JP3729712B2 - デオキシヌクレオシドの酵素的製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼとアデニン・デアミナーゼとを併用（カップリング）したデオキシヌクレオシドの効率的な製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
デオキシヌクレオシド類は、アンチセンス医薬品（デオキシヌクレオチドのオリゴマーなど）を初めとする種々の医薬品の原料などに有用な化合物である。
従来、これらのデオキシヌクレオシド類は、化学的に合成するか、白子などのＤＮＡを酵素分解することにより調製されていた。さらに、最近、酵素を用いたデオキシヌクレオシド類の合成法も報告されており、それらは主にヌクレオシド・ホスホリラーゼやヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを用いた方法である（Journal of Biotechnology,23,193-210(1992)）。
【０００３】
ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ（E.C.2.4.2.6.、別名：トランス−Ｎ−デオキシリボシラーゼ）は、デオキシヌクレオシドのデオキシリボシル基を他の塩基に転移する反応を触媒する酵素である。例えばラクトバシラス属に属する乳酸菌の一種であるラクトバシラス・ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）やラクトバシラス・ライヒマンニ（Lactobacillus leichmannii）にはヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−Ｉと同−ＩＩの２種類の酵素が存在し、それらの酵素学的諸性質も既に報告されている（Methods in Enzymology,Vol.LI.446(1978)、Biol.chem.Hoppe-Seyler,Vol.377,357-362(1996)）。さらに、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを利用した２’，３’−ジデオキシヌクレオシドの合成も既に報告されている（ＷＯ９０／０６３１２、ＷＯ９１／０４３２２、Biochemical And Biophysical Reserch Communications,Vol.155,No.2,829-834(1988)）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼが触媒する反応は平衡反応であるため、反応が平衡に達するとそれ以上の反応は進行せず、目的とするデオキシヌクレオシドの合成収率の向上には限界があった。
従来、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを用いた酵素反応における上記の問題点を克服するための方策は何ら報告されていない。しかし、同様の問題を抱えるヌクレオシド・ホスホリラーゼにおいては、目的とするデオキシヌクレオシド合成反応の方へ平衡反応を傾かせ、合成収率を向上させるための工夫がいくつか報告されている。たとえば、ヌクレオシド・ホスホリラーゼを用いデオキシイノシンと塩基からデオキシヌクレオシドを製造する方法において、生成するヒポキサンチンをオキシダーゼなどを用いて尿酸など反応の基質になりえない物質に変換させ、目的とするデオキシヌクレオシドの合成収率を向上させる方法などが提案されている（特開平５−４９４９３、特開平９−２１５４９８、特開平１１−４６７９０）。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記のヌクレオシド・ホスホリラーゼで提案されている収率向上のための方法を参考に、鋭意検討を重ねた結果、まったく意外なことに、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを用いてデオキシアデノシンと塩基とからデオキシヌクレオシドを製造する際、生成したアデニンをアデニン・デアミナーゼを用いてヒポキサンチンに変換させることにより目的とするデオキシヌクレオシドの収率が格段に向上することを見出した。
【０００６】
一般に、ヒポキサンチンがヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの基質となることは古くから知られており、アデニンをヒポキサンチンに変換したとしても目的外のデオキシイノシンが生成し、目的とするデオキシヌクレオシドの収率が向上するとは到底考えられていなかった。事実、ヌクレオシド・ホスホリラーゼを用いた反応においても、ヒポキサンチンはヌクレオシド・ホスホリラーゼの基質となり得るため、生成したヒポキサンチンをオキシダーゼ等で尿素まで変換しないと目的とするデオキシヌクレオシドの収率を向上させることはできない。
【０００７】
この点を更に検討した結果、（１）ヒポキサンチンは、濃度が薄い場合のみヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの基質となり得、デオキシヌクレオシドの製造の際に用いるような通常の濃度では基質になり得ないこと、（２）このため、アデニンをアデニン・デアミナーゼを用いてヒポキサンチンに変換したとしても、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼによりデオキシイノシンはまったく生成しないか、生成してもごく僅かであり、ヒポキサンチンがヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを用いたデオキシヌクレオシドの製造に悪影響を及ぼさないことを確認し、本発明を完成させた。
したがって、本発明は、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを用いてデオキシアデノシンと塩基とからデオキシヌクレオシドを製造する際、デオキシアデノシンを１０〜５００ｍＭの濃度で用い、水または緩衝液中で反応させ、生成したアデニンをアデニン・デアミナーゼを用いてヒポキサンチンに変換させることを特徴とする、デオキシヌクレオシドの製造法に関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、以下の式に示す反応によりデオキシヌクレオシドを製造しようとするものである。すなわち、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼによりデオキシアデノシン（ｄＲｉｂ−Ａｄｅ）と塩基（ＢＨ）から目的とするデオキシヌクレオシド（ｄＲｉｂ−Ｂ）およびアデニンを生成させるとともに、生成したアデニンはアデニン・デアミナーゼによりヒポキサンチンに変換する。
【０００９】
【式１】
（式中、ｄＲｉｂはデオキシリボシル基、Ａｄｅはアデニン、ＢＨは塩基、Ｈｙｐはヒポキサンチン、Ｅ１はヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ、Ｅ２はアデニン・デアミナーゼを示す。）
前述したように、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの反応は平衡反応であるため、反応が平衡に達すると進行しなくなる。そこで、アデニン・デアミナーゼを反応系に共存させ、生成したアデニンをヒポキサンチンに変換させることで平衡を崩し、目的とするデオキシヌクレオシドの収率向上を達成することが可能となる。
【００１０】
本発明で使用するヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼおよびアデニン・デアミナーゼは、いずれも公知の酵素であり、動物由来、植物由来、微生物由来など特定のものに限定されず、すべての由来のものを使用することができる。しかし、酵素調製の簡便性などの点から微生物由来の酵素を使用するのが好都合である。たとえば、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼは乳酸菌に属する微生物から容易に調製でき、アデニン・デアミナーゼは細菌や酵母に属する微生物から容易に調製することができる（Methods in Enzymology,Vol.LI.446(1978)、J. Am. Chem. Soc., 79, 630-633(1957)、J. Biol. Chem., 242, 740-746(1967)等参照）。また、ラクトバシラス・ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）由来のヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼはヒポキサンチンを基質として認識しにくいことから、本発明においては好適な酵素である。
【００１１】
微生物を培養するための培地としては、これらの微生物が資化可能な炭素源及び窒素源を適当量含有し、必要に応じて金属塩、微量発育促進物質、消泡剤などを添加したものが使用される。具体的には、培地成分としては糖類（グルコース、サッカロースなど）、天然炭水化物（糖蜜、廃糖蜜、澱粉、麦、ふすま、米など）、アルコール類、脂肪酸類、炭化水素類など、窒素源としては、肉エキス、酵母エキス、大豆加水分解物など、金属塩としては亜鉛、鉄、マグネシウムなどのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩など、微量発育促進物質としては、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビオチンなどがあげられる。
培養は、通常の液体培養法（振とう培養、通気撹拌培養、静置培養、連続培養など）によって、２０〜５０℃の温度条件下で必要により通気攪拌しながら、目的とする酵素活性が十分得られるまで行えばよい。
【００１２】
