CN115725536A

CN115725536A - 一种双功能酶、双功能酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN115725536A
Application number: CN202110994849.5A
Authority: CN
Inventors: 刘珊珊; 秦永发
Original assignee: Beijing Tiankai Yida Biological Science & Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Tiankai Yida Biological Science & Technology Co ltd
Priority date: 2021-08-27
Filing date: 2021-08-27
Publication date: 2023-03-03

Abstract

本发明公开了一种双功能酶、双功能酶突变体及其应用。该双功能酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，该双功能酶由CKI酶和CCT酶通过连接肽连接组成，CKI酶的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示，CCT酶的蛋白序列如SEQ ID NO:3所示，连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。本发明具有如下有益效果：(1)双功能酶或突变体可替代CKI酶和CCT酶，使两步反应合为一步反应，由于中间产物及终产物对其反馈抑制低，该酶活性更高，为两种酶的活性的160％以上，更加适用于体外酶促反应。(2)使用双功能酶进行酶促反应，仅需在反应体系中加入单一酶，降低了酶的生产成本。(3)在反应体系中无需考虑酶的配比，使催化流程更加简单且重复性更佳。

Description

一种双功能酶、双功能酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种双功能酶、双功能酶突变体及其应用。

背景技术

胞二磷胆碱，又称为尼古林、二磷酸胞嘧啶胆碱等，英文citicholine，简称CDPC，是卵磷脂生物合成的关键辅助因子，是构建生物膜的重要成分。中枢神经损伤后，胞二磷胆碱参与修复和再生，起神经保护作用；在神经介质的转移和生物电的传导中也起重要作用。对急性中风、外科手术后引起的神经损伤、意识障碍，对帕金森综合征、痴呆症、青光眼等有明显的临床治疗效果。同时它作为一种核酸药物，还可与蛋白酶抑制剂联合应用于胰腺炎的治疗。随着我国人口老龄化不断提高，市场上对于帕金森氏综合症、脑血管等疾病药物需求持续增大。

目前合成CDPC的方法主要有三种：生物发酵法、化学合成法和酶促合成法。生物发酵法存在时间周期长、收率低，后续纯化步骤复杂等问题；化学合成法步骤繁杂，中间产物多，还会造成一定程度的环境污染；新兴的酶促合成法利用酶法生产CDPC，即利用胆碱激酶(CKI，EC 2.7.1.32)催化胆碱和和三磷酸腺苷(ATP)生成磷酸胆碱和二磷酸腺苷(ADP)，再利用磷酸胆碱二胞苷转移酶(CCT，EC 2.7.7.15)催化磷酸胆碱和三磷酸胞苷(CTP)生成CDPC，是一种高收率、绿色环保的合成方法，符合未来产业的发展趋势。

酶促合成法的关键在于酶的使用，如何提高催化用酶的活性、稳定性及制造成本，直接影响其工业化进程。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种双功能酶、双功能酶突变体及其应用，该酶具有胆碱激酶(CKI，EC 2.7.1.32)和磷酸胆碱二胞苷转移酶(CCT，EC 2.7.7.15)两种酶的催化能力，并且有高活性、制酶成本低等优点，更加适于工业化生产。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种双功能酶，所述双功能酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述双功能酶由CKI酶和CCT酶通过连接肽连接组成，所述CKI酶的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示，所述CCT酶的蛋白序列如SEQ ID NO:3所示，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

优选地，所述双功能酶是由编码该蛋白的基因序列表达而成，所述基因序列如SEQID NO:10所示，其构建方法如下：

(1)按照缓症链球菌(Streptococcus mitis)的胆碱激酶(CKI，EC 2.7.1.32)和磷酸胆碱二胞苷转移酶(CCT，EC 2.7.7.15)的蛋白序列，根据大肠杆菌DNA密码子偏好性进行序列优化，分别合成DNA序列cki(SEQ ID NO:5)和cct(SEQ ID NO:6)；

(2)设计扩增引物，引物含连接肽对应的基因以及与表达载体同源的序列，使用引物对cki和cct进行聚合酶链反应(PCR)，分别扩增cki和cct片段；同时将表达载体进行酶切线性化，使用无缝克隆方式将两段目的DNA(cki和cct)与载体连接；

(3)将构建的质粒(载体)转入表达菌株，进行蛋白表达。

一种双功能酶突变体，所述突变体是将双功能酶中的连接肽的氨基酸序列进行突变得到的，突变为第352位、第469位氨基酸的单点突变或组合突变。

优选地，突变体SEQ ID NO:7是第352位氨基酸由异亮氨酸(I)变为苏氨酸(T)，突变体SEQ ID NO：8是第469位氨基酸由赖氨酸(K)变为谷氨酰胺(Q)，突变体SEQ ID NO：9是第352位氨基酸由异亮氨酸(I)变为苏氨酸(T)同时第469位氨基酸由赖氨酸(K)变为谷氨酰胺(Q)。

优选地，所突变方法为定点突变。

一种双功能酶的应用，所述双功能酶用于催化制备CDPC。

优选地，催化制备CDPC是以氯化胆碱、氯化钾、六水氯化镁、十二水磷酸氢二钾、ATP和CTP为反应体系，加入双功能酶进行反应，控制pH值为7.5；温度为35℃；制备得到的。

一种双功能酶突变体的应用，其用于催化制备CDPC。

优选地，催化制备CDPC是以氯化胆碱、氯化钾、六水氯化镁、十二水磷酸氢二钾、ATP和CTP为反应体系，加入双功能酶的突变体进行反应，控制pH值为7.5；温度为35℃；制备得到的。

本发明上述技术方案，具有如下有益效果：

(1)本申请的双功能酶(CCT-CKI)，其可完全替代CKI酶和CCT酶，使两步反应合为一步反应，由于中间产物及终产物对其反馈抑制低，该酶活性更高，其活性与单酶组合相比则提高了20％以上，更加适用于体外酶促反应。

