JP4010996B2 - デオキシヌクレオシド５’−モノリン酸の製造法 - Google Patents
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Description
本発明は、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼとデオキシヌクレオシドキナーゼとを組み合わせたデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸の製造法、及び上記製造法にアデノシン５’−トリリン酸の酵素的な再生系をさらに併用（カップリング）したデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸の製造法に関するものである。
デオキシヌクレオシド５’−モノリン酸は、種々の医薬品あるいは化成品の原料となる有用な化合物である。特に、遺伝子の解析や診断に使用されているＰＣＲ法の普及により、その基質である４種類のデオキシヌクレオシド５’−トリリン酸もデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸から合成され、その需要も増加している。
このデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸は、デオキシヌクレオシドの５’位を化学的にリン酸化することで合成することが可能である。しかし、デオキシヌクレオシド５’−モノリン酸の化学合成には、（１）原料となるチミジンあるいはデオキシウリジン以外のデオキシヌクレオシド（例えば、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンなど）の安価な製造法が確立されていない、（２）リン酸化効率を高めるためには、原料となるデオシキヌクレオシドの純度を相当高める必要がある、（３）オキシ塩化リン等のリン酸化剤が一般に使用されているが、リン酸化反応は危険を伴い、防爆設備が必要である、（４）リン酸化の効率は５０〜６０％程度であり、低コストでデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸を合成できない、等の問題点を有し、必ずしも実用的な方法にはなり得なかった。
従来、上記（１）の問題を克服するため、安価なチミジンあるいはデオキシウリジンと塩基とを原料として用い、ヌクレオシドホスホリラーゼやヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを作用させて目的とするデオキシヌクレオシドを合成する方法も開発されている（Journal of Biotechnology, 23, 193-210 (1992)）。
しかし、上記反応に使用する酵素は可逆的な反応を触媒するため、目的とするデオキシヌクレオシドの生成効率は決して高くない。例えば、チミジンあるいはデオキシウリジンとシトシンとを原料として用い、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを作用させてデオキシシチジンを合成する場合、その生成効率は、対チミジン当たりのモル収率で５０％程度である（Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, 989-995 (2003)）。
Journal of Biotechnology, 23, 193-210 (1992)
Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, 989-995 (2003)
本発明者は、より効率的なデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸の酵素合成法を開発すべく、鋭意検討を重ねた結果、安価なデオキシヌクレオシドであるチミジンあるいはデオキシウリジンと塩基とを原料に、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを作用させてチミジンあるいはデオキシウリジンのデオキシリボース基を塩基に転移させると同時に、デオキシヌクレオシドキナーゼを作用させて生成したデオキシヌクレオシドを酵素的にリン酸化させることで、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ反応の平衡が傾き、結果として目的とするデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸を収率良く合成できることを見出した。
この知見を基に、さらに検討を重ね、デオキシヌクレオシドキナーゼによる酵素的なリン酸化反応において、アデニレートキナーゼ（ＡＤＫ）とアデノシン５’−モノリン酸：ポリリン酸リン酸転移酵素（ＰＡＰ）の組み合わせからなる酵素を用い、アデノシン５’−モノリン酸（ＡＭＰ）を基質、ポリリン酸をリン酸ドナーとするアデノシン５’−トリリン酸（ＡＴＰ）再生系を組み合わせることで、高価ＡＴＰを使用しない、安価なデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸の合成法の開発に成功し、本発明を完成させた。
したがって、本発明は、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼとデオキシヌクレオシドキナーゼを併用し、下記反応によりデオキシヌクレオシド（ｄＲ−Ａ）と塩基（Ｂ）からデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸（ｄＲ-Ｂ−Ｐ）を合成することを特徴とする、デオキシヌクレオシド５’−モノリン酸の製造法に関するものである。
ｄＲ−Ａ ＋ Ｂ → ｄＲ−Ｂ ＋ Ａ
Ｅ１ ↓Ｅ２＋ＡＴＰ
ｄＲ-Ｂ−Ｐ ＋ＡＤＰ（またはＡＭＰ）
（式中、ｄＲはデオキシリボシル基、Ａ及びＢは塩基（但し、ＡとＢの塩基は同一の塩基ではない。）、ＡＴＰはアデノシン５’−トリリン酸、ＡＤＰはアデノシン５’−ジリン酸、ＡＭＰはアデノシン５’−モノリン酸、Ｅ１はヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ、Ｅ２はデオキシヌクレオシドキナーゼをそれぞれ示す。）
