JPH05219978A - 核酸関連物質の酵素的製造法及びそれに使用する酵素調製物 - Google Patents
核酸関連物質の酵素的製造法及びそれに使用する酵素調製物Info
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- JPH05219978A JPH05219978A JP4027903A JP2790392A JPH05219978A JP H05219978 A JPH05219978 A JP H05219978A JP 4027903 A JP4027903 A JP 4027903A JP 2790392 A JP2790392 A JP 2790392A JP H05219978 A JPH05219978 A JP H05219978A
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 核酸関連物質を酵素的に製造する方法、及び
その製造法に使用する酵素調製物が提供される。 【構成】 ポリヌクレオチドあるいはイノシン、２’，
３’−ジデオキシイノシンなどの核酸関連物質の製造に
不可欠な酵素、例えばポリヌクレオチドホスホリラーゼ
あるいはアデノシンデアミナーゼなどを組換えＤＮＡ手
法により微生物内で大量に調製し、該微生物から得られ
る酵素調製物を用いて核酸関連物質を製造することによ
り、ポリヌクレオチドあるいはイノシン、２’，３’−
ジデオキシイノシンなどの核酸関連物質を大量にかつ工
業的に有利に製造することができる。
その製造法に使用する酵素調製物が提供される。 【構成】 ポリヌクレオチドあるいはイノシン、２’，
３’−ジデオキシイノシンなどの核酸関連物質の製造に
不可欠な酵素、例えばポリヌクレオチドホスホリラーゼ
あるいはアデノシンデアミナーゼなどを組換えＤＮＡ手
法により微生物内で大量に調製し、該微生物から得られ
る酵素調製物を用いて核酸関連物質を製造することによ
り、ポリヌクレオチドあるいはイノシン、２’，３’−
ジデオキシイノシンなどの核酸関連物質を大量にかつ工
業的に有利に製造することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸関連物質を酵素的
に製造する方法であって、組換えＤＮＡ手法により合成
目的の核酸関連物質の製造に不可欠な酵素を微生物内で
大量に調製し、該微生物から得られる酵素調製物を用い
る核酸関連物質の製造法、及びその製造法に使用する酵
素調製物に関するものである。
に製造する方法であって、組換えＤＮＡ手法により合成
目的の核酸関連物質の製造に不可欠な酵素を微生物内で
大量に調製し、該微生物から得られる酵素調製物を用い
る核酸関連物質の製造法、及びその製造法に使用する酵
素調製物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】アデニン、グアニン、ウラシル、チミ
ン、ヒポキサンチン、アデノシン、グアノシン、イノシ
ン、チミジン、ウリジン、アデニル酸、イノシン酸、グ
アニル酸、ＡＤＰ、ＡＴＰ、３’−アジドチミジン（Ａ
ＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ＤＤＩ）、
２’，３’−ジデオキシアデノシン（ＤＤＡ）、３’−
デオキシ−２’，３’−ジデヒドロチミジン（ＤＨ
Ｔ）、９−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）アデニン
（ａｒａＡ）、ポリイノシン酸（ｐｏｌｙＩ）、ポリシ
チジル酸（ｐｏｌｙＣ）、ポリアデニル酸（ｐｏｌｙ
Ａ）などの化合物に代表される核酸関連物質は、種々の
生理活性物質の合成原料として重要であるばかりでな
く、それ自体医薬品として開発され、既に市販されてい
るものもある。このため、核酸関連物質を工業的な規模
で大量に収率よく製造する方法を確立することは産業上
極めて有益であり、この方面の研究も数多く報告されて
いる。たとえば、ポリヌクレオチドとＤＤＩとを例に挙
げ、現在まで報告された研究の概要を説明する。
ン、ヒポキサンチン、アデノシン、グアノシン、イノシ
ン、チミジン、ウリジン、アデニル酸、イノシン酸、グ
アニル酸、ＡＤＰ、ＡＴＰ、３’−アジドチミジン（Ａ
ＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ＤＤＩ）、
２’，３’−ジデオキシアデノシン（ＤＤＡ）、３’−
デオキシ−２’，３’−ジデヒドロチミジン（ＤＨ
Ｔ）、９−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）アデニン
（ａｒａＡ）、ポリイノシン酸（ｐｏｌｙＩ）、ポリシ
チジル酸（ｐｏｌｙＣ）、ポリアデニル酸（ｐｏｌｙ
Ａ）などの化合物に代表される核酸関連物質は、種々の
生理活性物質の合成原料として重要であるばかりでな
く、それ自体医薬品として開発され、既に市販されてい
るものもある。このため、核酸関連物質を工業的な規模
で大量に収率よく製造する方法を確立することは産業上
極めて有益であり、この方面の研究も数多く報告されて
いる。たとえば、ポリヌクレオチドとＤＤＩとを例に挙
げ、現在まで報告された研究の概要を説明する。
【０００３】Ａ．ポリヌクレオチド ポリヌクレオチドは、１９５５年にオチアヨらにより初
めて実験室的に合成され、その後この物質が種々の生理
活性を有することが明らかとなった。特に、インターフ
ェロン産生誘導能の証明は、この物質の医薬品としての
開発を加速させた。ポリヌクレオチドの合成法として
は、化学的方法と酵素的方法の２種類の方法が考えられ
る。しかし、ポリヌクレオチドはモノヌクレオチドの重
合体であるため、現在の技術レベルから考えて経済的な
大量製造に化学的合成法を適用することは困難である。
めて実験室的に合成され、その後この物質が種々の生理
活性を有することが明らかとなった。特に、インターフ
ェロン産生誘導能の証明は、この物質の医薬品としての
開発を加速させた。ポリヌクレオチドの合成法として
は、化学的方法と酵素的方法の２種類の方法が考えられ
る。しかし、ポリヌクレオチドはモノヌクレオチドの重
合体であるため、現在の技術レベルから考えて経済的な
大量製造に化学的合成法を適用することは困難である。
【０００４】また、ポリヌクレオチドを酵素的に合成す
る際に使用するポリヌクレオチドホスホリラーゼは微生
物に広く存在することが知られており、ポリヌクレオチ
ド合成時に使用する酵素調製物としては微生物由来のも
のを用いるのが有利である。このため、ポリヌクレオチ
ドの工業的製造に適した微生物のスクリーニングが多く
の研究者によって行われた。たとえば、１９７５年に六
川らは、ヌクレアーゼ、ヌクレオシド二りん酸分解酵素
などのポリヌクレオチド合成阻害酵素の活性が微弱でポ
リヌクレオチドホスホリラーゼ活性の比較的高い菌株、
Achromobactersp. KR170-4 を見いだし、これを報告し
ている（Agric. Biol. Chem., 39, 1455(1975)）。しか
しながら、該菌株は、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ
の生産性が低く、ポリヌクレオチドの工業的製造に応用
できるような最適な酵素源とはなり得ない。また、該菌
株より調製した酵素を用いてポリウリジル酸やポリグア
ニル酸を合成することは困難であった。
る際に使用するポリヌクレオチドホスホリラーゼは微生
物に広く存在することが知られており、ポリヌクレオチ
ド合成時に使用する酵素調製物としては微生物由来のも
のを用いるのが有利である。このため、ポリヌクレオチ
ドの工業的製造に適した微生物のスクリーニングが多く
の研究者によって行われた。たとえば、１９７５年に六
川らは、ヌクレアーゼ、ヌクレオシド二りん酸分解酵素
などのポリヌクレオチド合成阻害酵素の活性が微弱でポ
リヌクレオチドホスホリラーゼ活性の比較的高い菌株、
Achromobactersp. KR170-4 を見いだし、これを報告し
ている（Agric. Biol. Chem., 39, 1455(1975)）。しか
しながら、該菌株は、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ
の生産性が低く、ポリヌクレオチドの工業的製造に応用
できるような最適な酵素源とはなり得ない。また、該菌
株より調製した酵素を用いてポリウリジル酸やポリグア
ニル酸を合成することは困難であった。
【０００５】大腸菌のポリヌクレオチドホスホリラーゼ
は基質特異性が広く、種々のポリヌクレオチド合成に有
用であることが知られている。しかし、該酵素の菌体内
における存在量は極めて少なく、ポリヌクレオチド合成
阻害酵素も酵素抽出液中にかなり混在するため、ポリヌ
クレオチドの製造に好適な高度に精製されたポリヌクレ
オチドホスホリラーゼを大量に調製することは困難であ
った。このような理由から、大腸菌由来のポリヌクレオ
チドホスホリラーゼを用いてポリヌクレオチドを工業的
に大量に製造しようとする試みは行われていない。
は基質特異性が広く、種々のポリヌクレオチド合成に有
用であることが知られている。しかし、該酵素の菌体内
における存在量は極めて少なく、ポリヌクレオチド合成
阻害酵素も酵素抽出液中にかなり混在するため、ポリヌ
クレオチドの製造に好適な高度に精製されたポリヌクレ
オチドホスホリラーゼを大量に調製することは困難であ
った。このような理由から、大腸菌由来のポリヌクレオ
チドホスホリラーゼを用いてポリヌクレオチドを工業的
に大量に製造しようとする試みは行われていない。
【０００６】Portier らは大腸菌ポリヌクレオチドホス
ホリラーゼをコードするpnp 遺伝子のプラスミドへのク
ローン化を行い、ポリヌクレオチドホスホリラーゼの生
産量の増大を試みた結果、親株の約１０〜２０倍程度の
ポリヌクレオチドホスホリラーゼの生産性の向上が認め
られたことを報告している（Chem. Abst., 99, 51863k
(1982) ）。しかし、この程度生産量を上昇させたとし
てもポリヌクレオチドの製造において従来法では得られ
ない技術上のメリットをもたらすものではなく、また、
この組換え菌から酵素標品を調製する簡便な手法が確立
されていないなどの理由により、組換え菌を用いたポリ
ヌクレオチドの製造法は実用化までには至っていない。
ホリラーゼをコードするpnp 遺伝子のプラスミドへのク
ローン化を行い、ポリヌクレオチドホスホリラーゼの生
産量の増大を試みた結果、親株の約１０〜２０倍程度の
ポリヌクレオチドホスホリラーゼの生産性の向上が認め
られたことを報告している（Chem. Abst., 99, 51863k
(1982) ）。しかし、この程度生産量を上昇させたとし
てもポリヌクレオチドの製造において従来法では得られ
ない技術上のメリットをもたらすものではなく、また、
この組換え菌から酵素標品を調製する簡便な手法が確立