(2)本申请的双功能酶突变体，其与单独使用双功能酶相比，酶活又有大幅提高，与单酶组合相比则提高了60％以上。

(3)本申请通过使用双功能酶进行酶促反应，仅需在反应体系中加入单一酶，降低了酶的生产成本，工业适应性更强。

(4)在本申请双功能酶或其突变体参与的反应中，在反应体系中无需考虑酶的配比，使催化流程更加简单且重复性更佳。

附图说明

图1为实施例1中基因片段cki和cct的琼脂糖电泳图。

图2为实施例1中CKI、CCT和M47三种酶的SDS-PAGE蛋白电泳图。

图3为实施例2中基因片段cki-cct和cct-cki的琼脂糖电泳图。

图4为实施例2中描述的载体构建图，其中A图为pET22b-cct-cki，B图为pET22b-cki-cct。

图5为实施例2中CKI-CCT和CCT-CKI两种酶的SDS-PAGE蛋白电泳图，其中A图泳道1为蛋白标志物20-100kDa；泳道2为双功能酶CCT-CKI，约65kDa；B图泳道1为蛋白标志物20-100kDa；泳道2为双功能酶CKI-CCT，约65kDa。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1CKI和CCT酶的表达

按照GenBank中缓症链球菌(Streptococcus mitis)的胆碱激酶(CKI，EC2.7.1.32)蛋白序列(SEQ ID NO:2)，根据大肠杆菌DNA密码子偏好性进行序列优化，合成DNA序列cki(SEQ ID NO:5)。

按照GenBank中缓症链球菌(Streptococcus mitis)的磷酸胆碱二胞苷转移酶(CCT，EC 2.7.7.15)蛋白序列(SEQ ID NO:3)，根据大肠杆菌DNA密码子偏好性进行序列优化，合成DNA序列cct(SEQ ID NO:6)。

设计引物，引物序列见表1。

表1.PCR扩增引物表1

以SEQ ID NO:5为模板，正义引物cki-F(SEQ ID NO:11)和反义引物cki-R(SEQ IDNO:12)进行PCR扩增，具体条件为：预变性95℃5分钟；变性95℃30秒，退火56℃30秒，延伸72℃1分钟，循环数为30；72℃10分钟。得到cki扩增片段。

以SEQ ID NO:6为模板，正义引物cct-F(SEQ ID NO:13)和反义引物cct-R(SEQ IDNO:14)进行PCR扩增，具体条件为：预变性95℃5分钟；变性95℃30秒，退火55℃30秒，延伸72℃1分钟，循环数为30；72℃10分钟。得到cct扩增片段。

图1为1％琼脂糖电泳图，如图所示：泳道1为DNA标志物100-2000bp；泳道2为cct片段，约690bp；泳道3为cki片段，约870bp。

将pET22b载体使用BamH I和Nde I进行双酶切，使用无缝克隆试剂盒将cki和cct扩增片段分别连接至pET22b载体，构建出pET22b-cki和pET22b-cct质粒。

测序验证正确后，将pET22b-cki和pET22b-cct质粒分别转入E.coli BL21(DE3)菌株。将转化后的E.coli BL21(DE3)单克隆接入LB培养基，培养至对数期后，加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导5小时，收集菌体，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)筛选高表达菌株。其中LB培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％NaCl。

图2为表达蛋白的SDS-PAGE图，如图所示：泳道1为蛋白标志物20-100kDa；泳道2为CKI酶，约34kDa；泳道3为CCT酶，约27kDa。

实施例2构建pET22b-cct-cki和pET22b-cki-cct质粒

从上游进行基因改造，使两蛋白之间通过8个甘氨酸连接(SEQ ID NO:4)。

设计扩增引物，引物序列见表2：

表2.PCR扩增引物表序列表

以SEQ ID NO:5为模板，正义引物cki-F(SEQ ID NO:11)和反义引物linker-R1(SEQ ID NO:16)为引物，进行PCR扩增；同时以SEQ ID NO:6为模板，正义引物linker-F1(SEQ ID NO:15)和反义引物cct-R(SEQ ID NO:14)为引物进行PCR扩增，具体条件为：预变性95℃5分钟；变性95℃30秒，退火56℃30秒，延伸72℃2分钟，循环数为30；72℃10分钟。分别得到扩增片段cki-1和cct-1。

将pET22b载体使用BamH I和Nde I进行双酶切，使用无缝克隆试剂盒将cki-1和cct-1扩增片段同时连接至pET22b载体，构建出pET22b-cki-cct质粒。

同样，以SEQ ID NO:6为模板，正义引物cct-F(SEQ ID NO:13)和反义引物linker-R2(SEQ ID NO:18)为引物，进行PCR扩增；同时以SEQ ID NO:5为模板，正义引物linker-F2(SEQ ID NO:17)和反义引物cki-R(SEQ ID NO:12)为引物，进行PCR扩增，具体条件为：预变性95℃5分钟；变性95℃30秒，退火56℃30秒，延伸72℃2分钟，循环数为30；72℃10分钟。分别得到扩增片段cki-2和cct-2。

将pET22b载体使用BamH I和Nde I进行双酶切，使用无缝克隆试剂盒将cki-2和cct-2扩增片段同时连接至pET 22b载体，构建出pET22b-cct-cki质粒。

图3为1％琼脂糖电泳图，如图所示：泳道1为DNA标志物100-2000bp；泳道2为cct-cki扩增产物，约1600bp；泳道3为cki-cct扩增产物，约1600bp。

载体构建图参见图4，A图为pET22b-cct-cki，B图为pET22b-cki-cct。

测序验证正确后，分别转入E.coli BL21(DE3)菌株。按照实施例1同样步骤培养菌株并诱导蛋白表达。

图5为表达蛋白的SDS-PAGE图，如图所示：A图泳道1为蛋白标志物20-100kDa；泳道2为双功能酶CCT-CKI，约65kDa；B图泳道1为蛋白标志物20-100kDa；泳道2为双功能酶CKI-CCT，约65kDa。

将收获的菌体经超声破碎后，离心收集上清。经硫酸铵沉淀、疏水层析、离子交换层析及脱盐步骤，可获得纯化的酶。

实施例3酶活测定

配制标准反应体系：体系中含有10mM胆碱、10mM CTP(胞苷三磷酸)、10mM ATP(腺苷三磷酸)、50mM氯化钾、20mM氯化镁和50mM Tris。设定检测温度35℃，pH值8.0。加入一定量的酶进行反应，使用高效液相检测CDPC生成量，检测波长276nm。

酶活性单位定义为：在温度35℃，1分钟内生成1μmol CDPC的酶量为1U。

使用上述酶活测定方法，分别使用实施例1中两种酶和实施例2所述酶进行酶活测定。

结果表明：

实施例1中两种酶CKI：CCT摩尔比为1:1，两种酶的总浓度与实施例2中酶浓度相同。经测活，CCT-CKI活性明显高于两种酶的组合，约为两种酶组合的120％；而酶CKI-CCT活性约为两种酶的组合的40％。

