CN104774799A

CN104774799A - 一株表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌及其构建方法与应用

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Publication number: CN104774799A
Application number: CN201510184705.8A
Authority: CN
Inventors: 应汉杰; 王骏之; 刘映淼; 杨晟; 陶荣盛; 蒋宇
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2015-04-17
Filing date: 2015-04-17
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2035-04-17
Also published as: CN104774799B

Abstract

本发明公开了一株表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌，属于基因工程技术领域。该菌株是导入了磷酰胆碱胞苷转移酶CCT基因和胆碱激酶CKI基因共表达质粒的基因工程菌，所述的CCT基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1中1～1275所示；所述的CKI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1中1276～3024所示。本发明的大肠杆菌基因工程菌株可以高效表达胆碱激酶，其诱导酶活达1.94U/mg。本发明还公开了上述基因工程菌的构建方法及利用该基因工程菌催化产胞磷胆碱的应用，催化体系中胞磷胆碱的含量达到19g/L。将该菌株应用于生产胞磷胆碱，具有工艺简单、条件温和、周期短、副产物少等优点。

Description

一株表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种表达胆碱激酶大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

胞磷胆碱是由核糖、焦磷酸、胞嘧啶和胆碱构成的核苷酸衍生物，是生物合成卵磷脂的中间体，卵磷脂又是磷脂中最重要的一种，是细胞膜的组成成分。药理上有改善脑组织代谢，调节脑血管张力及保护脑神经的作用，临床上可用于治疗头部损伤，脑老化，帕金森综合症等多种心脑血管疾病。

胞磷胆碱的制备方法概括起来主要有化学合成法和生物合成法。化学合成法主要见于早期工艺路线，但是由于使用多种毒性有机试剂，且转化率低，因此不适于大规模生产应用。

另外一种是生物合成法，最早以酵母菌泥为生物酶源，以葡萄糖为底物进行从头发酵生产胞磷胆碱，转化率可达到80％左右且操作工艺简单。之后，细胞固定化工艺应用于胞磷胆碱的生物制备，以高聚材料将酵母细胞微囊化后制成固定化细胞柱，将制备好的反应液通过细胞柱，流出液即可制得胞磷胆碱，转化率达60％，且菌体可重复利用多次。

随着合成生物学技术的发展，日本协和发酵株式会社利用基因工程手段在大肠杆菌中高效表达了甘油磷脂代谢途径中的关键酶，偶联高效ATP再生系统，实现了胞磷胆碱的商业化生产应用。

酶法即以甘油磷脂代谢途径中关键酶为酶源催化生产胞磷胆碱。胆碱激酶CCT(choline-phosphate cytidylyltransferase，EC:2.7.1.32)在镁离子参与下，可催化氯化胆碱和ATP生成磷酸胆碱和ADP，是胞磷胆碱生物合成的关键酶。因此，开发以基因工程为手段，克隆高活性的胆碱激酶基因，构建工程菌株大量表达胆碱激酶(EC:2.7.7.15)，磷酰胆碱胞苷转移酶CKI(choline kinase，EC:2.7.7.15)，三磷酸胞苷合成酶(EC:6.3.4.2)，产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)，以乳清酸、氯化胆碱和葡萄糖为底物原料生成胞磷胆碱，是胞磷胆碱合成的一条可行途径。

胆碱激酶广泛存在于各类于酵母菌中，但由于病理学研究需要，从猴类肺部中首次被分离纯化，直到20世纪50年代才通过基因互补法从酵母细胞中纯化出来。之后胆碱激酶分别在酵母菌，大肠杆菌中进行过表达，但是基因表达量及酶活普遍较低，难以运用于工业化生产中。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一株表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的大肠杆菌基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述大肠杆菌基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技书问题是，提供上述大肠杆菌基因工程菌在制备胞磷胆碱中的应用。

一株表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌，该菌株是导入了克隆有磷酰胆碱胞苷转移酶CCT基因和胆碱激酶CKI基因的双顺反子表达质粒的基因工程菌，

所述的CCT基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1中1～1275，其氨基酸序列如SEQID NO：2所示，其长度为1275bp，编码424个氨基酸和一个终止密码子；

