JP2001103973A - シチジン５’−ジリン酸コリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】シチジン５’−ジリン酸コリン（ＣＤＰ−コリ
ン）の効率的な製造法およびそれに使用する酵素タンパ
ク質をコードするＤＮＡ断片を提供する。 【解決手段】特定のＤＮＡ断片を使用して調製したコリ
ンホスフェートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＣＴ）
活性を有する酵素タンパク質、及びそれとは別の特定の
ＤＮＡ断片を使用して調製したコリンキナーゼ（ＣＫ
Ｉ）活性を有する酵素タンパク質の存在下、酵母菌体、
シチジン５′−モノリン酸（ＣＭＰ）及びコリンを反応
させてＣＤＰ-コリンを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、シチジン５’−ジ
リン酸コリン（ＣＤＰ−コリン）の効率的な製造法およ
びそれに使用する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断
片に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ＣＤＰ−コリンは医薬品として頭部外
傷、脳手術に伴う意識障害、脳卒中などの改善治療に用
いられている有用な化合物である。ＣＤＰ−コリンの製
造方法としては、化学合成法、酵母などの微生物を用い
る方法などが古くから知られている。しかし、これらい
ずれの方法もシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）１モ
ルに対するＣＤＰ−コリンの合成収率は低く、低コスト
でＣＤＰ−コリンを製造できる効率的な方法とはいえな
かった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】最近、丸山らはオロッ
ト酸より酵素処理によりＣＤＰ−コリンを製造する方法
を開発した（特開平５−２７６９７４）。しかしなが
ら、該方法ではオロット酸からウリジン５’−トリリン
酸（ＵＴＰ）を製造するための微生物を培養する工程と
ＵＴＰからのＣＤＰ−コリンの合成に関与する３種類の
酵素〔ＣＴＰシンセターゼ、コリンホスフェートシチジ
ルトランシフェラーぜ（ＣＣＴ）およびコリンキナーゼ
（ＣＫＩ）〕を生産する組換え大腸菌を培養する工程が
あり、微生物培養の手間と培養設備の観点から必ずしも
簡便な方法とは言えない。また、オロット酸１モルに対
するＣＤＰ−コリンの合成収率も必ずしも高くなく、満
足し得る方法ではない。

【０００４】また、山下らはＣＣＴ遺伝子を含む組換え
ＤＮＡで形質転換された酵母菌体を用い、ＣＭＰとホス
ホコリンからＣＭＰ１モルに対し９０％前後の合成収率
でＣＤＰ−コリンを製造する方法を開発した（特許第２
７２４８２５号）。該方法は、セルフクローニングによ
りＣＤＰ−コリンの合成に関与するＣＣＴの生産を増強
した酵母を用いることで、高収率でＣＤＰ−コリンを合
成できるものの、用いる組換え酵母菌体はＣＭＰからの
ＣＤＰ−コリン合成に関与する一連の酵素の供給を担う
こととなり、しかもＣＣＴ以外のＣＤＰ−コリン合成関
連酵素の生産性は必ずしも高くないため、合成反応には
多量の酵母菌体を使用する必要があった。このため、組
換え酵母の培養量が膨大となり、結果的には必ずしも実
用的な方法とは言えず、実際には実施されるに至ってい
ない。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、酵母菌体
がヌクレオシド５’−モノリン酸を効率的にヌクレオシ
ド５’−トリリン酸に転換する活性を有することに着目
し、ＣＭＰからのＣＤＰ−コリンの効率的な合成法を確
立すべく、ＣＭＰとコリン（あるいはホスホリルコリ
ン）を基質とする酵母添加反応液に酵母由来のＣＣＴ及
ＣＫＩを生産する組換え大腸菌、その処理物あるいは酵
素抽出液を添加して反応することで、またはＣＭＰとホ
スホコリンを基質とする酵母添加反応液にＣＣＴを生産
する組換え大腸菌、その処理物あるいは酵素抽出液を添
加して反応することでＣＤＰ−コリンが合成できるかど
うか検討した結果、コリンを用いた場合には意外なこと
に目的とするＣＤＰ−コリンはまったく合成されない
か、合成されても極くわずかな量しか生成されないこ
と、およびホスホコリンを用いた場合であっても満足し
うる量のＣＤＰ−コリンを合成することができないこと
を確認した。

【０００６】この原因を究明する過程において、ＣＤＰ
−コリンの低収率は、酵母由来のＣＣＴ並びにＣＫＩは
大腸菌において安定に高生産されないことに起因してい
ることを突き止めた。そこで本発明者らは、大腸菌にお
ける当該酵素の発現経過を検討した結果、完全には解明
されなかったものの、発現後のＣＣＴおよびＣＫＩを不
安定化する要因の１つにプロテアーゼによる加水分解が
関与しているものと推測された。そこで、使用する酵素
にプロテアーゼ抵抗性を付与し、安定に高発現させるた
めの方策に関し種々検討を重ねた結果、Ｎ末端またはＣ
末端のアミノ酸を複数個欠失させても得られるタンパク
質は目的とする酵素活性を維持し、発現量が増大すると
ともに、プロテアーゼに対しても抵抗性を示し、大腸菌
においても安定に高生産される系を構築できることを見
いだし、このような高生産系で得られた酵素タンパク質
を使用することで効率的にＣＤＰ−コリンを合成するこ
とを確認し、本発明を完成させた。

【０００７】すなわち、本発明は、以下の（ａ）〜
（ｃ）に記載のＤＮＡ断片のいずれかを使用して調製し
たＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質、および（ｄ）〜
（ｆ）に記載のＤＮＡ断片のいずれかを使用して調製し
たＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質の２種類の酵素タ
ンパク質の存在下、酵母菌体、ＣＭＰ及びコリンを反応
させてＣＤＰ-コリンを製造することを特徴とする、Ｃ
ＤＰ-コリンの製造法に関するものである。 （ａ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ断
片、（ｂ）配列番号１で示される塩基配列において、１
個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加
されたＤＮＡ断片、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）に記
載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズするＤＮＡ断片、（ｄ）配列番号２で示される塩
基配列を有するＤＮＡ断片、（ｅ）配列番号２で示され
る塩基配列において、１個もしくは複数個の塩基が欠
失、置換、挿入または付加されたＤＮＡ断片、（ｆ）上
記（ｄ）または（ｅ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片