Ｅ１ ↓Ｅ２＋ＡＴＰ
ｄＲ-Ｂ−Ｐ ＋ＡＤＰ（またはＡＭＰ）
（式中、ｄＲはデオキシリボシル基、Ａ及びＢは塩基（但し、ＡとＢの塩基は同一の塩基ではない。）、ＡＴＰはアデノシン５’−トリリン酸、ＡＤＰはアデノシン５’−ジリン酸、ＡＭＰはアデノシン５’−モノリン酸、Ｅ１はヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ、Ｅ２はデオキシヌクレオシドキナーゼをそれぞれ示す。）
また、本発明は、上記のデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸の製造法において、デオキシヌクレオシドキナーゼ反応で消費されるアデノシン５’−トリリン酸（ＡＴＰ）の再生系を更にカップリングさせた、デオキシヌクレオシド５’−モノリン酸の製造法に関するものである。
ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの反応は平衡反応であるため、反応が平衡に達すると触媒反応は進行しなくなる。しかし、本発明では、デオキシヌクレオシドキナーゼを用い、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ反応で生成したデオキシヌクレオシドをデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸に変換させることでヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ反応の平衡を崩し、目的とするデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸の収率を格段に向上させることができる。
また、このヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼとデオキシヌクレオシドキナーゼの反応に、さらにポリリン酸をリン酸ドナーとする酵素的ＡＴＰ再生系を併用（カップリング）することで、高価なＡＴＰを使用することなく、ＡＴＰを再生利用することができ、さらに効率良く、しかも低コストでデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸を製造することが可能である。
さらに、本発明では、原料であるデオキシヌクレオシドと塩基から目的物のデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸を合成するため、原料と目的物の物性がかなり異なるため、目的物の単離精製は極めて容易である。
本発明は、上述の反応によりデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸を製造しようとするものである。すなわち、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼによりデオキシヌクレオシド（ｄＲ−Ａ）のデオキシリボシル基を塩基（Ｂ）に転移させ目的とするデオキシヌクレオシド（ｄＲ−Ｂ）を生成させるとともに、生成したデオキシヌクレオシド（ｄＲ−Ｂ）をデオキシヌクレオシドキナーゼの作用でリン酸化して、デオキシヌクレオシド５’−モノリン酸（ｄＲ-Ｂ−Ｐ）を生成させるというものである。
本発明で使用するヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼおよびデオキシヌクレオシドキナーゼは、いずれも公知の酵素であり、動物由来、植物由来、微生物由来など特定のものに限定されず、すべての由来のものを使用することができる。
しかし、酵素調製の簡便性などの点から微生物由来の酵素を使用するのが好都合である。たとえば、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼは乳酸菌に属する微生物から容易に調製できる（Methods in Enzymology,Vol.LI.446(1978)、J. Am. Chem. Soc., 79, 630-633(1957)、J. Biol. Chem., 242, 740-746(1967)等参照）。また、デオキシヌクレオシドキナーゼは、例えば枯草菌などのバチラス属菌株から容易に調製できる（J. Biol. Chem., 276, 5518-1124 (2001)）。
微生物を培養するための培地としては、これらの微生物が資化可能な炭素源及び窒素源を適当量含有し、必要に応じて金属塩、微量発育促進物質、消泡剤などを添加したものが使用される。具体的には、培地成分としては糖類（グルコース、サッカロースなど）、天然炭水化物（糖蜜、廃糖蜜、澱粉、麦、ふすま、米など）、アルコール類、脂肪酸類、炭化水素類など、窒素源としては、肉エキス、酵母エキス、大豆加水分解物など、金属塩としては亜鉛、鉄、マグネシウムなどのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩など、微量発育促進物質としては、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビオチンなどがあげられる。
培養は、通常の液体培養法（振とう培養、通気撹拌培養、静置培養、連続培養など）によって、２０〜５０℃の温度条件下で必要により通気攪拌しながら、目的とする酵素活性が十分得られるまで行えばよい。
このようにして得られた培養物を用い、使用目的に応じ適宜処理加工したものを酵素調製物として本発明に使用する。そのような酵素調製物としては特に制限されるものではなく、例えば、微生物の培養物自体、培養物から通常の分離手段（遠心分離、沈殿分離、凝集分離、洗浄など）によって分離された菌体、またはその菌体処理物を例示することができる。菌体処理物をさらに具体的に例示すれば、生菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波処理、フレンチプレス処理などにより物理的に菌体を破砕するか、あるいはリゾチーム処理など酵素的に溶菌させた後、菌体残渣を遠心分離により除去した無細胞抽出液を挙げることができる。さらに、この無細胞抽出液を熱処理、硫安塩析処理、透析処理、エタノールなどの溶媒処理、各種クロマトグラフィー処理などの酵素精製に通常使用されている処理を単独で、または数種組み合わせて得られる粗精製酵素、精製酵素を例示することもできる。
