤＫ）およびポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素（ＰＡＰ）からなるアデノシン５’−トリリン酸（ＡＴＰ）の供給・再生系。
- アデノシン５’−モノリン酸（ＡＭＰ）、ポリリン酸、請求項３記載のポリリン酸依存的ヌクレオシド５’−ジリン酸キナーゼ（ＰＮＤＫ）およびアデニル酸キナーゼ（ＡＤＫ）からなるアデノシン５’−トリリン酸（ＡＴＰ）の供給・再生系。
- ＡＴＰをエネルギー源および／叉は基質として消費する酵素反応により生成される、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）、糖ヌクレオチド及びＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）から選ばれる有用物質を安価かつ効率的に製造する方法であって、ＡＴＰの代わりに、請求項４又は５記載のＡＴＰの供給・再生系を利用することを特徴とする該有用物質の製造法。
- アデノシン５’−トリリン酸スルフリラーゼ（ＡＴＰＳ）とアデノシン５’−ホスホ硫酸キナーゼ（ＡＰＳＫ）とを用い、ＡＴＰを硫酸化およびリン酸化して３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）を製造する方法において、ＡＴＰの代わりに、請求項４又は５記載のＡＴＰの供給・再生系を利用することを特徴とするＰＡＰＳの製造法。
- ＡＴＰＳとＡＰＳＫとが、ジオバシラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物由来のものである、請求項７記載のＰＡＰＳの製造法。
- ３０〜５０℃の反応温度下、ＰＡＰＳを酵素合成する、請求項８記載のＰＡＰＳの製造法。
- ＡＴＰＳが、配列番号１で示される塩基配列からなり、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のアデノシン５’−トリリン酸スルフリラーゼ（ＡＴＰＳ）をコードするＤＮＡ断片、又は配列番号１で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなり、ＡＴＰＳ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ断片を用い、組換えＤＮＡ手法にてＡＴＰＳ活性を有する粗酵素を調製し、得られた粗酵素を加熱処理することにより得られるＡＴＰＳまたはＡＴＰＳ活性を有する酵素である請求項７〜９のいずれかに記載のＰＡＰＳの製造法。
- 粗酵素の加熱処理が、４５〜６５℃に加熱処理するものである請求項１０記載のＰＡＰＳの製造法。
- ＡＰＳＫが、配列番号２で示される塩基配列からなり、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のアデノシン５’−ホスホ硫酸キナーゼ（ＡＰＳＫ）をコードするＤＮＡ断片、又は配列番号２で示される塩基配列からなり、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなり、ＡＰＳＫ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ断片を用い、組換えＤＮＡ手法にてＡＰＳＫ活性を有する粗酵素を調製し、得られた粗酵素を加熱処理することにより得られるＡＰＳＫまたはＡＰＳＫ活性を有する酵素である請求項７〜１１のいずれかに記載のＰＡＰＳの製造法。
- 粗酵素の加熱処理が、４５〜６５℃に加熱処理するものである請求項１２記載のＰＡＰＳの製造法。
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