【０００８】また、本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）に
記載のＤＮＡ断片のいずれかを使用して調製したＣＣＴ
活性を有する酵素タンパク質の存在下、酵母菌体、ＣＭ
Ｐ及びホスホリルコリンを反応させてＣＤＰ-コリンを
製造することを特徴とする、ＣＤＰ-コリンの製造法に
関するものである。 （ａ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ断
片、（ｂ）配列番号１で示される塩基配列において、１
個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加
されたＤＮＡ断片、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）に記
載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズするＤＮＡ断片

【０００９】さらに、本発明は、（１）配列番号１で示
される塩基配列からなり、ＣＣＴ活性を有する酵素タン
パク質をコードするＤＮＡ断片、（２）配列番号１で示
される塩基配列において、１個もしくは複数個の塩基が
欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなり、
ＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ
断片、または（３）これらのＤＮＡ断片とストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、ＣＣＴ活性を有する
酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片に関するもので
ある。

【００１０】さらにまた、本発明は、（１）配列番号２
で示される塩基配列からなり、ＣＫＩ活性を有する酵素
タンパク質をコードするＤＮＡ断片、（２）配列番号２
で示される塩基配列において、１個もしくは複数個の塩
基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からな
り、ＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤ
ＮＡ断片、または（３）これらのＤＮＡ断片とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、ＣＫＩ活性を有
する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片に関するも
のである。

【００１１】

【発明の実施の形態】上述したように、本発明の特徴
は、反応系に添加するＣＣＴとして、以下の（ａ）〜
（ｃ）に記載のＤＮＡ断片のいずれかを使用して調製し
たＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質、および必要によ
りＣＫＩとして以下の（ｄ）〜（ｆ）に記載のＤＮＡ断
片のいずれかを使用して調製したＣＫＩ活性を有する酵
素タンパク質を使用することにある。 （ａ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ断
片、（ｂ）配列番号１で示される塩基配列において、１
個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加
されたＤＮＡ断片、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）に記
載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズするＤＮＡ断片、（ｄ）配列番号２で示される塩
基配列を有するＤＮＡ断片、（ｅ）配列番号２で示され
る塩基配列において、１個もしくは複数個の塩基が欠
失、置換、挿入または付加されたＤＮＡ断片、（ｆ）上
記（ｄ）または（ｅ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片

【００１２】上記（ａ）記載のＤＮＡ断片は、酵母ＣＣ
Ｔをコードする遺伝子からＣ末端２２アミノ酸残基相当
分を欠失させたＤＮＡ断片である。具体的には、図１に
示す塩基配列中、塩基番号１〜１２０８番目で示される
配列が酵母のＣＣＴ構造遺伝子に相当し、このＣＣＴ遺
伝子からＣ末端２２アミノ酸残基相当分（６６塩基）を
欠失させたものが配列番号１で示される塩基配列であ
る。上記（ａ）のＤＮＡ断片と同等の機能、すなわちＣ
ＣＴ活性を維持し、プロテアーゼに対する抵抗性を示す
限り、配列番号１で示される塩基配列において１個もし
くは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された
ＤＮＡ断片、またはこれらのＤＮＡ断片とストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片も本発明
で使用可能である。

【００１３】また、上記（ｄ）記載のＤＮＡ断片は、酵
母ＣＫＩをコードする遺伝子からＮ末端２９アミノ酸残
基相当分を欠失させたＤＮＡ断片である。具体的には、
図１に示す塩基配列中、塩基番号１２２３〜２８８１番
目で示される配列がＣＫＩの構造遺伝子に相当し、この
ＣＫＩ遺伝子からＮ末端２９アミノ酸残基相当分（８７
塩基）を欠失させたものが配列番号２で示される塩基配
列である。上記（ｄ）のＤＮＡ断片と同等の機能、すな
わちＣＫＩ活性を維持し、プロテアーゼに対する抵抗性
を示す限り、配列番号２で示される塩基配列において１
個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加
されたＤＮＡ断片、またはこれらのＤＮＡ断片とストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片も
本発明で使用可能である。なお、本発明でいうストリン
ジェントな条件下での反応とは、５ｘＳＳＣ（１ｘＳＳ
Ｃは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム
４．４１ｇを１リットルの水に溶解させたもの）、０．
１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム
塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．５％（ｗ／ｖ）
ブロッキング試薬を含む溶液を用い、６０℃で２０時間
程度のハイブリダイゼーション反応を行うことを意味す
る。

【００１４】このような特定のＤＮＡ断片を使用すると
き、酵素タンパク質の発現量を最大にすることができ、
生産された後の安定性も向上することが本発明者らの実
験で初めて確認された。ＤＮＡ断片の調製は、既にクロ
ーン化され、その全塩基配列が決定されており、酵母の
ＣＣＴ遺伝子（Eur. J. Biochem., 169, 477-486, 198
7）およびＣＫＩ遺伝子（J. Biol. Chem., 264, 2053-2
059, 1989）を参考に公知の組換えＤＮＡ手法（例えば
「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second E
dition」Cold Spring Harbor Laboratory (1989)）をク
ローン化後、ヌクレアーゼ等の酵素を用いて消化させる
ことにより容易に実施することができる。また、調製し
たＤＮＡ断片を用い発現ベクターの調製、発現ベクター
を用いたＣＣＴおよびＣＫＩ活性を有する酵素タンパク
質の調製なども分子生物学の分野に属する技術者にとっ
ては周知の技術であり、例えば（「Molecular Cloning,
ALaboratory Manual, Second Edition」Cold Spring H
arbor Laboratory (1989)）に従って行うことができ
る。