所述的CKI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1中1276～3024所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其长度为1749bp，编码582个氨基酸和一个终止密码子。

其中，所述的菌株为E.coli Rosetta(DE3)、E.coli BL21、Saccharomyces cerevisiaeBY4742，优选为E.coli Rosetta(DE3)、E.coli BL21，最优选为E.coli Rosetta(DE3)。

其中，将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列克隆到表达质粒的多克隆位点处，即在CCT基因和CKI基因之间不插入任何核苷酸序列。

其中，所述的表达质粒为pET 28a、pBADgIII或pYES2(zeo)Pgal、pET24a，优选的表达质粒为pET24a、pET 28a。

上述表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌的构建方法也在本发明的保护范围之内，该方法包括如下步骤：

(1)提取酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c的基因组DNA，

(2)以步骤(1)得到的该基因组DNA为模板，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列为引物，PCR得CCT基因，

以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列为引物，PCR得到CKI基因；

(3)以步骤(2)得到的CCT基因和CKI基因为模板，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列为引物，通过重叠延伸PCR扩增得到SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

(4)将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列克隆到表达质粒中，得到重组质粒；

(5)将步骤(4)得到的重组质粒转化宿主菌，即得到表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌。

上述表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌在制备胞磷胆碱中的应用也在本发明的保护范围之内。

优选将表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌、表达三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌及产氨棒杆菌加入含有乳清酸和氯化胆碱的催化体系中，催化制备胞磷胆碱，

其中，所述的表达三磷酸胞苷合成酶的菌体是导入了来自于乳酸菌的三磷酸胞苷合成酶基因pyrG的大肠杆菌。

其中，所述的表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌按照如下方法制备：

(1a)将表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌接种到LB培养基中，培养至OD₆₀₀为0.6；

(2a)向培养基中加入终浓度为0.2mol/L的IPTG，诱导76-8h，诱导时间优选为7h；

(3a)收集菌体，得到表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌；

其中，所述的表达三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌按照如下方法制备：

(1b)将三磷酸合成酶的基因pyrG插入pET24a质粒中，构建得到表达载体pET24a-pyrG，所述三磷酸合成酶的基因pyrG的GenBank登记号为AJ010153.3；

(2b)将表达载体pET24a-pyrG转化大肠杆菌，得重组大肠杆菌；

(3b)诱导重组大肠杆菌表达三磷酸胞苷合成酶，诱导结束后收集菌体，得到表达三磷酸胞苷合成酶的菌体；

其中，所述的产氨棒杆菌按照如下方法制备：

(1c)将产氨棒杆菌接种到一级培养基中，培养得到一级种子培养液；

(2c)将步骤(1c)得到的一级种子培养液再转接到培养基中，培养得到二级种子培养液；

(3c)将步骤(2c)得到的二级种子培养液接种到发酵罐中，发酵，得到产氨棒杆菌；

所述的培养基，其组成如下200～250g/L葡萄糖、20～25g/L酵母提取物、15～20g/L多聚蛋白胨、2～3/L KH₂PO₄、2～3g/L K₂HPO₄、2～3g/L MgSO₄·7H₂O、0.05～0.1g/LCaCl₂·2H₂O、30～50mg/L FeSO₄·7H₂O、20～30mg/L ZnSO₄·7H2O、5～10mg/L MnSO₄·4H₂O、10～15mg/L甘氨酸、10～15mg/LCuSO4·5H2O、5～10g/L尿素、3～5mg/L VB1·HCl，并由NaOH调pH7.2，溶剂为水；

培养基的组成优选为：200g/L葡萄糖、20g/L酵母提取物、15g/L多聚蛋白胨、2g/LKH₂PO₄、2g/L K₂HPO₄、2.5g/L MgSO₄·7H₂O、0.05g/L CaCl₂·2H₂O、40mg/L FeSO₄·7H₂O、25mg/L ZnSO₄·7H2O、8mg/L MnSO₄·4H₂O、10mg/L甘氨酸、10mg/LCuSO4·5H2O、5g/L尿素、4mg/L VB1·HCl，并由NaOH调pH7.2，溶剂为水。

