JP2002017393A - デオキシヌクレオシドの酵素的製造法 - Google Patents
デオキシヌクレオシドの酵素的製造法Info
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- JP2002017393A JP2002017393A JP2000202460A JP2000202460A JP2002017393A JP 2002017393 A JP2002017393 A JP 2002017393A JP 2000202460 A JP2000202460 A JP 2000202460A JP 2000202460 A JP2000202460 A JP 2000202460A JP 2002017393 A JP2002017393 A JP 2002017393A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェ
ラーゼとアデニン・デアミナーゼとを併用（カップリン
グ）したデオキシヌクレオシドの効率的な製造法を提供
する。 【解決手段】ヌクレオシド・デオキシリボシルトランス
フェラーゼを用いてデオキシアデノシンと塩基とからデ
オキシヌクレオシドを製造する際、生成したアデニンを
アデニン・デアミナーゼを用いてヒポキサンチンに変換
させることを特徴とする、デオキシヌクレオシドの製造
法に関する。
ラーゼとアデニン・デアミナーゼとを併用（カップリン
グ）したデオキシヌクレオシドの効率的な製造法を提供
する。 【解決手段】ヌクレオシド・デオキシリボシルトランス
フェラーゼを用いてデオキシアデノシンと塩基とからデ
オキシヌクレオシドを製造する際、生成したアデニンを
アデニン・デアミナーゼを用いてヒポキサンチンに変換
させることを特徴とする、デオキシヌクレオシドの製造
法に関する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヌクレオシド・デオキ
シリボシルトランスフェラーゼとアデニン・デアミナー
ゼとを併用（カップリング）したデオキシヌクレオシド
の効率的な製造法に関するものである。
シリボシルトランスフェラーゼとアデニン・デアミナー
ゼとを併用（カップリング）したデオキシヌクレオシド
の効率的な製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】デオキシヌクレオシド類は、アンチセン
ス医薬品（デオキシヌクレオチドのオリゴマーなど）を
初めとする種々の医薬品の原料などに有用な化合物であ
る。従来、これらのデオキシヌクレオシド類は、化学的
に合成するか、白子などのＤＮＡを酵素分解することに
より調製されていた。さらに、最近、酵素を用いたデオ
キシヌクレオシド類の合成法も報告されており、それら
は主にヌクレオシド・ホスホリラーゼやヌクレオシド・
デオキシリボシルトランスフェラーゼを用いた方法であ
る（Journal of Biotechnology,23,193-210(1992)）。
ス医薬品（デオキシヌクレオチドのオリゴマーなど）を
初めとする種々の医薬品の原料などに有用な化合物であ
る。従来、これらのデオキシヌクレオシド類は、化学的
に合成するか、白子などのＤＮＡを酵素分解することに
より調製されていた。さらに、最近、酵素を用いたデオ
キシヌクレオシド類の合成法も報告されており、それら
は主にヌクレオシド・ホスホリラーゼやヌクレオシド・
デオキシリボシルトランスフェラーゼを用いた方法であ
る（Journal of Biotechnology,23,193-210(1992)）。
【０００３】ヌクレオシド・デオキシリボシルトランス
フェラーゼ（E.C.2.4.2.6.、別名：トランス−Ｎ−デオ
キシリボシラーゼ）は、デオキシヌクレオシドのデオキ
シリボシル基を他の塩基に転移する反応を触媒する酵素
である。例えばラクトバシラス属に属する乳酸菌の一種
であるラクトバシラス・ヘルベチカス（Lactobacillus
helveticus）やラクトバシラス・ライヒマンニ（Lactob
acillus leichmannii）にはヌクレオシド・デオキシリ
ボシルトランスフェラーゼ−Ｉと同−ＩＩの２種類の酵
素が存在し、それらの酵素学的諸性質も既に報告されて
いる（Methodsin Enzymology,Vol.LI.446(1978)、Biol.
chem.Hoppe-Seyler,Vol.377,357-362(1996)）。さら
に、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラー
ゼを利用した２’，３’−ジデオキシヌクレオシドの合
成も既に報告されている（ＷＯ９０／０６３１２、ＷＯ
９１／０４３２２、Biochemical And Biophysical Rese
rchCommunications,Vol.155,No.2,829-834(1988)）。
フェラーゼ（E.C.2.4.2.6.、別名：トランス−Ｎ−デオ
キシリボシラーゼ）は、デオキシヌクレオシドのデオキ
シリボシル基を他の塩基に転移する反応を触媒する酵素
である。例えばラクトバシラス属に属する乳酸菌の一種
であるラクトバシラス・ヘルベチカス（Lactobacillus
helveticus）やラクトバシラス・ライヒマンニ（Lactob
acillus leichmannii）にはヌクレオシド・デオキシリ
ボシルトランスフェラーゼ−Ｉと同−ＩＩの２種類の酵
素が存在し、それらの酵素学的諸性質も既に報告されて
いる（Methodsin Enzymology,Vol.LI.446(1978)、Biol.
chem.Hoppe-Seyler,Vol.377,357-362(1996)）。さら
に、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラー
ゼを利用した２’，３’−ジデオキシヌクレオシドの合
成も既に報告されている（ＷＯ９０／０６３１２、ＷＯ
９１／０４３２２、Biochemical And Biophysical Rese
rchCommunications,Vol.155,No.2,829-834(1988)）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ヌクレ
オシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼが触媒す
る反応は平衡反応であるため、反応が平衡に達するとそ
れ以上の反応は進行せず、目的とするデオキシヌクレオ
シドの合成収率の向上には限界があった。従来、ヌクレ
オシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを用いた
酵素反応における上記の問題点を克服するための方策は
何ら報告されていない。しかし、同様の問題を抱えるヌ
クレオシド・ホスホリラーゼにおいては、目的とするデ
オキシヌクレオシド合成反応の方へ平衡反応を傾かせ、
合成収率を向上させるための工夫がいくつか報告されて
いる。たとえば、ヌクレオシド・ホスホリラーゼを用い
デオキシイノシンと塩基からデオキシヌクレオシドを製
造する方法において、生成するヒポキサンチンをオキシ
ダーゼなどを用いて尿酸など反応の基質になりえない物
質に変換させ、目的とするデオキシヌクレオシドの合成
収率を向上させる方法などが提案されている（特開平５
−４９４９３、特開平９−２１５４９８、特開平１１−
４６７９０）。
オシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼが触媒す
る反応は平衡反応であるため、反応が平衡に達するとそ
れ以上の反応は進行せず、目的とするデオキシヌクレオ
シドの合成収率の向上には限界があった。従来、ヌクレ
オシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを用いた
酵素反応における上記の問題点を克服するための方策は
何ら報告されていない。しかし、同様の問題を抱えるヌ
クレオシド・ホスホリラーゼにおいては、目的とするデ
オキシヌクレオシド合成反応の方へ平衡反応を傾かせ、
合成収率を向上させるための工夫がいくつか報告されて
いる。たとえば、ヌクレオシド・ホスホリラーゼを用い
デオキシイノシンと塩基からデオキシヌクレオシドを製
造する方法において、生成するヒポキサンチンをオキシ
ダーゼなどを用いて尿酸など反応の基質になりえない物
質に変換させ、目的とするデオキシヌクレオシドの合成
収率を向上させる方法などが提案されている（特開平５
−４９４９３、特開平９−２１５４９８、特開平１１−
４６７９０）。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記のヌ
クレオシド・ホスホリラーゼで提案されている収率向上
のための方法を参考に、鋭意検討を重ねた結果、まった
く意外なことに、ヌクレオシド・デオキシリボシルトラ
ンスフェラーゼを用いてデオキシアデノシンと塩基とか
らデオキシヌクレオシドを製造する際、生成したアデニ
ンをアデニン・デアミナーゼを用いてヒポキサンチンに
変換させることにより目的とするデオキシヌクレオシド
の収率が格段に向上することを見出した。
クレオシド・ホスホリラーゼで提案されている収率向上
のための方法を参考に、鋭意検討を重ねた結果、まった
く意外なことに、ヌクレオシド・デオキシリボシルトラ
ンスフェラーゼを用いてデオキシアデノシンと塩基とか
らデオキシヌクレオシドを製造する際、生成したアデニ
ンをアデニン・デアミナーゼを用いてヒポキサンチンに
変換させることにより目的とするデオキシヌクレオシド
の収率が格段に向上することを見出した。
【０００６】一般に、ヒポキサンチンがヌクレオシド・
デオキシリボシルトランスフェラーゼの基質となること
は古くから知られており、アデニンをヒポキサンチンに
変換したとしても目的外のデオキシイノシンが生成し、
目的とするデオキシヌクレオシドの収率が向上するとは
到底考えられていなかった。事実、ヌクレオシド・ホス
ホリラーゼを用いた反応においても、ヒポキサンチンは
ヌクレオシド・ホスホリラーゼの基質となり得るため、
生成したヒポキサンチンをオキシダーゼ等で尿素まで変
換しないと目的とするデオキシヌクレオシドの収率を向
上させることはできない。
デオキシリボシルトランスフェラーゼの基質となること
は古くから知られており、アデニンをヒポキサンチンに
変換したとしても目的外のデオキシイノシンが生成し、
目的とするデオキシヌクレオシドの収率が向上するとは
到底考えられていなかった。事実、ヌクレオシド・ホス
ホリラーゼを用いた反応においても、ヒポキサンチンは
ヌクレオシド・ホスホリラーゼの基質となり得るため、
生成したヒポキサンチンをオキシダーゼ等で尿素まで変
換しないと目的とするデオキシヌクレオシドの収率を向
上させることはできない。
【０００７】この点を更に検討した結果、（１）ヒポキ
サンチンは、濃度が薄い場合のみヌクレオシド・デオキ
シリボシルトランスフェラーゼの基質となり得、デオキ
シヌクレオシドの製造の際に用いるような通常の濃度で
は基質になり得ないこと、（２）このため、アデニンを
アデニン・デアミナーゼを用いてヒポキサンチンに変換
したとしても、ヌクレオシド・デオキシリボシルトラン