さらに、上記の両酵素の遺伝子ともクローニングされており、クローン化されたＤＮＡ断片を用い、公知の組換えＤＮＡ手法で目的とする酵素を調製することも可能である（J. Biol. Chem., 276, 5518-1124 (2001) など参照）。すわなち、遺伝子のクローニング、クローン化したＤＮＡ断片を用いた発現ベクターの調製、当該発現ベクターを用いた目的とする酵素活性を有する酵素の調製などは、分子生物学の分野に属する技術者にとっては周知の技術であり、例えば「Molecular Cloning」(Maniatis ら編 Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor New York(1982))に記載の方法に従って行うことができる。
本発明で使用するＡＴＰ再生系はポリリン酸をリン酸ドナーとして酵素的にＡＴＰを再生できるものであればいずれも使用可能である。ポリリン酸キナーゼを用いる方法（Biochim. Biophys. Acta, 26, 294-300 (1956), Agric. Biol. Chem., 52, 1471-1477 (1988), J. Bacteriol., 177, 491-496 (1995)）、ポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼの組み合わせ(Biochemistry(Moscow), 65, 315-323 (2000), Porc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 14168-14171 (2000))、ポリリン酸：アデノシン５’−モノリン酸リン酸転移酵素とアデニレートキナーゼの組み合わせ (J. Bacteriol., 177, 491-496 (1995), Appl. Environ. Microbiol., 66, 2045 (2000), 生物工学会誌 第80巻 p590 (2002))、あるいはポリリン酸キナーゼとポリリン酸：アデノシン５’−モノリン酸リン酸転移酵素の組み合わせ(J. Biosci. Bioeng., 91, 557-563 (2001))などが例示される。
これらの酵素も、前述のヌクレオシドデオキシリボシルトランスフェラーゼやデオキヌクレオシドキナーゼと同様な方法で調製することが可能である。なお、上記の酵素の遺伝子もいくつかクローニングされており、クローン化されたＤＮＡ断片を用い、公知の組換えＤＮＡ手法で目的とする酵素を調製することも可能である（J. Biol. Chem., 268, 633-639 (1993), Biosci. Biotechnol. Biochem., 62, 1594-1596 (1998), Porc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 14168-14171 (2000)参照）。
原料として使用するデオキシヌクレオシドとしては、市販のものが使用でき、特に、チミジンあるいはデオキシウリジンが好適である。
また、原料として使用する塩基としては、合成目的のデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸の塩基に応じて公知の塩基類から種々選択すればよく、具体的には複素環塩基または置換基（例えばアミノ基、置換アミノ基、水酸基、オキソ基、メルカプト基、アシル基、アルキル基、置換アルキル基、アルコキシル基、ハロゲン原子など）を有する誘導体を例示することができる。
複素環塩基の具体例としては、たとえば、プリン及びその誘導体、ピリミジン及びその誘導体、トリアゾール及びその誘導体、イミダゾール及びその誘導体、デアザプリン及びその誘導体、アザプリン及びその誘導体、アザピリミジン及びその誘導体またはピリジン及びその誘導体などである。
具体的には、プリン塩基およびその誘導体としてはグアニン、キサンチン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、Ｎ6−アルキルもしくはアシルアデニン、２−アルコキシアデニン、２−チオアデニン、２，６−ジアミノプリンなど、ピリミジンおよびその誘導体としてはシトシン、ウラシル、チミン、５−ハロゲノウラシル（５−フルオロウラシル、５−ヨードウラシルなど）、５−ハロゲノシトシン（５−フルオロシトシンなど）、５−トリハロゲノメチルウラシル（５−トリフルオロメチルウラシルなど）、２−チオシトシン、４−チオウラシル、Ｎ4−アシルシトシン、５−ハロゲノビニルウラシルなど、トリアゾールおよびその誘導体としては、１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド、１，２，４−トリアゾール−３−カルボン酸、１，２，４−トリアゾール−３−カルボン酸アルキルエステルなど、イミダゾールおよびその誘導体としては５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミド、４−カルバモイル−イミダゾリウム−５−オレート、ベンズイミダゾールなど、デアザプリンおよびその誘導体としては１−デアザアデニン、３−デアザアデニン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニンなど、アザプリンおよびその誘導体としては８−アザアデニン、７−デアザ−８−アザヒポキサンチン（アロプリノール）など、アザピリミジンおよびその誘導体としては５−アザチミン、５−アザシトシン、６−アザウラシルなど、またはピリジンおよびその誘導体としては３−デアザウラシル、ニコチン酸、ニコチン酸アミドなどが例示される。