【００１５】すなわち、宿主微生物としては、ＣＣＴ活
性またはＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質が発現で
き、ＣＤＰ−コリンの製造に適用できるものであればい
ずれも使用可能であり、培養及び酵素調製の簡便さから
大腸菌が適当である。具体的には、組換えＤＮＡ実験に
使用されるＫ１２株、Ｃ６００菌、ＪＭ１０５菌、ＪＭ
１０９菌(Gene, 33, 103-119(1985))などが使用可能で
あり、特にプロテアーゼ欠損株が好ましい。また、発現
用ベクターとしては大腸菌内で複製可能であれば特に限
定されないが、ｐＢＲ３２２（Gene, 2, 95-113, 197
7）あるいはｐＵＣ１８（Gene, 33, 103-119, 1985）な
ど、あるいはそれら誘導体が使用できる。このようなベ
クターと上記ＤＮＡ断片を用いて、大腸菌の菌体中で自
発現可能となるように発現制御シグナル（転写開始及び
翻訳開始シグナル）をその上流に連結した組換え発現ベ
クターを作製する。

【００１６】このような発現制御シグナルとしては、人
為的制御が可能で、酵素タンパク質の発現量を飛躍的に
上昇させるような強力な転写開始並びに翻訳開始シグナ
ルを用いることが望ましい。具体的には、ｌａｃプロモ
ーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター（Pr
oc．Natl．Acad．Sci．USA.,80，21(1983）、Gene，2
0，231(1982））、ｔｒｃプロモーター(J．Biol．Che
m．，260，3539(1985））などを例示することができ
る。作製した組換えべクターを用いて大腸菌を形質転換
する。大腸菌を形質転換する方法はすでに多くの方法が
報告されており、たとえば、低温下、塩化カルシウム処
理して菌体内にプラスミドを導入する方法（J．Mol．Bi
ol．，53，159（1970））により大腸菌を形質転換する
ことができる。

【００１７】得られた形質転換体は当該形質転換体が増
殖可能な培地中で増殖させ、さらにクローン化したＣＣ
Ｔ活性ならびにＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質の発
現を誘導して菌体内に当該酵素タンパク質が大量に蓄積
するまで培養を行う。培地としてはブイヨン培地、ＬＢ
培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラク
ト、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％トリプト
ン、１％イーストエキストラクト、０．５％食塩）など
を使用することができる。また、ベクターとしてプラス
ミドを用いた場合には、培養中におけるプラスミドの脱
落を防ぐために適当な抗生物質（プラスミドの薬剤耐性
マーカーに応じ、アンピシリン、カナマイシンなど）の
薬剤を適当量培養液に加えて培養する。

【００１８】形質転換体の培養は、低温で培養すること
で上記酵素タンパク質を安定に生産させることができる
ので、当該培地に種菌を接種後、２０〜３０℃で、好ま
しくは２０〜２８℃で１０〜５０時間程度必要により通
気撹拌しながら培養する。また、酵素タンパク質の発現
を誘導する必要がある場合には、用いたプロモーターで
常用されている方法で該遺伝手の発現を誘導する。例え
ば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターを使用し
た場合には、培養中期に発現誘導剤であるイソプロピル
−β−D−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと
略称する）を適当量添加する。また、使用するプロモー
ターが構成的に転写活性を有する場合には、特に発現誘
導剤を添加する必要はない。

【００１９】反応液に添加する酵素タンパク質として
は、上記の方法で得られる培養液から遠心分離、膜分離
などの固液分離手段で回収した微生物の菌体を利用する
ことも可能であるが、該微生物の処理物、該処理物から
得られる酵素調製物を利用することもできる。微生物の
処理物としては、上記回収した微生物菌体を、機械的破
壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナ
イザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥
（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチーム
などによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処
理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して
得られる菌体処理物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜
の変性物を例示することができる。酵素調製物として
は、上記菌体処理物から当該酵素活性を有する画分を通
常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機
溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理
など）を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示す
ることができる。

【００２０】また、反応系に添加する酵母菌体として
は、ＣＭＰをシチジン５’−トリリン酸（ＣＴＰ）に変
換できる酵母であればよく、なかでも市販のパン酵母、
あるいはワイン酵母を用いることで酵母菌体製造の過程
が省略でき、極めて有利である。また、酵母乾燥菌体、
酵母生菌体いずれの形態も利用可能である。酵母菌体の
使用濃度としては、乾燥重量として１〜５％（ｗ／ｖ）
の範囲から適宜設定することができる。基質として使用
するＣＭＰ、コリンまたはホスホリルコリンは市販品を
使用することができる。各基質の使用濃度としては１〜
２００ｍＭ、好ましくは５０〜１５０ｍＭの範囲から適
宜設定できる。

【００２１】ＣＤＰ−コリンの合成反応は、例えば水溶
液、好ましくはリン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）
中、酵母菌体、ＣＭＰ、コリン（またはホスホリルコリ
ン）を添加し、さらにＣＣＴ活性を有する酵素タンパク
質、ＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質（ホスホリルコ
リンを使用した場合には不要）をそれぞれ０．０１ユニ
ット／ｍｌ以上、好ましくは０．０４〜１．０ユニット
／ｍｌ添加し、５〜３０℃、好ましくは２０〜３０℃で
１０〜７２時間程度、必要により撹拌しながら反応させ
ることにより実施できる。