このようにして得られた培養物を用い、使用目的に応じ適宜処理加工したものを酵素調製物として本発明に使用する。そのような酵素調製物としては特に制限されるものではなく、例えば、微生物の培養物自体、培養物から通常の分離手段（遠心分離、沈殿分離、凝集分離、洗浄など）によって分離された菌体、またはその菌体処理物を例示することができる。菌体処理物をさらに具体的に例示すれば、生菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波処理、フレンチプレス処理などにより物理的に菌体を破砕するか、あるいはリゾチーム処理など酵素的に溶菌させた後、菌体残渣を遠心分離により除去した無細胞抽出液を挙げることができる。さらに、この無細胞抽出液を熱処理、硫安塩析処理、透析処理、エタノールなどの溶媒処理、各種クロマトグラフィー処理などの酵素精製に通常使用されている処理を単独で、または数種組み合わせて得られる粗精製酵素、精製酵素を例示することもできる。
【００１３】
さらに、上記の両酵素の遺伝子ともクローニングされており、クローン化されたＤＮＡ断片を用い、公知の組換えＤＮＡ手法で目的とする酵素を調製することも可能である（Science, 277, (5331), 1453-1474, (1997)、PCT/JP00/03490 など参照)。すわなち、遺伝子のクローニング、クローン化したＤＮＡ断片を用いた発現ベクターの調製、当該発現ベクターを用いた目的とする酵素活性を有する酵素の調製などは、分子生物学の分野に属する技術者にとっては周知の技術であり、例えば「Molecular Cloning」(Maniatis ら編、Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor、New York(1982)）に記載の方法に従って行うことができる。
【００１４】
使用するデオキシアデノシンとしては、２’−デオキシアデノシン、３’−デオキシアデノシン、２’，３’−デオキシアデノシン等のデオキシアデノシン類が例示される。
また、使用する塩基としては、合成目的のデオキシヌクレオシドの塩基に応じて公知の塩基類から種々選択すればよく、具体的には複素環塩基または置換基（例えばアミノ基、置換アミノ基、水酸基、オキソ基、メルカプト基、アシル基、アルキル基、置換アルキル基、アルコキシル基、ハロゲン原子など）を有する誘導体を例示することができる。複素環塩基の具体例としては、たとえば、プリン及びその誘導体、ピリミジン及びその誘導体、トリアゾール及びその誘導体、イミダゾール及びその誘導体、デアザプリン及びその誘導体、アザプリン及びその誘導体、アザピリミジン及びその誘導体またはピリジン及びその誘導体などである。
【００１５】
具体的には、プリン塩基およびその誘導体としてはグアニン、キサンチン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、Ｎ6−アルキルもしくはアシルアデニン、２−アルコキシアデニン、２−チオアデニン、２，６−ジアミノプリンなど、ピリミジンおよびその誘導体としてはシトシン、ウラシル、チミン、５−ハロゲノウラシル（５−フルオロウラシル、５−ヨードウラシルなど）、５−ハロゲノシトシン（５−フルオロシトシンなど）、５−トリハロゲノメチルウラシル（５−トリフルオロメチルウラシルなど）、２−チオシトシン、４−チオウラシル、Ｎ4−アシルシトシン、５−ハロゲノビニルウラシルなど、トリアゾールおよびその誘導体としては、１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド、１，２，４−トリアゾール−３−カルボン酸、１，２，４−トリアゾール−３−カルボン酸アルキルエステルなど、イミダゾールおよびその誘導体としては５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミド、４−カルバモイル−イミダゾリウム−５−オレート、ベンズイミダゾールなど、デアザプリンおよびその誘導体としては１−デアザアデニン、３−デアザアデニン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニンなど、アザプリンおよびその誘導体としては８−アザアデニン、７−デアザ−８−アザヒポキサンチン（アロプリノール）など、アザピリミジンおよびその誘導体としては５−アザチミン、５−アザシトシン、６−アザウラシルなど、またはピリジンおよびその誘導体としては３−デアザウラシル、ニコチン酸、ニコチン酸アミドなどが例示される。
【００１６】
デオキシヌクレオシドの合成反応は、１０ｍＭ以上、好ましくは２０ｍＭ以上、さらに好ましくは５０〜５００ｍＭ濃度になるようにデオキシアデノシンと適当濃度の塩基とを水または緩衝液（ｐＨ３〜１０）に溶解または懸濁させ、０．００１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．０１ユニット／ｍｌ以上のヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼと、０．０１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．１ユニット／ｍｌ以上のアデニン・デアミナーゼを使用し、１０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃の温度条件下で１０分〜５０時間程度、必要により攪拌しながら反応させることにより実施することができる。
デオキシアデノシンの濃度が薄すぎる、例えば１０ｍＭ未満では、生成したヒポキサンチンがヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの基質となり、目的外のデオキシイノシンが合成される可能性が大きくなり、好ましくない。また、反応温度が１０℃未満のときは反応速度が遅く、反応効率が悪い。一方、反応温度が６０℃を越える場合には酵素が変性、失活する可能性があり、好ましくない。また、反応途中でｐＨが変動するときは、酸またはアルカリを用いて上記ｐＨ範囲に補正すればよい。
【００１７】
反応終了後、生成したデオキシヌクレオシドは核酸関連物質の精製法として通常使用されている方法あるいはこれを応用した方法によって分離精製することができる。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過法など各種のクロマトグラフィー、向流分配、向流抽出など、二液相間の分配を利用する方法、また、濃縮、冷却、有機溶媒添加など、溶解度の差を利用する方法などのデオキシヌクレオシドの分離精製で使用されている一般的な分離精製法を単独で、あるいは適宜組み合わせて行なえばよい。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。なお、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Molecular Cloning」（前述）にしたがって行った。また、各種制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、プラスミドベクターｐＨＳＧ３９８及びｐＨＳＧ３９９は全て宝酒造（株）より入手した。サザンハイブリダイゼーション用のＤＮＡ標識キットおよびＤＮＡ検出キットはベーリンガー・マンハイム社から入手した。
【００１９】
実施例１
（１）ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ構造遺伝子のクローニングおよび塩基配列の決定
ラクトバシラス・ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）ATCC8018から常法に従って調製したヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩの精製酵素標品（２００ｐｍｏｌ：４μｇ）を終濃度８Ｍの尿素存在下で３７℃１時間の変性処理し、トリプシン溶液（宝酒造製・TaKaRa Residue-specific Proteases Kit）処理後、定法に従いＰＶＤＦ膜に転写した。転写されたバンド（２本）を切り取り、Ｎ末端アミノ酸解析に供した。アミノ酸配列から推定された塩基配列をもとに、ＰＣＲ用プライマーを以下の通りデザインした。
【００２０】
プライマー（Ａ）: 5-CCTCTGCAGCCATGAAYAARAARAARACNYTNTAYTTYGG-3
プライマー（Ｂ）: 5-ACCAAGCTTRTTRTGIARRTAYTCIGGRTGYTCRTC-3
（上記プライマーの塩基配列において、ＹはＣまたはＴを、ＲはＡまたはＧを、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴを、Ｉは２’−デオキシイノシンをそれぞれ示す。）
【００２１】
ＰＣＲによる遺伝子の増幅は、反応液１００μｌ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭｄＡＴＰ、０．２ｍＭｄＧＴＰ、０．２ｍＭｄＣＴＰ、０．２ｍＭｄＴＴＰ、乳酸菌染色体ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（４０℃、３０秒）、伸長反応（７２℃、３０秒）のステップを２８回繰り返すことにより行った。
サザンハイブリダイゼーション用のプローブは、上記ＰＣＲ条件でｄＮＴＰにＤＩＧ標識ＵＴＰを含む混合液を使用して作製した。乳酸菌染色体ＤＮＡは種々の制限酵素で分解し電気泳動後、常法に従ってサザンハイブリダイゼーションを行った。この結果から、図１のような制限酵素地図が得られた。
【００２２】
図１のとおり、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ遺伝子（ｎｄｔＢ ｇｅｎｅ）は乳酸菌染色体ＤＮＡのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩの３．２ｋｂ断片に存在することが判明した。そこで乳酸菌染色体のＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ消化物の２．３〜４．０ｋｂ断片を回収して、これをｐＵＣ１８のＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ消化物とライゲーションしたものを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲを行った。プライマーはプライマー（Ｂ）とシーケンス用プライマーＭ４（ＴａＫａＲａ）を使用し、先の条件で、９４℃・３０秒、４０℃・３０秒、７２℃・１２０秒のサイクルを３０回繰り返した。得られたＤＮＡ断片はＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化後、クローニングベクターｐＨＳＧ３９８に組み込んだ。このプラスミドをｐ３９８−５ＳＨと命名した。