デオキシヌクレオシド５’−モノリン酸の合成反応は、１０ｍＭ以上、好ましくは２０ｍＭ以上、さらに好ましくは４０〜５００ｍＭ濃度になるようにデオキシヌクレオシドと適当濃度の塩基、及び０．１ｍＭ以上のアデノシン５’−トリリン酸（ＡＴＰ）を水または緩衝液（ｐＨ３〜１０）に溶解または懸濁させ、０．００１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．０１ユニット／ｍｌ以上のヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼと、０．０１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．１ユニット／ｍｌ以上のデオキシヌクレオシドキナーゼを使用し、１０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃の温度条件下で１０分〜５０時間程度、必要により攪拌しながら反応させることにより実施することができる。
また、ＡＴＰ再生系をカップリングしたデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸の合成反応は、１０ｍＭ以上、好ましくは２０ｍＭ以上、さらに好ましくは４０〜５００ｍＭ濃度になるようにデオキシヌクレオシドと適当濃度の塩基、及び０．１ｍＭ以上のアデノシン５’−モノリン酸（もしくはアデノシン５’−ジリン酸）、さらには無機リン酸として１０ｍＭ以上、好ましくは５０ｍＭ以上となるようにポリリン酸を水または緩衝液（ｐＨ３〜１０）に溶解または懸濁させ、０．００１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．０１ユニット／ｍｌ以上のヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼと、０．０１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．１ユニット／ｍｌ以上のデオキシヌクレオシドキナーゼとＡＴＰ再生酵素（例えば、ポリリン酸：アデノシン５’−モノリン酸リン酸転移酵素とアデニレートキナーゼ）を使用し、１０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃の温度条件下で１０分〜５０時間程度、必要により攪拌しながら反応させることにより実施することができる。
反応終了後、生成したデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸は核酸関連物質の精製法として通常使用されている方法あるいはこれを応用した方法によって分離精製することができる。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過法など各種のクロマトグラフィー、向流分配、向流抽出など、二液相間の分配を利用する方法、また、濃縮、冷却、有機溶媒添加など、溶解度の差を利用する方法などのデオキシヌクレオチドの分離精製で使用されている一般的な分離精製法を単独で、あるいは適宜組み合わせて行なえばよい。
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。なお、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Molecular Cloning」（前述）にしたがって行った。また、各種制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等は、特記しない限り、宝バイオ（株）より入手した。
（１）ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩの調製
乳酸菌ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩは、文献（Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 2243-2245 (2000), Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, 989-995 (2003)）記載の方法で調製した。なお、活性は、５ｍＭの２’−デオキシアデノシンとシトシン、またはチミジンとシトシンを基質にして測定した。すなわち、反応液に菌体抽出液を加えて反応を開始し、１分間煮沸することにより酵素を失活させた。３７℃における２’−デオキシシチジンの生成量を高速液体クロマトグラフィーにより定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅの２’−デオキシシチジンを生成する活性を１単位（ユニット）とした。得られた酵素標品の比活性は、３６ユニット／ｍｇ蛋白質であった。
乳酸菌ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩは、文献（Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 2243-2245 (2000), Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, 989-995 (2003)）記載の方法で調製した。なお、活性は、５ｍＭの２’−デオキシアデノシンとシトシン、またはチミジンとシトシンを基質にして測定した。すなわち、反応液に菌体抽出液を加えて反応を開始し、１分間煮沸することにより酵素を失活させた。３７℃における２’−デオキシシチジンの生成量を高速液体クロマトグラフィーにより定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅの２’−デオキシシチジンを生成する活性を１単位（ユニット）とした。得られた酵素標品の比活性は、３６ユニット／ｍｇ蛋白質であった。
（２）枯草菌デオキシシチジン／デオキシアデノシンキナーゼ（ＹａａＦ）の調製
（２−１）ＹａａＦ生産菌の造成