されていないなどの理由により、組換え菌を用いたポリ
ヌクレオチドの製造法は実用化までには至っていない。
【０００７】Ｂ．ＤＤＩ ＤＤＩは、強い坑ウイルス活性を有し、インフルエンザ
ウイルス、エイズウイルスなどに起因するウイルス性疾
患の治療薬として期待されている。２’，３’−ジデオ
キシヌクレオシドを合成する方法としては、化学的な合
成法と酵素的な合成法の２種類の方法が知られている。
化学的な合成法は、反応工程が長かったり、合成収率が
低いといった問題点を有し、必ずしも満足できる方法で
はない。また、酵素的合成法としては、たとえば、微生
物菌体中のヌクレオシドホスホリラーゼを用いてＤＤ
Ｉ、ＤＤＡなどの２’，３’−ジデオキシヌクレオシド
を製造する方法が知られている（特開昭６２−１４９８
９３号）が、ＤＤＩの合成収率が低いという欠点を有し
ていた。
ウイルス、エイズウイルスなどに起因するウイルス性疾
患の治療薬として期待されている。２’，３’−ジデオ
キシヌクレオシドを合成する方法としては、化学的な合
成法と酵素的な合成法の２種類の方法が知られている。
化学的な合成法は、反応工程が長かったり、合成収率が
低いといった問題点を有し、必ずしも満足できる方法で
はない。また、酵素的合成法としては、たとえば、微生
物菌体中のヌクレオシドホスホリラーゼを用いてＤＤ
Ｉ、ＤＤＡなどの２’，３’−ジデオキシヌクレオシド
を製造する方法が知られている（特開昭６２−１４９８
９３号）が、ＤＤＩの合成収率が低いという欠点を有し
ていた。
【０００８】この欠点を克服するため、動物臓器由来の
アデノシンデアミナーゼを用いて、比較的収率よく調製
できるＤＤＡをＤＤＩに変換する試みもなされている
（WebbII, R. R., et al., Nucleoside and Nucleotide
s, 7, 147(1988); Beach, C.M., et al., Nucleoside
and Nucleotides, 10, 1499 (1991) ）が、酵素源が動
物であるため供給量およびコスト面での問題が残る。ま
た、ＤＤＡをＤＤＩに変換する活性を有する微生物を培
養し、その洗浄生菌体を用いてＤＤＡをＤＤＩに変換す
る方法も報告されているが（特開平２−２９１２９１
号）、大量の生菌体を必要とするなど、工業的レベルで
のＤＤＩの製造に最適のものではなかった。
アデノシンデアミナーゼを用いて、比較的収率よく調製
できるＤＤＡをＤＤＩに変換する試みもなされている
（WebbII, R. R., et al., Nucleoside and Nucleotide
s, 7, 147(1988); Beach, C.M., et al., Nucleoside
and Nucleotides, 10, 1499 (1991) ）が、酵素源が動
物であるため供給量およびコスト面での問題が残る。ま
た、ＤＤＡをＤＤＩに変換する活性を有する微生物を培
養し、その洗浄生菌体を用いてＤＤＡをＤＤＩに変換す
る方法も報告されているが（特開平２−２９１２９１
号）、大量の生菌体を必要とするなど、工業的レベルで
のＤＤＩの製造に最適のものではなかった。
【０００９】また、微生物菌体からアデノシンデアミナ
ーゼを抽出し、これをＤＤＡからＤＤＩに変換する反応
に適用しようとしても、該酵素の菌体内における存在量
は極めて少なく、得られる粗酵素液にはアデノシンデア
ミナーゼのほかにヌクレオシダーゼ、ヌクレオシドホス
ホリラーゼなどの副反応を触媒する酵素も含有されてい
るため、ＤＤＩの製造に好適な高度に精製されたアデノ
シンデミナーゼを大量に調製することは困難であった。
ーゼを抽出し、これをＤＤＡからＤＤＩに変換する反応
に適用しようとしても、該酵素の菌体内における存在量
は極めて少なく、得られる粗酵素液にはアデノシンデア
ミナーゼのほかにヌクレオシダーゼ、ヌクレオシドホス
ホリラーゼなどの副反応を触媒する酵素も含有されてい
るため、ＤＤＩの製造に好適な高度に精製されたアデノ
シンデミナーゼを大量に調製することは困難であった。
【００１０】
【本発明が解決しようとする課題】上述のように、核酸
関連物質を酵素的に製造しようとする場合、合成目的の
核酸関連物質の種類に関係なく、（１）菌体内に存在す
る合成目的の核酸関連物質の製造に不可欠な酵素の量が
十分でない、（２）微生物から抽出した粗酵素液には好
ましくない副反応を触媒する酵素がかなり混在し、この
ままでは酵素調製物として使用できない、（３）核酸関
連物質の製造に不可欠な酵素は菌体内酵素である場合が
ほとんどであり、これらの酵素を高度に精製するのが非
常に困難である、などの共通する問題を有し、核酸関連
物質を大量に製造する方法として必ずしも満足できるも
のではなかった。
関連物質を酵素的に製造しようとする場合、合成目的の
核酸関連物質の種類に関係なく、（１）菌体内に存在す
る合成目的の核酸関連物質の製造に不可欠な酵素の量が
十分でない、（２）微生物から抽出した粗酵素液には好
ましくない副反応を触媒する酵素がかなり混在し、この
ままでは酵素調製物として使用できない、（３）核酸関
連物質の製造に不可欠な酵素は菌体内酵素である場合が
ほとんどであり、これらの酵素を高度に精製するのが非
常に困難である、などの共通する問題を有し、核酸関連
物質を大量に製造する方法として必ずしも満足できるも
のではなかった。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述した
核酸関連物質の酵素的製造法に共通する問題を克服し、
核酸関連物質を工業的に大量に製造する方法を開発すべ
く鋭意研究を行った。その結果、組換えＤＮＡ手法を用
いて合成目的の核酸関連物質の製造に不可欠な酵素を人
為的に大量発現させることにより宿主微生物内に目的の
酵素を大過剰に蓄積させ、この形質転換体から簡便な方
法で核酸関連物質の製造に好適な酵素調製物を大量に調
製できることを発見した。さらに、このようにして得た
酵素調製物を核酸関連物質の製造に用いると、極めて収
率よく、かつ短時間に目的とする核酸関連物質を合成で
きることを知見し、本発明を完成させた。
核酸関連物質の酵素的製造法に共通する問題を克服し、
核酸関連物質を工業的に大量に製造する方法を開発すべ
く鋭意研究を行った。その結果、組換えＤＮＡ手法を用
いて合成目的の核酸関連物質の製造に不可欠な酵素を人
為的に大量発現させることにより宿主微生物内に目的の
酵素を大過剰に蓄積させ、この形質転換体から簡便な方
法で核酸関連物質の製造に好適な酵素調製物を大量に調
製できることを発見した。さらに、このようにして得た
酵素調製物を核酸関連物質の製造に用いると、極めて収
率よく、かつ短時間に目的とする核酸関連物質を合成で
きることを知見し、本発明を完成させた。
【００１２】したがって、本発明は下記の工程からなる
核酸関連物質の酵素的製造法に関するものである。 （Ａ）合成目的の核酸関連物質の製造に不可欠な酵素の
遺伝子をクローニングし、該遺伝子の発現が高効率で起
こるように適当な発現制御シグナルと連結して発現ベク
ターを構築する工程； （Ｂ）Ａ工程で得られたベクターを用いて微生物を形質
転換する工程； （Ｃ）Ｂ工程で得られた形質転換体を当該微生物が増殖
可能な培地中で増殖させ、さらにクローニングした酵素
の遺伝子の発現を誘導して合成目的の核酸関連物質の製
造に不可欠な酵素が菌体内に大量に蓄積するまで培養を
行う工程； （Ｄ）Ｃ工程で培養を終えた菌体を回収し、合成目的の
核酸関連物質の製造に不可欠な酵素を抽出、精製して酵
素調製物を調製する工程；および （Ｅ）Ｄ工程で得られた酵素調製物を用いて合成目的の
核酸関連物質を製造する工程
核酸関連物質の酵素的製造法に関するものである。 （Ａ）合成目的の核酸関連物質の製造に不可欠な酵素の
遺伝子をクローニングし、該遺伝子の発現が高効率で起
こるように適当な発現制御シグナルと連結して発現ベク
ターを構築する工程； （Ｂ）Ａ工程で得られたベクターを用いて微生物を形質
転換する工程； （Ｃ）Ｂ工程で得られた形質転換体を当該微生物が増殖
可能な培地中で増殖させ、さらにクローニングした酵素
の遺伝子の発現を誘導して合成目的の核酸関連物質の製
造に不可欠な酵素が菌体内に大量に蓄積するまで培養を
行う工程； （Ｄ）Ｃ工程で培養を終えた菌体を回収し、合成目的の
核酸関連物質の製造に不可欠な酵素を抽出、精製して酵
素調製物を調製する工程；および （Ｅ）Ｄ工程で得られた酵素調製物を用いて合成目的の
核酸関連物質を製造する工程
【００１３】また、本発明は下記の工程から調製され
る、核酸関連物質の酵素的製造法に使用する酵素調製物
に関するものである。 （Ａ）合成目的の核酸関連物質の製造に不可欠な酵素の
遺伝子をクローニングし、該遺伝子の発現が高効率で起
こるように適当な発現制御シグナルと連結して発現ベク
ターを構築する工程； （Ｂ）Ａ工程で得られたベクターを用いて微生物を形質
転換する工程； （Ｃ）Ｂ工程で得られた形質転換体を当該微生物が増殖
可能な培地中で増殖させ、さらにクローニングした酵素
の遺伝子の発現を誘導して合成目的の核酸関連物質の製
造に不可欠な酵素が菌体内に大量に蓄積するまで培養を
行う工程；および （Ｄ）Ｃ工程で培養を終えた菌体を回収し、合成目的の
核酸関連物質の製造に不可欠な酵素を抽出、精製して酵
素調製物を調製する工程
る、核酸関連物質の酵素的製造法に使用する酵素調製物
に関するものである。 （Ａ）合成目的の核酸関連物質の製造に不可欠な酵素の
遺伝子をクローニングし、該遺伝子の発現が高効率で起
こるように適当な発現制御シグナルと連結して発現ベク
ターを構築する工程； （Ｂ）Ａ工程で得られたベクターを用いて微生物を形質
転換する工程； （Ｃ）Ｂ工程で得られた形質転換体を当該微生物が増殖
可能な培地中で増殖させ、さらにクローニングした酵素
の遺伝子の発現を誘導して合成目的の核酸関連物質の製
造に不可欠な酵素が菌体内に大量に蓄積するまで培養を
行う工程；および （Ｄ）Ｃ工程で培養を終えた菌体を回収し、合成目的の
核酸関連物質の製造に不可欠な酵素を抽出、精製して酵
素調製物を調製する工程
【００１４】本明細書において、「核酸関連物質」とは
ある特定の化合物を指称するものではなく、核酸塩基、
ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およ
びそれらの化合物から誘導されることが知られている、
あるいはこれから知られるであろう化合物群を総称した
ものである。また、「核酸関連物質の製造に不可欠な酵
素」とは、たとえばアデノシンデアミナーゼ、ポリヌク
レオチドホスホリラーゼ、ヌクレオシドホスホリラー
ゼ、ヌクレオシダーゼ、ヌクレオシドオキシダーゼなど
のように核酸関連物質に作用して他の化合物に変換する
ことのできる酵素を総称したものである。
ある特定の化合物を指称するものではなく、核酸塩基、
ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およ
びそれらの化合物から誘導されることが知られている、