【００２３】
得られた上流領域の塩基配列解析からヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ遺伝子の開始コドン上流に位置するプライマーを以下の通りデザインした。
プライマー（Ｃ）：5-TAAGTCGACAGCAATTTTTATGGGGAG-3
乳酸菌の染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化後連結したＤＮＡを鋳型に，プライマー（Ｃ）を用いて，ＰＣＲ法により乳酸菌由来ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【００２４】
ＰＣＲ反応は実施例１と同じ反応組成，反応器を用い，熱変性（９４℃，３０秒），アニーリング（５０℃・３０秒），伸長反応（７２℃，２分）のステップを３０回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、ＳａｌＩとＥｃｏＲＩで消化し，１．０ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。回収したＤＮＡを，制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＨＳＧ３９８またはｐＨＳＧ３９９とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し，得られたクロラムフェニコール耐性形質転換体より，プラスミドｐ３９８−Ｔ２Ｆ５とｐ３９９−Ｔ２Ｆ５を単離した。得られた形質転換体をそれぞれＪＭ１０９［ｐ３９８−Ｔ２Ｆ５］、ＪＭ１０９［ｐ３９９−Ｔ２Ｆ５］と命名した。
【００２５】
これらの組換えプラスミドのクローンの挿入断片について、ダイデオキシチェインターミーネーター法（Science,214,1295(1981)）によりＤＮＡ塩基配列を決定した。その結果、図２に示すヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ構造遺伝子のＤＮＡ塩基配列を得た。この塩基配列は、４７４ｂｐであり、Ｍｅｔで始まる１５８個のアミノ酸からなる分子量１８，３１７のポリペプチドをコードする。なお、このペプチドのアミノ末端１０個のアミノ酸配列は、精製単離した乳酸菌ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩのそれと完全に一致した。
【００２６】
（２）ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ高発現用組換えプラスミドの作製
ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ生産用組換えプラスミドｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４を以下の方法で作製した（図３参照）。すなわち、ｐ３９９−Ｔ２Ｆ５を鋳型に，以下に示すプライマー（Ｄ）とシーケンス用プライマーＲＶ（ＴａＫａＲａ）を用いて，ＰＣＲ法により乳酸菌由来ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。なお、プライマーＤにはＮｃｏＩ部位と連結するようＢｓｐＨＩ認識配列を導入してある。
プライマー（Ｄ）：５’-AAATCATGAACAAGAAAAAGACTTTATAT-３’
【００２７】
ＰＣＲ反応は（１）と同じ反応組成，反応器を用い，熱変性（９４℃，３０秒），アニーリング（５０℃、３０秒），伸長反応（７２℃，２分）のステップを３０回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後はＢｓｐＨＩとＥｃｏＲＩで消化し，１．０ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。回収したＤＮＡを，制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Gene,69,301(1988)、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し，得られたアンピシリン耐性形質転換体より，ｐＴｃ９９Ａの発現用ｔｒｃプロモーターの直後にヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ構造遺伝子が挿入された組換えベクター、ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４を単離した。得られた形質転換体をＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４］と命名した。
【００２８】
（３）形質転換体の培養とヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩの調製
上記の組換えプラスミドを保持する大腸菌形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で振盪培養した。４×ｌ０8個／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃度０．０５ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で４時間振盪培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ、１０分間）により培養菌体を回収し、１０ｍｌの緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。菌体懸濁液を超音波破砕機にて処理して、さらに遠心分離（１２，０００×ｇ、１０分間）により菌体残渣を除去した。このようにして得られた上清画分を菌体抽出液とした。菌体抽出液におけるヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ活性を対照菌（ｐＨＳＧ３９８を保持する大腸菌ＪＭ１０９）と共に下記表に示す。なお、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ活性は、５ｍＭの２’−デオキシアデノシンとシトシン、またはチミジンとシトシンを基質にして測定した。反応液に菌体抽出液を加えて反応を開始し、１分間煮沸することにより酵素を失活させた。３７℃におけるデオキシシチジンの生成量を高速液体クロマトグラフィーにより定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅの２’−デオキシシチジンを生成する活性を１単位（ユニット）とした。
【表１】
* 1 unit = 1μmole 2'-deoxycytidine-production from 2'-deoxyadenosine/min at 37℃
** 1 unit = 1μmole 2'-deoxycytidine-production from thymidine/min at 37℃
【００２９】
表１に示すように対照菌（ｐＨＳＧ３９８を保持する大腸菌ＪＭ１０９）で検出されないが、作製した組換えプラスミドを保持する形質転換体においては、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ活性が確認された。また、下記表２に示すように、本発明で造成された形質転換体（ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４保持菌）の生産性は、元株である乳酸菌ラクトバシラス・ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）ATCC8018株の３，０００〜４，０００倍に相当する。
【００３０】
【表２】
＊ 1 unit = 1μmole 2'-deoxycytidine-production from 2'-deoxyuridine/min at 37℃
【００３１】
（４）大腸菌アデニン・デアミナーゼをコードするｙｉｃＰ遺伝子のクローニングおよびアデニン・デアミナーゼ生産用組換えプラスミドの作製
大腸菌の染色体ＤＮＡを鋳型として，以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌アデニン・デアミナーゼ遺伝子（ｙｉｃＰ）（Science, 277, (5331), 1453-1474, (1997)）を増幅した。
プライマー（Ｅ）： ５’- TTTGGATCCATTGGAGGAGATTTAATCCC -３’
プライマー（Ｆ）： ５’- AAAGAATTCAGCAGTTGACAGTGGC -３’
ＰＣＲによるｙｉｃＰ遺伝子の増幅は、反応液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．００１％ ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｅ）（Ｆ）各々 ０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、２分）、伸長反応（７２℃、３分）のステップを３０回繰り返すことにより行った。
【００３２】
遺伝子増幅後はＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化し，２．０ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。回収したＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＨＳＧ３９９とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたクロラムフェニコール耐性形質転換体より、ｐＨＳＧ３９９のｌａｃプロモーターの直後にアデニン・デアミナーゼ構造遺伝子が挿入された組換えプラスミドｐ３９９−ｙｉｃＰを単離した。得られた形質転換体をＪＭ１０９［ｐ３９９−ｙｉｃＰ］と命名した。
【００３３】