枯草菌（ＡＴＣＣ ２３８５７）の染色体ＤＮＡを鋳型として，以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により枯草菌デオキシシチジン／デオキシアデノシンキナーゼ遺伝子（ｙａａＦ）（J. Biol. Chem., 276, 5518-1124 (2001)）を増幅した。
（２−１）ＹａａＦ生産菌の造成
枯草菌（ＡＴＣＣ ２３８５７）の染色体ＤＮＡを鋳型として，以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により枯草菌デオキシシチジン／デオキシアデノシンキナーゼ遺伝子（ｙａａＦ）（J. Biol. Chem., 276, 5518-1124 (2001)）を増幅した。
プライマー（Ａ）： ５’-ATGGATCCATGAAGGAACATCATATCCCTA-３’
プライマー（Ｂ）： ５’-ATAAGCTTCGATACGGAGGAATACCCAAGTCC-３’
プライマー（Ｂ）： ５’-ATAAGCTTCGATACGGAGGAATACCCAAGTCC-３’
ＰＣＲによるｙａａＦ遺伝子の増幅は、反応液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．００１％ ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々 ０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、２分）、伸長反応（７２℃、３分）のステップを３０回繰り返すことにより行った。
増幅した０．９ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、回収したＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同様に制限酵素処理したプラスミドｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ（ニューイングランドバイオラボ社）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体より、プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２Ｘのｔａｃプロモーターの下流のマルト−ス結合領域（ＭａｌＥ）に連結した形でｙａａＦ遺伝子が挿入された組換えプラスミドｐＭＹＦ１−７を単離した。このプラスミド保持菌は、ＭａｌＥがアミノ末端に結合した６５ｋＤaのＹａａＦ融合蛋白質を生産する。
（２−２）ＹａａＦの調製
上記の組換えベクターを保持する大腸菌形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で振盪培養した。４×ｌ０8個／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で５時間振盪培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ、１０分間）により培養菌体を回収し、１０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。
上記の組換えベクターを保持する大腸菌形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で振盪培養した。４×ｌ０8個／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で５時間振盪培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ、１０分間）により培養菌体を回収し、１０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。
菌体懸濁液を超音波破砕機にて処理して、さらに遠心分離（１０，０００×ｇ、１０分間）により菌体残渣を除去し、得られた上清画分を無細胞抽出液とした。調製した無細胞抽出液中のデオキシシチジンキナーゼ活性を測定したところ、１．２ユニット／ｍｇ蛋白質の活性が検出された。なお、デオキシシチジン／デオキシアデノシンキナーゼ活性は以下に示す方法で測定、算出したものであり、１単位（ユニット）とは、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅの２’−デオキシシチジンをリン酸化して２’−デオキシシチジン５’−モノリン酸（ｄＣＭＰ）を生成する活性を示す。
＜デオキシシチジン／デオキシアデノシンキナーゼの活性測定＞
２０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ ２’−デオキシシチジン、５ｍＭ ＡＴＰを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に酵素標品を添加して、３７℃で保温することで反応を行い、１００℃、１分間の熱処理により反応を停止させ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のｄＣＭＰを定量する。
２０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ ２’−デオキシシチジン、５ｍＭ ＡＴＰを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に酵素標品を添加して、３７℃で保温することで反応を行い、１００℃、１分間の熱処理により反応を停止させ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のｄＣＭＰを定量する。