【００２２】なお、上記酵素反応は、無機リン酸、窒素
源及びエネルギー源を反応系に添加して行うのが望まし
い。使用する無機リン酸としては、リン酸カリウムなど
のリン酸塩をそのまま使用してもよく、リン酸緩衝液の
形態で使用してもかまわない。無機リン酸の使用濃度
は、１０〜５００ｍＭ、好ましくは１００〜３００ｍＭ
の範囲から適宜選定することができる。また、窒素源と
してはグルタミン酸等のアミノ酸あるいは硫安を使用す
ることができ、エネルギー源としてはグルコース、フラ
クトースなどの糖類または酢酸、クエン酸などの有機酸
を使用することができ、それぞれ１０〜５００ｍＭ、好
ましくは２０〜４００ｍＭの範囲から適宜選定すること
ができる。このようにして得られたＣＤＰ−コリンは、
通常の単離精製手段（イオン交換クロマトグラフィー、
吸着クロマトグラフィー、塩析など）により単離精製す
ることができる。

【００２３】

【実施例】以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明
するが、本発明がこれに限定されないことは明らかであ
る。なお、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素によ
る切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに
大腸菌の形質転換法は全て「Molecular Cloning, A Lab
oratory Manual, Second Edition」（Sambrookら編、Co
ld spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N
ew York (1989)）に従って行った。また、制限酵素、Ａ
ｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼは宝酒造（株）より入手した。また、実施例におい
て、反応液中のＣＤＰ−コリンの定量にはＨＰＬＣ法に
より行った。具体的には、分離には日立社製の３０１３
−Ｎカラムを用い、溶出液としてはＡ液；０．１２ｍＭ
ＮＨ₄Ｃｌ、０．２ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．２ｍＭ
ＫＨ₂ＰＯ₄、５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、Ｂ液；５
００ｍＭ ＮＨ₄Ｃｌ、８３ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、８３ｍ
Ｍ Ｋ₂ＨＰＯ₄、５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを用
い、０〜５０％Ｂ液（０−２０分リニアーグラジエン
ト）、１００％Ｂ液（２０−２５分）の条件で分析を行
った。

【００２４】実施例１ （１）発現用プラスミドｐＴｒｃ１２−６の作製 プラスミドベクター πＡＧ１（プラスミドベクター
πＡＧ１を保持した大腸菌 Ｋ−１２株 ＴＮＣ１１１
菌の寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６９０１号：平成１１
年９月３０日生命工学工業技術研究所寄託）を制限酵素
ＥｃｏＲＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて
ＤＮＡ末端を平滑化し、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いてｐＢｇｌＩＩリンカーを付与した。該ＤＮＡを制限
酵素ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで切断し、カナマイシン
耐性遺伝子を含む１．８ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ
断片を調製した。次にｐＴｒｃ９９ＡＤＮＡを制限酵素
ＰｖｕＩで切断後、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼによる部分
消化を行い、β―ラクタマーゼ遺伝子を欠失させ、さら
にｐＢｇｌＩＩリンカーをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用い
てＤＮＡ末端に付与し、さらに制限酵素ＢｇｌＩＩで切
断した。該ＤＮＡと先に調製したカナマイシン耐性遺伝
子を含むＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
し、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し
た。得られたカナマイシン耐性形質転換体より、プラス
ミドｐＴｒｃ１２−６を得た。ｐＴｒｃ１２−６は、ｐ
Ｔｒｃ９９Ａのβ―ラクタマーゼ遺伝子が完全に欠失し
（position ５６７―１８１６ｂｐが欠失）、その欠失
部位にＴｎ９０３由来のカナマイシン耐性遺伝子が挿入
されたものである。

【００２５】（２）ＣＣＴ遺伝子のクローニング 酵母 Saccharomyces cerevisiae DBY746（ＡＴＣＣ
４４７７３）の染色体ＤＮＡをの方法（Biochim. Bioph
ys. Acta., 72, 619 (1963)）で調製した。このＤＮＡ
をテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマー
ＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により酵母ＣＣ
Ｔ遺伝子を増幅した。 プライマー（Ａ）：5'-TACCATGGCAAACCCAACAAGGGA-3' プライマー（Ｂ）：5'-TATCTAGAGGGGCTCAGTTCGCTGATT-
3' ＰＣＲによるＣＴＴ遺伝子の増幅は、反応液１００μｌ
中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％
ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、テンペレートＤＮＡ
０．５μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．
２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．
５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、ア
ニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーショ
ン（７２℃、１．５分）のステップを２５回繰り返すこ
とにより行った。

【００２６】遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回
収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方
法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．
８ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵
素ＮｃｏＩ及びＸｂａＩで切断し、同じく制限酵素Ｎｃ
ｏＩ及びＸｂａＨＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１２
−６とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応
液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られた
アンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ１
２−ＣＣＴを単離した。ｐＴｒｃ１２−ＣＣＴは、ｐＴ
ｒｃ１２−６のｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−Ｘ
ｂａＨＩ切断部位に酵母ＣＣＴ遺伝子を含有するＮｃｏ
Ｉ−ＸｂａＩＤＮＡ断片が挿入されたものである。

【００２７】（３）ＣＫＩ遺伝子のクローニング 酵母 Saccharomyces cerevisiae DBY746（ＡＴＣＣ
４４７７３）の染色体ＤＮＡをテンペレートとして、以
下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成
し、ＰＣＲ法により酵母ＣＫＩ遺伝子を増幅した。 プライマー（Ｃ）：5'-ATTCTAGAGGAGCAAAAGATGGTACAAGA
ATCA-3' プライマー（Ｄ）：5'-ATCTGCAGGAATTCGTATACGTATTACA-
3' ＰＣＲによるＣＫＩ遺伝子の増幅は、反応液１００μｌ
中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％
ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、テンペレートＤＮＡ
０．５μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｃ）（Ｄ）各々０．
２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．
５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、ア
ニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーショ
ン（７２℃、１．５分）のステップを２５回繰り返すこ
とにより行った。

【００２８】遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回
収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方
法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、２．
０ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵
素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵素Ｘｂ
ａＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１２−
６とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液
を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたカ
ナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ１２
−ＣＫＩを単離した。ｐＴｒｃ１２−ＣＫＩは、ｐＴｒ
ｃ１２−６のｔｒｃプロモーター下流のＸｂａＩ−Ｐｓ
ｔＩ切断部位に酵母ＣＫＩ遺伝子を含有するＸｂａＩ−
ＰｓｔＩ ＤＮＡ断片が挿入されたものである。