あるいはこれから知られるであろう化合物群を総称した
ものである。また、「核酸関連物質の製造に不可欠な酵
素」とは、たとえばアデノシンデアミナーゼ、ポリヌク
レオチドホスホリラーゼ、ヌクレオシドホスホリラー
ゼ、ヌクレオシダーゼ、ヌクレオシドオキシダーゼなど
のように核酸関連物質に作用して他の化合物に変換する
ことのできる酵素を総称したものである。
【００１５】本発明の方法を実施するに際し、合成目的
の核酸関連物質、その製造に不可欠な酵素及び原料化合
物の最適な組合せを設定することが必要である。たとえ
ば、合成目的の核酸関連物質がポリヌクレオチドの場
合、ポリヌクレオチドの製造に不可欠な酵素と原料化合
物はポリヌクレオチドホスホリラーゼとヌクレオシド二
りん酸になる。また、合成目的の核酸関連物質がＤＤＩ
の場合、ＤＤＩの製造に不可欠な酵素としてアデノシン
デアミナーゼを使用すれば、原料化合物はＤＤＡとな
り、酵素としてヌクレオシドホスホリラーゼを使用すれ
ば、原料化合物はヒポキサンチンと２’，３’−ジデオ
キシヌクレオシドもしくは２，３−ジデオキシリボース
−１−りん酸となる。このように、合成目的の核酸関連
物質、その製造に不可欠な酵素、及び原料化合物の三者
を照らし合わせて最も合理的な組合せを合目的的に選択
すればよい。
の核酸関連物質、その製造に不可欠な酵素及び原料化合
物の最適な組合せを設定することが必要である。たとえ
ば、合成目的の核酸関連物質がポリヌクレオチドの場
合、ポリヌクレオチドの製造に不可欠な酵素と原料化合
物はポリヌクレオチドホスホリラーゼとヌクレオシド二
りん酸になる。また、合成目的の核酸関連物質がＤＤＩ
の場合、ＤＤＩの製造に不可欠な酵素としてアデノシン
デアミナーゼを使用すれば、原料化合物はＤＤＡとな
り、酵素としてヌクレオシドホスホリラーゼを使用すれ
ば、原料化合物はヒポキサンチンと２’，３’−ジデオ
キシヌクレオシドもしくは２，３−ジデオキシリボース
−１−りん酸となる。このように、合成目的の核酸関連
物質、その製造に不可欠な酵素、及び原料化合物の三者
を照らし合わせて最も合理的な組合せを合目的的に選択
すればよい。
【００１６】以下、本発明方法を工程順に説明する。 １．Ａ工程 Ａ工程は、合成目的の核酸関連物質の製造に不可欠な酵
素の遺伝子をクローニングし、該遺伝子の発現が高効率
で起こるように適当な発現制御シグナルと連結して発現
ベクターを構築する工程である。遺伝子をクローニング
する際の対象微生物は特に限定されないが、後述のＢ工
程で宿主として使用する微生物と同じものを対象にす
る、いわゆるセルフクローニングが本発明では有利であ
る。酵素をコードする遺伝子が既にクローン化され、そ
の一次構造が明らかとなっている場合、該遺伝子の塩基
配列と相補的な塩基配列を持つオリゴデオキシヌクレオ
チドを合成し、それをプローブとして、微生物の染色体
から常法により当該酵素の遺伝子をクローン化すること
ができる。また、ポリメラーゼ連鎖反応（以後、ＰＣＲ
と略称する）によりクローン化することも可能である。
さらに、報告されたＤＮＡ塩基配列に基づき該遺伝子を
化学的に合成することもできる。酵素をコードする遺伝
子の一次構造が不明な場合であっても、必要により酵素
のアミノ酸配列の一部を既知の方法で求め、部分的なア
ミノ酸配列に相当する塩基配列を明らかにすることによ
り、一次構造が知られている場合と同様に酵素の遺伝子
をクローン化することができる。
素の遺伝子をクローニングし、該遺伝子の発現が高効率
で起こるように適当な発現制御シグナルと連結して発現
ベクターを構築する工程である。遺伝子をクローニング
する際の対象微生物は特に限定されないが、後述のＢ工
程で宿主として使用する微生物と同じものを対象にす
る、いわゆるセルフクローニングが本発明では有利であ
る。酵素をコードする遺伝子が既にクローン化され、そ
の一次構造が明らかとなっている場合、該遺伝子の塩基
配列と相補的な塩基配列を持つオリゴデオキシヌクレオ
チドを合成し、それをプローブとして、微生物の染色体
から常法により当該酵素の遺伝子をクローン化すること
ができる。また、ポリメラーゼ連鎖反応（以後、ＰＣＲ
と略称する）によりクローン化することも可能である。
さらに、報告されたＤＮＡ塩基配列に基づき該遺伝子を
化学的に合成することもできる。酵素をコードする遺伝
子の一次構造が不明な場合であっても、必要により酵素
のアミノ酸配列の一部を既知の方法で求め、部分的なア
ミノ酸配列に相当する塩基配列を明らかにすることによ
り、一次構造が知られている場合と同様に酵素の遺伝子
をクローン化することができる。
【００１７】クローン化した酵素の遺伝子は、酵素の発
現の人為的制御が可能となるように発現制御シグナル
（転写開始シグナルおよび翻訳開始シグナル）とベクタ
ー上で連結する。本発明者らは、発現量の上昇と後述の
Ｄ工程における酵素精製の容易さとの関連に関して研究
した結果、親株より５０倍以上、好ましくは１００倍以
上発現量を上昇させることにより、後述するようにＤ工
程における酵素の精製が極めて容易になることを見いだ
した。したがって、発現制御シグナルとしてはクローン
化した酵素遺伝子由来の発現制御シグナルを使用するこ
とも可能であるが、酵素遺伝子の発現量を飛躍的に上昇
させるような強力な転写開始ならびに翻訳開始シグナル
を用いることが望ましい。このような発現制御シグナル
としては、宿主として大腸菌を用いる場合には、lac プ
ロモーター、trp プロモーター、tac プロモーター（de
r Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 21
(1983) ；Russell and Bennett, Gene, 20, 231 (198
2)）などを、宿主として酵母を用いる場合には、グリセ
ルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ
（J. Biol. Chem., 254, 9837 (1979))、３−ホスホグ
リセレートキナーゼ（J. Biol. Chem., 255, 2073 (19
80))および抑制性酸性ホスファターゼ（Nucl. Acids Re
s., 11, 1657 (1983))に対するプロモーターなどを例示
することができる。
現の人為的制御が可能となるように発現制御シグナル
（転写開始シグナルおよび翻訳開始シグナル）とベクタ
ー上で連結する。本発明者らは、発現量の上昇と後述の
Ｄ工程における酵素精製の容易さとの関連に関して研究
した結果、親株より５０倍以上、好ましくは１００倍以
上発現量を上昇させることにより、後述するようにＤ工
程における酵素の精製が極めて容易になることを見いだ
した。したがって、発現制御シグナルとしてはクローン
化した酵素遺伝子由来の発現制御シグナルを使用するこ
とも可能であるが、酵素遺伝子の発現量を飛躍的に上昇
させるような強力な転写開始ならびに翻訳開始シグナル
を用いることが望ましい。このような発現制御シグナル
としては、宿主として大腸菌を用いる場合には、lac プ
ロモーター、trp プロモーター、tac プロモーター（de
r Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 21
(1983) ；Russell and Bennett, Gene, 20, 231 (198
2)）などを、宿主として酵母を用いる場合には、グリセ
ルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ
（J. Biol. Chem., 254, 9837 (1979))、３−ホスホグ
リセレートキナーゼ（J. Biol. Chem., 255, 2073 (19
80))および抑制性酸性ホスファターゼ（Nucl. Acids Re
s., 11, 1657 (1983))に対するプロモーターなどを例示
することができる。
【００１８】ベクターとしては、種々のプラスミドベク
ター、ファージベクターなどが使用可能であるが、微生
物菌体内で複製可能であり、特定の制限酵素切断部位を
有し、菌体内のコピー数の高いプラスミドベクターを使
用するのが望ましい。具体的に宿主として大腸菌を使用
する場合には、pBR322（Boliveret al., Gene, 2, 95(1
975)）、pUC18 、pUC19 (Messing, J., Methods in Enz
ymology, 101, 20 (1983))などが例示することができ
る。また、酵母を宿主とする場合には、ＹＥｐ１３（AT
CC 37115）、ＹＥｐ２４（ATCC 37051）などを例示する
ことができる。酵素遺伝子のクローニング、クローニン
グした遺伝子と発現制御シグナルの連結および融合ＤＮ
Ａをベクターに挿入する方法は、一般の技術者、特に分
子生物学、遺伝子工学の分野に属する技術者にとっては
周知の技術であり、具体的には、例えば「Molecular Cl
oning 」（Maniatisら編、Cold Spring Harbor、New Yo
rk (1982) ）に記載の方法に従って行うことができる。
ター、ファージベクターなどが使用可能であるが、微生
物菌体内で複製可能であり、特定の制限酵素切断部位を
有し、菌体内のコピー数の高いプラスミドベクターを使
用するのが望ましい。具体的に宿主として大腸菌を使用
する場合には、pBR322（Boliveret al., Gene, 2, 95(1
975)）、pUC18 、pUC19 (Messing, J., Methods in Enz
ymology, 101, 20 (1983))などが例示することができ
る。また、酵母を宿主とする場合には、ＹＥｐ１３（AT
CC 37115）、ＹＥｐ２４（ATCC 37051）などを例示する
ことができる。酵素遺伝子のクローニング、クローニン
グした遺伝子と発現制御シグナルの連結および融合ＤＮ
Ａをベクターに挿入する方法は、一般の技術者、特に分
子生物学、遺伝子工学の分野に属する技術者にとっては
周知の技術であり、具体的には、例えば「Molecular Cl
oning 」（Maniatisら編、Cold Spring Harbor、New Yo
rk (1982) ）に記載の方法に従って行うことができる。
【００１９】２．Ｂ工程 Ｂ工程はＡ工程で得られたベクターを用いて微生物を形
質転換する工程である。Ｂ工程で使用する微生物として
は、安全性が高く扱いやすいものであれば、特に限定さ
れない。たとえば、大腸菌、酵母などＤＮＡ組換え操作
に常用されている微生物を使用することができる。その
中でも、大腸菌が取扱い上有利であり、たとえば組換え
ＤＮＡ実験に使用されるC600菌、JM105 菌、JM105 菌、
MC1061菌などが使用可能である。微生物を形質転換する
方法は既に多くの方法が報告されており、宿主として使
用する微生物の種類に応じて適宜選択すればよい。たと
えば大腸菌を宿主として使用する場合、低温下、塩化カ