上記の無細胞抽出液を用いてデオキシシチジン／デオキシアデノシンキナーゼ（ＭａｌＥ−ＹａａＦ融合酵素）以下のように精製した。すなわち、あらかじめ緩衝液Ａ（２０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．４）、０．２Ｍ 塩化ナトリウム、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で平衡化したアミロースレジン（ニューイングランドバイオラボ社製）に無細胞抽出液をロードし、カラム容積の１０倍容の緩衝液Ａで洗浄し、次に１０ｍＭ マルト−スを含有する緩衝液Ａを用いてレジンに吸着したＭａｌＥ−ＹａａＦ融合酵素を溶出した。回収液におけるデオキシシチジン／デオキシアデノシンキナーゼの比活性は、５．６ユニット／ｍｇ蛋白質であった。
（３）大腸菌アデニレートキナーゼ（ＡＤＫ）の調製
大腸菌アデニレートキナーゼは、文献（Porc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 14168-14171 (2000)）記載の方法で調製した。なお、活性は、１０ｍＭのＡＴＰと１０ｍＭのＡＭＰを基質にして測定した。すなわち、反応液に酵素液を加えて反応を開始し、１分間煮沸することにより酵素を失活させた。３７℃におけるアデノシン５’−ジリン酸（ＡＤＰ）の生成量を高速液体クロマトグラフィーにより定量し、３７℃で１分間に２μｍｏｌｅのＡＤＰを生成する活性を１単位（ユニット）とした。得られた酵素標品の比活性は、５,０００ユニット／ｍｇ蛋白質であった。
大腸菌アデニレートキナーゼは、文献（Porc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 14168-14171 (2000)）記載の方法で調製した。なお、活性は、１０ｍＭのＡＴＰと１０ｍＭのＡＭＰを基質にして測定した。すなわち、反応液に酵素液を加えて反応を開始し、１分間煮沸することにより酵素を失活させた。３７℃におけるアデノシン５’−ジリン酸（ＡＤＰ）の生成量を高速液体クロマトグラフィーにより定量し、３７℃で１分間に２μｍｏｌｅのＡＤＰを生成する活性を１単位（ユニット）とした。得られた酵素標品の比活性は、５,０００ユニット／ｍｇ蛋白質であった。
（４）Acinetobacter Johnsoniiのポリリン酸：アデノシン５’−モノリン酸リン酸転移酵素（ＰＡＰ）の調製
（４−１）Acinetobacter johnsonii 210株のＰＡＰ遺伝子のクローニング
文献（J. Biosci. Bioeng., 91, 557-563 (2001)）に記載された方法で大腸菌ポリリン酸キナーゼを調製した。さらに調製した大腸菌ポリリン酸キナーゼを用いて秋山らの方法（J. Biol. Chem., 268, 633-639 (1993)）に従い放射性標識ポリリン酸を調製した。
（４−１）Acinetobacter johnsonii 210株のＰＡＰ遺伝子のクローニング
文献（J. Biosci. Bioeng., 91, 557-563 (2001)）に記載された方法で大腸菌ポリリン酸キナーゼを調製した。さらに調製した大腸菌ポリリン酸キナーゼを用いて秋山らの方法（J. Biol. Chem., 268, 633-639 (1993)）に従い放射性標識ポリリン酸を調製した。
Acinetobacter johnsonii 210A株をＬＢ培地に植菌し、３０℃で一晩振とう培養した。遠心分離により菌体を回収し、染色体ＤＮＡを精製した。Acinetobacter johnsonii染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解した後、蔗糖密度勾配遠心により分画し、約７−１０ｋｂの画分を回収した。該ＤＮＡ断片とＢａｍＨＩで切断したプラスミドベクターpBlueScript SK(+)（東洋紡より購入）をT4 DNA ligaseにより連結し、該ＤＮＡ液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造より購入）を形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換体６０００株を単離し、５０ずつグループ化した。
各グループをＬＢ培地で３７℃で一晩培養し、遠心分離により菌体を回収後２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で菌体を洗浄し、同緩衝液で菌体を再縣濁した。菌体縣濁液に等量のBugBuster（宝バイオより購入）を加え、室温で３０分放置し溶菌させたのち、３倍容の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えて、菌体抽出液とした。
先に調製した放射性標識ポリリン酸（リン酸として０．２４ｍＭ）を含有する活性検出液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），４０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４， ４ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＡＭＰ）２０mｌに菌体抽出液１mｌを加え、３７℃で１時間反応させた。該反応液を薄層クロマトグラフィー（展開液：０．７５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ３．５））にかけ、ホスホイメージアナライザーＢＡＳＳ２０００（Ｆｕｊｉｘ製）でＡＤＰの生成を検出することで、得られた形質転換体のスクリーニングを行い、６０００株中１クローンにＰＡＰ活性が検出された。
得られたクローンより、Acinetobacter johnsonii 210A株のＰＡＰ遺伝子が挿入されたプラスミドｐＰＡＰ２を得た（図１）。なお、プラスミドｐＰＡＰ２は、約１０ｋｂのAcinetobacter johnsonii 210A株の染色体ＤＮＡが挿入されており、プラスミドＤＮＡ（ｐＰＡＰ２）の表記で、平成１４年（２００２）５月２１日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許微生物寄託センターにブタペスト条約に基づく国際寄託がなされ、受託番号としてＦＥＲＭ ＢＰ−８０４７を与えられている。
（４−２）Acinetobacter johnsonii ＰＡＰの調製