【００２９】（４）ＣＣＴ及びＣＫＩの調製 プラスミドｐＴｒｃ１２−ＣＣＴを制限酵素ＮｃｏＩ及
びＸｂａＩで消化し、ＣＣＴ遺伝子を含むＮｃｏＩ−Ｘ
ｂａＩ断片を分離精製した。該断片とＮｃｏＩ及びＸｂ
ａＩで切断したプラスミドｐＴｒｃ１２−ＣＫＩ ＤＮ
ＡとＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、連結反応液を
用いた大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られたカナ
マイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ＣＣ
Ｋ８を単離した。ｐＴｒｃ−ＣＣＫ８は、ｐＴｒｃ９９
Ａのｔｒｃプロモーター下流に酵母ＣＣＴ及びＣＫＩ遺
伝子が連結されて挿入されたものである。プラスミドｐ
Ｔｒｃ−ＣＣＫ８を用いて大腸菌Ｋ−１２株 ＭＥ８４
１７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４７号：平成１１年８月１
８日 生命工学工業技術研究所寄託）を形質転換し、得
られた形質転換体を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを
含有する２ｘＹＴ培地 ３００ｍｌに植菌し、３７℃で
振とう培養した。４ｘ１０ ⁸菌／ｍｌに達した時点で、
培養液に終濃度０．２５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添
加し、さらに２８℃で２０時間振とう培養を続けた。

【００３０】培養終了後、遠心分離（９，０００ｘｇ，
１０分）により菌体を回収し、３０ｍｌの緩衝液〔５０
ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ〕に懸濁した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、
さらに遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌
体残渣を除去した。このように得られた上清画分を酵素
液とした。酵素液におけるＣＣＴ活性は０．８４ユニッ
ト／ｍｇ蛋白、ＣＫＩ活性は０．０６ユニット／ｍｇ蛋
白であった。さらに、酵素生産の過程をタイムコースを
追って調べた結果、ＩＰＴＧ誘導後、ＣＣＴ、ＣＫＩと
も生産されるものの、その量は必ずしも高くなく、しか
も生産された酵素の活性が徐々に失われてゆき、その原
因の１つとしてプロテアーゼによる加水分解が推定され
た。

【００３１】なお、本発明における各種酵素の単位（ユ
ニット）は、以下に示す方法で測定、算出したものであ
る。 （ＣＣＴ活性の測定と単位の算出法）５ｍＭ ＣＴＰ、
５ｍＭ ホスホコリン、２５ｍＭ 塩化マグネシウムを
含有する１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）
に酵素標品を添加し、２８℃で反応させる。反応終了後
１００℃で１分間の熱処理を行い、高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）で反応液中のＣＤＰ−コリン量を
分析する。２８℃で１分間に１μｍｏｌｅのＣＤＰ−コ
リンを生成する活性を１単位（ユニット）とする。 （ＣＫＩ活性の測定と単位の算出法）５ｍＭ ＣＴＰ、
５ｍＭ 塩化コリン、５ｍＭ ＡＴＰ、２５ｍＭ 塩化
マグネシウム、１ユニット／ｍｌ ＣＣＴを含有する１
００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品
を添加し、２８℃で反応を行い、１００℃で１分間の熱
処理により反応を停止させる。反応液中のＣＤＰ−コリ
ン量をＨＰＬＣ法により定量する。２８℃で１分間に１
μｍｏｌｅのＣＤＰ−コリンの生成する活性を１単位
（ユニット）とする。

【００３２】（５）酵母ＣＣＴをコードする遺伝子から
Ｃ末端２２アミノ酸残基相当分を欠失させたＤＮＡ断片
（ＣＴＲ−１）の調製 上記（４）で構築、単離したｐＴｒｃ−ＣＣＫ８プラス
ミドをテンペレートとして、前述のプライマーＤＮＡ
（Ａ）と下に示すプライマーＤＮＡ（Ｅ）を常法に従っ
て合成し、ＰＣＲ法によりＣＴＲ−１を増幅した。 プライマー（Ｅ）：5'-TACCATGGCAAACCCAACAACAGGGA-3' ＰＣＲによるＣＴＲ−１の増幅は、反応液１００μｌ中
（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％
ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、テンペレートＤＮＡ
０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｅ）各々
０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔ
ｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍ
ａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１
分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライ
ゼーション（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返
すことにより行った。

【００３３】遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回
収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方
法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．
２ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵
素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じく制限酵素Ｎ
ｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１
２−６とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反
応液を用いて大腸菌Ｋ−１２株 ＭＥ８４１７（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−６８４７）を形質転換し、得られたカナマイ
シン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ＣＴＲ１
を単離した。ｐＴｒｃ−ＣＴＲ１は、ｐＴｒｃ１２−６
のｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ切断
部位に３’末端６６ｂｐを欠失した酵母ＣＣＴ構造遺伝
子を含有するＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片が挿入さ
れたものである。

【００３４】（６）酵母ＣＫＩをコードする遺伝子から
Ｎ末端２９アミノ酸残基相当分を欠失させたＤＮＡ断片
（ＣＫＦ−Ａ）の調製 上記（４）で構築、単離したｐＴｒｃ−ＣＣＫ８プラス
ミドをテンペレートとして、先に示したプライマーＤＮ
Ａ（Ｄ）と以下に示すプライマーＤＮＡ（Ｆ）を常法に
従って合成し、ＰＣＲによりＣＫＦ−Ａを増幅した。 プライマー（Ｆ）：5'-TGTCTAGATGGTAACACGCCAACGTTCCT
C-3' ＰＣＲによるＣＫＦ−Ａの増幅は、反応液１００μｌ中
（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％
ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、テンペレートＤＮＡ
０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｄ）（Ｆ）各々
０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔ
ｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍ
ａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１
分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライ
ゼーション（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返
すことにより行った。