スフェラーゼによりデオキシイノシンはまったく生成し
ないか、生成してもごく僅かであり、ヒポキサンチンが
ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを
用いたデオキシヌクレオシドの製造に悪影響を及ぼさな
いことを確認し、本発明を完成させた。したがって、本
発明は、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェ
ラーゼを用いてデオキシアデノシンと塩基とからデオキ
シヌクレオシドを製造する際、生成したアデニンをアデ
ニン・デアミナーゼを用いてヒポキサンチンに変換させ
ることを特徴とする、デオキシヌクレオシドの製造法に
関するものである。
サンチンは、濃度が薄い場合のみヌクレオシド・デオキ
シリボシルトランスフェラーゼの基質となり得、デオキ
シヌクレオシドの製造の際に用いるような通常の濃度で
は基質になり得ないこと、（２）このため、アデニンを
アデニン・デアミナーゼを用いてヒポキサンチンに変換
したとしても、ヌクレオシド・デオキシリボシルトラン
スフェラーゼによりデオキシイノシンはまったく生成し
ないか、生成してもごく僅かであり、ヒポキサンチンが
ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを
用いたデオキシヌクレオシドの製造に悪影響を及ぼさな
いことを確認し、本発明を完成させた。したがって、本
発明は、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェ
ラーゼを用いてデオキシアデノシンと塩基とからデオキ
シヌクレオシドを製造する際、生成したアデニンをアデ
ニン・デアミナーゼを用いてヒポキサンチンに変換させ
ることを特徴とする、デオキシヌクレオシドの製造法に
関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明は、以下の式に示す反応に
よりデオキシヌクレオシドを製造しようとするものであ
る。すなわち、ヌクレオシド・デオキシリボシルトラン
スフェラーゼによりデオキシアデノシン（ｄＲｉｂ−Ａ
ｄｅ）と塩基（ＢＨ）から目的とするデオキシヌクレオ
シド（ｄＲｉｂ−Ｂ）およびアデニンを生成させるとと
もに、生成したアデニンはアデニン・デアミナーゼによ
りヒポキサンチンに変換する。
よりデオキシヌクレオシドを製造しようとするものであ
る。すなわち、ヌクレオシド・デオキシリボシルトラン
スフェラーゼによりデオキシアデノシン（ｄＲｉｂ−Ａ
ｄｅ）と塩基（ＢＨ）から目的とするデオキシヌクレオ
シド（ｄＲｉｂ−Ｂ）およびアデニンを生成させるとと
もに、生成したアデニンはアデニン・デアミナーゼによ
りヒポキサンチンに変換する。
【０００９】
【式１】 （式中、ｄＲｉｂはデオキシリボシル基、Ａｄｅはアデ
ニン、ＢＨは塩基、Ｈｙｐはヒポキサンチン、Ｅ１はヌ
クレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ、Ｅ
２はアデニン・デアミナーゼを示す。） 前述したように、ヌクレオシド・デオキシリボシルトラ
ンスフェラーゼの反応は平衡反応であるため、反応が平
衡に達すると進行しなくなる。そこで、アデニン・デア
ミナーゼを反応系に共存させ、生成したアデニンをヒポ
キサンチンに変換させることで平衡を崩し、目的とする
デオキシヌクレオシドの収率向上を達成することが可能
となる。
ニン、ＢＨは塩基、Ｈｙｐはヒポキサンチン、Ｅ１はヌ
クレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ、Ｅ
２はアデニン・デアミナーゼを示す。） 前述したように、ヌクレオシド・デオキシリボシルトラ
ンスフェラーゼの反応は平衡反応であるため、反応が平
衡に達すると進行しなくなる。そこで、アデニン・デア
ミナーゼを反応系に共存させ、生成したアデニンをヒポ
キサンチンに変換させることで平衡を崩し、目的とする
デオキシヌクレオシドの収率向上を達成することが可能
となる。
【００１０】本発明で使用するヌクレオシド・デオキシ
リボシルトランスフェラーゼおよびアデニン・デアミナ
ーゼは、いずれも公知の酵素であり、動物由来、植物由
来、微生物由来など特定のものに限定されず、すべての
由来のものを使用することができる。しかし、酵素調製
の簡便性などの点から微生物由来の酵素を使用するのが
好都合である。たとえば、ヌクレオシド・デオキシリボ
シルトランスフェラーゼは乳酸菌に属する微生物から容
易に調製でき、アデニン・デアミナーゼは細菌や酵母に
属する微生物から容易に調製することができる（Method
s in Enzymology,Vol.LI.446(1978)、J. Am. Chem. So
c., 79, 630-633(1957)、J. Biol. Chem., 242, 740-74
6(1967)等参照）。また、ラクトバシラス・ヘルベチカ
ス（Lactobacillus helveticus）由来のヌクレオシド・
デオキシリボシルトランスフェラーゼはヒポキサンチン
を基質として認識しにくいことから、本発明においては
好適な酵素である。
リボシルトランスフェラーゼおよびアデニン・デアミナ
ーゼは、いずれも公知の酵素であり、動物由来、植物由
来、微生物由来など特定のものに限定されず、すべての
由来のものを使用することができる。しかし、酵素調製
の簡便性などの点から微生物由来の酵素を使用するのが
好都合である。たとえば、ヌクレオシド・デオキシリボ
シルトランスフェラーゼは乳酸菌に属する微生物から容
易に調製でき、アデニン・デアミナーゼは細菌や酵母に
属する微生物から容易に調製することができる（Method
s in Enzymology,Vol.LI.446(1978)、J. Am. Chem. So
c., 79, 630-633(1957)、J. Biol. Chem., 242, 740-74
6(1967)等参照）。また、ラクトバシラス・ヘルベチカ
ス（Lactobacillus helveticus）由来のヌクレオシド・
デオキシリボシルトランスフェラーゼはヒポキサンチン
を基質として認識しにくいことから、本発明においては
好適な酵素である。
【００１１】微生物を培養するための培地としては、こ
れらの微生物が資化可能な炭素源及び窒素源を適当量含
有し、必要に応じて金属塩、微量発育促進物質、消泡剤
などを添加したものが使用される。具体的には、培地成
分としては糖類（グルコース、サッカロースなど）、天
然炭水化物（糖蜜、廃糖蜜、澱粉、麦、ふすま、米な
ど）、アルコール類、脂肪酸類、炭化水素類など、窒素
源としては、肉エキス、酵母エキス、大豆加水分解物な
ど、金属塩としては亜鉛、鉄、マグネシウムなどのリン
酸塩、塩酸塩、硫酸塩など、微量発育促進物質として
は、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビオチンなどがあげ
られる。培養は、通常の液体培養法（振とう培養、通気
撹拌培養、静置培養、連続培養など）によって、２０〜
５０℃の温度条件下で必要により通気攪拌しながら、目
的とする酵素活性が十分得られるまで行えばよい。
れらの微生物が資化可能な炭素源及び窒素源を適当量含
有し、必要に応じて金属塩、微量発育促進物質、消泡剤
などを添加したものが使用される。具体的には、培地成
分としては糖類（グルコース、サッカロースなど）、天
然炭水化物（糖蜜、廃糖蜜、澱粉、麦、ふすま、米な
ど）、アルコール類、脂肪酸類、炭化水素類など、窒素
源としては、肉エキス、酵母エキス、大豆加水分解物な
ど、金属塩としては亜鉛、鉄、マグネシウムなどのリン
酸塩、塩酸塩、硫酸塩など、微量発育促進物質として
は、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビオチンなどがあげ
られる。培養は、通常の液体培養法（振とう培養、通気
撹拌培養、静置培養、連続培養など）によって、２０〜
５０℃の温度条件下で必要により通気攪拌しながら、目
的とする酵素活性が十分得られるまで行えばよい。
【００１２】このようにして得られた培養物を用い、使
用目的に応じ適宜処理加工したものを酵素調製物として
本発明に使用する。そのような酵素調製物としては特に
制限されるものではなく、例えば、微生物の培養物自
体、培養物から通常の分離手段（遠心分離、沈殿分離、
凝集分離、洗浄など）によって分離された菌体、または
その菌体処理物を例示することができる。菌体処理物を
さらに具体的に例示すれば、生菌体を適当な緩衝液に懸
濁し、超音波処理、フレンチプレス処理などにより物理
的に菌体を破砕するか、あるいはリゾチーム処理など酵
素的に溶菌させた後、菌体残渣を遠心分離により除去し
た無細胞抽出液を挙げることができる。さらに、この無
細胞抽出液を熱処理、硫安塩析処理、透析処理、エタノ
ールなどの溶媒処理、各種クロマトグラフィー処理など
の酵素精製に通常使用されている処理を単独で、または
数種組み合わせて得られる粗精製酵素、精製酵素を例示
することもできる。
用目的に応じ適宜処理加工したものを酵素調製物として
本発明に使用する。そのような酵素調製物としては特に
制限されるものではなく、例えば、微生物の培養物自
体、培養物から通常の分離手段（遠心分離、沈殿分離、
凝集分離、洗浄など）によって分離された菌体、または
その菌体処理物を例示することができる。菌体処理物を
さらに具体的に例示すれば、生菌体を適当な緩衝液に懸
濁し、超音波処理、フレンチプレス処理などにより物理
的に菌体を破砕するか、あるいはリゾチーム処理など酵
素的に溶菌させた後、菌体残渣を遠心分離により除去し
た無細胞抽出液を挙げることができる。さらに、この無
細胞抽出液を熱処理、硫安塩析処理、透析処理、エタノ
ールなどの溶媒処理、各種クロマトグラフィー処理など
の酵素精製に通常使用されている処理を単独で、または
数種組み合わせて得られる粗精製酵素、精製酵素を例示
することもできる。
【００１３】さらに、上記の両酵素の遺伝子ともクロー
ニングされており、クローン化されたＤＮＡ断片を用
い、公知の組換えＤＮＡ手法で目的とする酵素を調製す
ることも可能である（Science, 277, (5331), 1453-147
4, (1997)、PCT/JP00/03490 など参照)。すわなち、遺
伝子のクローニング、クローン化したＤＮＡ断片を用い
た発現ベクターの調製、当該発現ベクターを用いた目的
とする酵素活性を有する酵素の調製などは、分子生物学
の分野に属する技術者にとっては周知の技術であり、例
えば「Molecular Cloning」(Maniatis ら編、Cold Spri
ng Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor、New Yor
k(1982)）に記載の方法に従って行うことができる。
ニングされており、クローン化されたＤＮＡ断片を用
い、公知の組換えＤＮＡ手法で目的とする酵素を調製す
ることも可能である（Science, 277, (5331), 1453-147
4, (1997)、PCT/JP00/03490 など参照)。すわなち、遺
伝子のクローニング、クローン化したＤＮＡ断片を用い
た発現ベクターの調製、当該発現ベクターを用いた目的