さらに、ｐ３９９−ｙｉｃＰからＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片を切り出し、ｐＴｒｃ１２−６のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位と組換えた（ａ）。また、ｐ３９９−ｙｉｃＰのＢｓｐＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を切り出し、ｐＴｒｃ９９ＡのＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位と組換えた（ｂ）。（ａ）のＳｃａＩ−ＰｓｔＩ断片（長鎖）と（ｂ）のＳｃａＩ−ＰｓｔＩ断片（短鎖）を連結して、ｔｒｃプロモーターの下流にｙｉｃＰ遺伝子が挿入された組換えプラスミドｐ１２−６ｙｉｃＰを得た。得られた形質転換体をＪＭ１０９［ｐ１２−６ｙｉｃＰ］と命名した。
【００３４】
（５）アデニン・デアミナーゼの調製
上記の組換えプラスミドを保持する大腸菌形質転換体を、２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールまたはカナマイシンを含有する２×ＹＴ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で振盪培養した。４×ｌ０8個／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で５時間振盪培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００ｇ、１０分間）により培養菌体を回収し、１０ｍｌの緩衝液Ａ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）、０．５ｍＭＭｎＣｌ2、２０％エチレングリコール）に懸濁した。菌体懸濁液を超音波破砕機にて処理して、さらに遠心分離（２，０００ｇ、１０分間）により菌体残渣を除去した。このようにして得られた上清画分を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液におけるアデニン・デアミナーゼ活性を対照菌（ｐＨＳＧ３９８を保持する大腸菌ＪＭ１０９）と共に下記表に示す。なお、アデニン・デアミナーゼ活性は以下に示す方法で測定、算出したものである。
【００３５】
（アデニン・デアミナーゼ活性の測定と単位の算出法）
アデニンを含む反応液１ｍｌ（０．１Ｍ トリス塩酸（ｐＨ７．６），２ｍＭＭｎＣｌ2，１ｍＭ アデニン塩酸塩）をあらかじめ３７℃に加温しておき、緩衝液Ａで１０倍希釈した無細胞抽出液を５mｌ添加して、３７℃で１０分反応させた後、煮沸させることにより酵素を失活させる。この溶液を２０倍希釈後、ヒポキサンチンの生成量を高速液体クロマトグラフィーにより定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのヒポキサンチンを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
【００３６】
【表２】
＊ 1 unit = 1μmole hypoxanthine-production from adenine/min at 37℃
表３に示すように、アデニン・デアミナーゼ活性は、作製した組換えプラスミドを保持する形質転換体においては確認されたが、対照菌（ｐＨＳＧ３９８を保持する大腸菌ＪＭ１０９）においては検出されなかった。
【００３７】
上記の無細胞抽出液を以下のように簡易精製した。まず、あらかじめ緩衝液Ａで平衡化したＤＥ５２カラム（ワットマン社製）を用い、０．３ＭのＮａＣｌを含有する緩衝液Ａを展開液としてクロマトグラフィーを行った。アデニン・デアミナーゼ活性画分を回収し、つぎに緩衝液Ａであらかじめ平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｓ−３００（アマシャム・ファルマシア社製）にて、ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。精製の結果、比活性はイオン交換クロマトグラフィーで３倍、ゲル濾過クロマトグラフィーでは３．３倍に上昇した。
【００３８】
（６） ２’−デオキシシチジンの合成
１００ｍＭ ２’−デオキシアデノシン、１００ｍＭ シトシン、１００ｍＭＭＯＰＳ−ＮａＯＨ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、１ｍＭ ＭｎＣｌ2、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ ０．０３６ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、アデニン・デアミナーゼ ０．３０ｕｎｉｔｓ／ｍｌを含む溶液５ｍｌを４０℃で４０時間反応させた。
経時的に反応液の分析を行った結果を図４に示す。図４から明らかなように、アデニン・デアミナーゼを添加しない反応液においては、２’−デオキシシチジンは２２ｍＭしか生成しなかったのに対し、アデニン・デアミナーゼを添加した反応液においては５３ｍＭの２’−デオキシシチジンが生成することが認められた。なお、ヒポキサンチンから塩基交換反応により変換される２’−デオキシイノシンは反応液中からは観察されなかった。
【００３９】
実施例２ ２’−デオキシグアノシンの合成
１００ｍＭ ２’−デオキシアデノシン、２０ｍＭ グアニン、１００ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、１ｍＭ ＭｎＣｌ2、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ ０．３６ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、アデニン・デアミナーゼ ０．３０ｕｎｉｔｓ／ｍｌを含む溶液５ｍｌ中を４０℃で攪拌しながら４０時間反応させた。
経時的に反応液の分析を行った結果を図５に示す。アデニン・デアミナーゼを添加しない反応液においては、２’−デオキシグアノシンは１．６ｍＭしか生成しなかったのに対し、アデニン・デアミナーゼを添加した反応液においては、６．０ｍＭの２’−デオキシグアノシンが生成することが認められた。なお、反応液中には、２’−デオキシイノシンが生成していたが、その生成量は無視できる程度のものであった。
【００４０】
実施例３ ２’−デオキシ−５−フルオロウリジンの合成
２００ｍＭ ２’−デオキシアデノシン、２００ｍＭ ５−フルオロウラシル、１００ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、１ｍＭ ＭｎＣｌ2、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ ０．１２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ，アデニン・デアミナーゼ ０．３０ｕｎｉｔｓ／ｍｌを含む溶液５ｍｌを４０℃で攪拌しながら６５時間反応させた。
経時的に反応液の分析を行った結果を図６に示す。アデニン・デアミナーゼを添加しない反応液においては、２’−デオキシ−５−フルオロウリジンは４０ｍＭしか生成しなかったのに対し、アデニン・デアミナーゼを添加した反応液においては、８０ｍＭの２’−デオキシ−５−フルオロウリジンが生成することが認められた。なお、２’−デオキシイノシンは反応液中からは観察されなかった。
【００４１】
実施例１〜３の結果をまとめると表４のようになる。表４から明らかなように、アデニン・デアミナーゼを反応系に共存させることにより、アデニン・デアミナーゼを添加しない場合と比較して、デオキシヌクレオシドの収率は２〜４倍も向上した。
【表４】
【００４２】
【発明の効果】
上述したように、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼとアデニン・デアミナーゼを併用（カップリング）する本発明によれば、目的とするデオキシヌクレオシドの合成収率を２〜４倍も向上させることが可能であり、本発明方法は極めて実用的な方法である。
【００４３】
【配列表】
【００４４】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、乳酸菌ラクトバシラス・ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）ATCC8018由来のヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ構造遺伝子を含有する４．３ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩＤＮＡ断片の制限酵素地図を示したものである。図１における「ｎｄｔＢ」はヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩをコードする遺伝子（４７４ｂｐ、１５８個のアミノ酸からなる分子量１８，３１７のポリペプチドをコードする）を示す。
【図２】図２は、乳酸ラクトバシラス・ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus)ATCC8018由来のヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片の塩基配列を示したものである。図中、Ｓ．Ｄ．はＳＤ配列を、Ｍｅｔはヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ構造遺伝子の翻訳開始コドンを、ｓｔｏｐはその停止コドンをそれぞれ示す。
【図３】図３は、組換えプラスミドベクター、ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４の構築法を示したものである。
【図４】図４は、アデニン・デアミナーゼの添加の有無による２’−デオキシシチジン生成量の経時変化を示したものである。図中、●はアデニン・デアミナーゼを添加した時の結果を、○はアデニン・デアミナーゼを添加しないときの結果を示したものである。（図５、図６も同様）
【図５】図５は、アデニン・デアミナーゼの添加の有無による２’−デオキシグアノシン生成量の経時変化を示したものである。
【図６】図６は、アデニン・デアミナーゼの添加の有無による２’−デオキシ−５−フルオロウリジン生成量の経時変化を示したものである。
【産業上の利用分野】