【００３５】遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回
収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方
法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．
７ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵
素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵素Ｘｂ
ａＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１２−
６とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液
を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたカ
ナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃＣＫ
Ｆ−Ａを単離した。ｐＴｒｃＣＫＦ−Ａは、ｐＴｒｃ１
２−６のｔｒｃプロモーター下流のＸｂａＩ−ＰｓｔＩ
切断部位に酵母ＣＫＩ遺伝子の５’末端８７ｂｐを欠
失した構造遺伝子を含有するＸｂａＩ−ＰｓｔＩＤＮＡ
断片が挿入されたものである。なお、ＣＫＦ−Ａタンパ
ク質のＮ末端１、２番目のアミノ酸基はメチオニン、バ
リンである（天然のＣＫＩではセリン、ロイシンに相
当）。

【００３６】（７）ＣＴＲ−１およびＣＫＦ−Ａを用い
てのＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質とＣＫＩ活性を
有する酵素タンパク質の生産 ｐＴｒｃＣＫＦ−Ａプラスミドを制限酵素ＰｓｔＩで切
断した後、切断断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて
平滑化した。続いて平滑化処理した該プラスミドを制限
酵素ＸｂａＩで切断し、得られたＣＫＦ−Ａ遺伝子を含
む１．５ｋｂのＤＮＡ断片を文献（Molecular Clonin
g、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動によ
り分離、回収した。次にｐＴｒｃ−ＣＴＲ１プラスミド
を制限酵素ＳａｌＩで切断した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いて切断断片を平滑化した。続いて制限酵素Ｘ
ｂａＩで切断し、該ＤＮＡ断片と実施例で調製したＣＫ
Ｆ−Ａ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連
結反応液を用いて大腸菌Ｋ−１２株 ＭＥ８４１７（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６８４７）を形質転換し、得られたカナ
マイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ＦＡ
を単離した。得られた形質転換体を、２０μｇ／ｍｌの
カナマイシンを含有する改変ＬＢ培地（１％ポリペプト
ン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、１
％グルコース）３００ｍｌに植菌し、２４℃で振とう培
養した。培養液ｍｌあたりの菌体数が５ｘ１０⁸に達し
た時点で終濃度が０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添
加し、さらに２４℃で２０時間培養を続けた。

【００３７】培養終了後、遠心分離（９，０００ｘｇ，
１０分）により菌体を回収し、３０ｍｌの緩衝液〔５０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ塩
化マグネシウム〕にけん濁した後、超音波処理を行い、
菌体を破砕し、遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）
により菌体残渣を除去した。このようにして得られた上
清画分を酵素標品とした。このようにして調製した酵素
標品における両酵素活性と従来のＣ末またはＮ末欠失前
の遺伝子を用いて調製した上記（４）で得られた酵素液
の酵素活性との比較を表１に示す。表１から明らかなよ
うに、大腸菌における生産性は、上述したＣ末またはＮ
末を欠失させた特定のＤＮＡ断片を使用することによ
り、生来の酵母ＣＣＴに比べて約１．４倍、ＣＫＩは生
来の酵母ＣＫＩに比べて約２０倍の生産性の向上が確認
され、発現量の増大とともに、プロテアーゼ抵抗性の付
与が生産された酵素タンパク質の活性を高レベルに維持
できる要因と推測された。

【００３８】

【表１】

【００３９】（８）ＣＤＰ−コリンの合成（その１） ２００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、７５ｍＭ
ＣＭＰ、２５ｍＭ塩化マグネシウム、７５ｍＭ塩化コリ
ン、０．２Ｍグルコース、２％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母
（オリエンタル酵母社）を含有する反応液４．９ｍｌ
に、上記（７）で調製した酵素液を０．１ｍｌ添加して
（ＣＣＴ活性：０．３８ユニット／ｍｌ、ＣＫＩ活性：
０．４０ユニット／ｍｌ）、試験管中で通気撹拌し、２
８℃で４６時間保温した。反応開始７、２３、３２時間
後に終濃度０．２Ｍとなるようにグルコースを添加し
た。反応４６時間後に６８ｍＭのＣＤＰ−コリンが合成
された（対ＣＭＰモル収率：９０．７％）。比較とし
て、前記（４）で調製した酵素液を０．１ｍｌ添加する
他は同じ条件で反応を行ったが、ＣＤＰ−コリンの合成
はわずかであった。

【００４０】実施例２ ＣＤＰ−コリンの合成（その
２） ２００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、１２５ｍＭ
ＣＭＰ、２５ｍＭ塩化マグネシウム、１１０ｍＭホス
ホリルコリン、０．２Ｍグルコース、３．０％（ｗ／
ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母社）を含有する反
応液４．９ｍｌに、実施例１の（７）で調製した酵素液
を０．１ｍｌ添加し（ＣＣＴ活性：０．３８ユニット／
ｍｌ）、試験管中で通気撹拌し、２５℃で４８時間保温
した。反応開始７、２３、３２時間後に終濃度０．２Ｍ
となるようにグルコースを添加した。反応４８時間後
に、１０２ｍＭのＣＤＰ−コリンが合成された（対ＣＭ
Ｐモル収率：８１．６％）。

【００４１】実施例３ ＣＤＰ−コリンの合成（その
３） 実施例１の（７）と同様の方法で、調製した組換え大腸
菌の培養液２０ｍｌを遠心分離（９，０００ｘｇ，１０
分）により菌体を回収し、−５℃で１晩保存した後、
２．３ｍｌの緩衝液〔５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ 塩化マグネシウム〕にけん
濁し、菌体けん濁液とした。次に、２００ｍＭリン酸カ
リウム（ｐＨ８．０）、１２５ｍＭ ＣＭＰ、２５ｍＭ
塩化マグネシウム、１３０ｍＭホスホリルコリン、０．
４Ｍグルコース、３．０％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オ
リエンタル酵母社）を含有する反応液４．８７５ｍｌ
に、調製した菌体けん濁液を０．１２５ｍｌ添加し、さ
らにキシレンを０．０２５ｍｌ添加し、試験管中で通気
撹拌し、２４℃で４０時間保温した。反応開始１６と２
４時間後に終濃度０．２Ｍとなるようにグルコースを添
加した。反応４０時間後に、１０７ｍＭのＣＤＰ−コリ
ンが合成された（対ＣＭＰモル収率：８５．６％）。