とする酵素活性を有する酵素の調製などは、分子生物学
の分野に属する技術者にとっては周知の技術であり、例
えば「Molecular Cloning」(Maniatis ら編、Cold Spri
ng Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor、New Yor
k(1982)）に記載の方法に従って行うことができる。
【００１４】使用するデオキシアデノシンとしては、
２’−デオキシアデノシン、３’−デオキシアデノシ
ン、２’，３’−デオキシアデノシン等のデオキシアデ
ノシン類が例示される。また、使用する塩基としては、
合成目的のデオキシヌクレオシドの塩基に応じて公知の
塩基類から種々選択すればよく、具体的には複素環塩基
または置換基（例えばアミノ基、置換アミノ基、水酸
基、オキソ基、メルカプト基、アシル基、アルキル基、
置換アルキル基、アルコキシル基、ハロゲン原子など）
を有する誘導体を例示することができる。複素環塩基の
具体例としては、たとえば、プリン及びその誘導体、ピ
リミジン及びその誘導体、トリアゾール及びその誘導
体、イミダゾール及びその誘導体、デアザプリン及びそ
の誘導体、アザプリン及びその誘導体、アザピリミジン
及びその誘導体またはピリジン及びその誘導体などであ
る。
２’−デオキシアデノシン、３’−デオキシアデノシ
ン、２’，３’−デオキシアデノシン等のデオキシアデ
ノシン類が例示される。また、使用する塩基としては、
合成目的のデオキシヌクレオシドの塩基に応じて公知の
塩基類から種々選択すればよく、具体的には複素環塩基
または置換基（例えばアミノ基、置換アミノ基、水酸
基、オキソ基、メルカプト基、アシル基、アルキル基、
置換アルキル基、アルコキシル基、ハロゲン原子など）
を有する誘導体を例示することができる。複素環塩基の
具体例としては、たとえば、プリン及びその誘導体、ピ
リミジン及びその誘導体、トリアゾール及びその誘導
体、イミダゾール及びその誘導体、デアザプリン及びそ
の誘導体、アザプリン及びその誘導体、アザピリミジン
及びその誘導体またはピリジン及びその誘導体などであ
る。
【００１５】具体的には、プリン塩基およびその誘導体
としてはグアニン、キサンチン、６−メルカプトプリ
ン、６−チオグアニン、Ｎ6−アルキルもしくはアシル
アデニン、２−アルコキシアデニン、２−チオアデニ
ン、２，６−ジアミノプリンなど、ピリミジンおよびそ
の誘導体としてはシトシン、ウラシル、チミン、５−ハ
ロゲノウラシル（５−フルオロウラシル、５−ヨードウ
ラシルなど）、５−ハロゲノシトシン（５−フルオロシ
トシンなど）、５−トリハロゲノメチルウラシル（５−
トリフルオロメチルウラシルなど）、２−チオシトシ
ン、４−チオウラシル、Ｎ4−アシルシトシン、５−ハ
ロゲノビニルウラシルなど、トリアゾールおよびその誘
導体としては、１，２，４−トリアゾール−３−カルボ
キサミド、１，２，４−トリアゾール−３−カルボン
酸、１，２，４−トリアゾール−３−カルボン酸アルキ
ルエステルなど、イミダゾールおよびその誘導体として
は５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミド、４−
カルバモイル−イミダゾリウム−５−オレート、ベンズ
イミダゾールなど、デアザプリンおよびその誘導体とし
ては１−デアザアデニン、３−デアザアデニン、７−デ
アザアデニン、７−デアザグアニンなど、アザプリンお
よびその誘導体としては８−アザアデニン、７−デアザ
−８−アザヒポキサンチン（アロプリノール）など、ア
ザピリミジンおよびその誘導体としては５−アザチミ
ン、５−アザシトシン、６−アザウラシルなど、または
ピリジンおよびその誘導体としては３−デアザウラシ
ル、ニコチン酸、ニコチン酸アミドなどが例示される。
としてはグアニン、キサンチン、６−メルカプトプリ
ン、６−チオグアニン、Ｎ6−アルキルもしくはアシル
アデニン、２−アルコキシアデニン、２−チオアデニ
ン、２，６−ジアミノプリンなど、ピリミジンおよびそ
の誘導体としてはシトシン、ウラシル、チミン、５−ハ
ロゲノウラシル（５−フルオロウラシル、５−ヨードウ
ラシルなど）、５−ハロゲノシトシン（５−フルオロシ
トシンなど）、５−トリハロゲノメチルウラシル（５−
トリフルオロメチルウラシルなど）、２−チオシトシ
ン、４−チオウラシル、Ｎ4−アシルシトシン、５−ハ
ロゲノビニルウラシルなど、トリアゾールおよびその誘
導体としては、１，２，４−トリアゾール−３−カルボ
キサミド、１，２，４−トリアゾール−３−カルボン
酸、１，２，４−トリアゾール−３−カルボン酸アルキ
ルエステルなど、イミダゾールおよびその誘導体として
は５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミド、４−
カルバモイル−イミダゾリウム−５−オレート、ベンズ
イミダゾールなど、デアザプリンおよびその誘導体とし
ては１−デアザアデニン、３−デアザアデニン、７−デ
アザアデニン、７−デアザグアニンなど、アザプリンお
よびその誘導体としては８−アザアデニン、７−デアザ
−８−アザヒポキサンチン（アロプリノール）など、ア
ザピリミジンおよびその誘導体としては５−アザチミ
ン、５−アザシトシン、６−アザウラシルなど、または
ピリジンおよびその誘導体としては３−デアザウラシ
ル、ニコチン酸、ニコチン酸アミドなどが例示される。
【００１６】デオキシヌクレオシドの合成反応は、１０
ｍＭ以上、好ましくは２０ｍＭ以上、さらに好ましくは
５０〜５００ｍＭ濃度になるようにデオキシアデノシン
と適当濃度の塩基とを水または緩衝液（ｐＨ３〜１０）
に溶解または懸濁させ、０．００１ユニット／ｍｌ以
上、好ましくは０．０１ユニット／ｍｌ以上のヌクレオ
シド・デオキシリボシルトランスフェラーゼと、０．０
１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．１ユニット／ｍ
ｌ以上のアデニン・デアミナーゼを使用し、１０〜６０
℃、好ましくは２０〜５０℃の温度条件下で１０分〜５
０時間程度、必要により攪拌しながら反応させることに
より実施することができる。デオキシアデノシンの濃度
が薄すぎる、例えば１０ｍＭ未満では、生成したヒポキ
サンチンがヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフ
ェラーゼの基質となり、目的外のデオキシイノシンが合
成される可能性が大きくなり、好ましくない。また、反
応温度が１０℃未満のときは反応速度が遅く、反応効率
が悪い。一方、反応温度が６０℃を越える場合には酵素
が変性、失活する可能性があり、好ましくない。また、
反応途中でｐＨが変動するときは、酸またはアルカリを
用いて上記ｐＨ範囲に補正すればよい。
ｍＭ以上、好ましくは２０ｍＭ以上、さらに好ましくは
５０〜５００ｍＭ濃度になるようにデオキシアデノシン
と適当濃度の塩基とを水または緩衝液（ｐＨ３〜１０）
に溶解または懸濁させ、０．００１ユニット／ｍｌ以
上、好ましくは０．０１ユニット／ｍｌ以上のヌクレオ
シド・デオキシリボシルトランスフェラーゼと、０．０
１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．１ユニット／ｍ
ｌ以上のアデニン・デアミナーゼを使用し、１０〜６０
℃、好ましくは２０〜５０℃の温度条件下で１０分〜５
０時間程度、必要により攪拌しながら反応させることに
より実施することができる。デオキシアデノシンの濃度
が薄すぎる、例えば１０ｍＭ未満では、生成したヒポキ
サンチンがヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフ
ェラーゼの基質となり、目的外のデオキシイノシンが合
成される可能性が大きくなり、好ましくない。また、反
応温度が１０℃未満のときは反応速度が遅く、反応効率
が悪い。一方、反応温度が６０℃を越える場合には酵素
が変性、失活する可能性があり、好ましくない。また、
反応途中でｐＨが変動するときは、酸またはアルカリを
用いて上記ｐＨ範囲に補正すればよい。
【００１７】反応終了後、生成したデオキシヌクレオシ
ドは核酸関連物質の精製法として通常使用されている方
法あるいはこれを応用した方法によって分離精製するこ
とができる。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、
吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲ
ル濾過法など各種のクロマトグラフィー、向流分配、向
流抽出など、二液相間の分配を利用する方法、また、濃
縮、冷却、有機溶媒添加など、溶解度の差を利用する方
法などのデオキシヌクレオシドの分離精製で使用されて
いる一般的な分離精製法を単独で、あるいは適宜組み合
わせて行なえばよい。
ドは核酸関連物質の精製法として通常使用されている方
法あるいはこれを応用した方法によって分離精製するこ
とができる。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、
吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲ
ル濾過法など各種のクロマトグラフィー、向流分配、向
流抽出など、二液相間の分配を利用する方法、また、濃
縮、冷却、有機溶媒添加など、溶解度の差を利用する方
法などのデオキシヌクレオシドの分離精製で使用されて
いる一般的な分離精製法を単独で、あるいは適宜組み合
わせて行なえばよい。
【００１８】
【実施例】以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明
するが、本発明がこれに限定されないことは明らかであ
る。なお、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素によ
る切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに
大腸菌の形質転換法は全て「Molecular Cloning」（前
述）にしたがって行った。また、各種制限酵素、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ、プラスミドベクターｐＨＳＧ３９８及び
ｐＨＳＧ３９９は全て宝酒造（株）より入手した。サザ
ンハイブリダイゼーション用のＤＮＡ標識キットおよび
ＤＮＡ検出キットはベーリンガー・マンハイム社から入
手した。
するが、本発明がこれに限定されないことは明らかであ
る。なお、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素によ
る切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに
大腸菌の形質転換法は全て「Molecular Cloning」（前
述）にしたがって行った。また、各種制限酵素、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ、プラスミドベクターｐＨＳＧ３９８及び
ｐＨＳＧ３９９は全て宝酒造（株）より入手した。サザ
ンハイブリダイゼーション用のＤＮＡ標識キットおよび
ＤＮＡ検出キットはベーリンガー・マンハイム社から入