步骤(1c)和(2c)中，所述的培养，其培养温度为25～35℃，培养温度优选为28℃，培养时间为25～40h，培养时间优选为32h，转速为200～250rpm，转速优选为220rpm；

步骤(3c)中，所述的发酵，其发酵温度为30～35℃，发酵温度优选为30℃，转速为400～600rpm，转速优选为600rpm，28％(v/v)氨水控制PH7，通气5L/min，培养40-50h，培养时间优选为40h。

其中，所述的催化体系的组成如下：葡萄糖200～300g/L、MgSO₄.7H₂O 4～15g/L、KH₂PO₄15～20g/L，乳清酸10～15g/L、氯化胆碱5～10g/L，20～30ml/L二甲苯，并由NaOH调pH7.2，溶剂为水。

催化体系优选为：葡萄糖250g/L、MgSO₄.7H₂O 15g/L、KH₂PO₄20g/L，乳清酸8.5g/L、氯化胆碱g/L，20ml/L二甲苯，并由NaOH调pH7.2，溶剂为水。

表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌的加入量为30～50g/L；表达三磷酸胞苷合成酶的菌体加入量为20～40g/L；产氨棒杆菌的加入量为100～200g/L，所用的三种菌体都是湿菌体。

有益效果：

本发明具有如下突出的效果：

(1)本发明通过构建重组表达质粒载体pET28a-CCT-CKI，该质粒中的含有磷酰胆碱胞苷转移酶CCT基因和胆碱激酶CKI基因，将该质粒转化宿主菌，得到E.coliRosetta(DE3)/pET28a-CCT-CKI重组菌，该重组菌能高效表达胆碱激酶，胆碱激酶酶活可达到1.94U/mg。

(2)本发明还提供了利用上述E.coli Rosetta(DE3)/pET28a-CCT-CKI重组菌、表达三磷酸胞苷合成酶基因的重组工程菌E.coli Rosetta(DE3)/pET24a-pyrG、产氨棒杆菌，能以乳清酸，氯化胆碱和葡萄糖为底物原料生成胞磷胆碱，最终检测有19g/L胞磷胆碱生成，乳清酸的摩尔转化率达到70％。

(3)本发明具有工艺简单、条件温和、周期短、副产物少等优点，而且清洁无污染，能实现胞磷胆碱生产过程的节能、降耗、减排。

附图说明

图1为pET28a-CCT-CKI质粒图；

图2为pET28a-CCT-rbsCKI质粒图；

图3为pET28a-CKI-rbsCCT质粒图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

除非另外指明，以下各实施例中所使用的生物材料、载体、菌株、试剂、试剂盒等均可通过常规商购途径获得，其中涉及的生物基因工程操作技术，如质粒提取、酶切消化、片段回收、核酸片段与质粒载体连接反应及克隆和筛选等，均为本领域内的常规操作或参照相应产品的说明书进行操作。

以下实施例中所用的引物如表1所示。

表1引物名称及其核苷酸序列

	引物名称	序列	酶切位点
				SEQ ID NO：4	CCT2-S	agaaacaatcagcgaactgatttgtttaactttaagaaggagatatac
SEQ ID NO：5	CCT2-A	ctcgagttacaaataactagtatcgaggaac	XhoI
				SEQ ID NO：6	CKI2-S	ccatggcaaacccaacaacagggaag	NcoI