因此，CCT-CKI可作为活性较佳的双功能酶使用，蛋白序列为SEQ ID NO:1。

实施例4双功能酶linker的选择

按照实施例2所述方法，设计连接引物，将CCT和CKI蛋白使用不同linker相连接，cct序列位于cki之前。表3为部分连接肽序列和所对应的酶活。酶活检测方法同实施例3，以实施例2中CCT-CKI酶活为100％作对照。

表3.不同连接肽序列的酶活性

序号	连接肽序列	双功能酶活性
			1	GGGGGGGG	100％
2	GGGGGG	89％
			3	GGGGSGGGGS	93％
4	GGGSGSGG	68％
			5	GSAGSAAGSGEF	53％
6	EAAAKEAAAK	73％

结果表明，序号为1的使用8个甘氨酸作为连接肽(SEQ ID NO:4)构建的新酶CCT-CKI活性较高，蛋白序列为SEQ ID NO:1。

实施例5

通过NCBI网站多序列比对，以及使用在线建模软件对蛋白高级结构进行分析，确定部分位点可能对蛋白的活性有较大的影响，对SEQ ID NO:17的部分位点进行单点突变，引物及突变位点见表4。

将突变序列连接至pET22b载体(方法按照实施例2)，突变序列测序验证正确后，分别转入E.coli BL21(DE3)菌株。按照实施例1同样步骤培养菌株并诱导蛋白表达。按照实施例3所述测活方法检测各蛋白表达活性，与实施例4中SEQ ID NO:1中CCT-CKI酶活为100％作对照，结果见表4。

表4.单点突变用引物及酶活性对比

上述的表4中，除I352T和K469Q突变酶(M4和M7)有一定的酶活提高外，其它突变均效果不大。因此，选择M4(SEQ ID NO:7)和M7(SEQ ID NO:8)两个位置进行突变。

实施例6

按照实施例5的方法，使用表4中M4和M7引物制备突变体M47，按照实施例3的测活方法检测各蛋白表达活性，与CCT-CKI酶相比，酶活提高了32％。与单酶组合相比提高了约60％。M47酶蛋白序列见SEQ ID NO:9。M47酶的SDS-PAGE图见图2，如图所示：泳道1为蛋白标志物20-100kDa；泳道4为M47酶，约65kDa；泳道2作为对照，为CKI酶，约34kDa；泳道3作为对照，为CCT酶，约27kDa。

实施例7双功能酶CCT-CKI制备CDPC

按照如下配方配制反应液：在1L的反应体系中含10g/L氯化胆碱、3.8g/L氯化钾、10.2g/L六水氯化镁、18g/L十二水磷酸氢二钾、35g/L ATP和35g/L CTP，调节pH值至7.5，加入实施例3的双功能酶CCT-CKI(SEQ ID NO:1)6000U开始反应。反应期间控制pH值为7.5，温度为35℃。

反应9小时后，HPLC检测CDPC生成量为19g/L。

实施例8双功能酶突变体制备CDPC

按照实施例7的条件配制反应液，分别加入实施例5和实施例6的双功能酶M4、M7和M47 6000U开始反应。反应期间控制pH值为7.5，温度为35℃。

反应9小时后，HPLC检测CDPC生成量分别为21g/L、20g/L和25g/L，使用M47酶效果最佳。

实施例9双功能酶突变体M47制备CDPC

按照如下配方配制反应液：在1L的反应体系中含10g/L氯化胆碱、3.8g/L氯化钾、10.2g/L六水氯化镁、18g/L十二水磷酸氢二钾、35g/L ATP和35g/L CTP，调节pH值至7.5。

在恒温搅拌反应罐中，将实施例6中的双功能酶M47酶与LX1000HA湿载体混合，按照固定化载体与酶质量比为20:1混合，按照酶量的10％添加戊二醛，100rpm搅拌16小时。过滤去除固定液后用0.02M磷酸钾缓冲液(pH8.0)清洗2遍，即得固定化双功能酶。将固定酶装入反应柱设备，排尽气泡后制得酶反应柱。

使用恒流泵将反应液缓慢通过酶反应柱，反应期间控制温度为35℃。反应10小时后，收集反应液，高效液相色谱(HPLC)高效液相色谱(HPLC)检测CDPC的生成量约为24g/L。

对比例1

按照实施例7配制反应液，调节pH值至7.5，加入实施例1所述CCK和CKI酶开始反应(摩尔比例1:1)。反应期间控制pH值为7.5，温度为35℃。

反应9小时后，HPLC检测CDPC生成量不足16g/L。

上述实施例7-实施例9均为采用本申请的双功能酶或双功能酶突变体制备CDPC的示例。对比例1采用传统方法制备CDPC。结果如表5所示：

表5.实施例7-9以及对比例1的制备方法结果比对

从结果可以看出，反应液相同的情况下，使用本申请的双功能酶制备得到的CDPC的产量(19)要远远高于对比例1(＜16)；而采用本申请双功能酶突变体制备得到的CDPC的产量(实施例8和9)要高于双功能酶(实施例7)制备得到的CDPC的产量，而其中以多点突变的效果更好；而同样采用两点突变酶制备CDPC(CCT-CKI M47)的结果显示，固定酶和游离酶生产的结果差别并不大，可以忽略。