ルシウム処理して菌体内にプラスミドを移入する方法
（Mandel and Higa, J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)
）により、大腸菌を形質転換することができる。ま
た、酵母を宿主として使用する場合には、プロトプラス
ト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75,1929 (197
8)）、アルカリ金属処理法（J. Bacteriol., 153, 163
(1983) ）などの方法を採用することができる。
質転換する工程である。Ｂ工程で使用する微生物として
は、安全性が高く扱いやすいものであれば、特に限定さ
れない。たとえば、大腸菌、酵母などＤＮＡ組換え操作
に常用されている微生物を使用することができる。その
中でも、大腸菌が取扱い上有利であり、たとえば組換え
ＤＮＡ実験に使用されるC600菌、JM105 菌、JM105 菌、
MC1061菌などが使用可能である。微生物を形質転換する
方法は既に多くの方法が報告されており、宿主として使
用する微生物の種類に応じて適宜選択すればよい。たと
えば大腸菌を宿主として使用する場合、低温下、塩化カ
ルシウム処理して菌体内にプラスミドを移入する方法
（Mandel and Higa, J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)
）により、大腸菌を形質転換することができる。ま
た、酵母を宿主として使用する場合には、プロトプラス
ト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75,1929 (197
8)）、アルカリ金属処理法（J. Bacteriol., 153, 163
(1983) ）などの方法を採用することができる。
【００２０】３．Ｃ工程 Ｃ工程は、Ｂ工程で得られた形質転換体を当該微生物が
増殖可能な培地中で増殖させ、さらにクローニングした
酵素の遺伝子の発現を誘導して菌体内に該酵素が大量に
蓄積するまで培養を行う工程である。形質転換体の培養
は、炭素源、窒素源などの微生物の増殖に必要な栄養源
を含有する培地を用いて常法に従って行えばよい。たと
えば、宿主として大腸菌を使用した場合、培地としては
２ｘＹＴ培地（Messing, J., Method in Enzymology,10
0, 20 (1983)）、ＬＢ培地、Ｍ９ＣＡ培地（Maniatis
ら、Molecular Cloning、前述）などの大腸菌の培養に
常用されている培地を用い、２０〜４０℃の培養温度で
必要により通気、撹袢しながら培養することができる。
また、ベクターとしてプラスミドを用いた場合には、培
養中におけるプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生
物質（プラスミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシ
リン、テトラサイクリンなど）の薬剤を適当量培養液に
加えて培養する。
増殖可能な培地中で増殖させ、さらにクローニングした
酵素の遺伝子の発現を誘導して菌体内に該酵素が大量に
蓄積するまで培養を行う工程である。形質転換体の培養
は、炭素源、窒素源などの微生物の増殖に必要な栄養源
を含有する培地を用いて常法に従って行えばよい。たと
えば、宿主として大腸菌を使用した場合、培地としては
２ｘＹＴ培地（Messing, J., Method in Enzymology,10
0, 20 (1983)）、ＬＢ培地、Ｍ９ＣＡ培地（Maniatis
ら、Molecular Cloning、前述）などの大腸菌の培養に
常用されている培地を用い、２０〜４０℃の培養温度で
必要により通気、撹袢しながら培養することができる。
また、ベクターとしてプラスミドを用いた場合には、培
養中におけるプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生
物質（プラスミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシ
リン、テトラサイクリンなど）の薬剤を適当量培養液に
加えて培養する。
【００２１】培養中に酵素遺伝子の発現を誘導する必要
がある場合には、用いたプロモーターで常用されている
方法で酵素の発現を誘導する。たとえば、lac プロモー
ターやtac プロモーターを使用した場合には、培養中期
に発現誘導剤であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略称する）を適当量培
養液に添加する。また、使用するプロモーターが構成的
に転写活性を有する場合には、特に発現誘導剤を添加す
る必要はない。酵素遺伝子の発現を誘導した後、酵素遺
伝子産物（合成目的の核酸関連物質の製造に不可欠な酵
素）を菌体内に大量に蓄積させるため、さらに数時間培
養を継続する。
がある場合には、用いたプロモーターで常用されている
方法で酵素の発現を誘導する。たとえば、lac プロモー
ターやtac プロモーターを使用した場合には、培養中期
に発現誘導剤であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略称する）を適当量培
養液に添加する。また、使用するプロモーターが構成的
に転写活性を有する場合には、特に発現誘導剤を添加す
る必要はない。酵素遺伝子の発現を誘導した後、酵素遺
伝子産物（合成目的の核酸関連物質の製造に不可欠な酵
素）を菌体内に大量に蓄積させるため、さらに数時間培
養を継続する。
【００２２】４．Ｄ工程 Ｄ工程は、Ｃ工程で培養を終えた菌体を回収し、合成目
的の核酸関連物質の製造に不可欠な酵素を抽出、精製し
て酵素調製物を調製する工程である。上述したように本
発明の方法においては目的の酵素が微生物菌体内に過剰
量生産されているため、培養して得られた菌体からの目
的とする酵素の調製は極めて簡単である。たとえば、回
収した菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波処理、フレ
チプレス処理などの方法により物理的に菌体を破壊し、
菌体残渣を除去して得た無細胞抽出液そのものを酵素調
製物として使用することもできる。さらに精製が必要と
される場合であっても、硫酸アンモニウムによる塩析処
理、透析処理、エタノールなどの溶媒処理、各種クロマ
トグラフィー処理などの酵素に精製に通常使用されてい
る処理を単独で、またはせいぜい２種類の処理を組み合
わせただけの簡便な手段で核酸関連物質の合成に好適な
高度に精製された（９０％以上）酵素調製物を調製する
ことができる。
的の核酸関連物質の製造に不可欠な酵素を抽出、精製し
て酵素調製物を調製する工程である。上述したように本
発明の方法においては目的の酵素が微生物菌体内に過剰
量生産されているため、培養して得られた菌体からの目
的とする酵素の調製は極めて簡単である。たとえば、回
収した菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波処理、フレ
チプレス処理などの方法により物理的に菌体を破壊し、
菌体残渣を除去して得た無細胞抽出液そのものを酵素調
製物として使用することもできる。さらに精製が必要と
される場合であっても、硫酸アンモニウムによる塩析処
理、透析処理、エタノールなどの溶媒処理、各種クロマ
トグラフィー処理などの酵素に精製に通常使用されてい
る処理を単独で、またはせいぜい２種類の処理を組み合
わせただけの簡便な手段で核酸関連物質の合成に好適な
高度に精製された（９０％以上）酵素調製物を調製する
ことができる。
【００２３】５．Ｅ工程 Ｅ工程は、Ｄ工程で得られた酵素調製物を用いて合成目
的の核酸関連物質を製造する工程である。核酸関連物質
の合成は、使用する酵素の最適条件を予備試験により設
定し、この条件下で原料化合物と酵素を反応させること
により実施することができる。たとえば、大腸菌のポリ
ヌクレオチドホスホリラーゼを用いるポリヌクレオチド
を合成は、反応温度０〜７０℃、反応ｐＨ７〜１２、マ
グネシウムイオン、マンガンイオン、コバルトイオン、
亜鉛イオンなどの二価陽イオン濃度０．１〜５０ｍＭの
範囲内から適宜最適条件を選択し、適当な緩衝液にヌク
レオシド二りん酸（原料化合物）、二価陽イオンおよび
酵素調製物を添加し、設定した条件下で反応させること
により行うことができる。反応終了後、合成された核酸
関連物質は、核酸関連物質の精製法として通常使用され
ている方法を適宜組み合わせ、精製単離する。
的の核酸関連物質を製造する工程である。核酸関連物質
の合成は、使用する酵素の最適条件を予備試験により設
定し、この条件下で原料化合物と酵素を反応させること
により実施することができる。たとえば、大腸菌のポリ
ヌクレオチドホスホリラーゼを用いるポリヌクレオチド
を合成は、反応温度０〜７０℃、反応ｐＨ７〜１２、マ
グネシウムイオン、マンガンイオン、コバルトイオン、
亜鉛イオンなどの二価陽イオン濃度０．１〜５０ｍＭの
範囲内から適宜最適条件を選択し、適当な緩衝液にヌク
レオシド二りん酸（原料化合物）、二価陽イオンおよび
酵素調製物を添加し、設定した条件下で反応させること
により行うことができる。反応終了後、合成された核酸
関連物質は、核酸関連物質の精製法として通常使用され
ている方法を適宜組み合わせ、精製単離する。
【００２４】
【発明の効果】本発明は、組換えＤＮＡ手法を用いて目
的とする酵素を微生物菌体内に過剰量蓄積せしめること
により、簡便な方法で高度に精製された酵素調製物の大
量調製を初めて可能にしたものである。このようにして
得た酵素調製物は、簡便な精製手段であるにもかかわら
ず、高度に精製されたものである。また、酵素調製物中
に副反応を触媒する酵素が存在していたとしても、目的
とする酵素と副反応を触媒する酵素との存在比が格段に
相違するため、核酸関連物質の合成になんら悪影響を及
ぼさない。したがって、核酸関連物質の合成に好適な酵
素調製物を調製するために従来のような煩雑な精製操作
を全く必要としない。このように、本発明は、核酸関連
物質の工業的な大量製造を初めて実用化するものであっ
て、産業上、きわめて有益なものである。
的とする酵素を微生物菌体内に過剰量蓄積せしめること
により、簡便な方法で高度に精製された酵素調製物の大
量調製を初めて可能にしたものである。このようにして
得た酵素調製物は、簡便な精製手段であるにもかかわら
ず、高度に精製されたものである。また、酵素調製物中
に副反応を触媒する酵素が存在していたとしても、目的
とする酵素と副反応を触媒する酵素との存在比が格段に
相違するため、核酸関連物質の合成になんら悪影響を及
ぼさない。したがって、核酸関連物質の合成に好適な酵
素調製物を調製するために従来のような煩雑な精製操作
を全く必要としない。このように、本発明は、核酸関連
物質の工業的な大量製造を初めて実用化するものであっ