手した。
【００１９】実施例１ （１）ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラ
ーゼ−ＩＩ構造遺伝子のクローニングおよび塩基配列の
決定 ラクトバシラス・ヘルベチカス（Lactobacillus helvet
icus）ATCC8018から常法に従って調製したヌクレオシド
・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩの精製酵
素標品（２００ｐｍｏｌ：４μｇ）を終濃度８Ｍの尿素
存在下で３７℃１時間の変性処理し、トリプシン溶液
（宝酒造製・TaKaRa Residue-specific Proteases Ki
t）処理後、定法に従いＰＶＤＦ膜に転写した。転写さ
れたバンド（２本）を切り取り、Ｎ末端アミノ酸解析に
供した。アミノ酸配列から推定された塩基配列をもと
に、ＰＣＲ用プライマーを以下の通りデザインした。
ーゼ−ＩＩ構造遺伝子のクローニングおよび塩基配列の
決定 ラクトバシラス・ヘルベチカス（Lactobacillus helvet
icus）ATCC8018から常法に従って調製したヌクレオシド
・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩの精製酵
素標品（２００ｐｍｏｌ：４μｇ）を終濃度８Ｍの尿素
存在下で３７℃１時間の変性処理し、トリプシン溶液
（宝酒造製・TaKaRa Residue-specific Proteases Ki
t）処理後、定法に従いＰＶＤＦ膜に転写した。転写さ
れたバンド（２本）を切り取り、Ｎ末端アミノ酸解析に
供した。アミノ酸配列から推定された塩基配列をもと
に、ＰＣＲ用プライマーを以下の通りデザインした。
【００２０】プライマー（Ａ）: 5-CCTCTGCAGCCATGAAYA
ARAARAARACNYTNTAYTTYGG-3 プライマー（Ｂ）: 5-ACCAAGCTTRTTRTGIARRTAYTCIGGRTG
YTCRTC-3 （上記プライマーの塩基配列において、ＹはＣまたはＴ
を、ＲはＡまたはＧを、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴを、Ｉ
は２’−デオキシイノシンをそれぞれ示す。）
ARAARAARACNYTNTAYTTYGG-3 プライマー（Ｂ）: 5-ACCAAGCTTRTTRTGIARRTAYTCIGGRTG
YTCRTC-3 （上記プライマーの塩基配列において、ＹはＣまたはＴ
を、ＲはＡまたはＧを、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴを、Ｉ
は２’−デオキシイノシンをそれぞれ示す。）
【００２１】ＰＣＲによる遺伝子の増幅は、反応液１０
０１μｌ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．
００１％ゼラチン、０．２ｍＭｄＡＴＰ、０．２ｍＭｄ
ＧＴＰ、０．２ｍＭｄＣＴＰ、０．２ｍＭｄＴＴＰ、乳
酸菌染色体ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ
（Ａ）（Ｂ）各々０．２ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼ ２．５ユニット）をPerkin-Elmer Cetus
Instrument社製DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変性
（９４℃、３０秒）、アニーリング（４０℃、３０
秒）、伸長反応（７２℃、３０秒）のステップを２８回
繰り返すことにより行った。サザンハイブリダイゼーシ
ョン用のプローブは、上記ＰＣＲ条件でｄＮＴＰにＤＩ
Ｇ標識ＵＴＰを含む混合液を使用して作製した。乳酸菌
染色体ＤＮＡは種々の制限酵素で分解し電気泳動後、常
法に従ってサザンハイブリダイゼーションを行った。こ
の結果から、図１のような制限酵素地図が得られた。
０１μｌ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．
００１％ゼラチン、０．２ｍＭｄＡＴＰ、０．２ｍＭｄ
ＧＴＰ、０．２ｍＭｄＣＴＰ、０．２ｍＭｄＴＴＰ、乳
酸菌染色体ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ
（Ａ）（Ｂ）各々０．２ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼ ２．５ユニット）をPerkin-Elmer Cetus
Instrument社製DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変性
（９４℃、３０秒）、アニーリング（４０℃、３０
秒）、伸長反応（７２℃、３０秒）のステップを２８回
繰り返すことにより行った。サザンハイブリダイゼーシ
ョン用のプローブは、上記ＰＣＲ条件でｄＮＴＰにＤＩ
Ｇ標識ＵＴＰを含む混合液を使用して作製した。乳酸菌
染色体ＤＮＡは種々の制限酵素で分解し電気泳動後、常
法に従ってサザンハイブリダイゼーションを行った。こ
の結果から、図１のような制限酵素地図が得られた。
【００２２】図１のとおり、ヌクレオシド・デオキシリ
ボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ遺伝子（ｎｄｔＢ ｇ
ｅｎｅ）は乳酸菌染色体ＤＮＡのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ
の３．２ｋｂ断片に存在することが判明した。そこで乳
酸菌染色体のＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ消化物の２．３〜
４．０ｋｂ断片を回収して、これをｐＵＣ１８のＳａｌ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ消化物とライゲーションしたものを鋳型
ＤＮＡとしてＰＣＲを行った。プライマーはプライマー
（Ｂ）とシーケンス用プライマーＭ４（ＴａＫａＲａ）
を使用し、先の条件で、９４℃・３０秒、４０℃・３０
秒、７２℃・１２０秒のサイクルを３０回繰り返した。
得られたＤＮＡ断片はＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化
後、クローニングベクターｐＨＳＧ３９８に組み込ん
だ。このプラスミドをｐ３９８−５ＳＨと命名した。
ボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ遺伝子（ｎｄｔＢ ｇ
ｅｎｅ）は乳酸菌染色体ＤＮＡのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ
の３．２ｋｂ断片に存在することが判明した。そこで乳
酸菌染色体のＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ消化物の２．３〜
４．０ｋｂ断片を回収して、これをｐＵＣ１８のＳａｌ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ消化物とライゲーションしたものを鋳型
ＤＮＡとしてＰＣＲを行った。プライマーはプライマー
（Ｂ）とシーケンス用プライマーＭ４（ＴａＫａＲａ）
を使用し、先の条件で、９４℃・３０秒、４０℃・３０
秒、７２℃・１２０秒のサイクルを３０回繰り返した。
得られたＤＮＡ断片はＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化
後、クローニングベクターｐＨＳＧ３９８に組み込ん
だ。このプラスミドをｐ３９８−５ＳＨと命名した。
【００２３】得られた上流領域の塩基配列解析からヌク
レオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ
遺伝子の開始コドン上流に位置するプライマーを以下の
通りデザインした。 プライマー（Ｃ）：5-TAAGTCGACAGCAATTTTTATGGGGAG-3 乳酸菌の染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化後連結したＤＮ
Ａを鋳型に，プライマー（Ｃ）を用いて，ＰＣＲ法によ
り乳酸菌由来ヌクレオシド・デオキシリボシルトランス
フェラーゼ−ＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。
レオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ
遺伝子の開始コドン上流に位置するプライマーを以下の
通りデザインした。 プライマー（Ｃ）：5-TAAGTCGACAGCAATTTTTATGGGGAG-3 乳酸菌の染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化後連結したＤＮ
Ａを鋳型に，プライマー（Ｃ）を用いて，ＰＣＲ法によ
り乳酸菌由来ヌクレオシド・デオキシリボシルトランス
フェラーゼ−ＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【００２４】ＰＣＲ反応は実施例１と同じ反応組成，反
応器を用い，熱変性（９４℃，３０秒），アニーリング
（５０℃・３０秒），伸長反応（７２℃，２分）のステ
ップを３０回繰り返すことにより行った。遺伝子増幅
後、ＳａｌＩとＥｃｏＲＩで消化し，１．０ｋｂのＤＮ
Ａ断片を精製した。回収したＤＮＡを，制限酵素Ｓａｌ
ＩとＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＨＳＧ３９８ま
たはｐＨＳＧ３９９とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転
換し，得られたクロラムフェニコール耐性形質転換体よ
り，プラスミドｐ３９８−Ｔ２Ｆ５とｐ３９９−Ｔ２Ｆ
５を単離した。得られた形質転換体をそれぞれＪＭ１０
９［ｐ３９８−Ｔ２Ｆ５］、ＪＭ１０９［ｐ３９９−Ｔ
２Ｆ５］と命名した。
応器を用い，熱変性（９４℃，３０秒），アニーリング
（５０℃・３０秒），伸長反応（７２℃，２分）のステ
ップを３０回繰り返すことにより行った。遺伝子増幅
後、ＳａｌＩとＥｃｏＲＩで消化し，１．０ｋｂのＤＮ
Ａ断片を精製した。回収したＤＮＡを，制限酵素Ｓａｌ
ＩとＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＨＳＧ３９８ま
たはｐＨＳＧ３９９とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転
換し，得られたクロラムフェニコール耐性形質転換体よ
り，プラスミドｐ３９８−Ｔ２Ｆ５とｐ３９９−Ｔ２Ｆ
５を単離した。得られた形質転換体をそれぞれＪＭ１０
９［ｐ３９８−Ｔ２Ｆ５］、ＪＭ１０９［ｐ３９９−Ｔ
２Ｆ５］と命名した。
【００２５】これらの組換えプラスミドのクローンの挿
入断片について、ダイデオキシチェインターミーネータ
ー法（Science,214,1295(1981)）によりＤＮＡ塩基配列
を決定した。その結果、図２に示すヌクレオシド・デオ
キシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ構造遺伝子のＤ
ＮＡ塩基配列を得た。この塩基配列は、４７４ｂｐであ
り、Ｍｅｔで始まる１５８個のアミノ酸からなる分子量
１８，３１７のポリペプチドをコードする。なお、この
ペプチドのアミノ末端１０個のアミノ酸配列は、精製単
離した乳酸菌ヌクレオシド・デオキシリボシルトランス
フェラーゼ−ＩＩのそれと完全に一致した。
入断片について、ダイデオキシチェインターミーネータ
ー法（Science,214,1295(1981)）によりＤＮＡ塩基配列
を決定した。その結果、図２に示すヌクレオシド・デオ
キシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ構造遺伝子のＤ
ＮＡ塩基配列を得た。この塩基配列は、４７４ｂｐであ
り、Ｍｅｔで始まる１５８個のアミノ酸からなる分子量
１８，３１７のポリペプチドをコードする。なお、この
ペプチドのアミノ末端１０個のアミノ酸配列は、精製単
離した乳酸菌ヌクレオシド・デオキシリボシルトランス
フェラーゼ−ＩＩのそれと完全に一致した。
【００２６】（２）ヌクレオシド・デオキシリボシルト
ランスフェラーゼ−ＩＩ高発現用組換えべクターの作製 ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−
ＩＩ生産用組換えベクターｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４を以下の
方法で作製した（図３参照）。すなわち、ｐ３９９−Ｔ
２Ｆ５を鋳型に，以下に示すプライマー（Ｄ）とシーケ
ンス用プライマーＲＶ（ＴａＫａＲａ）を用いて，ＰＣ
Ｒ法により乳酸菌由来ヌクレオシド・デオキシリボシル
トランスフェラーゼ−ＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増
幅した。なお、プライマーＤにはＮｃｏＩ部位と連結す
るようＢｓｐＨＩ認識配列を導入してある。 プライマー（Ｄ）：5-AAATCATGAACAAGAAAAAGACTTTATAT-
3
ランスフェラーゼ−ＩＩ高発現用組換えべクターの作製 ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−
ＩＩ生産用組換えベクターｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４を以下の
方法で作製した（図３参照）。すなわち、ｐ３９９−Ｔ
２Ｆ５を鋳型に，以下に示すプライマー（Ｄ）とシーケ
ンス用プライマーＲＶ（ＴａＫａＲａ）を用いて，ＰＣ
Ｒ法により乳酸菌由来ヌクレオシド・デオキシリボシル
トランスフェラーゼ−ＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増
幅した。なお、プライマーＤにはＮｃｏＩ部位と連結す
るようＢｓｐＨＩ認識配列を導入してある。 プライマー（Ｄ）：5-AAATCATGAACAAGAAAAAGACTTTATAT-
3
【００２７】ＰＣＲ反応は（１）と同じ反応組成，反応
器を用い，熱変性（９４℃，３０秒），アニーリング
（５０℃、３０秒），伸長反応（７２℃，２分）のステ
ップを３０回繰り返すことにより行った。遺伝子増幅後
はＢｓｐＨＩとＥｃｏＲＩで消化し，１．０ｋｂのＤＮ
Ａ断片を精製した。回収したＤＮＡを，制限酵素Ｎｃｏ
ＩとＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ
（Gene,69,301(1988)、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社より入
手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応
液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し，得られた
アンピシリン耐性形質転換体より，ｐＴｃ９９Ａの発現
用ｔｒｃプロモーターの直後にヌクレオシド・デオキシ
リボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ構造遺伝子が挿入さ
れた組換えベクター、ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４を単離した。
得られた形質転換体をＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ
４］と命名した。
器を用い，熱変性（９４℃，３０秒），アニーリング
（５０℃、３０秒），伸長反応（７２℃，２分）のステ
ップを３０回繰り返すことにより行った。遺伝子増幅後
はＢｓｐＨＩとＥｃｏＲＩで消化し，１．０ｋｂのＤＮ
Ａ断片を精製した。回収したＤＮＡを，制限酵素Ｎｃｏ
ＩとＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ
（Gene,69,301(1988)、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社より入
手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応
液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し，得られた
アンピシリン耐性形質転換体より，ｐＴｃ９９Ａの発現
用ｔｒｃプロモーターの直後にヌクレオシド・デオキシ
リボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ構造遺伝子が挿入さ
れた組換えベクター、ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４を単離した。
得られた形質転換体をＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ
４］と命名した。
【００２８】（３）形質転換体の培養とヌクレオシド・
デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩの調製 上記の組換えベクターを保持する大腸菌形質転換体を、
１００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールまたはアンピ
シリンを含有する２ｘＹＴ培地１００ｍｌに植菌し、３
７℃で振盪培養した。４×ｌ０8個／ｍｌに達した時点
で、培養液に終濃度０．０５ｍＭとなるようにＩＰＴＧ
を添加し、さらに３７℃で４時間振盪培養を続けた。培
養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ、１０分間）によ
り培養菌体を回収し、１０ｍｌの緩衝液（１０ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ７．８）、１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁した。
菌体懸濁液を超音波破砕機にて処理して、さらに遠心分
離（１２，０００×ｇ、１０分間）により菌体残渣を除
去した。このようにして得られた上清画分を菌体抽出液
とした。菌体抽出液におけるヌクレオシド・デオキシリ
ボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ活性を対照菌（ｐＨＳ
Ｇ３９８を保持する大腸菌ＪＭ１０９）と共に下記表に
示す。なお、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランス
フェラーゼ−ＩＩ活性は、５ｍＭの２’−デオキシアデ
ノシンとシトシン、またはチミジンとシトシンを基質に
して測定した。反応液に菌体抽出液を加えて反応を開始
し、１分間煮沸することにより酵素を失活させた。３７
℃におけるデオキシシチジンの生成量を高速液体クロマ
トグラフィーにより定量し、３７℃で１分間に１μｍｏ
ｌｅの２’−デオキシシチジンを生成する活性を１単位
（ユニット）とした。
デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩの調製 上記の組換えベクターを保持する大腸菌形質転換体を、
１００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールまたはアンピ
シリンを含有する２ｘＹＴ培地１００ｍｌに植菌し、３
７℃で振盪培養した。４×ｌ０8個／ｍｌに達した時点
で、培養液に終濃度０．０５ｍＭとなるようにＩＰＴＧ
を添加し、さらに３７℃で４時間振盪培養を続けた。培
養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ、１０分間）によ
り培養菌体を回収し、１０ｍｌの緩衝液（１０ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ７．８）、１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁した。
菌体懸濁液を超音波破砕機にて処理して、さらに遠心分
離（１２，０００×ｇ、１０分間）により菌体残渣を除
去した。このようにして得られた上清画分を菌体抽出液
とした。菌体抽出液におけるヌクレオシド・デオキシリ
ボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ活性を対照菌（ｐＨＳ
Ｇ３９８を保持する大腸菌ＪＭ１０９）と共に下記表に
示す。なお、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランス
フェラーゼ−ＩＩ活性は、５ｍＭの２’−デオキシアデ
ノシンとシトシン、またはチミジンとシトシンを基質に
して測定した。反応液に菌体抽出液を加えて反応を開始
し、１分間煮沸することにより酵素を失活させた。３７
℃におけるデオキシシチジンの生成量を高速液体クロマ
トグラフィーにより定量し、３７℃で１分間に１μｍｏ
ｌｅの２’−デオキシシチジンを生成する活性を１単位
（ユニット）とした。
【表１】 * 1 unit = 1μmole 2'-deoxycytidine-production fro
m 2'-deoxyadenosine/min at 37℃** 1 unit = 1μmole
2'-deoxycytidine-production from thymidine/min at
37℃
m 2'-deoxyadenosine/min at 37℃** 1 unit = 1μmole
2'-deoxycytidine-production from thymidine/min at
37℃
【００２９】表１に示すように対照菌（ｐＨＳＧ３９８
を保持する大腸菌ＪＭ１０９）で検出されないが、作製
した組換えベクターを保持する形質転換体においては、
ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−
ＩＩ活性が確認された。また、下記表２に示すように、
本発明で造成された形質転換体（ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４保