SEQ ID NO：7	CKI2-A	ccttcttaaagttaaacaaatcagttcgctgattgtttcttcttctg
				SEQ ID NO：8	CKI-pET42a-S	catgccatgggaatggtacaagaatcacgtccagg	NcoI
SEQ ID NO：9	CKI-pET42a-A	cccaagcttttacaaataactagtatcgagga	HindⅢ
				SEQ ID NO：10	CKI-pBADgIII-S	catgccatggtcatggtacaagaatcacgtccagg	NcoI
SEQ ID NO：11	CKI-pBADgIII-A	gctctagattacaaataactagtatcgagga	XbaI
				SEQ ID NO：12	CKI-pMal-cX2-S	gctctagaatggtacaagaatcacgtccagg	XbaI
SEQ ID NO：13	CKI-pMal-cX2-A	cccaagcttttacaaataactagtatcgagga	HindⅢ
				SEQ ID NO：14	CKI-pKK223-3-S	tcccccgggatggtacaagaatcacgtccagg	SmaI
SEQ ID NO：15	CKI-pKK223-3-A	ccaagcttttacaaataactagtatcgagga	HindⅢ
				SEQ ID NO：16	CKI1-S	gacgacgacaacgacaggttaacacgccaacgttcctcgcaaagac
SEQ ID NO：17	CKI1-A	ctcgagttacaaataactagtatcgaggaac	XhoI
				SEQ ID NO：18	CCT1-S	ccatggcaaacccaacaacagggaag	NcoI
SEQ ID NO：19	CCT1-A	gcgaggaacgttggcgtgttaacctgtcgttgtcgtcgtcatcttc
				SEQ ID NO：20	CCT-S	catgccatggcaaacccaacaacagggaag	NcoI
SEQ ID NO：21	CCT-A	ccgctcgagtcagttcgctgattgtttcttcttctg	XhoI
				SEQ ID NO：22	CCT3-S	tcgatactagttatttgtaatttgtttaactttaagaaggagatatac
SEQ ID NO：23	CCT3-A	ctcgagtcagttcgctgattgtttcttcttctg	Xho
				SEQ ID NO：24	CKI3-S	ccatggtacaagaatcacgtccaggg	NcoI
SEQ ID NO：25	CKI3-A	ccttcttaaagttaaacaaattacaaataactagtatcgaggaacttg
				SEQ ID NO：26	CKI-YES2-F	acgactcactatagggaatattaagcttatggtacaagaatcacgtccag
SEQ ID NO：27	CKI-YES2-R	catgatgcggccctctagatgcatgctcgagttacaaataactagtatcgagg

实施例1：CKI基因表达载体的构建。

(1)酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c基因组提取：

将酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c接种于YP液体培养基(YP培养基组成如下：20g/L蛋白胨和10g/L酵母提取物)，30℃培养至对数生长期，使用酵母基因组提取试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司)提取基因组。

(2)CKI基因表达载体构建：

根据NCBI数据库中已有酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c中胆碱激酶编码基因，设计合成了引物CKI-pET42a-S和CKI-pET42a-A(如SEQ ID NO：8和SEQ IDNO：9所示)，以基因组总DNA为模板进行PCR扩增。

PCR反应参数为：95℃变性5min；然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后；72℃保温10min。

得到长度约为1800bp片段，凝胶电泳分离纯化此片段并进行胶回收。将胶回收产物连接到pMD18T-vector(购自TAKARA公司)，连接产物转化采用氯化钙法制备的大肠杆菌DHSα感受态细胞，涂布于卡那抗性平板。

挑取LB平板上的单菌落，接种到装有5mLB液体培养基的20mL试管中，30℃，220rpm下培养12小时。利用质粒提取试剂盒(购自上海申能博彩生物科技有限公司)提取质粒，并委托金斯瑞科技(南京)有限公司测序，测得序列长度为1749bp，其核酸序列见SEQ ID NO:1中1276～3024所示。

采用EcoRI和HindⅢ双酶切pMD18-T-CKI重组质粒和pET42a载体，并连接酶切产物，获得相应的重组质粒pET42a-CKI。

利用CKI-pBADgIII-S和CKI-pBADgIII-A、CKI-pMal-cX2-S和CKI-pMal-cX2-A、CKI-pKK223-3-S和CKI-pKK223-3-A(其核苷酸序列如SEQ ID NO：10～15所示)四对引物分别扩增CKI基因，将得到的基因片段分别连接到pBADgIII、pMal-cX2和pKK223-3质粒中，构建重组载体pMal-cX2-CKI,pKK223-3-CKI和pBADgIII-CKI。

酶活检测结果见表2，结果显示融合表达质粒pET42a-CKI明显优于其他质粒。由于载体pET42a含有麦芽糖结合蛋白(MBP)与CKI基因融合表达，提高了该酶的表达量和酶活。