プラスミドｐＰＡＰ２を保持する大腸菌ＪＭ１０９菌をアンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含有する２ｘＹＴ培地で２８℃で一晩培養した。遠心分離により菌体を回収し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．８），１ｍＭ ＥＤＴＡからなる緩衝液に縣濁し、超音波処理後、遠心分離により菌体抽出液を回収した。該抽出液をＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ（トーソー）によるイオン交換クロマトグラフィー（溶出液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．８）， ０〜０．５Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配）で分画することで、ＰＡＰを部分精製し、回収された画分を酵素標品とした。なお、該画分におけるＰＡＰの比活性は、８０．５ユニット／ｍｇ蛋白質であった。ただし、１単位（ユニット）とは、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＡＤＰを生成する活性を示し、以下の条件で測定する。
プラスミドｐＰＡＰ２を保持する大腸菌ＪＭ１０９菌をアンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含有する２ｘＹＴ培地で２８℃で一晩培養した。遠心分離により菌体を回収し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．８），１ｍＭ ＥＤＴＡからなる緩衝液に縣濁し、超音波処理後、遠心分離により菌体抽出液を回収した。該抽出液をＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ（トーソー）によるイオン交換クロマトグラフィー（溶出液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．８）， ０〜０．５Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配）で分画することで、ＰＡＰを部分精製し、回収された画分を酵素標品とした。なお、該画分におけるＰＡＰの比活性は、８０．５ユニット／ｍｇ蛋白質であった。ただし、１単位（ユニット）とは、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＡＤＰを生成する活性を示し、以下の条件で測定する。
＜測定条件＞
２０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ ＡＭＰ、及びポリリン酸（無機リン酸として３０ｍＭ）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品を添加して、３７℃で保温することで反応を行い、１００℃、１分間の熱処理により反応を停止させ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のＡＤＰを定量する。
２０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ ＡＭＰ、及びポリリン酸（無機リン酸として３０ｍＭ）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品を添加して、３７℃で保温することで反応を行い、１００℃、１分間の熱処理により反応を停止させ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のＡＤＰを定量する。
（５） ２’−デオキシシチジン５’−モノリン酸（ｄＣＭＰ）の合成
４０ｍＭ チミジン、４０ｍＭ シトシン、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、４ｍＭ ＡＭＰ、無機リン酸として１００ｍＭのポリリン酸（シグマ社製）を含有する ２５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）にヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ ０．１ユニット／ｍｌ、大腸菌ＡＤＫ ０．２ユニット／ｍｌ、ＰＡＰ ０．２ ユニット／ｍｌ、デオキシシチジン／デオキシアデノシンキナーゼ（ＭａｌＥ−ＹａａＦ融合酵素） ０．４ユニット／ｍｌとなるように酵素を添加し、３７℃で２４時間反応させた。その結果、３３．１５ｍＭのｄＣＭＰの生成が確認された。この生成量は、対チミジンモル収率８２．９％である。
４０ｍＭ チミジン、４０ｍＭ シトシン、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、４ｍＭ ＡＭＰ、無機リン酸として１００ｍＭのポリリン酸（シグマ社製）を含有する ２５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）にヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ ０．１ユニット／ｍｌ、大腸菌ＡＤＫ ０．２ユニット／ｍｌ、ＰＡＰ ０．２ ユニット／ｍｌ、デオキシシチジン／デオキシアデノシンキナーゼ（ＭａｌＥ−ＹａａＦ融合酵素） ０．４ユニット／ｍｌとなるように酵素を添加し、３７℃で２４時間反応させた。その結果、３３．１５ｍＭのｄＣＭＰの生成が確認された。この生成量は、対チミジンモル収率８２．９％である。
なお、同様の反応条件で、大腸菌ＡＤＫ、ＰＡＰ及びデオキシシチジン／デオキシアデノシンキナーゼ（ＭａｌＥ−ＹａａＦ融合酵素）を添加せず行った場合の２’−デオキシシチジンの生成量は、対チミジンモル収率４８．０％であり、本発明方法により、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの反応平衡が崩れ、格段に収率が向上することが明らかとなった。