て、産業上、きわめて有益なものである。
【００２５】
【実施例】以下、ポリヌクレオチドホスホリラーゼを用
いたポリヌクレオチドの合成とアデノシンデアミナーゼ
を用いたＤＤＩの合成の２種類の実施例をあげ、本発明
を具体的に説明する。また、本実施例におけるＤＮＡの
調製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる
ＤＮＡ連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Molecu
lar Cloning」（Maniatisら編、Cold Spring Harbor La
boratory, Cold Spring Harbor, NewYork (1982)）に従
って行った。また、制限酵素 BamHI、AmpliTaq ＤＮＡ
ポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、並びにクローニン
グベクター pUC18は全て宝酒造（株）より入手した。
いたポリヌクレオチドの合成とアデノシンデアミナーゼ
を用いたＤＤＩの合成の２種類の実施例をあげ、本発明
を具体的に説明する。また、本実施例におけるＤＮＡの
調製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる
ＤＮＡ連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Molecu
lar Cloning」（Maniatisら編、Cold Spring Harbor La
boratory, Cold Spring Harbor, NewYork (1982)）に従
って行った。また、制限酵素 BamHI、AmpliTaq ＤＮＡ
ポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、並びにクローニン
グベクター pUC18は全て宝酒造（株）より入手した。
【００２６】実施例１；ポリヌクレオチドホスホリラー
ゼを用いたポリヌクレオチドの製造 （１）大腸菌ポリヌクレオチドホスホリラーゼをコード
する pnp遺伝子のクローニングと発現ベクターpDR-PNP
の構築 大腸菌 K12株C600菌（工業技術院微生物工業研究所寄
託、第８０３７号）の染色体ＤＮＡを斎藤と三浦の方法
（Biochim. Biophis. Acta.,72, 619(1963) ）で調製し
た。このＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２種
類のプライマーＤＮＡを合成し、ＰＣＲ法により大腸菌
pnp遺伝子を増幅した。プライマーＤＮＡは、Gene Ass
embler Plus DNA synthesizer （Pharmacia 社）を用い
て、GeneAssembler Plus Owner's Manual （Pharmacia
社）に従って合成、精製した。
ゼを用いたポリヌクレオチドの製造 （１）大腸菌ポリヌクレオチドホスホリラーゼをコード
する pnp遺伝子のクローニングと発現ベクターpDR-PNP
の構築 大腸菌 K12株C600菌（工業技術院微生物工業研究所寄
託、第８０３７号）の染色体ＤＮＡを斎藤と三浦の方法
（Biochim. Biophis. Acta.,72, 619(1963) ）で調製し
た。このＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２種
類のプライマーＤＮＡを合成し、ＰＣＲ法により大腸菌
pnp遺伝子を増幅した。プライマーＤＮＡは、Gene Ass
embler Plus DNA synthesizer （Pharmacia 社）を用い
て、GeneAssembler Plus Owner's Manual （Pharmacia
社）に従って合成、精製した。
【００２７】
【化１】プライマー（Ａ）； 5'-ACAGGATCCTACATTGCTTA
ATCCGATCGT-3' プライマー（Ｂ）； 5'-TATGGATCCTAACAAGGCGTCCTGCCCG
GT-3'
ATCCGATCGT-3' プライマー（Ｂ）； 5'-TATGGATCCTAACAAGGCGTCCTGCCCG
GT-3'
【００２８】ＰＣＲによるpnp 遺伝子の増幅は、反応液
１００μｌ中〔５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス
−塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、
０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ ０．１μ
ｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々１．０μＭ、デ
オキシヌクレオチド三りん酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＴＴＰ）各々０．２ｍＭ、AmpliTaq ＤＮＡ
ポリメラーゼ２．５ユニット〕をPerkin-Elmer Cetus I
nstrument 社製DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変性
（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、２分）、ポ
リメライゼーション（７２℃、３分）のステップを２５
回繰り返すことにより行った。遺伝子増幅後、反応液を
フェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、
水溶性画分に２倍溶のエタノールを添加しＤＮＡを沈澱
させた。沈澱回収したＤＮＡを文献(Molecular Clonin
g、前述) の方法に従ってアガロースゲル電気永動によ
り分離し、２．２ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該
ＤＮＡを制限酵素BamHIで切断し、制限酵素 BamHIで切
断したプラスミドpDR540（Russell and Bennett, Gene,
20, 231 (1982)：Pharmacia 社より入手）とＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸
菌JM105 菌（Pharmacia 社より入手）を形質転換し、得
られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミド pDR
-PNPを調製した。pDR-PNP は、プラスミドpDR540の tac
プロモーター下流の BamHI切断部位に大腸菌pnp 遺伝子
を含有する BamHI ＤＮＡ断片がその転写方向が tacプ
ロモーターと一致して挿入されたものである（図１参
照）。
１００μｌ中〔５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス
−塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、
０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ ０．１μ
ｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々１．０μＭ、デ
オキシヌクレオチド三りん酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＴＴＰ）各々０．２ｍＭ、AmpliTaq ＤＮＡ
ポリメラーゼ２．５ユニット〕をPerkin-Elmer Cetus I
nstrument 社製DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変性
（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、２分）、ポ
リメライゼーション（７２℃、３分）のステップを２５
回繰り返すことにより行った。遺伝子増幅後、反応液を
フェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、
水溶性画分に２倍溶のエタノールを添加しＤＮＡを沈澱
させた。沈澱回収したＤＮＡを文献(Molecular Clonin
g、前述) の方法に従ってアガロースゲル電気永動によ
り分離し、２．２ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該
ＤＮＡを制限酵素BamHIで切断し、制限酵素 BamHIで切
断したプラスミドpDR540（Russell and Bennett, Gene,
20, 231 (1982)：Pharmacia 社より入手）とＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸
菌JM105 菌（Pharmacia 社より入手）を形質転換し、得
られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミド pDR
-PNPを調製した。pDR-PNP は、プラスミドpDR540の tac
プロモーター下流の BamHI切断部位に大腸菌pnp 遺伝子
を含有する BamHI ＤＮＡ断片がその転写方向が tacプ
ロモーターと一致して挿入されたものである（図１参
照）。
【００２９】（２）大腸菌ポリヌクレオチドホスホリラ
ーゼの大量調製 プラスミドpDR-PNP を保持する大腸菌JM105 菌を、１０
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地５
００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。４ｘ１０
8 菌／ｍｌに達した時点で、培養液に集濃度１ｍＭにな
るようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で２４時間振
とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９０００
ｇ、１０分）により菌体を回収し、６０ｍｌの緩衝液
（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）、５ｍＭ塩化マグ
ネシウム、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール）に菌
体を懸濁した。菌体懸濁液を超音波処理することで、菌
体を破壊し遠心分離（２００００ｇ、１０分）により菌
体残査を除去した。このようにして得られた上清画分を
菌体抽出液とした。菌体抽出液におけるポリヌクレオチ
ドホスホリラーゼ活性を対照菌（pDR540を保持する大腸