实施例2：CCT基因、CKI基因融合表达及共表达载体构建。

(1)CCT、CKI融合表达载体构建：

根据酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c中胆碱激酶编码基因，设计合成了引物CKI1-S/CKI1-A(其核苷酸序列如SEQ ID NO：16～17所示)，根据NCBI数据库中已有酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c中胞苷转移酶基因，设计合成了引物CCT1-S/CCT1-A(其核苷酸序列如SEQ ID NO：18～19示)，以Saccharomyces cerevisiaeS288c基因组总DNA为模板分别PCR扩增，得到CCT基因，其长度为1275bp，编码424个氨基酸和一个终止密码子，PCR反应参数均与实例1相同。

得一长度为1800bp左右的基因片段和另一长度为1200bp左右的基因片段，凝胶电泳分离纯化这两个片段并进行胶回收，然后由引物CCT1-S(SEQ ID NO：18)和CKI1-A(SEQ ID NO：17)，以纯化得到的两片段为模板，通过overlap PCR连接。

PCR反应参数为：95℃变性5min；然后94℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃保温10min。

将该片段回收后与pMD18T-vector相连，构建得pMD18-T-CCT-CKI重组质粒，送测序验证，具体操作同实施例1。

采用NcoI和XhoI双酶切pMD18-T-CCT-CKI重组质粒和pET28a载体，并连接酶切产物，获得相应的融合表达重组质粒pET28a-CCT-CKI。

本文还仿造日本构造了表达质粒pCK1，该质粒中同样含有融合蛋白CCT-CKI，但是CKI基因的N端删除了36个碱基，并转化入E.coli MM294，没有检测到胆碱激酶酶活。

(2)CCT表达载体构建：

根据NCBI数据库中已有酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c中胞苷转移酶基因，设计合成了引物CCT-S/CCT-A(SEQ ID NO：20～21)，以酿酒酵母基因组总DNA为模板进行PCR扩增。

PCR反应参数为：95℃变性5min；然后94℃变性30sec,，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃保温10min。

得到长度约为1200bp片段，凝胶电泳分离纯化此片段并进行胶回收，将该片段回收后与pMD18-T载体相连，构建得pMD18-T-CCT重组质粒，测得序列长度为1275bp，具体操作同实例1。

采用NcoI和XhoI双酶切pMD18-T-CCT重组质粒和pET28a载体，并连接酶切产物，获得相应的重组质粒pET28a-CCT。

(3)CCT、CKI共表达载体构建：

设计合成了引物CKI2-S和CKI2-A(SEQ ID NO：6～7所示)，以重组质粒pET28a-CKI为模板，进行PCR扩增。PCR反应参数均与实例1相同。

得到长度约为1800bp片段，凝胶电泳分离纯化此片段并进行胶回收。纯化得到的目的片段包括CKI基因，核糖体结合位点(ATATACC)和间隔区(RBS与起始密码子间序列ATATACC)。

由引物CCT2-S和CCT2-A(SEQ ID NO：4～5所示)，以酿酒酵母Saccharomycescerevisiae S288c基因组为模板进行PCR扩增，PCR反应参数同实施例1。

得到长度约为1200bp片段，凝胶电泳分离纯化此片段并进行胶回收。

然后，纯化得到的两基因片段由引物CCT2-S和CKI2-A，以纯化得到的两片段为模板，通过overlap PCR连接PCR扩增，PCR反应参数同实例1同实施例2。

得到一约3000bp片段(包括CCT基因，核糖体结合位点，间隔区和CKI基因)，将该片段回收后与pMD18-T载体相连，构建得pMD18-T-CCT-rbsCKI重组质粒，送测序验证序列正确。

采用NcoI和XhoI双酶切pMD18-T-CCT-rbsCKI重组质粒和pET28a载体，并连接酶切产物，获得相应的共表达重组质粒pET28a-CCT-rbsCKI(见图2)。