（６）２’−デオキシアデノシン５’−モノリン酸（ｄＡＭＰ）の合成
４０ｍＭ チミジン、４０ｍＭ アデニン、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、４ｍＭ ＡＭＰ、無機リン酸として１００ｍＭのポリリン酸（シグマ社製）を含有する ２５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）にヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ ０．１ユニット／ｍｌ、大腸菌ＡＤＫ ０．２ユニット／ｍｌ、ＰＡＰ ０．２ユニット／ｍｌ、デオキシシチジン／デオキシアデノシンキナーゼ（ＭａｌＥ−ＹａａＦ融合酵素） ０．４ユニット／ｍｌとなるように酵素を添加し、３７℃で２１時間反応させた。その結果、２５．６２ｍＭのｄＡＭＰの生成が確認された。この生成量は、対チミジンモル収率６４．１％である。
４０ｍＭ チミジン、４０ｍＭ アデニン、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、４ｍＭ ＡＭＰ、無機リン酸として１００ｍＭのポリリン酸（シグマ社製）を含有する ２５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）にヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ ０．１ユニット／ｍｌ、大腸菌ＡＤＫ ０．２ユニット／ｍｌ、ＰＡＰ ０．２ユニット／ｍｌ、デオキシシチジン／デオキシアデノシンキナーゼ（ＭａｌＥ−ＹａａＦ融合酵素） ０．４ユニット／ｍｌとなるように酵素を添加し、３７℃で２１時間反応させた。その結果、２５．６２ｍＭのｄＡＭＰの生成が確認された。この生成量は、対チミジンモル収率６４．１％である。
<受託証＞
SEQUENCE LISTING
<110> Yamasa Corporation
<120> Process for producing deoxynucleoside 5'-monophosphate
<130> YP2003-006
<140>
<141>
<160> 2
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplification of yaaF gene
<400> 1
atggatccat gaaggaacat catatcccta 30
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplification of yaaF gene
<400> 2
ataagcttcg atacggagga atacccaagt cc 32
<110> Yamasa Corporation
<120> Process for producing deoxynucleoside 5'-monophosphate
<130> YP2003-006
<140>
<141>
<160> 2
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplification of yaaF gene
<400> 1
atggatccat gaaggaacat catatcccta 30
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplification of yaaF gene
<400> 2
ataagcttcg atacggagga atacccaagt cc 32
Claims (8)
- ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼとデオキシヌクレオシドキナーゼを併用し、下記反応によりデオキシヌクレオシド（ｄＲ−Ａ）と塩基（Ｂ）からデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸（ｄＲ-Ｂ−Ｐ）を合成することを特徴とする、デオキシヌクレオシド５’−モノリン酸の製造法。
ｄＲ−Ａ ＋ Ｂ → ｄＲ−Ｂ ＋ Ａ
Ｅ１ ↓Ｅ２＋ＡＴＰ
ｄＲ-Ｂ−Ｐ ＋ＡＤＰ（またはＡＭＰ）
（式中、ｄＲはデオキシリボシル基、Ａ及びＢは塩基（但し、ＡとＢの塩基は同一の塩基ではない。）、ＡＴＰはアデノシン５’−トリリン酸、ＡＤＰはアデノシン５’−ジリン酸、ＡＭＰはアデノシン５’−モノリン酸、Ｅ１はヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ、Ｅ２はデオキシヌクレオシドキナーゼをそれぞれ示す。） - デオキシヌクレオシド（ｄＲ−Ａ）が、２’−デオキシウリジンまたはチミジンである、請求項１記載の製造法。
- 塩基（Ｂ）が、グアニン、アデニン、シトシン、又はその誘導体である、請求項１記載の製造法。
- 請求項１記載のデオキシヌクレオシド５’−モノリン酸の製造法において、デオキシヌクレオシドキナーゼ反応で消費されるアデノシン５’−トリリン酸（ＡＴＰ）の再生系を更にカップリングさせた、デオキシヌクレオシド５’−モノリン酸の製造法。
- デオキシヌクレオシド（ｄＲ−Ａ）が、２’−デオキシウリジンまたはチミジンである、請求項４記載の製造法。
- 塩基（Ｂ）が、グアニン、アデニン、シトシン、又はその誘導体である、請求項４記載の製造法。
- アデノシン５’−トリリン酸（ＡＴＰ）の再生系が、ポリリン酸をリン酸ドナーとした酵素的なＡＴＰ再生系である、請求項４記載の製造法。
- アデノシン５’−トリリン酸（ＡＴＰ）の再生系が、ポリリン酸キナーゼを用いる系、ポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼを用いる系、ポリリン酸：アデノシン５’−モノリン酸リン酸転移酵素とアデニレートキナーゼを用いる系、あるいはポリリン酸キナーゼとポリリン酸：アデノシン５’−モノリン酸リン酸転移酵素を用いる系から選ばれたものである、請求項４記載の製造法。
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