因此，本申请由于中间产物或终产物对双功能酶反馈抑制低，在酶促反应中应用本发明所述双功能酶或双功能酶突变体较使用两个单独酶效果更好。

虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 北京天开易达生物科技有限公司

<120> 一种双功能酶、双功能酶突变体及其应用

<130> 20210824

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 526

<212> PRT

<213> 人工合成双功能酶氨基酸序列

<400> 1

Met Lys Ala Ile Ile Leu Ala Ala Gly Leu Gly Thr Arg Leu Arg Pro

1 5 10 15

Met Thr Glu Asn Thr Pro Lys Ala Leu Ile Gln Val Asn Gln Lys Pro

20 25 30

Leu Ile Glu Tyr Gln Ile Glu Phe Leu Lys Glu Lys Gly Ile Asn Asp

35 40 45

Ile Ile Ile Ile Val Gly Tyr Leu Lys Glu Gln Phe Asp Tyr Leu Lys

50 55 60

Glu Lys Tyr Gly Val Arg Leu Val Phe Asn Asp Lys Tyr Ala Asp Tyr

65 70 75 80

Asn Asn Phe Tyr Ser Leu Tyr Leu Val Lys Glu Glu Leu Ala Asn Ser

85 90 95

Tyr Val Ile Asp Ala Asp Asn Tyr Leu Phe Lys Asn Met Phe Arg Asn

100 105 110

Asp Leu Thr Arg Ser Thr Tyr Phe Ser Val Tyr Arg Glu Asp Cys Thr

115 120 125

Asn Glu Trp Phe Leu Val Tyr Gly Asp Asp Tyr Lys Val Gln Asp Ile

130 135 140

Ile Val Asp Ser Lys Ala Gly Arg Ile Leu Ser Gly Val Ser Phe Trp

145 150 155 160

Asp Ala Pro Thr Ala Glu Lys Ile Val Ser Phe Ile Asp Lys Ala Tyr

165 170 175

Ala Ser Gly Glu Phe Val Asp Leu Tyr Trp Asp Asn Met Val Lys Asp

180 185 190

Asn Ile Lys Glu Leu Asp Val Tyr Val Glu Glu Leu Glu Gly Asn Ser

195 200 205

Ile Tyr Glu Ile Asp Ser Val Gln Asp Tyr His Lys Leu Glu Glu Ile

210 215 220

Leu Lys Asn Glu Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Met Glu Lys

225 230 235 240

Ile Ile Lys Glu Lys Ile Ser Ser Leu Leu Ser Gln Glu Glu Glu Val

245 250 255

Leu Ser Val Glu Gln Leu Gly Gly Met Thr Asn Gln Asn Tyr Leu Val

260 265 270

Lys Thr Thr Asn Lys Gln Tyr Ile Val Lys Phe Phe Gly Lys Gly Thr

275 280 285

Glu Lys Leu Ile Asn Arg Gln Asp Glu Lys Tyr Asn Leu Glu Leu Leu

290 295 300

Lys Asp Leu Asp Leu Asp Val Lys Asn Tyr Leu Phe Asp Ile Glu Ala

305 310 315 320

Gly Ile Lys Val Asn Glu Tyr Ile Glu Ser Ala Ile Thr Leu Asp Ser

325 330 335

Thr Ser Ile Lys Thr Lys Phe Asp Lys Ile Ala Pro Ile Leu Gln Ile

340 345 350

Ile His Ala Ser Gly Lys Glu Leu Arg Gly Glu Phe Ala Pro Phe Glu

355 360 365

Glu Ile Lys Lys Tyr Glu Ser Leu Ile Glu Glu Lys Ile Pro Tyr Ala

370 375 380

Asn Tyr Glu Ala Val Arg Glu Glu Val Phe Ser Leu Glu Lys Arg Leu

385 390 395 400

Ala Asp Leu Gly Val Asp Arg Lys Ser Cys His Ile Asp Leu Val Pro

405 410 415

Glu Asn Phe Ile Glu Ser Pro Gln Gly Arg Leu Tyr Leu Ile Asp Trp

420 425 430

Glu Tyr Ser Ser Met Asn Asp Pro Met Trp Asp Leu Ala Ala Leu Phe

435 440 445

Leu Glu Ser Glu Phe Thr Pro Gln Glu Glu Glu Val Phe Leu Ser His

450 455 460

Tyr Glu Ser Asp Lys Thr Pro Val Ser Arg Glu Lys Ile Thr Ile Tyr

465 470 475 480

Lys Ile Leu Gln Asp Thr Ile Trp Ser Leu Trp Thr Val Tyr Lys Glu

485 490 495

Glu Gln Gly Ala Asp Phe Gly Asp Tyr Gly Val Ser Arg Tyr Gln Arg

500 505 510

Ala Val Lys Gly Leu Ala Tyr Tyr Gly Gly Ser Asp Glu Lys

515 520 525

<210> 2

<211> 289

<212> PRT

<213> 缓症链球菌CKI酶蛋白序列

<400> 2

Met Glu Lys Ile Ile Lys Glu Lys Ile Ser Ser Leu Leu Ser Gln Glu

1 5 10 15

Glu Glu Val Leu Ser Val Glu Gln Leu Gly Gly Met Thr Asn Gln Asn

20 25 30

Tyr Leu Val Lys Thr Thr Asn Lys Gln Tyr Ile Val Lys Phe Phe Gly

35 40 45

Lys Gly Thr Glu Lys Leu Ile Asn Arg Gln Asp Glu Lys Tyr Asn Leu

50 55 60

Glu Leu Leu Lys Asp Leu Asp Leu Asp Val Lys Asn Tyr Leu Phe Asp

65 70 75 80

Ile Glu Ala Gly Ile Lys Val Asn Glu Tyr Ile Glu Ser Ala Ile Thr

85 90 95

Leu Asp Ser Thr Ser Ile Lys Thr Lys Phe Asp Lys Ile Ala Pro Ile

100 105 110

Leu Gln Ile Ile His Ala Ser Gly Lys Glu Leu Arg Gly Glu Phe Ala

115 120 125

Pro Phe Glu Glu Ile Lys Lys Tyr Glu Ser Leu Ile Glu Glu Lys Ile

130 135 140

Pro Tyr Ala Asn Tyr Glu Ala Val Arg Glu Glu Val Phe Ser Leu Glu

145 150 155 160

Lys Arg Leu Ala Asp Leu Gly Val Asp Arg Lys Ser Cys His Ile Asp

165 170 175

Leu Val Pro Glu Asn Phe Ile Glu Ser Pro Gln Gly Arg Leu Tyr Leu

180 185 190

Ile Asp Trp Glu Tyr Ser Ser Met Asn Asp Pro Met Trp Asp Leu Ala

195 200 205