类似的，设计合成了引物CCT3-S和CCT3-A(SEQ ID NO：22～23所示)，以重组质粒pET28a-CCT为模板，PCR扩增得到的目的片段包括CCT基因，核糖体结合位点(ATATACC)和间隔区(RBS与起始密码子间序列ATATACC)；由引物CKI3-S和CKI3(SEQ ID NO：24～25所示)，以Saccharomyces cerevisiae S288c基因组为模板PCR扩增得CKI基因片段。同样，两片段经overlap PCR连接并测序验证。

采用Nco和XhoI双酶切pMD18-T-CKI-rbsCCT重组质粒和pET28a载体，并连接酶切产物，获得相应的重组质粒pET28a-CKI-rbsCCT(见图3)。

实施例3：表达胆碱激酶的大肠杆菌工程菌株的构建。

将获得的重组质粒通过热击转化几种不同大肠杆菌宿主菌(Rosetta(DE3),，BL21(DE3)等)，具体操作如下:取1uL重组质粒，加入到100ul大肠杆菌感受态细胞液中，冰上放置30min后，42℃热击90s,立即取出放冰上2min，加入900ml LB液体培养基，37℃,220rpm下培养1小时后，取150ul培养液涂布含有卡拉霉素或氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养12小时后所得的单菌落即为重组菌。

提取质粒，以质粒为模板，进行双酶切验证。

进行诱导表达之后，经过筛选得到一株酶活最高的菌株Rosetta(DE3)/pET28a-CCT-CKI。酶活比较见表2。pET28a-CCT-rbsCKI酶活较低，可能CKI距离启动子序列较远，减弱了蛋白表达量。

表2各载体及宿主菌中的CKI基因的酶活

实施例4：IPTG诱导表达重组大肠杆菌。

重组菌大肠杆菌Rosetta(DE3)/pET28a-CCT-CKI，Rosetta(DE3)/pET28a-CCT及含有pET28a空质粒的对照菌大肠杆菌Rosetta(DE3)至含50mg/L卡拉霉素和20mg/L氯霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养过夜。

按2％接种量分别接种到新鲜培养液中，37℃，220rpm培养至OD600约为0.6时，加入IPTG至终浓度0.2mM，30℃，220rpm，诱导表达7h后，8000rpm,4℃，离心5min，收集菌体于-20℃冻存。取100mg菌泥于0.5ml 150mM磷酸盐缓冲(pH 7.0)，加入5ul二甲苯，并于30℃摇床震荡处理10min。

CCT酶活测定反应体系包括：150mM磷酸盐缓冲(PH7.5)，25mM MgCl2，5mMCTP，5mM氯化胆碱和5mM ATP；100g/L二甲苯处理过的Rosetta(DE3)/pET28a-CCT-CKI菌体，适量二甲苯处理过的Rosetta(DE3)/pET28a-CCT菌体。30℃反应15min，沸水中煮5min灭酶，离心，上清液过膜。HPLC检测胞磷胆碱的含量，具体分析条件如下：进样量为20μL，色谱柱为Sepax HP-C18(4.6×250mm)，流动相为乙腈:0.6％磷酸缓冲液(用三乙胺调pH6.60)(2:98)，流速1mL/min，柱温25℃，检测波长280nm。

酶活定义为在30℃下每分钟生成1微摩尔胞磷胆碱所需要的酶量定义为一个酶活单位U。

CKI酶活测定反应体系包括：150mM磷酸盐缓冲(PH7.5)，25mM MgCl2,5mM CTP,5mM氯化胆碱和5mM ATP；100g/L二甲苯处理过的Rosetta(DE3)/pET28a-CCT菌体，适量二甲苯处理过的大肠杆菌Rosetta(DE3)/pET28a-CCT-CKI菌体。30℃反应15min，沸水中煮5min灭酶活，离心，上清液过膜。HPLC检测胞磷胆碱的含量。

经检测，重组菌大肠杆菌Rosetta(DE3)/pET28a-CCT-CKI中CKI的酶活为1.98U/mg，对照菌中没有测到CKI的酶活。

实施例5：阿拉伯糖诱导表达重组大肠杆菌。

重组菌大肠杆菌pBADgIII-CKI及含有pBADgIII空质粒的对照菌大肠杆菌Rosetta(DE3)至含50mg/L氨苄霉素和20mg/L氯霉素的LB液体培养基中，37℃220rpm培养过夜。