本発明は、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼとアデニン・デアミナーゼとを併用（カップリング）したデオキシヌクレオシドの効率的な製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
デオキシヌクレオシド類は、アンチセンス医薬品（デオキシヌクレオチドのオリゴマーなど）を初めとする種々の医薬品の原料などに有用な化合物である。
従来、これらのデオキシヌクレオシド類は、化学的に合成するか、白子などのＤＮＡを酵素分解することにより調製されていた。さらに、最近、酵素を用いたデオキシヌクレオシド類の合成法も報告されており、それらは主にヌクレオシド・ホスホリラーゼやヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを用いた方法である（Journal of Biotechnology,23,193-210(1992)）。
【０００３】
ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ（E.C.2.4.2.6.、別名：トランス−Ｎ−デオキシリボシラーゼ）は、デオキシヌクレオシドのデオキシリボシル基を他の塩基に転移する反応を触媒する酵素である。例えばラクトバシラス属に属する乳酸菌の一種であるラクトバシラス・ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）やラクトバシラス・ライヒマンニ（Lactobacillus leichmannii）にはヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−Ｉと同−ＩＩの２種類の酵素が存在し、それらの酵素学的諸性質も既に報告されている（Methods in Enzymology,Vol.LI.446(1978)、Biol.chem.Hoppe-Seyler,Vol.377,357-362(1996)）。さらに、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを利用した２’，３’−ジデオキシヌクレオシドの合成も既に報告されている（ＷＯ９０／０６３１２、ＷＯ９１／０４３２２、Biochemical And Biophysical Reserch Communications,Vol.155,No.2,829-834(1988)）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼが触媒する反応は平衡反応であるため、反応が平衡に達するとそれ以上の反応は進行せず、目的とするデオキシヌクレオシドの合成収率の向上には限界があった。
従来、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを用いた酵素反応における上記の問題点を克服するための方策は何ら報告されていない。しかし、同様の問題を抱えるヌクレオシド・ホスホリラーゼにおいては、目的とするデオキシヌクレオシド合成反応の方へ平衡反応を傾かせ、合成収率を向上させるための工夫がいくつか報告されている。たとえば、ヌクレオシド・ホスホリラーゼを用いデオキシイノシンと塩基からデオキシヌクレオシドを製造する方法において、生成するヒポキサンチンをオキシダーゼなどを用いて尿酸など反応の基質になりえない物質に変換させ、目的とするデオキシヌクレオシドの合成収率を向上させる方法などが提案されている（特開平５−４９４９３、特開平９−２１５４９８、特開平１１−４６７９０）。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記のヌクレオシド・ホスホリラーゼで提案されている収率向上のための方法を参考に、鋭意検討を重ねた結果、まったく意外なことに、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを用いてデオキシアデノシンと塩基とからデオキシヌクレオシドを製造する際、生成したアデニンをアデニン・デアミナーゼを用いてヒポキサンチンに変換させることにより目的とするデオキシヌクレオシドの収率が格段に向上することを見出した。
【０００６】
一般に、ヒポキサンチンがヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの基質となることは古くから知られており、アデニンをヒポキサンチンに変換したとしても目的外のデオキシイノシンが生成し、目的とするデオキシヌクレオシドの収率が向上するとは到底考えられていなかった。事実、ヌクレオシド・ホスホリラーゼを用いた反応においても、ヒポキサンチンはヌクレオシド・ホスホリラーゼの基質となり得るため、生成したヒポキサンチンをオキシダーゼ等で尿素まで変換しないと目的とするデオキシヌクレオシドの収率を向上させることはできない。
【０００７】
この点を更に検討した結果、（１）ヒポキサンチンは、濃度が薄い場合のみヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの基質となり得、デオキシヌクレオシドの製造の際に用いるような通常の濃度では基質になり得ないこと、（２）このため、アデニンをアデニン・デアミナーゼを用いてヒポキサンチンに変換したとしても、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼによりデオキシイノシンはまったく生成しないか、生成してもごく僅かであり、ヒポキサンチンがヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを用いたデオキシヌクレオシドの製造に悪影響を及ぼさないことを確認し、本発明を完成させた。
したがって、本発明は、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを用いてデオキシアデノシンと塩基とからデオキシヌクレオシドを製造する際、デオキシアデノシンを１０〜５００ｍＭの濃度で用い、水または緩衝液中で反応させ、生成したアデニンをアデニン・デアミナーゼを用いてヒポキサンチンに変換させることを特徴とする、デオキシヌクレオシドの製造法に関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、以下の式に示す反応によりデオキシヌクレオシドを製造しようとするものである。すなわち、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼによりデオキシアデノシン（ｄＲｉｂ−Ａｄｅ）と塩基（ＢＨ）から目的とするデオキシヌクレオシド（ｄＲｉｂ−Ｂ）およびアデニンを生成させるとともに、生成したアデニンはアデニン・デアミナーゼによりヒポキサンチンに変換する。
【０００９】
【式１】
前述したように、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの反応は平衡反応であるため、反応が平衡に達すると進行しなくなる。そこで、アデニン・デアミナーゼを反応系に共存させ、生成したアデニンをヒポキサンチンに変換させることで平衡を崩し、目的とするデオキシヌクレオシドの収率向上を達成することが可能となる。
【００１０】
本発明で使用するヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼおよびアデニン・デアミナーゼは、いずれも公知の酵素であり、動物由来、植物由来、微生物由来など特定のものに限定されず、すべての由来のものを使用することができる。しかし、酵素調製の簡便性などの点から微生物由来の酵素を使用するのが好都合である。たとえば、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼは乳酸菌に属する微生物から容易に調製でき、アデニン・デアミナーゼは細菌や酵母に属する微生物から容易に調製することができる（Methods in Enzymology,Vol.LI.446(1978)、J. Am. Chem. Soc., 79, 630-633(1957)、J. Biol. Chem., 242, 740-746(1967)等参照）。また、ラクトバシラス・ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）由来のヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼはヒポキサンチンを基質として認識しにくいことから、本発明においては好適な酵素である。
【００１１】
微生物を培養するための培地としては、これらの微生物が資化可能な炭素源及び窒素源を適当量含有し、必要に応じて金属塩、微量発育促進物質、消泡剤などを添加したものが使用される。具体的には、培地成分としては糖類（グルコース、サッカロースなど）、天然炭水化物（糖蜜、廃糖蜜、澱粉、麦、ふすま、米など）、アルコール類、脂肪酸類、炭化水素類など、窒素源としては、肉エキス、酵母エキス、大豆加水分解物など、金属塩としては亜鉛、鉄、マグネシウムなどのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩など、微量発育促進物質としては、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビオチンなどがあげられる。
培養は、通常の液体培養法（振とう培養、通気撹拌培養、静置培養、連続培養など）によって、２０〜５０℃の温度条件下で必要により通気攪拌しながら、目的とする酵素活性が十分得られるまで行えばよい。
【００１２】
このようにして得られた培養物を用い、使用目的に応じ適宜処理加工したものを酵素調製物として本発明に使用する。そのような酵素調製物としては特に制限されるものではなく、例えば、微生物の培養物自体、培養物から通常の分離手段（遠心分離、沈殿分離、凝集分離、洗浄など）によって分離された菌体、またはその菌体処理物を例示することができる。菌体処理物をさらに具体的に例示すれば、生菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波処理、フレンチプレス処理などにより物理的に菌体を破砕するか、あるいはリゾチーム処理など酵素的に溶菌させた後、菌体残渣を遠心分離により除去した無細胞抽出液を挙げることができる。さらに、この無細胞抽出液を熱処理、硫安塩析処理、透析処理、エタノールなどの溶媒処理、各種クロマトグラフィー処理などの酵素精製に通常使用されている処理を単独で、または数種組み合わせて得られる粗精製酵素、精製酵素を例示することもできる。