持菌）の生産性は、元株である乳酸菌ラクトバシラス・
ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）ATCC8018株
の３，０００〜４，０００倍に相当する。
を保持する大腸菌ＪＭ１０９）で検出されないが、作製
した組換えベクターを保持する形質転換体においては、
ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−
ＩＩ活性が確認された。また、下記表２に示すように、
本発明で造成された形質転換体（ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４保
持菌）の生産性は、元株である乳酸菌ラクトバシラス・
ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）ATCC8018株
の３，０００〜４，０００倍に相当する。
【００３０】
【表２】 ＊ 1 unit = 1μmole 2'-deoxycytidine-production fr
om 2'-deoxyuridine/minat 37℃
om 2'-deoxyuridine/minat 37℃
【００３１】（４）大腸菌アデニン・デアミナーゼをコ
ードするｙｉｃＰ遺伝子のクローニングおよびアデニン
・デアミナーゼ生産用組換えベクターの作製 大腸菌の染色体ＤＮＡを鋳型として，以下に示す２種類
のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法に
より大腸菌アデニン・デアミナーゼ遺伝子（ｙｉｃＰ）
（Science, 277, (5331), 1453-1474, (1997)）を増幅
した。 プライマー（Ｅ）： 5- TTTGGATCCATTGGAGGAGATTTAATC
CC -3 プライマー（Ｆ）： 5- AAAGAATTCAGCAGTTGACAGTGGC -
3 ＰＣＲによるｙｉｃＰ遺伝子の増幅は、反応液１００μ
ｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ トリス塩酸
（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．
００１％ ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍ
Ｍ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄ
ＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ
（Ｅ）（Ｆ）各々 ０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼ ２．５ユニット）をPerkin-Elmer Cet
us Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変
性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、２分）、
伸長反応（７２℃、３分）のステップを３０回繰り返す
ことにより行った。
ードするｙｉｃＰ遺伝子のクローニングおよびアデニン
・デアミナーゼ生産用組換えベクターの作製 大腸菌の染色体ＤＮＡを鋳型として，以下に示す２種類
のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法に
より大腸菌アデニン・デアミナーゼ遺伝子（ｙｉｃＰ）
（Science, 277, (5331), 1453-1474, (1997)）を増幅
した。 プライマー（Ｅ）： 5- TTTGGATCCATTGGAGGAGATTTAATC
CC -3 プライマー（Ｆ）： 5- AAAGAATTCAGCAGTTGACAGTGGC -
3 ＰＣＲによるｙｉｃＰ遺伝子の増幅は、反応液１００μ
ｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ トリス塩酸
（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．
００１％ ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍ
Ｍ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄ
ＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ
（Ｅ）（Ｆ）各々 ０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼ ２．５ユニット）をPerkin-Elmer Cet
us Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変
性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、２分）、
伸長反応（７２℃、３分）のステップを３０回繰り返す
ことにより行った。
【００３２】遺伝子増幅後はＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで
消化し，２．０ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。回収した
ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化した
プラスミドｐＨＳＧ３９９とＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を
形質転換し、得られたクロラムフェニコール耐性形質転
換体より、ｐＨＳＧ３９９のｌａｃプロモーターの直後
にアデニン・デアミナーゼ構造遺伝子が挿入された組換
えベクター、ｐ３９９−ｙｉｃＰを単離した。得られた
形質転換体をＪＭ１０９［ｐ３９９−ｙｉｃＰ］と命名
した。
消化し，２．０ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。回収した
ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化した
プラスミドｐＨＳＧ３９９とＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を
形質転換し、得られたクロラムフェニコール耐性形質転
換体より、ｐＨＳＧ３９９のｌａｃプロモーターの直後
にアデニン・デアミナーゼ構造遺伝子が挿入された組換
えベクター、ｐ３９９−ｙｉｃＰを単離した。得られた
形質転換体をＪＭ１０９［ｐ３９９−ｙｉｃＰ］と命名
した。
【００３３】さらに、ｐ３９９−ｙｉｃＰからＢａｍＨ
Ｉ−ＳａｌＩ断片を切り出し、ｐＴｒｃ１２−６のＢａ
ｍＨＩ−ＳａｌＩ部位と組換えた（ａ）。また、ｐ３９
９−ｙｉｃＰのＢｓｐＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を切り出
し、ｐＴｒｃ９９ＡのＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位と組換
えた（ｂ）。（ａ）のＳｃａＩ−ＰｓｔＩ断片（長鎖）
と（ｂ）のＳｃａＩ−ＰｓｔＩ断片（短鎖）を連結し
て、ｔｒｃプロモーターの下流にｙｉｃＰ遺伝子が挿入
された組換えベクター、ｐ１２−６ｙｉｃＰを得た。得
られた形質転換体をＪＭ１０９［ｐ１２−６ｙｉｃＰ］
と命名した。
Ｉ−ＳａｌＩ断片を切り出し、ｐＴｒｃ１２−６のＢａ
ｍＨＩ−ＳａｌＩ部位と組換えた（ａ）。また、ｐ３９
９−ｙｉｃＰのＢｓｐＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を切り出
し、ｐＴｒｃ９９ＡのＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位と組換
えた（ｂ）。（ａ）のＳｃａＩ−ＰｓｔＩ断片（長鎖）
と（ｂ）のＳｃａＩ−ＰｓｔＩ断片（短鎖）を連結し
て、ｔｒｃプロモーターの下流にｙｉｃＰ遺伝子が挿入
された組換えベクター、ｐ１２−６ｙｉｃＰを得た。得
られた形質転換体をＪＭ１０９［ｐ１２−６ｙｉｃＰ］
と命名した。
【００３４】（５）アデニン・デアミナーゼの調製 上記の組換えベクターを保持する大腸菌形質転換体を、
２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールまたはカナマイ
シンを含有する２×ＹＴ培地１００ｍｌに植菌し、３７
℃で振盪培養した。４×ｌ０8個／ｍｌに達した時点
で、培養液に終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを
添加し、さらに３７℃で５時間振盪培養を続けた。培養
終了後、遠心分離（９，０００ｇ、１０分間）により培
養菌体を回収し、１０ｍｌの緩衝液Ａ（２５ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ７．６）、０．５ｍＭＭｎＣｌ2、２０％エ
チレングリコール）に懸濁した。菌体懸濁液を超音波破
砕機にて処理して、さらに遠心分離（２，０００ｇ、１
０分間）により菌体残渣を除去した。このようにして得
られた上清画分を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液に
おけるアデニン・デアミナーゼ活性を対照菌（ｐＨＳＧ
３９８を保持する大腸菌ＪＭ１０９）と共に下記表に示
す。なお、アデニン・デアミナーゼ活性は以下に示す方
法で測定、算出したものである。
２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールまたはカナマイ
シンを含有する２×ＹＴ培地１００ｍｌに植菌し、３７
℃で振盪培養した。４×ｌ０8個／ｍｌに達した時点
で、培養液に終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを
添加し、さらに３７℃で５時間振盪培養を続けた。培養
終了後、遠心分離（９，０００ｇ、１０分間）により培
養菌体を回収し、１０ｍｌの緩衝液Ａ（２５ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ７．６）、０．５ｍＭＭｎＣｌ2、２０％エ
チレングリコール）に懸濁した。菌体懸濁液を超音波破
砕機にて処理して、さらに遠心分離（２，０００ｇ、１
０分間）により菌体残渣を除去した。このようにして得
られた上清画分を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液に
おけるアデニン・デアミナーゼ活性を対照菌（ｐＨＳＧ
３９８を保持する大腸菌ＪＭ１０９）と共に下記表に示
す。なお、アデニン・デアミナーゼ活性は以下に示す方
法で測定、算出したものである。
【００３５】（アデニン・デアミナーゼ活性の測定と単
位の算出法）アデニンを含む反応液１ｍｌ（０．１Ｍ
トリス塩酸（ｐＨ７．６），２ｍＭＭｎＣｌ2，１ｍＭ
アデニン塩酸塩）をあらかじめ３７℃に加温してお