菌JM105 菌）と共に下記表に示す。尚、ポリヌクレオチ
ドホスホリラーゼ活性（イノシン二りん酸のポリメライ
ゼーション活性）は、六川らの方法（Agric. Biol.Che
m., 39, 1455 (1975) ）に従って測定した。ただし、反
応液組成は５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ９．０）、９ｍＭ
塩化マグネシウム、３６ｍＭイノシン二りん酸に変更し
た。下記表から明らかなように、発現ベクター pDR-PNP
保持菌からは対照菌の１００倍以上のポリヌクレオチド
ホスホリラーゼの生産が確認された。
ーゼの大量調製 プラスミドpDR-PNP を保持する大腸菌JM105 菌を、１０
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地５
００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。４ｘ１０
8 菌／ｍｌに達した時点で、培養液に集濃度１ｍＭにな
るようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で２４時間振
とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９０００
ｇ、１０分）により菌体を回収し、６０ｍｌの緩衝液
（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）、５ｍＭ塩化マグ
ネシウム、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール）に菌
体を懸濁した。菌体懸濁液を超音波処理することで、菌
体を破壊し遠心分離（２００００ｇ、１０分）により菌
体残査を除去した。このようにして得られた上清画分を
菌体抽出液とした。菌体抽出液におけるポリヌクレオチ
ドホスホリラーゼ活性を対照菌（pDR540を保持する大腸
菌JM105 菌）と共に下記表に示す。尚、ポリヌクレオチ
ドホスホリラーゼ活性（イノシン二りん酸のポリメライ
ゼーション活性）は、六川らの方法（Agric. Biol.Che
m., 39, 1455 (1975) ）に従って測定した。ただし、反
応液組成は５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ９．０）、９ｍＭ
塩化マグネシウム、３６ｍＭイノシン二りん酸に変更し
た。下記表から明らかなように、発現ベクター pDR-PNP
保持菌からは対照菌の１００倍以上のポリヌクレオチド
ホスホリラーゼの生産が確認された。
【００３０】
【表１】 ──────────────────────────────── 菌／プラスミド ポリヌクレオチドホスホリラーゼ活性 ──────────────────────────────── JM105／pDR540 ０．０２（ユニット／ｍｇ蛋白質） ──────────────────────────────── JM105／pDR-PNP ３．１７ ──────────────────────────────── １ユニット＝１μmole IDP polymerized／分 （at ３７℃）
【００３１】得られた菌体抽出液に２３ｇの硫酸アンモ
ニウムを加え、塩析した画分を遠心分離（２００００
ｇ、１５分）により回収し、さらに緩衝液（５０ｍＭト
リス塩酸（ｐＨ７．８）、５ｍＭ塩化マグネシウム、１
ｍＭ ２−メルカプトエタノール）に懸濁し、同じ組成
の緩衝液に対して１晩透析した。この透析内液を粗酵素
調製物とした。粗酵素調製物は、次に５０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ７．８）、５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ
２−メルカプトエタノール、５％グリセロールで平衡
化したＤＥＡＥセファデックスＡ−５０（Pharmacia 社
より入手）カラム（25mm diameter x 250 mm）に適し、
吸着した酵素を塩化ナトリウムを０．１〜０．４Ｍ含む
同一組成の緩衝液を用いたリニアグラジエント法で溶出
した。溶出した活性画分（４４ｍｌ）を集め、３０ｇの
硫酸アンモニウムを加えた。塩析した画分を先と同様遠
心分離（２００００ｇ、１５分）により回収し、さらに
緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）、５ｍＭ
塩化マグネシウム、１ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、５％グリセロール）に懸濁し、同じ組成の緩衝液に
対して１晩透析し、最終的な酵素調製物（９００ユニッ
ト）を得た。
ニウムを加え、塩析した画分を遠心分離（２００００
ｇ、１５分）により回収し、さらに緩衝液（５０ｍＭト
リス塩酸（ｐＨ７．８）、５ｍＭ塩化マグネシウム、１
ｍＭ ２−メルカプトエタノール）に懸濁し、同じ組成
の緩衝液に対して１晩透析した。この透析内液を粗酵素
調製物とした。粗酵素調製物は、次に５０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ７．８）、５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ
２−メルカプトエタノール、５％グリセロールで平衡
化したＤＥＡＥセファデックスＡ−５０（Pharmacia 社
より入手）カラム（25mm diameter x 250 mm）に適し、
吸着した酵素を塩化ナトリウムを０．１〜０．４Ｍ含む
同一組成の緩衝液を用いたリニアグラジエント法で溶出
した。溶出した活性画分（４４ｍｌ）を集め、３０ｇの
硫酸アンモニウムを加えた。塩析した画分を先と同様遠
心分離（２００００ｇ、１５分）により回収し、さらに
緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）、５ｍＭ
塩化マグネシウム、１ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、５％グリセロール）に懸濁し、同じ組成の緩衝液に
対して１晩透析し、最終的な酵素調製物（９００ユニッ
ト）を得た。
【００３２】（３）ポリヌクレオチドの合成 Ａ．ｐｏｌｙ Ｉの合成 イノシン二りん酸三ナトリウム塩５．３ｇ、塩化マグネ
シウム０．５４ｇを５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ９．
０）３００ｍｌに溶解し、５０ユニットの上記酵素調製
物（大腸菌ポリヌクレオチドホスホリラーゼ）を加え、
３２℃で３時間合成反応を行わせた（合成率５０％）。
反応終了後、冷エタノールを加え poly Ｉを沈澱させ
た。常法により poly Ｉを精製したところ、Ｓ値１３．
０の高分子poly Ｉを１．８３ｇ得た。
シウム０．５４ｇを５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ９．
０）３００ｍｌに溶解し、５０ユニットの上記酵素調製
物（大腸菌ポリヌクレオチドホスホリラーゼ）を加え、
３２℃で３時間合成反応を行わせた（合成率５０％）。
反応終了後、冷エタノールを加え poly Ｉを沈澱させ
た。常法により poly Ｉを精製したところ、Ｓ値１３．
０の高分子poly Ｉを１．８３ｇ得た。
【００３３】Ｂ．ｐｏｌｙ Ａ、ｐｏｌｙ Ｃ、ｐｏｌ
ｙ Ｇ及びｐｏｌｙ Ｕの合成 上記粗酵素調製物を用いて、下記表に示す基質及び二価
陽イオンを含有する５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ９．０）
緩衝液中、表に示した酵素量および反応温度で３時間反
応させ、ｐｏｌｙ Ａ、ｐｏｌｙ Ｃ、ｐｏｌｙ Ｇ及
びｐｏｌｙ Ｕを合成した。下記表に示されているよう
に、いずれのホモポリヌクレオチドも４０％以上の高い
効率で合成され、ヌクレアーゼなどの共雑酵素によって
もたらされる化合物は全く検出されなかった。
ｙ Ｇ及びｐｏｌｙ Ｕの合成 上記粗酵素調製物を用いて、下記表に示す基質及び二価
陽イオンを含有する５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ９．０）
緩衝液中、表に示した酵素量および反応温度で３時間反
応させ、ｐｏｌｙ Ａ、ｐｏｌｙ Ｃ、ｐｏｌｙ Ｇ及
びｐｏｌｙ Ｕを合成した。下記表に示されているよう
に、いずれのホモポリヌクレオチドも４０％以上の高い
効率で合成され、ヌクレアーゼなどの共雑酵素によって
もたらされる化合物は全く検出されなかった。
【００３４】
【表２】 ──────────────────────────────────── 基 質 二価陽イオン 合成温度 酵素量 合成率 (℃) (ユニット/ml) (％) ──────────────────────────────────── poly A 24mM ADP 5mM 37 0.33 71.6 ──────────────────────────────────── poly C 24mM CDP 17mM 37 0.33 50.1 ──────────────────────────────────── poly G 24mM GDP 3mM 65 0.33 86.3 ──────────────────────────────────── poly U 24mM UDP 11mM 45 0.33 42.3 ──────────────────────────────────── 註 Ｍｇ2+；ｐｏｌｙ Ａ、ｐｏｌｙ Ｃおよびｐｏｌｙ Ｕ Ｍｎ2+；ｐｏｌｙ Ｇ
【００３５】実施例２；アデノシンデアミナーゼを用い
たＤＤＩの製造 （１）大腸菌アデノシンデアミナーゼをコードする add
遺伝子のクローニングと発現ベクターpDR-add の構築 大腸菌 K12株C600菌（工業技術院微生物工業研究所寄
託、第８０３７号）の染色体ＤＮＡを斎藤と三浦の方法
（Biochim. Biophis. Acta., 72, 619 (1963)）で調製
した。このＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２
種類のプライマーＤＮＡを合成し、ＰＣＲ法により大腸
菌 add遺伝子を増幅した。プライマーＤＮＡは、Gene A
ssembler Plus DNA synthesizer （Pharmacia 社）を用
いて、GeneAssembler Plus Owner's Manual （Pharmaci
a 社）に従って合成、精製した。
たＤＤＩの製造 （１）大腸菌アデノシンデアミナーゼをコードする add
遺伝子のクローニングと発現ベクターpDR-add の構築 大腸菌 K12株C600菌（工業技術院微生物工業研究所寄
託、第８０３７号）の染色体ＤＮＡを斎藤と三浦の方法