【００１３】
さらに、上記の両酵素の遺伝子ともクローニングされており、クローン化されたＤＮＡ断片を用い、公知の組換えＤＮＡ手法で目的とする酵素を調製することも可能である（Science, 277, (5331), 1453-1474, (1997)、PCT/JP00/03490 など参照)。すわなち、遺伝子のクローニング、クローン化したＤＮＡ断片を用いた発現ベクターの調製、当該発現ベクターを用いた目的とする酵素活性を有する酵素の調製などは、分子生物学の分野に属する技術者にとっては周知の技術であり、例えば「Molecular Cloning」(Maniatis ら編、Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor、New York(1982)）に記載の方法に従って行うことができる。
【００１４】
使用するデオキシアデノシンとしては、２’−デオキシアデノシン、３’−デオキシアデノシン、２’，３’−デオキシアデノシン等のデオキシアデノシン類が例示される。
また、使用する塩基としては、合成目的のデオキシヌクレオシドの塩基に応じて公知の塩基類から種々選択すればよく、具体的には複素環塩基または置換基（例えばアミノ基、置換アミノ基、水酸基、オキソ基、メルカプト基、アシル基、アルキル基、置換アルキル基、アルコキシル基、ハロゲン原子など）を有する誘導体を例示することができる。複素環塩基の具体例としては、たとえば、プリン及びその誘導体、ピリミジン及びその誘導体、トリアゾール及びその誘導体、イミダゾール及びその誘導体、デアザプリン及びその誘導体、アザプリン及びその誘導体、アザピリミジン及びその誘導体またはピリジン及びその誘導体などである。
【００１５】
具体的には、プリン塩基およびその誘導体としてはグアニン、キサンチン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、Ｎ6−アルキルもしくはアシルアデニン、２−アルコキシアデニン、２−チオアデニン、２，６−ジアミノプリンなど、ピリミジンおよびその誘導体としてはシトシン、ウラシル、チミン、５−ハロゲノウラシル（５−フルオロウラシル、５−ヨードウラシルなど）、５−ハロゲノシトシン（５−フルオロシトシンなど）、５−トリハロゲノメチルウラシル（５−トリフルオロメチルウラシルなど）、２−チオシトシン、４−チオウラシル、Ｎ4−アシルシトシン、５−ハロゲノビニルウラシルなど、トリアゾールおよびその誘導体としては、１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド、１，２，４−トリアゾール−３−カルボン酸、１，２，４−トリアゾール−３−カルボン酸アルキルエステルなど、イミダゾールおよびその誘導体としては５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミド、４−カルバモイル−イミダゾリウム−５−オレート、ベンズイミダゾールなど、デアザプリンおよびその誘導体としては１−デアザアデニン、３−デアザアデニン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニンなど、アザプリンおよびその誘導体としては８−アザアデニン、７−デアザ−８−アザヒポキサンチン（アロプリノール）など、アザピリミジンおよびその誘導体としては５−アザチミン、５−アザシトシン、６−アザウラシルなど、またはピリジンおよびその誘導体としては３−デアザウラシル、ニコチン酸、ニコチン酸アミドなどが例示される。
【００１６】
デオキシヌクレオシドの合成反応は、１０ｍＭ以上、好ましくは２０ｍＭ以上、さらに好ましくは５０〜５００ｍＭ濃度になるようにデオキシアデノシンと適当濃度の塩基とを水または緩衝液（ｐＨ３〜１０）に溶解または懸濁させ、０．００１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．０１ユニット／ｍｌ以上のヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼと、０．０１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．１ユニット／ｍｌ以上のアデニン・デアミナーゼを使用し、１０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃の温度条件下で１０分〜５０時間程度、必要により攪拌しながら反応させることにより実施することができる。
デオキシアデノシンの濃度が薄すぎる、例えば１０ｍＭ未満では、生成したヒポキサンチンがヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの基質となり、目的外のデオキシイノシンが合成される可能性が大きくなり、好ましくない。また、反応温度が１０℃未満のときは反応速度が遅く、反応効率が悪い。一方、反応温度が６０℃を越える場合には酵素が変性、失活する可能性があり、好ましくない。また、反応途中でｐＨが変動するときは、酸またはアルカリを用いて上記ｐＨ範囲に補正すればよい。
【００１７】
反応終了後、生成したデオキシヌクレオシドは核酸関連物質の精製法として通常使用されている方法あるいはこれを応用した方法によって分離精製することができる。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過法など各種のクロマトグラフィー、向流分配、向流抽出など、二液相間の分配を利用する方法、また、濃縮、冷却、有機溶媒添加など、溶解度の差を利用する方法などのデオキシヌクレオシドの分離精製で使用されている一般的な分離精製法を単独で、あるいは適宜組み合わせて行なえばよい。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。なお、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Molecular Cloning」（前述）にしたがって行った。また、各種制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、プラスミドベクターｐＨＳＧ３９８及びｐＨＳＧ３９９は全て宝酒造（株）より入手した。サザンハイブリダイゼーション用のＤＮＡ標識キットおよびＤＮＡ検出キットはベーリンガー・マンハイム社から入手した。
【００１９】
実施例１
（１）ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ構造遺伝子のクローニングおよび塩基配列の決定
ラクトバシラス・ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）ATCC8018から常法に従って調製したヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩの精製酵素標品（２００ｐｍｏｌ：４μｇ）を終濃度８Ｍの尿素存在下で３７℃１時間の変性処理し、トリプシン溶液（宝酒造製・TaKaRa Residue-specific Proteases Kit）処理後、定法に従いＰＶＤＦ膜に転写した。転写されたバンド（２本）を切り取り、Ｎ末端アミノ酸解析に供した。アミノ酸配列から推定された塩基配列をもとに、ＰＣＲ用プライマーを以下の通りデザインした。
【００２０】
プライマー（Ａ）: 5-CCTCTGCAGCCATGAAYAARAARAARACNYTNTAYTTYGG-3
プライマー（Ｂ）: 5-ACCAAGCTTRTTRTGIARRTAYTCIGGRTGYTCRTC-3
（上記プライマーの塩基配列において、ＹはＣまたはＴを、ＲはＡまたはＧを、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴを、Ｉは２’−デオキシイノシンをそれぞれ示す。）
【００２１】
ＰＣＲによる遺伝子の増幅は、反応液１００μｌ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭｄＡＴＰ、０．２ｍＭｄＧＴＰ、０．２ｍＭｄＣＴＰ、０．２ｍＭｄＴＴＰ、乳酸菌染色体ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（４０℃、３０秒）、伸長反応（７２℃、３０秒）のステップを２８回繰り返すことにより行った。
サザンハイブリダイゼーション用のプローブは、上記ＰＣＲ条件でｄＮＴＰにＤＩＧ標識ＵＴＰを含む混合液を使用して作製した。乳酸菌染色体ＤＮＡは種々の制限酵素で分解し電気泳動後、常法に従ってサザンハイブリダイゼーションを行った。この結果から、図１のような制限酵素地図が得られた。
【００２２】
図１のとおり、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ遺伝子（ｎｄｔＢ ｇｅｎｅ）は乳酸菌染色体ＤＮＡのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩの３．２ｋｂ断片に存在することが判明した。そこで乳酸菌染色体のＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ消化物の２．３〜４．０ｋｂ断片を回収して、これをｐＵＣ１８のＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ消化物とライゲーションしたものを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲを行った。プライマーはプライマー（Ｂ）とシーケンス用プライマーＭ４（ＴａＫａＲａ）を使用し、先の条件で、９４℃・３０秒、４０℃・３０秒、７２℃・１２０秒のサイクルを３０回繰り返した。得られたＤＮＡ断片はＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化後、クローニングベクターｐＨＳＧ３９８に組み込んだ。このプラスミドをｐ３９８−５ＳＨと命名した。
【００２３】
得られた上流領域の塩基配列解析からヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ遺伝子の開始コドン上流に位置するプライマーを以下の通りデザインした。