き、緩衝液Ａで１０倍希釈した無細胞抽出液を５mｌ添
加して、３７℃で１０分反応させた後、煮沸させること
により酵素を失活させる。この溶液を２０倍希釈後、ヒ
ポキサンチンの生成量を高速液体クロマトグラフィーに
より定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのヒポキサ
ンチンを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
位の算出法）アデニンを含む反応液１ｍｌ（０．１Ｍ
トリス塩酸（ｐＨ７．６），２ｍＭＭｎＣｌ2，１ｍＭ
アデニン塩酸塩）をあらかじめ３７℃に加温してお
き、緩衝液Ａで１０倍希釈した無細胞抽出液を５mｌ添
加して、３７℃で１０分反応させた後、煮沸させること
により酵素を失活させる。この溶液を２０倍希釈後、ヒ
ポキサンチンの生成量を高速液体クロマトグラフィーに
より定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのヒポキサ
ンチンを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
【００３６】
【表３】 ＊ 1 unit = 1μmole hypoxanthine-production from
adenine/min at 37℃ 表３に示すように、アデニン・デアミナーゼ活性は、作
製した組換えベクターを保持する形質転換体においては
確認されたが、対照菌（ｐＨＳＧ３９８を保持する大腸
菌ＪＭ１０９）においては検出されなかった。
adenine/min at 37℃ 表３に示すように、アデニン・デアミナーゼ活性は、作
製した組換えベクターを保持する形質転換体においては
確認されたが、対照菌（ｐＨＳＧ３９８を保持する大腸
菌ＪＭ１０９）においては検出されなかった。
【００３７】上記の無細胞抽出液を以下のように簡易精
製した。まず、あらかじめ緩衝液Ａで平衡化したＤＥ５
２カラム（ワットマン社製）を用い、０．３ＭのＮａＣ
ｌを含有する緩衝液Ａを展開液としてクロマトグラフィ
ーを行った。アデニン・デアミナーゼ活性画分を回収
し、つぎに緩衝液Ａであらかじめ平衡化したＳｅｐｈａ
ｄｅｘ Ｓ−３００（アマシャム・ファルマシア社製）
にて、ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。精製の結
果、比活性はイオン交換クロマトグラフィーで３倍、ゲ
ル濾過クロマトグラフィーでは３．３倍に上昇した。
製した。まず、あらかじめ緩衝液Ａで平衡化したＤＥ５
２カラム（ワットマン社製）を用い、０．３ＭのＮａＣ
ｌを含有する緩衝液Ａを展開液としてクロマトグラフィ
ーを行った。アデニン・デアミナーゼ活性画分を回収
し、つぎに緩衝液Ａであらかじめ平衡化したＳｅｐｈａ
ｄｅｘ Ｓ−３００（アマシャム・ファルマシア社製）
にて、ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。精製の結
果、比活性はイオン交換クロマトグラフィーで３倍、ゲ
ル濾過クロマトグラフィーでは３．３倍に上昇した。
【００３８】（６） ２’−デオキシシチジンの合成 １００ｍＭ ２’−デオキシアデノシン、１００ｍＭ
シトシン、１００ｍＭＭＯＰＳ−ＮａＯＨ ｂｕｆｆｅ
ｒ（ｐＨ６．５）、１ｍＭ ＭｎＣｌ2、ヌクレオシド
・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ ０．０
３６ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、アデニン・デアミナーゼ ０．
３０ｕｎｉｔｓ／ｍｌを含む溶液５ｍｌを４０℃で４０
時間反応させた。経時的に反応液の分析を行った結果を
図４に示す。図４から明らかなように、アデニン・デア
ミナーゼを添加しない反応液においては、２’−デオキ
シシチジンは２２ｍＭしか生成しなかったのに対し、ア
デニン・デアミナーゼを添加した反応液においては５３
ｍＭの２’−デオキシシチジンが生成することが認めら
れた。なお、ヒポキサンチンから塩基交換反応により変
換される２’−デオキシイノシンは反応液中からは観察
されなかった。
シトシン、１００ｍＭＭＯＰＳ−ＮａＯＨ ｂｕｆｆｅ
ｒ（ｐＨ６．５）、１ｍＭ ＭｎＣｌ2、ヌクレオシド
・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ ０．０
３６ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、アデニン・デアミナーゼ ０．
３０ｕｎｉｔｓ／ｍｌを含む溶液５ｍｌを４０℃で４０
時間反応させた。経時的に反応液の分析を行った結果を
図４に示す。図４から明らかなように、アデニン・デア
ミナーゼを添加しない反応液においては、２’−デオキ
シシチジンは２２ｍＭしか生成しなかったのに対し、ア
デニン・デアミナーゼを添加した反応液においては５３
ｍＭの２’−デオキシシチジンが生成することが認めら
れた。なお、ヒポキサンチンから塩基交換反応により変
換される２’−デオキシイノシンは反応液中からは観察
されなかった。
【００３９】実施例２ ２’−デオキシグアノシンの合
成 １００ｍＭ ２’−デオキシアデノシン、２０ｍＭ グ
アニン、１００ｍＭＭＯＰＳ−ＮａＯＨ ｂｕｆｆｅｒ
（ｐＨ６．５）、１ｍＭ ＭｎＣｌ2、ヌクレオシド・
デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ ０．３６
ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、アデニン・デアミナーゼ ０．３０
ｕｎｉｔｓ／ｍｌを含む溶液５ｍｌ中を４０℃で攪拌し
ながら４０時間反応させた。経時的に反応液の分析を行
った結果を図５に示す。アデニン・デアミナーゼを添加
しない反応液においては、２’−デオキシグアノシンは
１．６ｍＭしか生成しなかったのに対し、アデニン・デ
アミナーゼを添加した反応液においては、６．０ｍＭの
２’−デオキシグアノシンが生成することが認められ
た。なお、反応液中には、２’−デオキシイノシンが生
成していたが、その生成量は無視できる程度のものであ
った。
成 １００ｍＭ ２’−デオキシアデノシン、２０ｍＭ グ
アニン、１００ｍＭＭＯＰＳ−ＮａＯＨ ｂｕｆｆｅｒ
（ｐＨ６．５）、１ｍＭ ＭｎＣｌ2、ヌクレオシド・
デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ ０．３６
ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、アデニン・デアミナーゼ ０．３０
ｕｎｉｔｓ／ｍｌを含む溶液５ｍｌ中を４０℃で攪拌し
ながら４０時間反応させた。経時的に反応液の分析を行
った結果を図５に示す。アデニン・デアミナーゼを添加
しない反応液においては、２’−デオキシグアノシンは
１．６ｍＭしか生成しなかったのに対し、アデニン・デ
アミナーゼを添加した反応液においては、６．０ｍＭの
２’−デオキシグアノシンが生成することが認められ
た。なお、反応液中には、２’−デオキシイノシンが生
成していたが、その生成量は無視できる程度のものであ
った。
【００４０】実施例３ ２’−デオキシ−５−フルオロ
ウリジンの合成 ２００ｍＭ ２’−デオキシアデノシン、２００ｍＭ
５−フルオロウラシル、１００ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯ
Ｈ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、１ｍＭ ＭｎＣ
ｌ2、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラ
ーゼ−ＩＩ ０．１２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ，アデニン・デ
アミナーゼ ０．３０ｕｎｉｔｓ／ｍｌを含む溶液５ｍ
ｌを４０℃で攪拌しながら６５時間反応させた。経時的
に反応液の分析を行った結果を図６に示す。アデニン・
デアミナーゼを添加しない反応液においては、２’−デ
オキシ−５−フルオロウリジンは４０ｍＭしか生成しな
かったのに対し、アデニン・デアミナーゼを添加した反
応液においては、８０ｍＭの２’−デオキシ−５−フル
オロウリジンが生成することが認められた。なお、２’
−デオキシイノシンは反応液中からは観察されなかっ
た。
ウリジンの合成 ２００ｍＭ ２’−デオキシアデノシン、２００ｍＭ
５−フルオロウラシル、１００ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯ
Ｈ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、１ｍＭ ＭｎＣ
ｌ2、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラ
ーゼ−ＩＩ ０．１２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ，アデニン・デ
アミナーゼ ０．３０ｕｎｉｔｓ／ｍｌを含む溶液５ｍ
ｌを４０℃で攪拌しながら６５時間反応させた。経時的
に反応液の分析を行った結果を図６に示す。アデニン・
デアミナーゼを添加しない反応液においては、２’−デ
オキシ−５−フルオロウリジンは４０ｍＭしか生成しな
かったのに対し、アデニン・デアミナーゼを添加した反
応液においては、８０ｍＭの２’−デオキシ−５−フル
オロウリジンが生成することが認められた。なお、２’
−デオキシイノシンは反応液中からは観察されなかっ
た。
【００４１】実施例１〜３の結果をまとめると表４のよ
うになる。表４から明らかなように、アデニン・デアミ
ナーゼを反応系に共存させることにより、アデニン・デ
アミナーゼを添加しない場合と比較して、デオキシヌク
レオシドの収率は２〜４倍も向上した。
うになる。表４から明らかなように、アデニン・デアミ
ナーゼを反応系に共存させることにより、アデニン・デ
アミナーゼを添加しない場合と比較して、デオキシヌク
レオシドの収率は２〜４倍も向上した。
【表４】
【００４２】
【発明の効果】上述したように、ヌクレオシド・デオキ
シリボシルトランスフェラーゼとアデニン・デアミナー
ゼを併用（カップリング）する本発明によれば、目的と
するデオキシヌクレオシドの合成収率を２〜４倍も向上
させることが可能であり、本発明方法は極めて実用的な
方法である。
シリボシルトランスフェラーゼとアデニン・デアミナー
ゼを併用（カップリング）する本発明によれば、目的と
するデオキシヌクレオシドの合成収率を２〜４倍も向上
させることが可能であり、本発明方法は極めて実用的な
方法である。