【００４２】実施例４ ＣＤＰ−コリンの合成（その
４） ２００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、７５ｍＭ
ＣＭＰ、２５ｍＭ塩化マグネシウム、８０ｍＭホスホリ
ルコリン、０．２Ｍグルコース、２％（ｗ／ｖ）乾燥パ
ン酵母（オリエンタル酵母社）を含有する反応液１５０
０ｍｌに、実施例１の（７）で調製した酵素液を１２．
５ｍｌ添加し（ＣＣＴ活性：０．３８ユニット／ｍ
ｌ）、３Ｌ卓上型ジャーファメンターで通気撹拌し
（０．５Ｌ／ｍｉｎ、３００ｒｐｍ）、２４℃で４８時
間保温した。反応開始７時間後に終濃度０．２Ｍとなる
ようにグルコース、並びに酵素液を１２．５ｍｌを添加
した。さらに反応２４及び３２時間後に終濃度０．２Ｍ
となるようにグルコースを添加した。反応４８時間後
に、６７．５ｍＭのＣＤＰ−コリンが合成された（対Ｃ
ＭＰモル収率９０．０％）

【００４３】

【発明の効果】本発明の方法は、Ｎ末端またはＣ末端の
アミノ酸を複数個欠失させた特定のＤＮＡ断片を使用す
ることで、目的とする酵素タンパク質を安定に高生産さ
せることができ、このような高生産系で得られた酵素タ
ンパク質を使用することでＣＤＰ−コリンを短時間に効
率的に合成できる極めて実用性の高い方法である。具体
的には、本発明の特定のＤＮＡ断片を使用することで、
大腸菌における酵素タンパク質の生産性は、ＣＣＴは約
１．４倍以上、ＣＫＩは約２０倍以上向上し、もってＣ
ＤＰ−コリンの合成も飛躍的に向上させることが可能で
ある。

【００４４】

【配列表】 SEQUENCE LISTNING <110> YAMASA CORPORATION <120> Process for the preparation of cytidine5'-diphosphate choline <130> YP99-00021 <140> <141> <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1208 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 ccatggcaaa cccaacaaca gggaagtcct cgattagggc taagctttct aactcatcgc 60 tatcaaacct atttaaaaaa aataaaaata aaagacagcg tgaggaaacg gaagagcagg 120 acaatgagga taaggatgag agtaagaacc aggatgaaaa taaggacaca cagctcactc 180 cccgcaagcg tcgccggttg acgaaggagt ttgaagagaa ggaggctcgt tacaccaacg 240 agttgcccaa ggaactgcgc aagtatcgtc ctggaaaagg tttcagattc aatttgcctc 300 caacggatag acccatcata tatgcagatg gtgtttttga tcttttccat cttggccaca 360 tgaagcaact ggaacagtgt aagaaggctt tccccaatgt aacactgata gttggtgtgc 420 ctagcgacaa aatcactcac aaactaaaag gtttgactgt gctgaccgat aagcagcgtt 480 gtgaaacttt aacgcactgc agatgggttg acgaagtcgt gcccaacgct ccctggtgtg 540 tcaccccaga atttctacta gaacacaaga ttgaccacgt ggcacatgac gatattcctt 600 acgttagcgc cgacagcgac gatatctaca agccaataaa ggagatggga aaattcttga 660 ctacccaaag aaccaatggt gtctctacaa gtgatattat cacaaagatc atcagagatt 720 atgacaaata tttgatgaga aactttgcaa ggggtgctac cagacaggag ctgaacgttt 780 cttggttgaa gaaaaacgaa ctggagttca aaaaacacat caatgaattc aggtcatatt 840 tcaagaaaaa ccagacaaat ttgaataacg cctccagaga cttgtacttc gaagtccgtg 900 aaatcttgct aaagaaaacg ttgggcaaaa aactctactc caagttaata ggcaatgaat 960 taaagaaaca aaatcaacga caaagaaaac agaatttttt ggatgatccg tttactagga 1020 agctaatcag ggaggcctct ccggctacag agtttgccaa cgaatttacg ggcgaaaact 1080 ctaccgctaa atcaccggat gacaatggaa atcttttcag tcaggaagat gatgaagaca 1140 ca 1142 <210> 2 <211> 1572 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 ttgagagctg tcaatgaggg agtagcgggt gtgcaactgg acgtctctga aaccgcaaat 60 aagggaccaa gaagagcatc agcaactgat gtcacagata gtttgggttc gacttcgtcg 120 gaatatattg agattccctt tgttaaggaa acattggatg caagtttacc ttcggattat 180 ctgaagcagg acatattaaa tctcattcag agtttgaaga tatccaaatg gtataacaac 240 aagaaaatcc aaccggtagc acaagatatg aacttagtca agatctctgg tgcgatgaca 300 aacgcaattt tcaaagttga ataccctaag ttaccatcgt tgctattgag aatatacgga 360 ccgaatattg ataatatcat tgacagggaa tatgaattgc agattttggc taggctttca 420 ttgaaaaata taggtccttc cctttacggc tgttttgtaa acggtagatt tgagcagttt 480 ctggagaatt ctaagacttt aacaaaagac gacattagaa actggaagaa ctctcaaagg 540 attgcaagga gaatgaagga gttacatgta ggtgttcctc tcttgagttc agaaaggaag 600 aacgggtcgg cttgttggca aaagattaac cagtggttgc gcacgattga gaaagtcgac 660 caatgggtgg gggatcctaa aaacattgaa aactctttat tatgtgagaa ttggtccaag 720 tttatggata ttgtcgatag atatcacaag tggcttattt ctcaagaaca gggtatagag 780 caagtcaaca aaaatcttat attctgccat aatgatgccc aatacggcaa tttacttttc 840 actgctcctg tgatgaacac accgagccta tacactgcac cttcgtctac atcattgact 900 tcccaatcaa gttccttatt tccttcgagc tccaatgtca ttgtagatga tataatcaac 960 ccgccaaagc aggagcaaag ccaagattcc aaattggtcg tcattgattt tgaatatgca 1020 ggtgccaatc ccgccgcata tgatttagcg aatcatcttt ccgagtggat gtatgattac 1080 aacaatgcta aggccccaca tcagtgccac gctgatagat atcccgataa agaacaggtt 1140 ttgaatttct tatactctta tgtttcgcat ctaaggggtg gtgctaagga acccatagat 1200 gaagaggttc aaagactcta taagtcaatc attcaatgga gacccactgt acaactattt 1260 tggtcgctct gggccatcct acaaagtggt aaattagaga aaaaagaagc ctccactgcc 1320 atcactagag aagaaattgg acccaatgga aaaaaatata tcatcaagac tgaacccgaa 1380 tcccctgaag aagactttgt tgaaaatgac gacgagcctg aagctggcgt cagcattgac 1440 acgttcgatt atatggctta tggtcgtgac aagattgcgg tcttttgggg cgacctcatt 1500 ggcttaggca taatcaccga agaagaatgc aaaaatttca gctctttcaa gttcctcgat 1560 actagttatt tg 1572 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of CCT gene <400> 3 taccatggca aacccaacaa ggga 24 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of CCT gene <400> 4 tatctagagg ggctcagttc gctgatt 27 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of CKI gene <400> 5 attctagagg agcaaaagat ggtacaagaa tca 33 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of CKI gene <400> 6 atctgcagga attcgtatac gtattaca 28 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of CTR-1 gene <400> 7 taccatggca aacccaacaa caggga 26 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of CKF-A gene <400> 8 tgtctagatg gtaacacgcc aacgttcctc 30