（Biochim. Biophis. Acta., 72, 619 (1963)）で調製
した。このＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２
種類のプライマーＤＮＡを合成し、ＰＣＲ法により大腸
菌 add遺伝子を増幅した。プライマーＤＮＡは、Gene A
ssembler Plus DNA synthesizer （Pharmacia 社）を用
いて、GeneAssembler Plus Owner's Manual （Pharmaci
a 社）に従って合成、精製した。
【００３６】
【化２】プライマー（Ａ）；5'-TAGGATCCACCATGATTGATA
CCACCCTG-3' プライマー（Ｂ）；5'-AAGGATCCTTTGTGCCTTGCATGAAAAAT
-3'
CCACCCTG-3' プライマー（Ｂ）；5'-AAGGATCCTTTGTGCCTTGCATGAAAAAT
-3'
【００３７】ＰＣＲによるadd 遺伝子の増幅は、反応液
１００μｌ中〔５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス
−塩酸（pH 8.3）、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００
１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ ０．１μｇ、プラ
イマー（Ａ）（Ｂ）それぞれ１．０μＭ、デオキシヌク
レオチド三りん酸（dATP, dCTP, dGTP, dCTP）それぞれ
０．２ｍＭ、AmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニ
ット〕をPerkin-ElmerCetus Instrument 社製 DNA Ther
mal Cycler を用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニ
ーリング（５５℃、２分）、ポリメライゼーション（７
２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことにより行
った。遺伝子増幅終了後、反応液をフェノール／クロロ
ホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍量
のエタノールを添加しＤＮＡを沈澱させた。沈澱回収し
たＤＮＡを文献（Molecular Cloning 、前述）の方法に
従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．０ｋ
ｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素 B
amHIで切断し、制限酵素 BamHIで切断したプラスミド p
DR540 ＤＮＡ（Russell and Bennet, Gene, 20, 231
(1982) ；Pharmacia 社より入手）とＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌JM109
（宝酒造 (株) より入手）を形質転換し、得られたアン
ピシリン耐性形質転換体よりプラスミド pDR-addを調製
した。pDR-add は、プラスミド pDR540 の tacプロモー
ター下流の BamHI切断部位に大腸菌add 遺伝子を含有す
る BamHI ＤＮＡ断片がその転写方向が一致して挿入さ
れたものである（図２参照）。
１００μｌ中〔５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス
−塩酸（pH 8.3）、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００
１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ ０．１μｇ、プラ
イマー（Ａ）（Ｂ）それぞれ１．０μＭ、デオキシヌク
レオチド三りん酸（dATP, dCTP, dGTP, dCTP）それぞれ
０．２ｍＭ、AmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニ
ット〕をPerkin-ElmerCetus Instrument 社製 DNA Ther
mal Cycler を用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニ
ーリング（５５℃、２分）、ポリメライゼーション（７
２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことにより行
った。遺伝子増幅終了後、反応液をフェノール／クロロ
ホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍量
のエタノールを添加しＤＮＡを沈澱させた。沈澱回収し
たＤＮＡを文献（Molecular Cloning 、前述）の方法に
従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．０ｋ
ｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素 B
amHIで切断し、制限酵素 BamHIで切断したプラスミド p
DR540 ＤＮＡ（Russell and Bennet, Gene, 20, 231
(1982) ；Pharmacia 社より入手）とＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌JM109
（宝酒造 (株) より入手）を形質転換し、得られたアン
ピシリン耐性形質転換体よりプラスミド pDR-addを調製
した。pDR-add は、プラスミド pDR540 の tacプロモー
ター下流の BamHI切断部位に大腸菌add 遺伝子を含有す
る BamHI ＤＮＡ断片がその転写方向が一致して挿入さ
れたものである（図２参照）。
【００３８】（２）組換え大腸菌アデノシンデアミナー
ゼの調製 プラスミド pDR-addを保持する大腸菌 JM109菌を、１０
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地１
００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。４ｘ１０
8 菌／ｍｌに達した時点で培養液に終濃度１ｍＭになる
ようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
を添加し、さらに７時間、３７℃で振とう培養を続け
た。培養終了後、遠心分離（８０００ｇ，１０分）によ
り菌体を回収し、２０ｍｌの緩衝液（２０ｍＭトリス−
塩酸 (pH 8.2) ）、１０％エチレングリコール、１ｍＭ
フェニルメチルスルフォニルフルオライド(PMSF)）に菌
体を懸濁した。菌体懸濁液を超音波処理することで菌体
を破壊し、遠心分離（１２、０００ｇ、１０分）により
菌体残査を除去した。回収した無細胞抽出液は、緩衝液
（１０ｍＭトリス−塩酸 (pH 8.2) 、１％エチレングリ
コール、２ｍＭ ＣａＣｌ2 、０．０５ｍＭエチレンジ
アミン四酢酸）に対して一晩透析した。この透析内液を
酵素調製物とした。酵素調製物におけるアデノシンデア
ミナーゼを Nygaardらの方法（Methods Enzymol., 51,
508 (1987)）に従って測定した。また、２’，３’−ジ
デオキシアデノシンデアミナーゼ活性もNygaardらの方
法を改変して測定した。すなわち、基質として２’，
３’−ジデオキシアデノシンを用い、さらに反応液と等
量の０．１Ｎ ＮａＯＨを添加することで反応を停止さ
せた。測定結果を下記表に示す。発現ベクター pDR-add
を保持する菌からの酵素調製物は、対照菌株（pDR540を
保持する大腸菌 JM109菌）の２００倍以上のアデノシン
デアミナーゼおよび２’，３’−ジデオキシアデノシン
デアミナーゼ活性が検出された。
ゼの調製 プラスミド pDR-addを保持する大腸菌 JM109菌を、１０
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地１
００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。４ｘ１０
8 菌／ｍｌに達した時点で培養液に終濃度１ｍＭになる
ようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
を添加し、さらに７時間、３７℃で振とう培養を続け
た。培養終了後、遠心分離（８０００ｇ，１０分）によ
り菌体を回収し、２０ｍｌの緩衝液（２０ｍＭトリス−
塩酸 (pH 8.2) ）、１０％エチレングリコール、１ｍＭ
フェニルメチルスルフォニルフルオライド(PMSF)）に菌
体を懸濁した。菌体懸濁液を超音波処理することで菌体
を破壊し、遠心分離（１２、０００ｇ、１０分）により
菌体残査を除去した。回収した無細胞抽出液は、緩衝液
（１０ｍＭトリス−塩酸 (pH 8.2) 、１％エチレングリ
コール、２ｍＭ ＣａＣｌ2 、０．０５ｍＭエチレンジ
アミン四酢酸）に対して一晩透析した。この透析内液を
酵素調製物とした。酵素調製物におけるアデノシンデア
ミナーゼを Nygaardらの方法（Methods Enzymol., 51,
508 (1987)）に従って測定した。また、２’，３’−ジ
デオキシアデノシンデアミナーゼ活性もNygaardらの方
法を改変して測定した。すなわち、基質として２’，
３’−ジデオキシアデノシンを用い、さらに反応液と等
量の０．１Ｎ ＮａＯＨを添加することで反応を停止さ
せた。測定結果を下記表に示す。発現ベクター pDR-add
を保持する菌からの酵素調製物は、対照菌株（pDR540を
保持する大腸菌 JM109菌）の２００倍以上のアデノシン
デアミナーゼおよび２’，３’−ジデオキシアデノシン
デアミナーゼ活性が検出された。
【００３９】
【表３】 ────────────────────────────────── アデノシン 2',3'-ジデオキシアデノ 菌／プラスミド デアミナーゼ活性 シンデアミナーゼ活性 ────────────────────────────────── JM109／pDR540 186 ユニット/mg蛋白 4 ユニット/mg 蛋白 ────────────────────────────────── JM109／pDR-add 44,646 4,882 ────────────────────────────────── １ユニット＝１ nmole deamination／分 at ３７℃
【００４０】（３）大腸菌アデノシンデアミナーゼを用
いたＤＤＡからのＤＤＩへの変換 １０ｍｌの緩衝液（２５ｍＭトリス−コハク酸(pH 7.