Ala Leu Phe Leu Glu Ser Glu Phe Thr Pro Gln Glu Glu Glu Val Phe

210 215 220

Leu Ser His Tyr Glu Ser Asp Lys Thr Pro Val Ser Arg Glu Lys Ile

225 230 235 240

Thr Ile Tyr Lys Ile Leu Gln Asp Thr Ile Trp Ser Leu Trp Thr Val

245 250 255

Tyr Lys Glu Glu Gln Gly Ala Asp Phe Gly Asp Tyr Gly Val Ser Arg

260 265 270

Tyr Gln Arg Ala Val Lys Gly Leu Ala Tyr Tyr Gly Gly Ser Asp Glu

275 280 285

Lys

<210> 3

<211> 229

<212> PRT

<213> 缓症链球菌CCT酶蛋白序列

<400> 3

Met Lys Ala Ile Ile Leu Ala Ala Gly Leu Gly Thr Arg Leu Arg Pro

1 5 10 15

Met Thr Glu Asn Thr Pro Lys Ala Leu Ile Gln Val Asn Gln Lys Pro

20 25 30

Leu Ile Glu Tyr Gln Ile Glu Phe Leu Lys Glu Lys Gly Ile Asn Asp

35 40 45

Ile Ile Ile Ile Val Gly Tyr Leu Lys Glu Gln Phe Asp Tyr Leu Lys

50 55 60

Glu Lys Tyr Gly Val Arg Leu Val Phe Asn Asp Lys Tyr Ala Asp Tyr

65 70 75 80

Asn Asn Phe Tyr Ser Leu Tyr Leu Val Lys Glu Glu Leu Ala Asn Ser

85 90 95

Tyr Val Ile Asp Ala Asp Asn Tyr Leu Phe Lys Asn Met Phe Arg Asn

100 105 110

Asp Leu Thr Arg Ser Thr Tyr Phe Ser Val Tyr Arg Glu Asp Cys Thr

115 120 125

Asn Glu Trp Phe Leu Val Tyr Gly Asp Asp Tyr Lys Val Gln Asp Ile

130 135 140

Ile Val Asp Ser Lys Ala Gly Arg Ile Leu Ser Gly Val Ser Phe Trp

145 150 155 160

Asp Ala Pro Thr Ala Glu Lys Ile Val Ser Phe Ile Asp Lys Ala Tyr

165 170 175

Ala Ser Gly Glu Phe Val Asp Leu Tyr Trp Asp Asn Met Val Lys Asp

180 185 190

Asn Ile Lys Glu Leu Asp Val Tyr Val Glu Glu Leu Glu Gly Asn Ser

195 200 205

Ile Tyr Glu Ile Asp Ser Val Gln Asp Tyr His Lys Leu Glu Glu Ile

210 215 220

Leu Lys Asn Glu Asn

225

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 连接肽

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 5

<211> 870

<212> DNA

<213> 优化合成的CKI酶编码基因

<400> 5

atggaaaaaa tcatcaaaga aaaaatctct tctctgctgt ctcaggaaga agaagttctg 60

tctgttgaac agctgggtgg tatgaccaac cagaactacc tggttaaaac caccaacaaa 120

cagtacatcg ttaaattctt cggtaaaggt accgaaaaac tgatcaaccg tcaggacgaa 180

aaatacaacc tggaactgct gaaagacctg gacctggacg ttaaaaacta cctgttcgac 240

atcgaagctg gtatcaaagt taacgaatac atcgaatctg ctatcaccct ggactctacc 300

tctatcaaaa ccaaattcga caaaatcgct ccgatcctgc agatcatcca cgcttctggt 360

aaagaactgc gtggtgaatt cgctccgttc gaagaaatca aaaaatacga atctctgatc 420

gaagaaaaaa tcccgtacgc taactacgaa gctgttcgtg aagaagtttt ctctctggaa 480

aaacgtctgg ctgacctggg tgttgaccgt aaatcttgcc acatcgacct ggttccggaa 540

aacttcatcg aatctccgca gggtcgtctg tacctgatcg actgggaata ctcttctatg 600

aacgacccga tgtgggacct ggctgctctg ttcctggaat ctgaattcac cccgcaggaa 660

gaagaagttt tcctgtctca ctacgaatct gacaaaaccc cggtttctcg tgaaaaaatc 720

accatctaca aaatcctgca ggacaccatc tggtctctgt ggaccgttta caaagaagaa 780

cagggtgctg acttcggtga ctacggtgtt tctcgttacc agcgtgctgt taaaggtctg 840

gcttactacg gtggttctga cgaaaaataa 870

<210> 6

<211> 690

<212> DNA

<213> 优化合成的CCT酶编码基因

<400> 6

atgaaagcta tcatcctggc tgctggtctg ggtacccgtc tgcgtccgat gaccgaaaac 60

accccgaaag ctctgatcca ggttaaccag aaaccgctga tcgaatacca gatcgaattc 120

ctgaaagaaa aaggtatcaa cgacatcatc atcatcgttg gttacctgaa agaacagttc 180

gactacctga aagaaaaata cggtgttcgt ctggttttca acgacaaata cgctgactac 240

aacaacttct actctctgta cctggttaaa gaagaactgg ctaactctta cgttatcgac 300

gctgacaact acctgttcaa aaacatgttc cgtaacgacc tgacccgttc tacctacttc 360

tctgtttacc gtgaagactg caccaacgaa tggttcctgg tttacggtga cgactacaaa 420

gttcaggaca tcatcgttga ctctaaagct ggtcgtatcc tgtctggtgt ttctttctgg 480

gacgctccga ccgctgaaaa aatcgtttct ttcatcgaca aagcttacgc ttctggtgaa 540

ttcgttgacc tgtactggga caacatggtt aaagacaaca tcaaagaact ggacgtttac 600

gttgaagaac tggaaggtaa ctctatctac gaaatcgact ctgttcagga ctaccacaaa 660

ctggaagaaa tcctgaaaaa cgaaaactaa 690

<210> 7

<211> 526

<212> PRT

<213> 人工合成双功能酶突变体氨基酸序列

<400> 7

Met Lys Ala Ile Ile Leu Ala Ala Gly Leu Gly Thr Arg Leu Arg Pro

1 5 10 15

Met Thr Glu Asn Thr Pro Lys Ala Leu Ile Gln Val Asn Gln Lys Pro

20 25 30

Leu Ile Glu Tyr Gln Ile Glu Phe Leu Lys Glu Lys Gly Ile Asn Asp

35 40 45