【００４３】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> YAMASA CORPORATION <120> Process for the enzymatically preparation of deoxynucleosides <130> YP2000-012 <140> <141> <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of ndtB gene <400> 1 cctctgcagc catgaayaar aaraaracny tntayttygg 40 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of ndtB gene <400> 2 accaagcttr ttrtgnarrt aytcnggrtg ytcrtc 36 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of ndtB gene <400> 3 taagtcgaca gcaattttta tggggag 27 <210> 4 <211> 158 <212> PRT <213> Lactobacillus helveticus <400> 4 Met Asn Lys Lys Lys Thr Leu Tyr Phe Gly Ala Gly Trp Phe Asn Glu 1 5 10 15 Lys Gln Asn Lys Ala Tyr Lys Glu Ala Met Ala Ala Leu Lys Glu Asn 20 25 30 Pro Thr Val Asp Leu Glu Asn Ser Tyr Val Pro Leu Glu Asn Gln Tyr 35 40 45 Lys Gly Ile Arg Ile Asp Glu His Pro Glu Tyr Leu His Asn Ile Glu 50 55 60 Trp Ala Ser Ala Thr Tyr His Asn Asp Leu Val Gly Ile Lys Thr Ser 65 70 75 80 Asp Val Leu Leu Gly Val Tyr Leu Pro Gln Glu Glu His Val Gly Leu 85 90 95 Gly Met Glu Leu Gly Tyr Pro Leu Ser Gln Gly Lys Leu Phe Phe Trp 100 105 110 Phe Ser His Met Lys Asp Tyr Gly Lys Pro Ile Ile Leu Met Ser Trp 115 120 125 Gly Val Cys Asp Asn Ala Ser Gln Ile Ser Glu Leu Lys Asp Phe Asp 130 135 140 Phe Asn Lys Pro Arg Tyr Asn Phe Tyr Asp Gly Ala Val Tyr 145 150 155 <210> 5 <211> 474 <212> DNA <213> Lactobacillus helveticus <400> 5 atgaataaaa agaagacgct gtactttggt gccggttggt ttaatgaaaa gcaaaacaaa 60 gcttacaaag aagcaatggc agctttaaaa gaaaatccaa cagttgattt agaaaatagt 120 tatgtgcccc ttgaaaacca atacaagggt attcgcattg atgagcatcc agagtacttg 180 cacaacattg aatgggcttc tgcaacctac cacaatgatt tagtaggaat taagacttct 240 gatgtcctgc ttggcgtata tctgccacaa gaagaacacg tcggcttagg catggaactg 300 ggctacccat tatctcaagg aaaattattt ttttggtttt cccatatgaa agattacggc 360 aagccaatca tcttaatgag ctggggcgtt tgtgacaatg ccagtcagat cagtgaatta 420 aaagacttcg actttaacaa gcctcgctac aatttctacg acggagctgt atat 474 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of ndtB gene <400> 6 aaatcatgaa caagaaaaag actttatat 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of yicP gene <400> 7 tttggatcca ttggaggaga tttaatccc 29 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of yicP gene <400> 8 aaagaattca gcagttgaca gtggc 25
【００４４】
【図１】図１は、乳酸菌ラクトバシラス・ヘルベチカス
（Lactobacillus helveticus）ATCC8018由来のヌクレオ
シド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ構造
遺伝子を含有する４．３ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ
ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示したものである。図１に
おける「ｎｄｔＢ」はヌクレオシド・デオキシリボシル
トランスフェラーゼ−ＩＩをコードする遺伝子（４７４
ｂｐ、１５８個のアミノ酸からなる分子量１８，３１７
のポリペプチドをコードする）を示す。
（Lactobacillus helveticus）ATCC8018由来のヌクレオ
シド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ構造
遺伝子を含有する４．３ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ
ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示したものである。図１に
おける「ｎｄｔＢ」はヌクレオシド・デオキシリボシル
トランスフェラーゼ−ＩＩをコードする遺伝子（４７４
ｂｐ、１５８個のアミノ酸からなる分子量１８，３１７
のポリペプチドをコードする）を示す。
【図２】図２は、乳酸ラクトバシラス・ヘルベチカス
（Lactobacillus helveticus)ATCC8018由来のヌクレオ
シド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ構造
遺伝子を含有するＤＮＡ断片の塩基配列を示したもので
ある。図中、Ｓ．Ｄ．はＳＤ配列を、Ｍｅｔはヌクレオ
シド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ構造
遺伝子の翻訳開始コドンを、ｓｔｏｐはその停止コドン
をそれぞれ示す。
（Lactobacillus helveticus)ATCC8018由来のヌクレオ
シド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ構造
遺伝子を含有するＤＮＡ断片の塩基配列を示したもので
ある。図中、Ｓ．Ｄ．はＳＤ配列を、Ｍｅｔはヌクレオ
シド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩ構造
遺伝子の翻訳開始コドンを、ｓｔｏｐはその停止コドン
をそれぞれ示す。
【図３】図３は、組換えプラスミドベクター、ｐＴｒｃ
−Ｔ２Ｆ４の構築法を示したものである。
−Ｔ２Ｆ４の構築法を示したものである。
【図４】図４は、アデニン・デアミナーゼの添加の有無
による２’−デオキシシチジン生成量の経時変化を示し
たものである。図中、●はアデニン・デアミナーゼを添
加した時の結果を、○はアデニン・デアミナーゼを添加
しないときの結果を示したものである。（図５、図６も
同様）
による２’−デオキシシチジン生成量の経時変化を示し
たものである。図中、●はアデニン・デアミナーゼを添
加した時の結果を、○はアデニン・デアミナーゼを添加
しないときの結果を示したものである。（図５、図６も
同様）
【図５】図５は、アデニン・デアミナーゼの添加の有無
による２’−デオキシグアノシン生成量の経時変化を示
したものである。
による２’−デオキシグアノシン生成量の経時変化を示
したものである。
【図６】図６は、アデニン・デアミナーゼの添加の有無
による２’−デオキシ−５−フルオロウリジン生成量の
経時変化を示したものである。
による２’−デオキシ−５−フルオロウリジン生成量の
経時変化を示したものである。
Claims (2)
- 【請求項１】 ヌクレオシド・デオキシリボシルトラン
スフェラーゼを用いてデオキシアデノシンと塩基とから
デオキシヌクレオシドを製造する際、生成したアデニン
をアデニン・デアミナーゼを用いてヒポキサンチンに変
換させることを特徴とする、デオキシヌクレオシドの製
造法。 - 【請求項２】 デオキシアデノシンが２’−デオキシア
デノシンであり、デオキシヌクレオシドが２’−デオキ
シヌクレオシドである、請求項１記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000202460A JP3729712B2 (ja) | 2000-07-04 | 2000-07-04 | デオキシヌクレオシドの酵素的製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000202460A JP3729712B2 (ja) | 2000-07-04 | 2000-07-04 | デオキシヌクレオシドの酵素的製造法 |
Publications (2)
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|---|---|
| JP2002017393A true JP2002017393A (ja) | 2002-01-22 |
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1457568A4 (en) * | 2001-12-28 | 2006-07-05 | Yamasa Corp | PROCESS FOR PRODUCING 2'-DESOXYGUANOSINE |
| KR100847348B1 (ko) * | 2007-01-09 | 2008-07-21 | 아이디비켐(주) | 효소 합성법에 의한 데옥시구아노신의 효율적 생산방법 |
| CN107974476A (zh) * | 2018-01-10 | 2018-05-01 | 中国科学院沈阳应用生态研究所 | 一种虫草素转化为3’-脱氧肌苷的生物转化方法 |
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2000
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| EP1457568A4 (en) * | 2001-12-28 | 2006-07-05 | Yamasa Corp | PROCESS FOR PRODUCING 2'-DESOXYGUANOSINE |
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