6)）に４．７ｍｇのＤＤＡを溶解し、上記酵素調製物
（アデノシンデアミナーゼ８７１０ユニット、粗酵素蛋
白質量２００μｇ；１ユニット＝１ｎｍｏｌイノシン生
成／分）を添加し、３７℃で３０分間反応させた。反応
終了後、常法により高速液体クロマトグラフィーで反応
液中のＤＤＩを定量したところ、ＤＤＡは完全にＤＤＩ
に変換されていた。また、アデニン並びにイノシンの生
成は認められなかった。
いたＤＤＡからのＤＤＩへの変換 １０ｍｌの緩衝液（２５ｍＭトリス−コハク酸(pH 7.
6)）に４．７ｍｇのＤＤＡを溶解し、上記酵素調製物
（アデノシンデアミナーゼ８７１０ユニット、粗酵素蛋
白質量２００μｇ；１ユニット＝１ｎｍｏｌイノシン生
成／分）を添加し、３７℃で３０分間反応させた。反応
終了後、常法により高速液体クロマトグラフィーで反応
液中のＤＤＩを定量したところ、ＤＤＡは完全にＤＤＩ
に変換されていた。また、アデニン並びにイノシンの生
成は認められなかった。
【００４１】（４）プラスミドpDR-add 保持菌を用いた
ＤＤＡからのＤＤＩへの変換 本発明で造成された大腸菌アデノシンデアミナーゼ生産
株（JM105[pDR-add]、JM105 菌はPharmacia 社より入
手）を用いてＤＤＡからＤＤＩへの微生物変換を横関ら
の方法（特開平２−２９１２９１）に従って行った。但
し、菌体はＩＰＴＧ添加培養後５時間の菌体を用いた。
また、プラスミドpDR540を保持する大腸菌JM105 菌を対
照とした。その結果、対照菌においては、反応４０分後
に６．２ｍｇ／ｄｌ、反応９０分後に９．０ｍｇ／ｄｌ
のＤＤＩが生成した。一方、JM105[pDR-add] 菌におい
ては、反応２分後に９．２ｍｇ／ｄｌのＤＤＩが生成し
た。
ＤＤＡからのＤＤＩへの変換 本発明で造成された大腸菌アデノシンデアミナーゼ生産
株（JM105[pDR-add]、JM105 菌はPharmacia 社より入
手）を用いてＤＤＡからＤＤＩへの微生物変換を横関ら
の方法（特開平２−２９１２９１）に従って行った。但
し、菌体はＩＰＴＧ添加培養後５時間の菌体を用いた。
また、プラスミドpDR540を保持する大腸菌JM105 菌を対
照とした。その結果、対照菌においては、反応４０分後
に６．２ｍｇ／ｄｌ、反応９０分後に９．０ｍｇ／ｄｌ
のＤＤＩが生成した。一方、JM105[pDR-add] 菌におい
ては、反応２分後に９．２ｍｇ／ｄｌのＤＤＩが生成し
た。
【００４２】
【図１】図１は、発現ベクターpDR-PNP の構築法を示
す。
す。
【図２】図２は、発現ベクターpDR-add の構築法を示
す。
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/55 Ｃ１２Ｐ 19/40 7432−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/54 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/55 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (10)
- 【請求項１】 下記の工程からなる核酸関連物質の酵素
的製造法。 （Ａ）合成目的の核酸関連物質の製造に不可欠な酵素の
遺伝子をクローニングし、該遺伝子の発現が高効率で起
こるように適当な発現制御シグナルと連結して発現ベク
ターを構築する工程； （Ｂ）Ａ工程で得られたベクターを用いて微生物を形質
転換する工程； （Ｃ）Ｂ工程で得られた形質転換体を当該微生物が増殖
可能な培地中で増殖させ、さらにクローニングした酵素
の遺伝子の発現を誘導して合成目的の核酸関連物質の製
造に不可欠な酵素が菌体内に大量に蓄積するまで培養を
行う工程； （Ｄ）Ｃ工程で培養を終えた菌体を回収し、合成目的の
核酸関連物質の製造に不可欠な酵素を抽出、精製して酵
素調製物を調製する工程；および （Ｅ）Ｄ工程で得られた酵素調製物を用いて合成目的の
核酸関連物質を製造する工程 - 【請求項２】 合成目的の核酸関連物質がポリヌクレオ
チドであり、該核酸関連物質の製造に不可欠な酵素がポ
リヌクレオチドホスホリラーゼである、請求項１記載の
製造法。 - 【請求項３】 合成目的の核酸関連物質がイノシンまた
はその誘導体であり、該核酸関連物質の製造に不可欠な
酵素がアデノシンデアミナーゼである、請求項１記載の
製造法。 - 【請求項４】 合成目的の核酸関連物質が２’，３’−
ジデオキシイノシンであり、該核酸関連物質の製造に不
可欠な酵素がアデノシンデアミナーゼである、請求項１
記載の製造法。 - 【請求項５】 合成目的の核酸関連物質の製造に不可欠
な酵素の遺伝子が大腸菌由来のものであり、形質転換に
用いる宿主細胞も大腸菌である、請求項１記載の製造
法。 - 【請求項６】 下記の工程から調製される、核酸関連物
質の酵素的製造法に使用する酵素調製物。 （Ａ）合成目的の核酸関連物質の製造に不可欠な酵素の
遺伝子をクローニングし、該遺伝子の発現が高効率で起
こるように適当な発現制御シグナルと連結して発現ベク
ターを構築する工程； （Ｂ）Ａ工程で得られたベクターを用いて微生物を形質
転換する工程； （Ｃ）Ｂ工程で得られた形質転換体を当該微生物が増殖
可能な培地中で増殖させ、さらにクローニングした酵素
の遺伝子の発現を誘導して合成目的の核酸関連物質の製
造に不可欠な酵素が菌体内に大量に蓄積するまで培養を
行う工程；および （Ｄ）Ｃ工程で培養を終えた菌体を回収し、合成目的の
核酸関連物質の製造に不可欠な酵素を抽出、精製して酵
素調製物を調製する工程 - 【請求項７】 合成目的の核酸関連物質がポリヌクレオ
チドであり、該核酸関連物質の製造に不可欠な酵素がポ
リヌクレオチドホスホリラーゼである、請求項６記載の
酵素調製物。 - 【請求項８】 合成目的の核酸関連物質がイノシンまた
はその誘導体であり、該核酸関連物質の製造に不可欠な
酵素がアデノシンデアミナーゼである、請求項６記載の
酵素調製物。 - 【請求項９】 合成目的の核酸関連物質が２’，３’−
ジデオキシイノシンであり、該核酸関連物質の製造に不
可欠な酵素がアデノシンデアミナーゼである、請求項６
記載の酵素調製物。 - 【請求項１０】 合成目的の核酸関連物質の製造に不可
欠な酵素の遺伝子が大腸菌由来のものであり、形質転換
に用いる宿主細胞も大腸菌である、請求項６記載の酵素
調製物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4027903A JPH05219978A (ja) | 1992-02-14 | 1992-02-14 | 核酸関連物質の酵素的製造法及びそれに使用する酵素調製物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4027903A JPH05219978A (ja) | 1992-02-14 | 1992-02-14 | 核酸関連物質の酵素的製造法及びそれに使用する酵素調製物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05219978A true JPH05219978A (ja) | 1993-08-31 |
Family
ID=12233851
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4027903A Pending JPH05219978A (ja) | 1992-02-14 | 1992-02-14 | 核酸関連物質の酵素的製造法及びそれに使用する酵素調製物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05219978A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006080326A1 (ja) * | 2005-01-25 | 2006-08-03 | Ajinomoto Co., Inc. | ヌクレオシド誘導体の製造方法 |
| JP2011055719A (ja) * | 2009-09-07 | 2011-03-24 | Masami Moriyama | ポリヌクレオチドの合成法 |
-
1992
- 1992-02-14 JP JP4027903A patent/JPH05219978A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006080326A1 (ja) * | 2005-01-25 | 2006-08-03 | Ajinomoto Co., Inc. | ヌクレオシド誘導体の製造方法 |
| US8362244B2 (en) | 2005-01-25 | 2013-01-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing nucleoside derivatives |
| JP5187560B2 (ja) * | 2005-01-25 | 2013-04-24 | 味の素株式会社 | ヌクレオシド誘導体の製造方法 |
| JP2011055719A (ja) * | 2009-09-07 | 2011-03-24 | Masami Moriyama | ポリヌクレオチドの合成法 |
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