Ile Ile Ile Ile Val Gly Tyr Leu Lys Glu Gln Phe Asp Tyr Leu Lys

50 55 60

Glu Lys Tyr Gly Val Arg Leu Val Phe Asn Asp Lys Tyr Ala Asp Tyr

65 70 75 80

Asn Asn Phe Tyr Ser Leu Tyr Leu Val Lys Glu Glu Leu Ala Asn Ser

85 90 95

Tyr Val Ile Asp Ala Asp Asn Tyr Leu Phe Lys Asn Met Phe Arg Asn

100 105 110

Asp Leu Thr Arg Ser Thr Tyr Phe Ser Val Tyr Arg Glu Asp Cys Thr

115 120 125

Asn Glu Trp Phe Leu Val Tyr Gly Asp Asp Tyr Lys Val Gln Asp Ile

130 135 140

Ile Val Asp Ser Lys Ala Gly Arg Ile Leu Ser Gly Val Ser Phe Trp

145 150 155 160

Asp Ala Pro Thr Ala Glu Lys Ile Val Ser Phe Ile Asp Lys Ala Tyr

165 170 175

Ala Ser Gly Glu Phe Val Asp Leu Tyr Trp Asp Asn Met Val Lys Asp

180 185 190

Asn Ile Lys Glu Leu Asp Val Tyr Val Glu Glu Leu Glu Gly Asn Ser

195 200 205

Ile Tyr Glu Ile Asp Ser Val Gln Asp Tyr His Lys Leu Glu Glu Ile

210 215 220

Leu Lys Asn Glu Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Met Glu Lys

225 230 235 240

Ile Ile Lys Glu Lys Ile Ser Ser Leu Leu Ser Gln Glu Glu Glu Val

245 250 255

Leu Ser Val Glu Gln Leu Gly Gly Met Thr Asn Gln Asn Tyr Leu Val

260 265 270

Lys Thr Thr Asn Lys Gln Tyr Ile Val Lys Phe Phe Gly Lys Gly Thr

275 280 285

Glu Lys Leu Ile Asn Arg Gln Asp Glu Lys Tyr Asn Leu Glu Leu Leu

290 295 300

Lys Asp Leu Asp Leu Asp Val Lys Asn Tyr Leu Phe Asp Ile Glu Ala

305 310 315 320

Gly Ile Lys Val Asn Glu Tyr Ile Glu Ser Ala Ile Thr Leu Asp Ser

325 330 335

Thr Ser Ile Lys Thr Lys Phe Asp Lys Ile Ala Pro Ile Leu Gln Thr

340 345 350

Ile His Ala Ser Gly Lys Glu Leu Arg Gly Glu Phe Ala Pro Phe Glu

355 360 365

Glu Ile Lys Lys Tyr Glu Ser Leu Ile Glu Glu Lys Ile Pro Tyr Ala

370 375 380

Asn Tyr Glu Ala Val Arg Glu Glu Val Phe Ser Leu Glu Lys Arg Leu

385 390 395 400

Ala Asp Leu Gly Val Asp Arg Lys Ser Cys His Ile Asp Leu Val Pro

405 410 415

Glu Asn Phe Ile Glu Ser Pro Gln Gly Arg Leu Tyr Leu Ile Asp Trp

420 425 430

Glu Tyr Ser Ser Met Asn Asp Pro Met Trp Asp Leu Ala Ala Leu Phe

435 440 445

Leu Glu Ser Glu Phe Thr Pro Gln Glu Glu Glu Val Phe Leu Ser His

450 455 460

Tyr Glu Ser Asp Lys Thr Pro Val Ser Arg Glu Lys Ile Thr Ile Tyr

465 470 475 480

Lys Ile Leu Gln Asp Thr Ile Trp Ser Leu Trp Thr Val Tyr Lys Glu

485 490 495

Glu Gln Gly Ala Asp Phe Gly Asp Tyr Gly Val Ser Arg Tyr Gln Arg

500 505 510

Ala Val Lys Gly Leu Ala Tyr Tyr Gly Gly Ser Asp Glu Lys

515 520 525

<210> 8

<211> 526

<212> PRT

<213> 人工合成双功能酶突变体氨基酸序列

<400> 8

Met Lys Ala Ile Ile Leu Ala Ala Gly Leu Gly Thr Arg Leu Arg Pro

1 5 10 15

Met Thr Glu Asn Thr Pro Lys Ala Leu Ile Gln Val Asn Gln Lys Pro

20 25 30

Leu Ile Glu Tyr Gln Ile Glu Phe Leu Lys Glu Lys Gly Ile Asn Asp

35 40 45

Ile Ile Ile Ile Val Gly Tyr Leu Lys Glu Gln Phe Asp Tyr Leu Lys

50 55 60

Glu Lys Tyr Gly Val Arg Leu Val Phe Asn Asp Lys Tyr Ala Asp Tyr

65 70 75 80

Asn Asn Phe Tyr Ser Leu Tyr Leu Val Lys Glu Glu Leu Ala Asn Ser

85 90 95

Tyr Val Ile Asp Ala Asp Asn Tyr Leu Phe Lys Asn Met Phe Arg Asn

100 105 110

Asp Leu Thr Arg Ser Thr Tyr Phe Ser Val Tyr Arg Glu Asp Cys Thr

115 120 125

Asn Glu Trp Phe Leu Val Tyr Gly Asp Asp Tyr Lys Val Gln Asp Ile

130 135 140

Ile Val Asp Ser Lys Ala Gly Arg Ile Leu Ser Gly Val Ser Phe Trp

145 150 155 160

Asp Ala Pro Thr Ala Glu Lys Ile Val Ser Phe Ile Asp Lys Ala Tyr

165 170 175

Ala Ser Gly Glu Phe Val Asp Leu Tyr Trp Asp Asn Met Val Lys Asp

180 185 190

Asn Ile Lys Glu Leu Asp Val Tyr Val Glu Glu Leu Glu Gly Asn Ser

195 200 205

Ile Tyr Glu Ile Asp Ser Val Gln Asp Tyr His Lys Leu Glu Glu Ile

210 215 220

Leu Lys Asn Glu Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Met Glu Lys

225 230 235 240

Ile Ile Lys Glu Lys Ile Ser Ser Leu Leu Ser Gln Glu Glu Glu Val

245 250 255

Leu Ser Val Glu Gln Leu Gly Gly Met Thr Asn Gln Asn Tyr Leu Val

260 265 270

Lys Thr Thr Asn Lys Gln Tyr Ile Val Lys Phe Phe Gly Lys Gly Thr

275 280 285

Glu Lys Leu Ile Asn Arg Gln Asp Glu Lys Tyr Asn Leu Glu Leu Leu

290 295 300

Lys Asp Leu Asp Leu Asp Val Lys Asn Tyr Leu Phe Asp Ile Glu Ala