プライマー（Ｃ）：5-TAAGTCGACAGCAATTTTTATGGGGAG-3
乳酸菌の染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化後連結したＤＮＡを鋳型に，プライマー（Ｃ）を用いて，ＰＣＲ法により乳酸菌由来ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【００２４】
ＰＣＲ反応は実施例１と同じ反応組成，反応器を用い，熱変性（９４℃，３０秒），アニーリング（５０℃・３０秒），伸長反応（７２℃，２分）のステップを３０回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、ＳａｌＩとＥｃｏＲＩで消化し，１．０ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。回収したＤＮＡを，制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＨＳＧ３９８またはｐＨＳＧ３９９とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し，得られたクロラムフェニコール耐性形質転換体より，プラスミドｐ３９８−Ｔ２Ｆ５とｐ３９９−Ｔ２Ｆ５を単離した。得られた形質転換体をそれぞれＪＭ１０９［ｐ３９８−Ｔ２Ｆ５］、ＪＭ１０９［ｐ３９９−Ｔ２Ｆ５］と命名した。
【００２５】
これらの組換えプラスミドのクローンの挿入断片について、ダイデオキシチェインターミーネーター法（Science,214,1295(1981)）によりＤＮＡ塩基配列を決定した。その結果、図２に示すヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ構造遺伝子のＤＮＡ塩基配列を得た。この塩基配列は、４７４ｂｐであり、Ｍｅｔで始まる１５８個のアミノ酸からなる分子量１８，３１７のポリペプチドをコードする。なお、このペプチドのアミノ末端１０個のアミノ酸配列は、精製単離した乳酸菌ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩのそれと完全に一致した。
【００２６】
（２）ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ高発現用組換えプラスミドの作製
ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ生産用組換えプラスミドｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４を以下の方法で作製した（図３参照）。すなわち、ｐ３９９−Ｔ２Ｆ５を鋳型に，以下に示すプライマー（Ｄ）とシーケンス用プライマーＲＶ（ＴａＫａＲａ）を用いて，ＰＣＲ法により乳酸菌由来ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。なお、プライマーＤにはＮｃｏＩ部位と連結するようＢｓｐＨＩ認識配列を導入してある。
プライマー（Ｄ）：５’-AAATCATGAACAAGAAAAAGACTTTATAT-３’
【００２７】
ＰＣＲ反応は（１）と同じ反応組成，反応器を用い，熱変性（９４℃，３０秒），アニーリング（５０℃、３０秒），伸長反応（７２℃，２分）のステップを３０回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後はＢｓｐＨＩとＥｃｏＲＩで消化し，１．０ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。回収したＤＮＡを，制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Gene,69,301(1988)、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し，得られたアンピシリン耐性形質転換体より，ｐＴｃ９９Ａの発現用ｔｒｃプロモーターの直後にヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ構造遺伝子が挿入された組換えベクター、ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４を単離した。得られた形質転換体をＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４］と命名した。
【００２８】
（３）形質転換体の培養とヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩの調製
上記の組換えプラスミドを保持する大腸菌形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で振盪培養した。４×ｌ０8個／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃度０．０５ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で４時間振盪培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ、１０分間）により培養菌体を回収し、１０ｍｌの緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。菌体懸濁液を超音波破砕機にて処理して、さらに遠心分離（１２，０００×ｇ、１０分間）により菌体残渣を除去した。このようにして得られた上清画分を菌体抽出液とした。菌体抽出液におけるヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ活性を対照菌（ｐＨＳＧ３９８を保持する大腸菌ＪＭ１０９）と共に下記表に示す。なお、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ活性は、５ｍＭの２’−デオキシアデノシンとシトシン、またはチミジンとシトシンを基質にして測定した。反応液に菌体抽出液を加えて反応を開始し、１分間煮沸することにより酵素を失活させた。３７℃におけるデオキシシチジンの生成量を高速液体クロマトグラフィーにより定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅの２’−デオキシシチジンを生成する活性を１単位（ユニット）とした。
* 1 unit = 1μmole 2'-deoxycytidine-production from 2'-deoxyadenosine/min at 37℃
** 1 unit = 1μmole 2'-deoxycytidine-production from thymidine/min at 37℃
【００２９】
表１に示すように対照菌（ｐＨＳＧ３９８を保持する大腸菌ＪＭ１０９）で検出されないが、作製した組換えプラスミドを保持する形質転換体においては、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ活性が確認された。また、下記表２に示すように、本発明で造成された形質転換体（ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４保持菌）の生産性は、元株である乳酸菌ラクトバシラス・ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）ATCC8018株の３，０００〜４，０００倍に相当する。
【００３０】
【表２】
【００３１】
（４）大腸菌アデニン・デアミナーゼをコードするｙｉｃＰ遺伝子のクローニングおよびアデニン・デアミナーゼ生産用組換えプラスミドの作製
大腸菌の染色体ＤＮＡを鋳型として，以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌アデニン・デアミナーゼ遺伝子（ｙｉｃＰ）（Science, 277, (5331), 1453-1474, (1997)）を増幅した。
プライマー（Ｅ）： ５’- TTTGGATCCATTGGAGGAGATTTAATCCC -３’
プライマー（Ｆ）： ５’- AAAGAATTCAGCAGTTGACAGTGGC -３’
ＰＣＲによるｙｉｃＰ遺伝子の増幅は、反応液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．００１％ ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｅ）（Ｆ）各々 ０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、２分）、伸長反応（７２℃、３分）のステップを３０回繰り返すことにより行った。
【００３２】
遺伝子増幅後はＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化し，２．０ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。回収したＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＨＳＧ３９９とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたクロラムフェニコール耐性形質転換体より、ｐＨＳＧ３９９のｌａｃプロモーターの直後にアデニン・デアミナーゼ構造遺伝子が挿入された組換えプラスミドｐ３９９−ｙｉｃＰを単離した。得られた形質転換体をＪＭ１０９［ｐ３９９−ｙｉｃＰ］と命名した。
【００３３】
さらに、ｐ３９９−ｙｉｃＰからＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片を切り出し、ｐＴｒｃ１２−６のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位と組換えた（ａ）。また、ｐ３９９−ｙｉｃＰのＢｓｐＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を切り出し、ｐＴｒｃ９９ＡのＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位と組換えた（ｂ）。（ａ）のＳｃａＩ−ＰｓｔＩ断片（長鎖）と（ｂ）のＳｃａＩ−ＰｓｔＩ断片（短鎖）を連結して、ｔｒｃプロモーターの下流にｙｉｃＰ遺伝子が挿入された組換えプラスミドｐ１２−６ｙｉｃＰを得た。得られた形質転換体をＪＭ１０９［ｐ１２−６ｙｉｃＰ］と命名した。