【００４５】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、酵母由来のＣＣＴおよびＣＫＩの構造
遺伝子を含有する塩基配列を示したものである。図中、
塩基番号１〜１２０８番目で示される配列がＣＣＴの構
造遺伝子であり、１２２３〜２８８１番目で示される配
列がＣＫＩの構造遺伝子である。

【００４６】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 19/30 Ｃ１２Ｒ 1:865） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 1/16 Ｇ Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/16 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 19/30 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 19/30 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA10 CA03 CA10 DA06 EA04 GA11 GA19 GA27 HA01 HA06 4B050 CC04 DD04 EE01 LL01 LL05 4B064 AF23 CA06 CA21 CB27 CB30 CC01 CD09 CD12 CD15 DA01 DA13 4B065 AA26X AA72X AA80Y AB01 AC14 AC16 BA02 BA25 BB01 BC01 BC03 BC11 BC26 BD01 BD15 BD32 BD34 BD36 BD50 CA23 CA29 CA44 CA46

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）〜（ｃ）に記載のＤＮＡ断
   片のいずれかを使用して調製したコリンホスフェートシ
   チジルトランシフェラーゼ（ＣＣＴ）活性を有する酵素
   タンパク質、および（ｄ）〜（ｆ）に記載のＤＮＡ断片
   のいずれかを使用して調製したコリンキナーゼ（ＣＫ
   Ｉ）活性を有する酵素タンパク質の２種類の酵素タンパ
   ク質の存在下、酵母菌体、シチジン５’−モノリン酸
   （ＣＭＰ）及びコリンを反応させてシチジン５’−ジリ
   ン酸コリン（ＣＤＰ-コリン）を製造することを特徴と
   する、ＣＤＰ-コリンの製造法。 （ａ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ断
   片、（ｂ）配列番号１で示される塩基配列において、１
   個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加
   されたＤＮＡ断片、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）に記
   載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリ
   ダイズするＤＮＡ断片、（ｄ）配列番号２で示される塩
   基配列を有するＤＮＡ断片、（ｅ）配列番号２で示され
   る塩基配列において、１個もしくは複数個の塩基が欠
   失、置換、挿入または付加されたＤＮＡ断片、（ｆ）上
   記（ｄ）または（ｅ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジ
   ェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片
2. 【請求項２】 以下の（ａ）〜（ｃ）に記載のＤＮＡ断
   片のいずれかを使用して調製したＣＣＴ活性を有する酵
   素タンパク質の存在下、酵母菌体、ＣＭＰ及びホスホリ
   ルコリンを反応させてＣＤＰ-コリンを製造することを
   特徴とする、ＣＤＰ-コリンの製造法。 （ａ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ断
   片、（ｂ）配列番号１で示される塩基配列において、１
   個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加
   されたＤＮＡ断片、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）に記
   載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリ
   ダイズするＤＮＡ断片
3. 【請求項３】配列番号１で示される塩基配列からなり、
   ＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ
   断片。
4. 【請求項４】配列番号１で示される塩基配列において、
   １個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付
   加された塩基配列からなり、ＣＣＴ活性を有する酵素タ
   ンパク質をコードするＤＮＡ断片。
5. 【請求項５】請求項３または請求項４記載のＤＮＡ断片
   とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＣＣ
   Ｔ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断
   片。
6. 【請求項６】配列番号２で示される塩基配列からなり、
   ＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ
   断片。
7. 【請求項７】配列番号２で示される塩基配列において、
   １個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付
   加された塩基配列からなり、ＣＫＩ活性を有する酵素タ
   ンパク質をコードするＤＮＡ断片。
8. 【請求項８】請求項６または請求項７記載のＤＮＡ断片
   とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＣＫ
   Ｉ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断
   片。