305 310 315 320

Gly Ile Lys Val Asn Glu Tyr Ile Glu Ser Ala Ile Thr Leu Asp Ser

325 330 335

Thr Ser Ile Lys Thr Lys Phe Asp Lys Ile Ala Pro Ile Leu Gln Ile

340 345 350

Ile His Ala Ser Gly Lys Glu Leu Arg Gly Glu Phe Ala Pro Phe Glu

355 360 365

Glu Ile Lys Lys Tyr Glu Ser Leu Ile Glu Glu Lys Ile Pro Tyr Ala

370 375 380

Asn Tyr Glu Ala Val Arg Glu Glu Val Phe Ser Leu Glu Lys Arg Leu

385 390 395 400

Ala Asp Leu Gly Val Asp Arg Lys Ser Cys His Ile Asp Leu Val Pro

405 410 415

Glu Asn Phe Ile Glu Ser Pro Gln Gly Arg Leu Tyr Leu Ile Asp Trp

420 425 430

Glu Tyr Ser Ser Met Asn Asp Pro Met Trp Asp Leu Ala Ala Leu Phe

435 440 445

Leu Glu Ser Glu Phe Thr Pro Gln Glu Glu Glu Val Phe Leu Ser His

450 455 460

Tyr Glu Ser Asp Gln Thr Pro Val Ser Arg Glu Lys Ile Thr Ile Tyr

465 470 475 480

Lys Ile Leu Gln Asp Thr Ile Trp Ser Leu Trp Thr Val Tyr Lys Glu

485 490 495

Glu Gln Gly Ala Asp Phe Gly Asp Tyr Gly Val Ser Arg Tyr Gln Arg

500 505 510

Ala Val Lys Gly Leu Ala Tyr Tyr Gly Gly Ser Asp Glu Lys

515 520 525

<210> 9

<211> 526

<212> PRT

<213> 人工合成双功能酶突变体氨基酸序列

<400> 9

Met Lys Ala Ile Ile Leu Ala Ala Gly Leu Gly Thr Arg Leu Arg Pro

1 5 10 15

Met Thr Glu Asn Thr Pro Lys Ala Leu Ile Gln Val Asn Gln Lys Pro

20 25 30

Leu Ile Glu Tyr Gln Ile Glu Phe Leu Lys Glu Lys Gly Ile Asn Asp

35 40 45

Ile Ile Ile Ile Val Gly Tyr Leu Lys Glu Gln Phe Asp Tyr Leu Lys

50 55 60

Glu Lys Tyr Gly Val Arg Leu Val Phe Asn Asp Lys Tyr Ala Asp Tyr

65 70 75 80

Asn Asn Phe Tyr Ser Leu Tyr Leu Val Lys Glu Glu Leu Ala Asn Ser

85 90 95

Tyr Val Ile Asp Ala Asp Asn Tyr Leu Phe Lys Asn Met Phe Arg Asn

100 105 110

Asp Leu Thr Arg Ser Thr Tyr Phe Ser Val Tyr Arg Glu Asp Cys Thr

115 120 125

Asn Glu Trp Phe Leu Val Tyr Gly Asp Asp Tyr Lys Val Gln Asp Ile

130 135 140

Ile Val Asp Ser Lys Ala Gly Arg Ile Leu Ser Gly Val Ser Phe Trp

145 150 155 160

Asp Ala Pro Thr Ala Glu Lys Ile Val Ser Phe Ile Asp Lys Ala Tyr

165 170 175

Ala Ser Gly Glu Phe Val Asp Leu Tyr Trp Asp Asn Met Val Lys Asp

180 185 190

Asn Ile Lys Glu Leu Asp Val Tyr Val Glu Glu Leu Glu Gly Asn Ser

195 200 205

Ile Tyr Glu Ile Asp Ser Val Gln Asp Tyr His Lys Leu Glu Glu Ile

210 215 220

Leu Lys Asn Glu Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Met Glu Lys

225 230 235 240

Ile Ile Lys Glu Lys Ile Ser Ser Leu Leu Ser Gln Glu Glu Glu Val

245 250 255

Leu Ser Val Glu Gln Leu Gly Gly Met Thr Asn Gln Asn Tyr Leu Val

260 265 270

Lys Thr Thr Asn Lys Gln Tyr Ile Val Lys Phe Phe Gly Lys Gly Thr

275 280 285

Glu Lys Leu Ile Asn Arg Gln Asp Glu Lys Tyr Asn Leu Glu Leu Leu

290 295 300

Lys Asp Leu Asp Leu Asp Val Lys Asn Tyr Leu Phe Asp Ile Glu Ala

305 310 315 320

Gly Ile Lys Val Asn Glu Tyr Ile Glu Ser Ala Ile Thr Leu Asp Ser

325 330 335

Thr Ser Ile Lys Thr Lys Phe Asp Lys Ile Ala Pro Ile Leu Gln Thr

340 345 350

Ile His Ala Ser Gly Lys Glu Leu Arg Gly Glu Phe Ala Pro Phe Glu

355 360 365

Glu Ile Lys Lys Tyr Glu Ser Leu Ile Glu Glu Lys Ile Pro Tyr Ala

370 375 380

Asn Tyr Glu Ala Val Arg Glu Glu Val Phe Ser Leu Glu Lys Arg Leu

385 390 395 400

Ala Asp Leu Gly Val Asp Arg Lys Ser Cys His Ile Asp Leu Val Pro

405 410 415

Glu Asn Phe Ile Glu Ser Pro Gln Gly Arg Leu Tyr Leu Ile Asp Trp

420 425 430

Glu Tyr Ser Ser Met Asn Asp Pro Met Trp Asp Leu Ala Ala Leu Phe

435 440 445

Leu Glu Ser Glu Phe Thr Pro Gln Glu Glu Glu Val Phe Leu Ser His

450 455 460

Tyr Glu Ser Asp Gln Thr Pro Val Ser Arg Glu Lys Ile Thr Ile Tyr

465 470 475 480

Lys Ile Leu Gln Asp Thr Ile Trp Ser Leu Trp Thr Val Tyr Lys Glu

485 490 495

Glu Gln Gly Ala Asp Phe Gly Asp Tyr Gly Val Ser Arg Tyr Gln Arg

500 505 510

Ala Val Lys Gly Leu Ala Tyr Tyr Gly Gly Ser Asp Glu Lys

515 520 525

<210> 10

<211> 1581

<212> DNA

<213> 人工合成双功能酶突变体基因序列

<400> 10

atgaaagcta tcatcctggc tgctggtctg ggtacccgtc tgcgtccgat gaccgaaaac 60

accccgaaag ctctgatcca ggttaaccag aaaccgctga tcgaatacca gatcgaattc 120

ctgaaagaaa aaggtatcaa cgacatcatc atcatcgttg gttacctgaa agaacagttc 180