按2％接种量分别接种到新鲜培养液中，37℃，220rpm培养至OD600约为0.6时，加入阿拉伯糖至终浓度2g/L，30℃，220rpm，诱导表达7h后，8000rpm,4℃，离心5min，收集菌体于-20℃冻存，测定菌体酶活，具体参照实施例4中的定义和方法。

经检测，重组菌大肠杆菌Rosetta(DE3)/pBADgIII-CKI中CKI的酶活为0.62U/mg，对照菌中没有测到CKI的酶活。

实施例6：半乳糖诱导表达重组酿酒酵母。

设计合成引物CKI-YES2-F和CKI-YES2-R(SEQ ID NO：26～27所示)，Saccharomycescerevisiae S288c基因组为模板进行PCR扩增CKI片段，基因片段回收纯化后通过Gibson重组法插入载体pYES2(zeo)Pgal，得到重组质粒pYES2(zeo)Pgal-CKI。

重组质粒使用Bulletin酵母转化试剂盒(yeast1)转化酿酒酵母BY4742,涂布含100mg/L卡拉霉素的YP平板，30℃培养20小时后所得的单菌落即为酿酒酵母重组菌BY4742/pYES2(zeo)Pgal-CKI。

重组菌BY4742/pYES2(zeo)Pgal-CKI和含有pYES2(zeo)Pgal空质粒的对照菌大肠杆菌BY4742至50mg/L卡拉霉素YB液体培养基中，37℃220rpm培养20小时。

再按2％接种量分别转接到含有10g/L半乳糖和100mg/L卡拉霉素的YP培养液中，30℃培养220rpm培养20小时，离心5min，收集菌体于-20℃冻存，测定菌体酶活，具体参照实施例4中的定义和方法。

经检测，酿酒酵母重组菌BY4742/pYES2(zeo)Pgal-CKI中CKI的酶活为0.148U/mg，对照菌中没有测到CKI的酶活。

实施例7：重组大肠杆菌偶联产氨棒杆菌催化产胞磷胆碱。

(1)制备三磷酸胞苷合成酶：

根据NCBI中乳酸菌Lactococcus lactis三磷酸合成酶的基因pyrG(Genbank accessionnumber:AJ010153.3)设计合成基因片段，并插入pET24a中NdeI和BamHI酶切位点，构建得表达载体pET24a-pyrG，载体转化大肠杆菌宿主菌Rosetta(DE3)，得重组大肠杆菌Rosetta(DE3)/pET24a-pyrG，具体参照实例3，4中的操作步骤。IPTG诱导表达重组大肠杆菌，具体参照实例5中的操作步骤和方法。二甲苯处理菌体后即得到三磷酸胞苷合成酶粗酶液。

(2)制备产氨棒杆菌：

产氨棒杆菌Corynebacterium ammoniagenes菌株LB平板划线，30℃静置培养48h至单菌落至1mm大小菌落。

挑3-5个单菌至20ml试管(5ml液体培养基)，220rpm，28℃培养24h。产氨棒杆菌培养液包含：100g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、10g/L多聚蛋白胨、1g/L KH₂PO₄、1g/L K₂HPO₄、1g/L MgSO₄·7H₂O、0.1g/L CaCl₂·2H₂O、20mg/L FeSO₄·7H₂O、10mg/LZnSO₄·7H2O、20mg/L MnSO₄·4H₂O、15mg/Lβ-丙氨酸、20mg/L L-半胱氨酸、100ug/L生物素、2g/L尿素、5mg/L VB1·HCl，并由NaOH调pH7.2。