【００３４】
（５）アデニン・デアミナーゼの調製
上記の組換えプラスミドを保持する大腸菌形質転換体を、２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールまたはカナマイシンを含有する２×ＹＴ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で振盪培養した。４×ｌ０8個／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で５時間振盪培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００ｇ、１０分間）により培養菌体を回収し、１０ｍｌの緩衝液Ａ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）、０．５ｍＭＭｎＣｌ2、２０％エチレングリコール）に懸濁した。菌体懸濁液を超音波破砕機にて処理して、さらに遠心分離（２，０００ｇ、１０分間）により菌体残渣を除去した。このようにして得られた上清画分を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液におけるアデニン・デアミナーゼ活性を対照菌（ｐＨＳＧ３９８を保持する大腸菌ＪＭ１０９）と共に下記表に示す。なお、アデニン・デアミナーゼ活性は以下に示す方法で測定、算出したものである。
【００３５】
（アデニン・デアミナーゼ活性の測定と単位の算出法）
アデニンを含む反応液１ｍｌ（０．１Ｍ トリス塩酸（ｐＨ７．６），２ｍＭＭｎＣｌ2，１ｍＭ アデニン塩酸塩）をあらかじめ３７℃に加温しておき、緩衝液Ａで１０倍希釈した無細胞抽出液を５mｌ添加して、３７℃で１０分反応させた後、煮沸させることにより酵素を失活させる。この溶液を２０倍希釈後、ヒポキサンチンの生成量を高速液体クロマトグラフィーにより定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのヒポキサンチンを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
【００３６】
【表２】
表３に示すように、アデニン・デアミナーゼ活性は、作製した組換えプラスミドを保持する形質転換体においては確認されたが、対照菌（ｐＨＳＧ３９８を保持する大腸菌ＪＭ１０９）においては検出されなかった。
【００３７】
上記の無細胞抽出液を以下のように簡易精製した。まず、あらかじめ緩衝液Ａで平衡化したＤＥ５２カラム（ワットマン社製）を用い、０．３ＭのＮａＣｌを含有する緩衝液Ａを展開液としてクロマトグラフィーを行った。アデニン・デアミナーゼ活性画分を回収し、つぎに緩衝液Ａであらかじめ平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｓ−３００（アマシャム・ファルマシア社製）にて、ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。精製の結果、比活性はイオン交換クロマトグラフィーで３倍、ゲル濾過クロマトグラフィーでは３．３倍に上昇した。
【００３８】
（６） ２’−デオキシシチジンの合成
１００ｍＭ ２’−デオキシアデノシン、１００ｍＭ シトシン、１００ｍＭＭＯＰＳ−ＮａＯＨ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、１ｍＭ ＭｎＣｌ2、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ ０．０３６ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、アデニン・デアミナーゼ ０．３０ｕｎｉｔｓ／ｍｌを含む溶液５ｍｌを４０℃で４０時間反応させた。
経時的に反応液の分析を行った結果を図４に示す。図４から明らかなように、アデニン・デアミナーゼを添加しない反応液においては、２’−デオキシシチジンは２２ｍＭしか生成しなかったのに対し、アデニン・デアミナーゼを添加した反応液においては５３ｍＭの２’−デオキシシチジンが生成することが認められた。なお、ヒポキサンチンから塩基交換反応により変換される２’−デオキシイノシンは反応液中からは観察されなかった。
【００３９】
実施例２ ２’−デオキシグアノシンの合成
１００ｍＭ ２’−デオキシアデノシン、２０ｍＭ グアニン、１００ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、１ｍＭ ＭｎＣｌ2、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ ０．３６ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、アデニン・デアミナーゼ ０．３０ｕｎｉｔｓ／ｍｌを含む溶液５ｍｌ中を４０℃で攪拌しながら４０時間反応させた。
経時的に反応液の分析を行った結果を図５に示す。アデニン・デアミナーゼを添加しない反応液においては、２’−デオキシグアノシンは１．６ｍＭしか生成しなかったのに対し、アデニン・デアミナーゼを添加した反応液においては、６．０ｍＭの２’−デオキシグアノシンが生成することが認められた。なお、反応液中には、２’−デオキシイノシンが生成していたが、その生成量は無視できる程度のものであった。
【００４０】
実施例３ ２’−デオキシ−５−フルオロウリジンの合成
２００ｍＭ ２’−デオキシアデノシン、２００ｍＭ ５−フルオロウラシル、１００ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、１ｍＭ ＭｎＣｌ2、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ ０．１２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ，アデニン・デアミナーゼ ０．３０ｕｎｉｔｓ／ｍｌを含む溶液５ｍｌを４０℃で攪拌しながら６５時間反応させた。
経時的に反応液の分析を行った結果を図６に示す。アデニン・デアミナーゼを添加しない反応液においては、２’−デオキシ−５−フルオロウリジンは４０ｍＭしか生成しなかったのに対し、アデニン・デアミナーゼを添加した反応液においては、８０ｍＭの２’−デオキシ−５−フルオロウリジンが生成することが認められた。なお、２’−デオキシイノシンは反応液中からは観察されなかった。
【００４１】
実施例１〜３の結果をまとめると表４のようになる。表４から明らかなように、アデニン・デアミナーゼを反応系に共存させることにより、アデニン・デアミナーゼを添加しない場合と比較して、デオキシヌクレオシドの収率は２〜４倍も向上した。
【表４】
【発明の効果】
上述したように、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼとアデニン・デアミナーゼを併用（カップリング）する本発明によれば、目的とするデオキシヌクレオシドの合成収率を２〜４倍も向上させることが可能であり、本発明方法は極めて実用的な方法である。
【００４３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、乳酸菌ラクトバシラス・ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）ATCC8018由来のヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ構造遺伝子を含有する４．３ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩＤＮＡ断片の制限酵素地図を示したものである。図１における「ｎｄｔＢ」はヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩをコードする遺伝子（４７４ｂｐ、１５８個のアミノ酸からなる分子量１８，３１７のポリペプチドをコードする）を示す。
【図２】図２は、乳酸ラクトバシラス・ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus)ATCC8018由来のヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片の塩基配列を示したものである。図中、Ｓ．Ｄ．はＳＤ配列を、Ｍｅｔはヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ構造遺伝子の翻訳開始コドンを、ｓｔｏｐはその停止コドンをそれぞれ示す。
【図３】図３は、組換えプラスミドベクター、ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４の構築法を示したものである。
【図４】図４は、アデニン・デアミナーゼの添加の有無による２’−デオキシシチジン生成量の経時変化を示したものである。図中、●はアデニン・デアミナーゼを添加した時の結果を、○はアデニン・デアミナーゼを添加しないときの結果を示したものである。（図５、図６も同様）
【図５】図５は、アデニン・デアミナーゼの添加の有無による２’−デオキシグアノシン生成量の経時変化を示したものである。
【図６】図６は、アデニン・デアミナーゼの添加の有無による２’−デオキシ−５−フルオロウリジン生成量の経時変化を示したものである。
Claims (2)
- ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを用いてデオキシアデノシンと塩基とからデオキシヌクレオシドを製造する際、デオキシアデノシンを１０〜５００ｍＭの濃度で用い、水または緩衝液中で反応させ、生成したアデニンをアデニン・デアミナーゼを用いてヒポキサンチンに変換させることを特徴とする、デオキシヌクレオシドの製造法。
- デオキシアデノシンが２’−デオキシアデノシンであり、デオキシヌクレオシドが２’−デオキシヌクレオシドである、請求項１記載の製造法。
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