gactacctga aagaaaaata cggtgttcgt ctggttttca acgacaaata cgctgactac 240

aacaacttct actctctgta cctggttaaa gaagaactgg ctaactctta cgttatcgac 300

gctgacaact acctgttcaa aaacatgttc cgtaacgacc tgacccgttc tacctacttc 360

tctgtttacc gtgaagactg caccaacgaa tggttcctgg tttacggtga cgactacaaa 420

gttcaggaca tcatcgttga ctctaaagct ggtcgtatcc tgtctggtgt ttctttctgg 480

gacgctccga ccgctgaaaa aatcgtttct ttcatcgaca aagcttacgc ttctggtgaa 540

ttcgttgacc tgtactggga caacatggtt aaagacaaca tcaaagaact ggacgtttac 600

gttgaagaac tggaaggtaa ctctatctac gaaatcgact ctgttcagga ctaccacaaa 660

ctggaagaaa tcctgaaaaa cgaaaacggt ggtggtggtg gtggtggtgg tatggaaaaa 720

atcatcaaag aaaaaatctc ttctctgctg tctcaggaag aagaagttct gtctgttgaa 780

cagctgggtg gtatgaccaa ccagaactac ctggttaaaa ccaccaacaa acagtacatc 840

gttaaattct tcggtaaagg taccgaaaaa ctgatcaacc gtcaggacga aaaatacaac 900

ctggaactgc tgaaagacct ggacctggac gttaaaaact acctgttcga catcgaagct 960

ggtatcaaag ttaacgaata catcgaatct gctatcaccc tggactctac ctctatcaaa 1020

accaaattcg acaaaatcgc tccgatcctg cagatcatcc acgcttctgg taaagaactg 1080

cgtggtgaat tcgctccgtt cgaagaaatc aaaaaatacg aatctctgat cgaagaaaaa 1140

atcccgtacg ctaactacga agctgttcgt gaagaagttt tctctctgga aaaacgtctg 1200

gctgacctgg gtgttgaccg taaatcttgc cacatcgacc tggttccgga aaacttcatc 1260

gaatctccgc agggtcgtct gtacctgatc gactgggaat actcttctat gaacgacccg 1320

atgtgggacc tggctgctct gttcctggaa tctgaattca ccccgcagga agaagaagtt 1380

ttcctgtctc actacgaatc tgacaaaacc ccggtttctc gtgaaaaaat caccatctac 1440

aaaatcctgc aggacaccat ctggtctctg tggaccgttt acaaagaaga acagggtgct 1500

gacttcggtg actacggtgt ttctcgttac cagcgtgctg ttaaaggtct ggcttactac 1560

ggtggttctg acgaaaaata a 1581

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 引物DNA序列

<400> 11

aagaaggaga tatacatatg gaaaaaatca tcaaag 36

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 引物DNA序列

<400> 12

gacggagctc gaattcggat ccttattttt cgtcagaacc acc 43

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 引物DNA序列

<400> 13

aagaaggaga tatacatatg aaagctatca tcctggc 37

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 引物DNA序列

<400> 14

gacggagctc gaattcggat ccttagtttt cgtttttcag gat 43

<210> 15

<211> 64

<212> DNA

<213> 引物DNA序列

<400> 15

acggtggttc tgacgaaaaa ggtggtggtg gtggtggtgg tggtatgaaa gctatcatcc 60

tggc 64

<210> 16

<211> 64

<212> DNA

<213> 引物DNA序列

<400> 16

gccaggatga tagctttcat accaccacca ccaccaccac cacctttttc gtcagaacca 60

ccgt 64

<210> 17

<211> 64

<212> DNA

<213> 引物DNA序列

<400> 17

aaatcctgaa aaacgaaaac ggtggtggtg gtggtggtgg tggtatggaa aaaatcatca 60

aaga 64

<210> 18

<211> 64

<212> DNA

<213> 引物DNA序列

<400> 18

tctttgatga ttttttccat accaccacca ccaccaccac caccgttttc gtttttcagg 60

attt 64

Claims

1.一种双功能酶，其特征在于，所述双功能酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的一种双功能酶，其特征在于，所述双功能酶由CKI酶和CCT酶通过连接肽连接组成，所述CKI酶的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示，所述CCT酶的蛋白序列如SEQ ID NO:3所示，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

3.根据权利要求2所述的一种双功能酶，其特征在于，所述双功能酶是由编码该蛋白的基因序列表达而成，所述基因序列如SEQ ID NO:10所示，其构建方法如下：

(1)按照缓症链球菌(Streptococcus mitis)的CKI酶和CCT酶的蛋白序列，根据大肠杆菌DNA密码子偏好性进行序列优化，分别合成DNA序列cki和cct，其中，cki序列如SEQ IDNO:5所示，所述cct序列如SEQ ID NO:6所示；

(2)设计扩增引物，引物含连接肽对应的基因以及与表达载体同源的序列，使用引物对cki和cct进行PCR反应，分别扩增cki和cct片段；同时将表达载体进行酶切线性化，使用无缝克隆方式将两段目的DNA与载体连接；

(3)将构建的质粒转入表达菌株，进行蛋白表达。

4.根据权利要求1-3任一所述的一种双功能酶突变体，其特征在于，所述突变体是将双功能酶中的连接肽的氨基酸序列进行突变得到的，突变为第352位、第469位氨基酸的单点突变或组合突变。

5.根据权利要求4所述的一种双功能酶突变体，其特征在于，突变体SEQ ID NO:7是第352位氨基酸由异亮氨酸变为苏氨酸，突变体SEQ ID NO：8是第469位氨基酸由赖氨酸变为谷氨酰胺，突变体SEQ ID NO：9是第352位氨基酸由异亮氨酸变为苏氨酸同时第469位氨基酸由赖氨酸变为谷氨酰胺。

6.根据权利要求1所述的一种双功能酶突变体，其特征在于，所突变方法为定点突变。

7.根据权利要求1-3任一所述的一种双功能酶的应用，所述双功能酶用于催化制备CDPC。

8.根据权利要求7所述的一种双功能酶的应用，其特征在于，所述催化制备CDPC是以氯化胆碱、氯化钾、六水氯化镁、十二水磷酸氢二钾、ATP和CTP为反应体系，加入双功能酶进行反应，控制pH值为7.5；温度为35℃；制备得到的。

9.根据权利要求4-6任一所述的一种双功能酶突变体的应用，所述双功能酶突变体用于催化制备CDPC。

10.根据权利要求9所述的一种双功能酶突变体的应用，特征在于，所述催化制备CDPC是以氯化胆碱、氯化钾、六水氯化镁、十二水磷酸氢二钾、ATP和CTP为反应体系，加入双功能酶的突变体进行反应，控制pH值为7.5；温度为35℃；制备得到的。