试管接种到1L摇瓶(100ml培养液)，220rpm，28℃培养24h。

摇瓶接种到2L发酵罐中(1.25L培养液)，32℃培养，600rpm，28％氨水控制PH6.8，通气2.5L/min，培养40h。

(3)菌体催化产胞磷胆碱：

催化转化体系包括：葡萄糖250g/L、MgSO₄.7H₂O 15g/L、KH₂PO₄20g/L，乳清酸8.5g/L、氯化胆碱7.5g/L，并由NaOH调pH7.2，150g/L产氨棒杆菌菌体，50g/L的重组大肠杆菌湿菌体，20ml/L二甲苯。反应液由NaOH调pH7.5，200rpm，14％KOH水溶液控制PH7.2，32℃反应14h，HPLC检测得有19g/L CDP-胆碱生成，乳清酸的摩尔转化率达到70％。

日本协和构建的了大肠杆菌重组菌MM294/pCKG55，偶联产氨棒杆菌生产胞磷胆碱。32℃反应23h，检测仅有11.4g/L CDP-胆碱生成，乳清酸转化率仅为37％，且有大量中间产物积累。

Claims

1.一株表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌，其特征在于，该菌株是导入了磷酰胆碱胞苷转移酶CCT基因和胆碱激酶CKI基因共表达质粒的基因工程菌，

所述的CCT基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1中1～1275所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，

所述的CKI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1中1276～3024所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.根据权利要求1所述的表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌，其特征在于，所述的菌株为E.coli Rosetta(DE3)、E.coli BL21、Saccharomyces cerevisiae BY4742。

3.根据权利要求1所述的表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌，其特征在于，将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列克隆到表达质粒的多克隆位点处，即在CCT基因和CKI基因之间不插入任何核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌，其特征在于，所述的表达质粒为pET 28a、pBADgIII、pMal-cX2或pYES2(zeo)Pgal。

5.权利要求1～4任一所述的表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c的基因组DNA，

6.权利要求1所述的表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌在制备胞磷胆碱中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌、表达三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌及产氨棒杆菌加入含有乳清酸和氯化胆碱的催化体系中，催化制备胞磷胆碱，

所述的表达三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌是导入了来自于乳酸菌的三磷酸胞苷合成酶基因pyrG的大肠杆菌。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌按照如下方法制备：

(2a)向培养基中加入终浓度为0.2mol/L的IPTG，诱导6-8h；

(3a)收集菌体，得到表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的表达三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌按照如下方法制备：

(2b)将表达载体pET24a-pyrG转化大肠杆菌，得重组大肠杆菌；

(3b)诱导重组大肠杆菌表达三磷酸胞苷合成酶，诱导结束后收集菌体，得到表达三磷酸胞苷合成酶的菌体。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的产氨棒杆菌按照如下方法制备：

(1c)将产氨棒杆菌接种到培养基中，培养得到一级种子培养液；

(3c)将步骤(2c)得到的二级种子培养液接种到发酵罐中，发酵，得到产氨棒杆菌。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的培养基，其组成如下：200～250g/L葡萄糖、20～25g/L酵母提取物、15～20g/L多聚蛋白胨、2～3/L KH₂PO₄、2～3g/LK₂HPO₄、2～3g/L MgSO₄·7H₂O、0.05～0.1g/L CaCl₂·2H₂O、30～50mg/L FeSO₄·7H₂O、20～30mg/L ZnSO₄·7H2O、5～10mg/L MnSO₄·4H₂O、10～15mg/L甘氨酸、10～15mg/LCuSO4·5H2O、5～10g/L尿素、3～5mg/L VB1·HCl，并由NaOH调pH7.2，溶剂为水。

12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，步骤(1c)和(2c)中，所述的培养，其培养温度为25～35℃，培养时间为25～40h，转速为200～250rpm。

13.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，步骤(3c)中，所述的发酵，其发酵温度为30～35℃，转速为400～600rpm，28％(v/v)氨水控制PH6.8，通气2～2.5L/min，培养40～50h。

14.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的催化体系的组成如下：葡萄糖200～300g/L、MgSO₄.7H₂O 4～15g/L、KH₂PO₄15～20g/L，乳清酸10～15g/L、氯化胆碱5～10g/L，20～30ml/L二甲苯，并由NaOH调pH7.2，溶剂为水。

15.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌的加入量为30～50g/L；表达三磷酸胞苷合成酶的菌体加入量为20～40g/L；产氨棒杆菌的加入量为100～200g/L。